JP2015055849A - 撮像装置、顕微鏡システム、撮像方法及び撮像プログラム - Google Patents

Abstract

【課題】光照射に起因する試料の劣化を抑制することができる撮像装置等を提供する。【解決手段】撮像範囲内の試料ＳＰを撮像して画像データを生成する撮像部２００と、撮像範囲に照射される光を発生する落射照明用光源２１１と、撮像範囲内の周縁領域において光が減衰するように、該光の輝度分布を制御する落射視野絞り２１４及び照明輝度分布制御部３６１と、試料ＳＰに対する撮像範囲を順次変化させるステージ位置制御部３６２と、撮像範囲が異なる複数の画像の画像データを撮像部２００から順次取得し、該複数の画像を貼り合わせて合成画像を作成する演算部３４とを備え、ステージ位置制御部３６２は、互いに隣接する撮像範囲において、光が減衰する周縁領域同士が重複するように撮像範囲を変化させ、演算部３４は、互いに隣接する撮像範囲にそれぞれ対応する画像を、周縁領域に対応する画像領域同士が重複するように貼り合わせる。【選択図】図１

Description

本発明は、試料を撮像することにより取得した複数の画像を貼り合わせて広視野の画像を作成する撮像装置、顕微鏡システム、撮像方法及び撮像プログラムに関する。

近年、スライドガラス上に載置された試料を写した画像を電子データとして記録し、パーソナルコンピュータ等のモニタ上においてユーザが該画像を観察できるようにした、所謂バーチャルスライド技術が知られている。バーチャルスライド技術においては、顕微鏡により拡大された試料の一部の画像を順次貼り合わせることにより、試料全体が写った広視野且つ高解像度の画像を構築する。つまり、同一被写体に対して異なる視野の画像を複数枚取得し、これらの画像をつなぎ合わせることで、被写体の拡大画像を生成する技術がバーチャルスライド技術である。また、複数の画像を接続する処理は、スティッチング処理と呼ばれることもある（例えば特許文献１参照）。

ところで、生物学や医学の分野において観察される試料の中には、光照射により劣化するものがある。例えば、染色された試料が光照射により褪色する、或いは、培養細胞の健康が光照射により損なわれるといったことが生じる。このような光の作用は、光毒性とも呼ばれる。そのため、光照射により劣化が生じる試料は、遮光状態で保管され、撮像時にのみ必要最低限の光が照射されるように取り扱われる（例えば非特許文献１参照）。

特開２０１２−３２１４号公報

許 南浩、中村幸夫 編、「改定 培養細胞実験ハンドブック」、羊土社、２００９年１月１日発行、第１７３頁

バーチャルスライド技術においては、隣接する画像間の位置合わせを行うために、隣接する視野の一部が重なり合うように撮像を行う。このため、重なり領域には複数回の光照射が行われることになる。その結果、上述した光照射により劣化する試料に対してバーチャルスライド技術を適用する場合、重なり領域における試料の劣化が著しくなってしまう。このような問題点に対し、上記特許文献１においては、重なり領域の位置を調整することにより、重なり領域に照射される励起光の累積光量を低減している。

しかしながら、上記特許文献１においても、重なり領域には少なくとも２回の光照射が行われるため、それ以外の領域と比べて試料の劣化が著しいことには変わりない。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであり、光照射に起因する試料の局所的な劣化を抑制することができる撮像装置、顕微鏡システム、撮像方法及び撮像プログラムを提供することを目的とする。

上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明に係る撮像装置は、撮像範囲内の被写体を撮像して画像データを生成する撮像手段と、前記撮像範囲に照射される光を発生する照明手段と、前記撮像範囲内の周縁領域において前記光が減衰するように、前記光の輝度分布を制御する照明制御手段と、前記被写体に対する前記撮像範囲を順次変化させる撮像範囲移動制御手段と、前記撮像範囲が異なる複数の画像の画像データを前記撮像手段から順次取得し、前記複数の画像を貼り合わせて合成画像を作成する演算手段と、を備え、前記撮像範囲移動制御手段は、互いに隣接する撮像範囲において、前記光が減衰する前記周縁領域同士が重複するように、前記撮像範囲を変化させ、前記演算手段は、前記互いに隣接する撮像範囲にそれぞれ対応する画像を、前記周縁領域に対応する画像領域同士が重複するように貼り合わせる、ことを特徴とする。

