JP2015129773A - アナライト検出プローブ - Google Patents
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Abstract
Description
して、少なくとも、励起光を照射したときに局在プラズモン共鳴を生じる金属粒子と、該金属粒子上に結合した1つ以上のリガンドと、該金属粒子上に保持された1つ以上のFRETにおけるドナーまたはアクセプターとなり得る蛍光体とにより構成されるアナライト検出プローブであって、2以上の当該プローブがリガンドを介してアナライトと複合体を形成したときに、2以上の金属粒子から生じた局在プラズモン共鳴による電場増強効果が得られる領域内で、FRETが起きる距離内に蛍光体が配置されうるよう、上記蛍光体が上記金属粒子上に保持されていることを特徴とする、アナライト検出プローブを提供する。
本発明の第1態様の検出プローブ1および検出プローブ2は、図1に示す通り、少なくとも、励起光を照射したときに局在プラズモン共鳴を生じる金属粒子10と、該金属粒子10に結合した1つ以上のリガンド20と、該リガンド20に結合した1つ以上の蛍光体(ドナー31またはアクセプター32)とを構成要素として含み、さらに金属粒子10表面に形成された誘電体層11を含んでいてもよい。
本発明の検出プローブは、励起光を照射したときに局在プラズモン共鳴を生じる金属粒子を構成要素の一つとする。
本発明の検出プローブの金属粒子は、蛍光体の金属消光を防止するため、表面の一部または全部が誘電体からなる層で被覆されていてもよい。
本発明の検出プローブは、アナライトと複合体を形成するためのリガンドを構成要素の一つとする。
本発明の検出プローブは、蛍光体を担持するための直鎖状高分子を構成要素の一つとする。
本発明の検出プローブは、アナライトを蛍光標識化するための蛍光体を構成要素の一つとする。
Alexa Fluor647/Cy5,HiLyte Fluor647/Cy5,フルオレセインイソチオシアネート(FITC)/テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC),R−フィコエリトリン(R-PE)/アロフィコシアニン(APC),フルオレセイン/Cy5,Naphthalene14/Dansyl,Dansyl95/FITC,Dansyl14/ODR,ε-A14/NBD,IAF14/TMR,Pyrene14/Coumarin,FITC14/TMRI,AEDANS14/FITC,IAEDANS14/IAF,IAF14/EIA,CF/TR,Bodipy25/Bodipy,BPE14/Cy5,Terbium96/Rhodamine,Europium94/Cy5,Europium97/APC;蛍光タンパク質ではCFP/YFP,GFP/RFP。
本発明のアナライト検出試薬は、ドナーとなる蛍光体を有するプローブ(D)とアクセプターとなる蛍光体を有するプローブ(A)の両方を含有する。少なくとも1種のドナー/アクセプターの組み合わせが含有されていればよく、同時に複数のアナライトの分析を行うような用途のために2種以上のドナー/アクセプターの組み合わせが含有されていてもよい。
本発明の検出プローブを使用する蛍光分析は、基本的には従来のFRETを利用した蛍光分析と同じような手順によって、すなわちプローブ(D)およびプローブ(A)をアナライトに接触させてそれらの複合体を形成させる工程(1)、およびこの複合体に励起光を照射したときに生じる蛍光シグナルを測定する工程(2)を経ることによって、アナライトを定性的または定量的に検出することができる。
本発明におけるアナライトは、FRETが起きる距離にリガンドが結合しうるものであれば特に限定されないが、たとえば、腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモン等のタンパク質(ポリペプチド、オリゴペプチド等を含む)、ウイルスやバクテリア等の病原微生物などが挙げられる。また、核酸(一本鎖または二本鎖の、DNA、RNA、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、PNA(ペプチド核酸)等を含む)、糖質(オリゴ糖、多糖類、糖鎖等を含む)、脂質などのその他の分子も、必要に応じてビオチン化等の修飾処理をした上で、アナライトとすることが可能である。
作製例1:アナライト検出プローブの作製
(ステップ1)金属粒子の準備
(1)金ナノ粒子:粒径50nm(金コロイド)の調製
