JP2015071584A - 筋萎縮抑制剤 - Google Patents
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Abstract
Description
しかしながら、斯かるネギに、アトロジン−1の発現抑制作用があること、筋萎縮抑制作用があることはこれまで全く知られていない。
(1)ネギ又はその抽出物を有効成分とするアトロジン−1発現抑制剤。
(2)ネギ又はその抽出物を有効成分とする筋萎縮抑制剤。
斯かるネギは、そのまま若しくはそれを圧搾することにより得られる搾汁、植物体自身を乾燥した乾燥物若しくはその粉砕物、あるいはこれらから抽出した抽出物として用いることができるが、抽出物として用いるのが好ましい。
公知の抽出方法としては、例えば、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超臨界抽出、超音波抽出及びマイクロ波抽出等が挙げられる。
より好適な水−アルコール系混合溶剤としては、20%(v/v)以上、好ましくは50%(v/v)以上、そして95%(v/v)以下、90%(v/v)以下のエタノール水溶液が挙げられる。例えば、20〜95%(v/v)エタノール水溶液、好ましくは50〜95%(v/v)エタノール水溶液が挙げられる。
また、ネギ又はその抽出物は、アトロジン−1発現抑制剤等を製造するために使用することができる。
より具体的には、フォークヘッド型転写因子であるFoxoを介したアトロジン−1のプロモーター活性の抑制(試験例1)、無血清刺激による筋管細胞におけるアトロジン−1の発現抑制(試験例2)、マウスの尾懸垂処置による筋萎縮抑制(試験例3)が挙げられる。
また、絶食は、骨格筋においてアトロジン−1の発現を上昇させ、筋萎縮を誘導させる一方、無血清刺激は培養筋管細胞において、アトロジン−1の発現を上昇させる(Hum. Gene Ther. 22: 313-324, 2011)。そのため、無血清刺激によるアトロジン−1の発現抑制は、筋萎縮抑制の指標となる。
<1>ネギ又はその抽出物を有効成分とするアトロジン−1発現抑制剤。
<2>ネギ又はその抽出物を有効成分とする筋萎縮抑制剤。
<3>アトロジン−1発現抑制剤を製造するための、ネギ又はその抽出物の使用。
<4>筋萎縮抑制剤を製造するための、ネギ又はその抽出物の使用。
<5>アトロジン−1発現抑制に使用するための、ネギ又はその抽出物。
<6>筋萎縮抑制に使用するための、ネギ又はその抽出物。
<7>ネギ又はその抽出物の有効量を投与又は摂取することによるアトロジン−1発現抑制方法。
<8>ネギ又はその抽出物の有効量を投与又は摂取することによる筋萎縮抑制方法。
<9>上記<5>〜<6>において、使用は非治療的使用である。
<10>上記<7>〜<8>において、方法は非治療的方法である。
<11>上記<7>〜<8>において、投与又は摂取の対象は、それぞれ筋萎縮抑制を必要とする若しくは希望する動物又はヒトである。
ねぎパウダー(商品名、こだま食品より入手)10gに、50%EtOH水溶液100mLを加え、室温、静置条件下で1週間抽出した後に、ろ過することで、抽出液を得た。抽出液の固形分濃度は4.04%(w/v)であった。
(1)マウスアトロジン−1プロモーター領域のクローニング及びレポータープラスミド構築
マウスアトロジン−1プロモーター領域としてエキソン1上流の約3.5kbの長さの領域をクローニングするために、フォワードプライマー(attggtacctcggtggaaggtctctgta[配列番号1])、リバースプライマー(attctcgagacggattgacagccaggaa[配列番号2])を利用し、マウスBACクローン(RP23−391D2;Children’s Hospital Oakland)を鋳型にし、DNAポリメラーゼ(TaKaRa LA−taqTM;宝酒造社)を用い、94℃1分間の後、94℃30秒、60℃30秒、及び72℃4分のサイクルを25回、続いて72℃5分間の条件でPCRを行った。得られたPCR産物をクローニングベクター(pGEMR−T Easy Vector Systems;プロメガ社)にサブクローニングし、制限酵素(Kpn1、Xho1:宝酒造社)処理によりDNA断片を調整した。調整したDNA断片をpGL3−Basicベクター(Promega)のマルチクローニングサイト(Kpn1/Xho1)に挿入し、pGL3−アトロジン−1を得た。