上記撮像装置において、前記照明制御手段は、前記照明手段から前記被写体までの前記光の光路に設けられた視野絞りを備えることを特徴とする。

上記撮像装置において、前記照明制御手段は、前記視野絞りの開口端部の像が前記撮像範囲の周縁部と重なるように、前記視野絞りの開口の大きさを調節する開口調節手段をさらに含み、前記撮像範囲移動制御手段は、前記開口の大きさに応じて前記撮像範囲を順次変化させる、ことを特徴とする。

上記撮像装置において、前記照明制御手段は、前記視野絞りを前記照明手段の光軸に沿って移動させる位置調節手段をさらに含み、前記撮像範囲移動制御手段は、前記視野絞りの前記光軸方向における位置に応じて前記撮像範囲を順次変化させる、ことを特徴とする。

上記撮像装置において、前記視野絞りは、開口端部から離れるに従って前記光の透過率が連続的に変化する部材によって形成されていることを特徴とする。

上記撮像装置において、前記演算手段は、さらに、前記互いに隣接する撮像範囲にそれぞれ対応する画像の前記画像領域から特徴領域を抽出し、該特徴領域に基づいて、前記対応する画像同士の位置合わせを行うことを特徴とする。

上記撮像装置において、前記演算手段は、前記互いに隣接する撮像範囲にそれぞれ対応する画像の前記画像領域に対してシェーディング補正を行い、シェーディング補正済みの前記画像領域に基づいて前記位置合わせを行うことを特徴とする。

上記撮像装置において、前記演算手段は、前記画像領域におけるシェーディング成分の最大値を基準として、前記シェーディング補正におけるゲインを決定することを特徴とする。

上記撮像装置において、前記演算手段は、前記画像領域におけるシェーディング成分の中央値を基準として、前記シェーディング補正におけるゲインを決定することを特徴とする。

本発明に係る顕微鏡システムは、前記撮像装置と、前記被写体が載置されるステージと、前記ステージと対向して設けられた対物レンズと、を備えることを特徴とする。

上記顕微鏡システムにおいて、前記被写体は、蛍光観察用の染色が施された試料であり、前記照明手段は、前記試料を励起する励起光を発生する落射照明手段である、ことを特徴とする。

本発明に係る撮像方法は、撮像手段の撮像範囲内の周縁領域において光が減衰するように、該光の輝度分布を制御する輝度分布制御ステップと、輝度分布が制御された前記光を前記撮像範囲に照射する光照射ステップと、前記光が照射された前記撮像範囲内の被写体を撮像して画像データを生成する撮像ステップと、前記被写体に対する前記撮像範囲を順次変化させる撮像範囲移動制御ステップと、前記撮像ステップにおいて生成された画像データに基づき、前記撮像範囲が異なる複数の画像を順次取得し、該複数の画像を貼り合わせて合成画像を作成する演算ステップと、を含み、前記撮像範囲移動制御ステップは、互いに隣接する撮像範囲において、前記光が減衰する前記周縁領域同士が重複するように、前記撮像範囲を変化させ、前記演算ステップは、前記互いに隣接する撮像範囲にそれぞれ対応する画像を、前記周縁領域に対応する画像領域同士が重複するように貼り合わせる、ことを特徴とする。

本発明に係る撮像プログラムは、撮像手段の撮像範囲内の周縁領域において光が減衰するように、該光の輝度分布を制御する輝度分布制御ステップと、照明手段に、輝度分布が制御された前記光を前記撮像範囲に照射させる光照射ステップと、撮像手段に、前記光が照射された前記撮像範囲内の被写体を撮像させ、画像データを生成させる撮像ステップと、前記被写体に対する前記撮像範囲を順次変化させる撮像範囲移動制御ステップと、前記撮像ステップにおいて生成された画像データに基づき、前記撮像範囲が異なる複数の画像を順次取得し、該複数の画像を貼り合わせて合成画像を作成する演算ステップと、をコンピュータに実行させ、前記撮像範囲移動制御ステップは、互いに隣接する撮像範囲において、前記光が減衰する前記周縁領域同士が重複するように、前記撮像範囲を変化させ、前記演算ステップは、前記互いに隣接する撮像範囲にそれぞれ対応する画像を、前記周縁領域に対応する画像領域同士が重複するように貼り合わせる、ことを特徴とする。