超純水200mlに、テトラクロロ金(III)酸四水和物の1%水溶液を10ml添加し、80℃に加熱した。溶液を撹拌しながら、その中にクエン酸の3%水溶液を20ml加え、80℃に加熱したまま更に20分激しく撹拌した。粒径は50nmであった。粒径は体積平均粒径を測定することで求めた。体積平均粒径は動的光散乱式粒子径・粒度分布測定装置「Nanotrac UPA-EX150」(日機装株式会社)にて測定を行った。以下金属ナノ粒子の粒径は同様の手法にて測定を行った。
粒径1.4nmの金ナノ粒子はフナコシ株式会社より購入し入手した。商品名は「Nanogold Particles, φ1.4 nm」である。
Au−Ag合金コロイド(Au:Ag=50:50重量比)は、Au源としてNa3Au(SO3)2水溶液、Ag源としてAgNO3水溶液を所定量混合して総金属固形分として0.03wt%になる水溶液を作成し、さらにクエン酸3ナトリウム2水和物を金属成分に対して等モル量添加・溶解して原料水溶液とした。この原料水溶液を40℃に加温した後、NaBH4を原料水溶液の金属成分に対して0.5モル量溶解した水溶液を5分で滴下させ、還元反応を行った。得られたコロイドは10nm程度の平均粒径を有しほぼ均一な粒径分布を示すことを確認した。
ステップ1の(1)〜(3)により準備した金属粒子を10-carboxy-1-decanethiolの2μMエタノール溶液に浸し、表面が10-carboxy-1-decanethiolからなるSAMで被覆された金属粒子を調製した。
前記ステップ1の(1)または(3)により準備した金属粒子の分散液100gを採取し、これに濃度1重量%のNaOH水溶液を添加して分散液のpHを10.5に調整し、95℃に昇温し30分間加熱した。その後、SiO2濃度3重量%の酸性珪酸液1.3gを15分間で添加して、シリカ被覆金ナノ粒子分散液を調製した。この分散液から粒子を分離した後、120℃で1時間乾燥してシリカ被覆金ナノ粒子を調製した。シリカ層の厚みは3nm程度であった。
表1に示す蛍光標識抗体を蛍光物質ラベリングキットを利用して作製した。たとえば、標識抗体1はanti-αfetoprotein 1D5 IgG1-κ抗体に「Cy5」を、標識抗体4はanti-αfetoprotein 6D2 IgG2a-κ抗体に「Alexa Fluor 647」を、それぞれキット付属のプロトコールにしたがって標識を行った(CyDye Antibody Labelling Kits)。その他の標識抗体についても同様に、1D5または6D2に各々のキット付属のプロトコールにしたがって標識を行った。なお、標識抗体4/1(Alexa Fluor647/Cy5)、標識抗体5/2(FITC/TRITC)、標識抗体6/3(R-PE/APC)は、それぞれFRETペア(ドナー/アクセプター)を形成する。
N-Hydroxysulfosuccinimide(NHS:同仁化学研究所社製)および1-Ethyl-3-[3-dimethylamino]propyl]carbodiimide hydrochloride(EDC:同仁化学研究所社製)それぞれを50mg/mLの濃度で25mM MES bufferに溶解した。得られたNHS溶液およびEDC溶液をミックスした溶液に、ステップ2で調製したSAMで被覆された金属粒子を添加し、粒子表面をスクシンイミド基で修飾した。そして、ステップ4で調製した蛍光標識抗体を加え、室温で30分間インキュベートし、金属粒子表面のスクシンイミド基とanti-αfetoprotein抗体のアミノ基を反応させることにより、蛍光標識抗体を金属粒子表面に固定化した。金属粒子表面の未反応のスクシンイミド基は、tris(hydroxymethyl)aminomethaneを添加して脱離させた。このようにして表2に示すアナライト検出プローブ1〜8,11,12を作製した。
ステップ3で調製したすでに表面がスクシンイミド基で修飾されているシリカ被覆金属粒子に対しては、その分散液にステップ4で調製した蛍光標識抗体を加え、室温で30分間インキュベートし、金属粒子表面のスクシンイミド基(NHSエステル)とanti-αfetoprotein抗体のアミノ基を反応させることにより、蛍光標識抗体を金属粒子表面に固定化した。金属粒子表面の未反応のスクシンイミド基は、tris(hydroxymethyl)aminomethaneを添加して脱離させた。このようにして表2に示すアナライト検出プローブ9,10,13,14を作製した。
まず、作製例1で作製したanti-αfetoprotein抗体を固定化した検出プローブ(2種類:6D2, 1D5を固定化したもの、実験によっては1種類)を溶液中に分散させた。そこに、anti-αfetoprotein抗体の抗原となるαfetoprotein(AFP)を含む溶液を添加した(図3参照)。