マウスFoxo1は、pENTR223.1ベクターに挿入されたFoxo1のCDS(Open Biosystems)をpcDNA−DEST40ベクター(Invitrogen)にLRクロナーゼ(Invitrogen)により挿入した。
マウス骨格筋細胞株(C2C12)を24穴プレートに播種し、DMEM培地(10% ウシ胎児血清)中で1日培養した。pGL3−アトロジン−1プラスミドとウミシイタケ(renilla)由来ルシフェラーゼ発現ベクターであるphRL−TK(Promega)、pcDNA−DEST40−Foxo1を同時に各々トランスフェクション試薬(LipofectamineTM Reagent:Invitrogen)を用いて導入した。トランスフェクション4時間後にDMEM(5%チャコール処理ウシ胎児血清)に交換した。さらに4時間後に無血清培地(DMEM)に交換し、同時に被験物質として、ネギを終濃度0.0808%(w/v)で添加し、22時間培養した。
PBSにて洗浄後、デュアルルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)を用いて細胞を溶解、溶解液にルシフェリンを含む基質溶液を加え、ルミノメーターにてホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ活性を各々測定した。ルシフェラーゼ活性は、ホタルルシフェラーゼ活性/ウミシイタケルシフェラーゼ活性とし、Foxo1刺激を行っていない群を100とした際の相対値を計算した。統計は、unpaired student’s t−testを用い、有意水準はP<0.05とした。その結果を図1に示す。
図1の結果に示すように、Foxo1により、アトロジン−1のプロモーター活性は有意に増加した。ネギ抽出物は、Foxo1による活性化を有意に抑制した。
マウス骨格筋細胞株C2C12(ATCC)をDMEM培地(10% ウシ胎児血清)にて培養し、DMEM培地(2% 馬血清)で分化誘導を行った。2日ごとに培地を交換し、分化誘導6日目のC2C12細胞の培地をPBSに置換した(無血清刺激)。ネギはPBS置換時に、終濃度0.0808%(w/v)で同時に添加した。PBS置換6時間後にRNAを回収した。
細胞のRNA抽出は、RNeasy mini kit(QIAGEN)を用いて、添付のプロトコール通りに行った。
各RNAは濃度を揃えた後、65℃で10分間の熱処理を行い、急冷後に1μgのRNAを用いて逆転写反応を行った。逆転写反応はHigh Capacity RNA−to−cDNA Kit(アプライドバイオシステム社)を用いて、添付のプロトコールどおりに行った。反応後は4℃で急冷した。サンプルは使用まで−20℃で保存した。
逆転写反応によって得られたcDNAを鋳型として、ABI PRISM7700 Sequence Detector(アプライドバイオシステムズ社)によりリアルタイムPCRを行った。リアルタイムPCRの反応液組成は、10μL Fast SYBR Green PCR Master Mix(アプライドバイオシステムズ社)、0.1μlの100μM 5’−プライマー及び3’−プライマー、4.8μL dH2Oとして、これに5μLのcDNAを加えて20μLの反応系で行い、得られた解析結果は36B4 mRNAの発現量を基準として補正し、相対的mRNA発現量として示した。用いたプライマーは表1に示した。統計は、unpaired student’s t−testを用い、有意水準はP<0.05とした。その結果を図2に示す。
10週齢のBALB/cマウスを2週間予備飼育した後、体重(約27g)が等しくなるように、コントロール−対照食群(n=8)、尾懸垂−対照食群(n=9)、尾懸垂−ネギ食群(n=7)の3群に群わけした。
製造例で調製したネギ抽出物を用いて、表2に示す組成(単位は質量%)の各食餌を作製し、各食餌で7日間飼育した後に、尾懸垂処置を施した。尾懸垂処置は、マウスの尾に両面テープなどにより針金を固定し、この針金をケージの金網に固定することにより、マウス後肢が宙に浮いた状態にさせ、7日間放置した。尾懸垂処置終了後、マウス後肢のヒラメ筋重量を測定した。なお、尾懸垂処置期間中も各食餌を自由摂餌させた。統計は、unpaired student's t-testを用い、有意水準はP<0.05とした。その結果を図3に示す。
Claims (2)
- ネギ又はその抽出物を有効成分とするアトロジン−1発現抑制剤。
- ネギ又はその抽出物を有効成分とする筋萎縮抑制剤。
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