本発明によれば、撮像範囲に照射される光の輝度分布を、撮像範囲内の周縁領域において該光が減衰するように制御すると共に、互いに隣接する撮像範囲において上記周縁領域同士が重複するように撮像範囲を変化させるので、周縁領域に照射される光の累積光量を他の領域と同程度にすることができ、光照射に起因する試料の局所的な劣化を抑制することが可能となる。

図１は、本発明の実施の形態１に係る顕微鏡システムの構成例を示すブロック図である。 図２は、図１に示す顕微鏡装置の構成を示す模式図である。 図３は、図１に示す落射視野絞りの構成を示す模式図である。 図４は、図１に示す落射視野絞りの構成を示す模式図である。 図５は、撮像範囲に照射される光の輝度プロファイルを示す模式図である。 図６は、図１に示す顕微鏡システムの動作を示すフローチャートである。 図７は、撮像範囲に照射される光の輝度分布の取得処理を示すフローチャートである。 図８は、撮像範囲に照射される光の好ましい輝度分布の例を示す模式図である。 図９は、本発明の実施の形態１における画像の貼り合わせ処理を示すフローチャートである。 図１０は、図９に示す画像の貼り合わせ処理を説明する模式図である。 図１１は、３×２のマトリックス状に画像を貼り合わせる場合を説明する模式図である。 図１２は、合成画像における輝度分布の補正処理を示すフローチャートである。 図１３は、合成画像における輝度分布の補正処理を説明する模式図である。 図１４は、本発明の実施の形態１の変形例１−１における視野絞りの配置を説明する模式図である。 図１５は、図１４に示す視野絞りの配置に応じた照射光の輝度プロファイルを示すグラフである。 図１６は、本発明の実施の形態２に係る顕微鏡システムの構成を示す図である。 図１７は、図１６に示す顕微鏡システムの動作を示すフローチャートである。 図１８は、本発明の実施の形態３に係る顕微鏡システムの構成を示す図である。 図１９は、図１８に示す相対位置補正部の構成を示すブロック図である。 図２０は、本発明の実施の形態３における画像の貼り合わせ処理を示すフローチャートである。 図２１は、隣接する２つの画像の重畳領域の一部を示す模式図である。 図２２は、図２１に示す重畳領域に対するシェーディング補正処理を説明する模式図である。 図２３は、シェーディング補正がなされた重畳領域を示す模式図である。 図２４は、本発明の実施の形態３の変形例３−１における重畳領域に対するシェーディング補正処理を説明する模式図である。

以下、本発明に係る撮像装置、顕微鏡システム、撮像方法及び撮像プログラムの実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。以下においては、本発明に係る撮像装置の一例として、撮像部が設けられた顕微鏡装置及び制御装置からなる顕微鏡システムの実施の形態を説明するが、これらの実施の形態により本発明が限定されるものではない。即ち、本発明は、撮像機能を備える各種機器に適用することができる。また、各図面の記載において、同一部分には同一の符号を附して示している。

（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１に係る顕微鏡システムを示す図である。図１に示すように、実施の形態１に係る顕微鏡システム１は、撮像部２００が設けられた顕微鏡装置２と、該顕微鏡装置２の動作を制御すると共に、撮像部２００から画像データを取り込んで所定の演算処理を施す制御装置３とを備える。