まず、作製例1で作製したanti-αfetoprotein抗体を固定化した検出プローブ(2種類:6D2, 1D5を固定化したもの、実験によっては1種類)を溶液中に分散させた。そこに、anti-αfetoprotein抗体の抗原となるαfetoprotein(AFP)を含む溶液を添加した。
作製例2:アナライト検出プローブの作製
(ステップ1)金属粒子の準備
(1)金ナノ粒子:粒径50nm(金コロイド)の調製
超純水200mlに、テトラクロロ金(III)酸四水和物の1%水溶液を10ml添加し、80℃に加熱した。溶液を撹拌しながら、その中にクエン酸の3%水溶液を20ml加え、80℃に加熱したまま更に20分激しく撹拌した。粒径は50nmであった。
粒径1.4nmの金ナノ粒子はフナコシ株式会社より購入し入手した。商品名は「Nanogold Particles, φ1.4 nm」である。
Au−Ag合金コロイド(Au:Ag=50:50重量比)は、Au源としてNa3Au(SO3)2水溶液、Ag源としてAgNO3水溶液を所定量混合して総金属固形分として0.03wt%になる水溶液を作成し、さらにクエン酸3ナトリウム2水和物を金属成分に対して等モル量添加・溶解して原料水溶液とした。この原料水溶液を40℃に加温した後、NaBH4を原料水溶液の金属成分に対して0.5モル量溶解した水溶液を5分で滴下させ、還元反応を行った。得られたコロイドは10nm程度の平均粒径を有しほぼ均一な粒径分布を示すことを確認した。
N-Hydroxysulfosuccinimide(NHS:同仁化学研究所社製)および1-Ethyl-3-[3-dimethylamino]propyl]carbodiimide hydrochloride(EDC:同仁化学研究所社製)それぞれを11.5mg/mL, 19.2mg/mLの濃度でMilliQ水に溶解した。得られたNHS溶液およびEDC溶液をミックスした溶液とカルボキシルメチルデキストラン(分子量500,000Da)をそれぞれ5μLずつとり混合した。さらに300μLのPBSで希釈した後、蛍光体(Cy5またはAlexa Fluor 647)を添加した。室温で30分間インキュベートし標識反応を行い、つづけて限外ろ過により蛍光標識デキストランを精製した。なお、Alexa Fluor647/Cy5はFRETペア(ドナー/アクセプター)を形成する。
N-Hydroxysulfosuccinimide(NHS:同仁化学研究所社製)および1-Ethyl-3-[3-dimethylamino]propyl]carbodiimide hydrochloride(EDC:同仁化学研究所社製)それぞれを50mg/mLの濃度で25mM MES bufferに溶解した。
ステップ2で調製された蛍光デキストランへの有機硫黄分分子の導入は、還元的アミノ化反応を応用した。アルデヒドまたはケトンを第一級アミン・第二級アミンとともにヒドリド還元剤の存在下反応させると、還元的アミノ化が起こり、対応するアミンが得られる。還元剤としてSodium cyanoborohydride (NaBH3CN)を用いる条件で反応を行い、蛍光デキストランの還元末端と11−アミノ−1−ウンデカンチオールのアミノ基との間にアミンを形成させた。生成物を精製後、凍結乾燥により得た白色粉末を得た。
ステップ3で調製された抗体−有機硫黄分子およびステップ4で調製された蛍光デキストラン−有機硫黄分子をそれぞれ終濃度1μMで混合し、ステップ1で準備した金ナノ粒子(1)〜(3)を添加することで、抗体および蛍光デキストランを適度な密度で固定化したナノ粒子の形成を行った。このようにして表5に示すアナライト検出プローブ15〜20を作製した。
まず、作製例2で作製したanti-αfetoprotein抗体を固定化した検出プローブ(2種類:6D2, 1D5を固定化したもの、実験によっては1種類)を溶液中に分散させた。そこに、anti-αfetoprotein抗体の抗原となるαfetoprotein(AFP)を含む溶液を添加した(図3参照)。
まず、作製例2で作製したanti-αfetoprotein抗体を固定化した検出プローブ(2種類:6D2, 1D5を固定化したもの、実験によっては1種類)を溶液中に分散させた。そこに、anti-αfetoprotein抗体の抗原となるαfetoprotein(AFP)を含む溶液を添加した。
2:プローブ(A)
10:金属粒子
11:被覆層
20:リガンド(たとえば抗体)
30:直鎖状高分子