図２は、顕微鏡装置２の構成を示す模式図である。図２に示すように、顕微鏡装置２は、落射照明ユニット２１０及び透過照明ユニット２２０が設けられた略Ｃ字形のアーム２０１と、該アーム２０１に取り付けられ、被写体である試料ＳＰが載置される標本ステージ２０２と、鏡筒２０３と、該鏡筒２０３の一端側に三眼鏡筒ユニット２０４を介して標本ステージ２０２と対向するように設けられた対物レンズ２０５と、観察光路Ｌ上に設けられた蛍光キューブ２０６と、接眼レンズ２０７が設けられた接眼筒２０８と、標本ステージ２０２を移動させるステージ位置変更部２０９とを有する。撮像部２００は、鏡筒２０３の他端側に設けられており、三眼鏡筒ユニット２０４は、対物レンズ２０５から入射した試料ＳＰの観察光を、撮像部２００の方向と接眼筒２０８の方向とに分岐する。

落射照明ユニット２１０は、試料ＳＰに照射される落射照明光を発生する落射照明用光源２１１と、落射照明光を観察光路Ｌの方向に導く落射照明光学系とを備える。落射照明光学系は、コレクタレンズ２１２と、落射フィルタ２１３と、落射視野絞り２１４と、落射開口絞り２１５とを含む。このうち、落射視野絞り２１４及び落射開口絞り２１５には、各々の開口量を調節する開口調節部が設けられている。このような落射照明ユニット２１０から出射した落射照明光は、蛍光キューブ２０６において光路を折り曲げられ、標本ステージ２０２上の試料ＳＰに照射される。

図３及び図４は、落射視野絞り２１４の構成を示す模式図である。以下においては、落射照明光学系の光軸Ｌ１と平行な方向をＡｚ方向とし、該光軸Ｌ１と直交する面をＡｘ−Ａｙ面とする。また、図３及び図４においては、理解を助けるために、撮像部２００による撮像範囲Ｖを落射視野絞り２１４の開口面と同一平面上に示し、撮像範囲Ｖの上端に対応するＡｙ座標をＡｙ＝ｙ０としている。

ここで、本願において、撮像範囲とは、撮像部２００の視野に入る標本ステージ２０２上の試料ＳＰ面の領域のことをいう。また、標本ステージ２０２上の試料ＳＰの位置を基準とした場合の撮像範囲の相対的な座標を（ｕ，ｖ）とする。

落射視野絞り２１４は、Ｌ字型をなす２つの絞り部材２１４ａ、２１４ｂを組み合わせてなる方形視野絞りと、該落射視野絞り２１４の開口の大きさを調節する開口調節部２１４ｃとを備える。絞り部材２１４ａ、２１４ｂは、Ａｘ−Ａｙ面内において、光軸Ｌ１に対して対称且つ連動して移動可能に設けられている。開口調節部２１４ｃにより絞り部材２１４ａ、２１４ｂのいずれかの位置を調節することにより、方形をなす開口の大きさが変化する。

図３は、絞り部材２１４ａの開口端部２１４ｄの像が撮像範囲Ｖよりも大きくなるように、絞り部材２１４ａの開口の大きさを設定した状態を示す（Ａｙ＝ｙ１、ｙ１＞ｙ０）。一方、図４は、該開口端部２１４ｄの像が撮像範囲Ｖの周縁部と重なるように、絞り部材２１４ａの開口の大きさを設定した状態を示す（Ａｙ＝ｙ２、ｙ２＜ｙ０）。なお、図４においては、撮像範囲Ｖと絞り部材２１４ａ、２１４ｂとが重なっている領域に網掛けを附している。

透過照明ユニット２２０は、試料ＳＰに照射される透過照明光を発生する透過照明用光源２２１と、透過照明光を観察光路Ｌの方向に導く透過照明光学系とを備える。透過照明光学系は、コレクタレンズ２２２と、透過フィルタ２２３と、透過視野絞り２２４と、透過開口絞り２２５とを含む。このうち、透過視野絞り２２４及び透過開口絞り２２５には、各々の開口量を調節する開口調節部が設けられている。また、透過視野絞り２２４の構成は、図３及び図４に示すものと同様である。

このような透過照明ユニット２２０から出射した透過照明光は、反射ミラー２２６により光路を折り曲げられ、窓レンズ２２７及び透過コンデンサレンズ２２８を介して試料ＳＰに照射される。