31:蛍光体(ドナー)
32:蛍光体(アクセプター)
40:アナライト(たとえば抗原)
50:複合体
100:SPFS用測定装置(システム)
101:ガラス基板(S-LAL100, Au:Cr=49:1 nm)
102:フローセル
103:三角プリズム(S-LAL100, n=1.72)
104:レーザーダイオード(635nm, 0.95mW)
105:レンズ
106:偏光プリズム
107:フォトダイオード
108:回転ステージ
109:対物レンズ(×20)
110:干渉フィルタ(670nm)
111:CCDカメラ
120:PC
121:ステージコントローラー
150:SPFS部
151:SPR部
Claims (14)
- 少なくとも、励起光を照射したときに局在プラズモン共鳴を生じる金属粒子と、該金属粒子上に結合した1つ以上のリガンドと、該金属粒子上に保持された1つ以上のFRETにおけるドナーまたはアクセプターとなり得る蛍光体とにより構成されるアナライト検出プローブであって、
2以上の当該プローブがリガンドを介してアナライトと複合体を形成したときに、2以上の金属粒子から生じた局在プラズモン共鳴による電場増強効果が得られる領域内で、FRETが起きる距離内に蛍光体が配置されうるよう、上記蛍光体が上記金属粒子上に保持されていることを特徴とする、アナライト検出プローブ。 - 少なくとも、励起光を照射したときに局在プラズモン共鳴を生じる金属粒子と、該金属粒子に結合した1つ以上のリガンドと、該リガンドに結合した1つ以上のFRETにおけるドナーまたはアクセプターとなり得る蛍光体とにより構成されることを特徴とする、請求項1に記載のアナライト検出プローブ。
- 少なくとも、励起光を照射したときに局在プラズモン共鳴を生じる金属粒子と、該金属粒子に結合した1つ以上のリガンドと、該金属粒子に結合した1つ以上の直鎖状高分子と、該直鎖状高分子に結合した1つ以上のFRETにおけるドナーまたはアクセプターとなり得る蛍光体とにより構成されることを特徴とする、請求項1に記載のアナライト検出プローブ。
- 前記金属粒子が金、銀、銅、アルミニウム、白金およびこれら2種以上の合金からなる群より選択された金属からなる粒子である、請求項1〜3のいずれかに記載のアナライト検出プローブ。
- 前記金属粒子の体積平均粒径が10〜100nmである、請求項1〜4のいずれかに記載のアナライト検出プローブ。
- 前記金属粒子の表面が誘電体からなる層で被覆されている、請求項1〜5のいずれかに記載のアナライト検出プローブ。
- 前記誘電体からなる層がSiO2からなる層を含む、請求項6に記載のアナライト検出プローブ。
- 前記誘電体からなる層の厚さが1〜20nmである、請求項6または7に記載のアナライト検出プローブ。
- 前記リガンドが抗体またはそのFab断片もしくはF(ab')2断片である、請求項1〜8のいずれかに記載のアナライト検出プローブ。
- FRETにおけるドナーとなる蛍光体を有する請求項1〜9のいずれかに記載のアナライト検出プローブ(以下「プローブ(D)」と称する。)と、アクセプターとなる蛍光分子を有する請求項1〜9のいずれかに記載のアナライト検出プローブ(以下「プローブ(A)」と称する。)とを含有することを特徴とする、アナライト検出試薬。
- 請求項10に記載のアナライト検出試薬に含有されるプローブ(D)およびプローブ(A)とアナライトとを接触させてそれらの複合体を形成させる工程(1)と、この複合体に励起光を照射したときに生じる蛍光シグナルを測定する工程(2)とを含むことを特徴とする、アナライト検出方法。
- 前記工程(2)が、SPFS用測定装置を用いて、誘電体部材上に形成された金属薄膜の上部の領域に前記複合体が位置する状態で、前記励起光を金属薄膜の裏面から照射することにより行われる、請求項11に記載のアナライト検出方法。
- 少なくとも、励起光を照射したときに局在プラズモン共鳴を生じる金属粒子と、該金属粒子に結合した1つ以上のリガンドと、該リガンドに結合した1つ以上のFRETにおけるドナーまたはアクセプターとなり得る蛍光体とにより構成されることを特徴とする、アナライト検出プローブ。
- 少なくとも、励起光を照射したときに局在プラズモン共鳴を生じる金属粒子と、該金属粒子に結合した1つ以上のリガンドと、該金属粒子に結合した1つ以上の直鎖状高分子と、該直鎖状高分子に結合した1つ以上のFRETにおけるドナーまたはアクセプターとなり得る蛍光体とにより構成されることを特徴とする、アナライト検出プローブ。
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