対物レンズ２０５は、倍率が互いに異なる複数の対物レンズ（例えば、対物レンズ２０５、２０５’）を保持可能なレボルバ２３０に取り付けられている。このレボルバ２３０を回転させて、標本ステージ２０２と対向する対物レンズ２０５、２０５’を変更することにより、撮像倍率を変化させることができる。

レボルバ２３０にはエンコーダが設けられており、該エンコーダの出力値が制御装置３に入力される。制御装置３は、該エンコーダの出力値に基づいて、試料ＳＰと対向している対物レンズ（例えば、対物レンズ２０５）の倍率、即ち、顕微鏡装置２における観察倍率を取得することができる。

さらに、細やかな倍率変化を実現するために、鏡筒２０３の内部には、複数のズームレンズと、これらのズームレンズの位置を変化させる駆動部（いずれも図示せず）とを含むズーム部が設けられていてもよい。ズーム部は、各ズームレンズの位置を調整することにより、被写体像を拡大又は縮小させる。なお、鏡筒２０３内の駆動部にエンコーダをさらに設けても良い。この場合、エンコーダの出力値を制御装置３に出力し、制御装置３において、エンコーダの出力値からズームレンズの位置を検出して撮像倍率を自動算出するようにしても良い。

蛍光キューブ２０６は、顕微鏡装置２において蛍光観察を行う際に観察光路Ｌに配置される。蛍光キューブ２０６は、落射照明用光源２１１から出射してコレクタレンズ２１２〜落射開口絞り２１５を含む落射照明光学系を通過した光のうち、特定の波長帯域を有する光（励起光）を選択的に透過させる励起フィルタ２３１と、励起フィルタ２３１を透過した光を試料ＳＰの方向に反射すると共に、試料ＳＰの方向から入射する光を透過させるダイクロイックミラー２３２と、試料ＳＰの方向から入射する光のうち、特定の波長帯域を有する光（蛍光）のみを選択的に透過させる吸収フィルタ２３３とをキューブ状に組み合わせた光学部材である。なお、顕微鏡装置２において透過明視野観察を行う場合、蛍光キューブ２０６は観察光路Ｌから外れた位置に移動させられる。

ステージ位置変更部２０９は、例えばモータ２３４、２３５を含み、制御装置３の制御の下で標本ステージ２０２の位置をＸＹ平面内で移動させることにより、試料ＳＰに対する撮像範囲を相対的に変化させると共に、標本ステージ２０２をＺ軸に沿って移動させることにより、対物レンズ２０５の焦点を試料ＳＰに合わせる。

また、ステージ位置変更部２０９には、標本ステージ２０２の位置を検出して検出信号を制御装置３に出力する位置検出部２３６が設けられている。位置検出部２３６は、例えばモータ２３４の回転量を検出するエンコーダによって構成される。或いは、ステージ位置変更部２０９を、制御装置３の制御の下でパルスを発生するパルス発生部とステッピングモータとによって構成しても良い。

撮像部２００は、例えばＣＣＤやＣＭＯＳ等の撮像素子を含み、該撮像素子が備える各画素において画素レベル（画素値）として輝度値Ｙを出力するモノクロ画像を撮像可能なカメラ、或いはＲ（赤）、Ｇ（緑）、Ｂ（青）の各バンドにおける画素レベル（画素値）を持つカラー画像を撮像可能なカメラであり、制御装置３の制御に従って、所定のタイミングで動作する。撮像部２００は、対物レンズ２０５から鏡筒２０３内の光学系を介して入射した光（観察光）を受光し、観察光に対応する画像データを生成して制御装置３に出力する。或いは、撮像部２００は、ＲＧＢ色空間で表された画素値を、ＹＣｂＣｒ色空間で表された画素値に変換して制御装置３に出力しても良い。

再び図１を参照すると、制御装置３は、当該制御装置３に種々の命令や情報を入力する際に用いられる入力部３１と、撮像部２００から画像データを取得する画像取得部３２と、記憶部３３と、画像取得部３２により取得された画像データに所定の画像処理を施すと共に種々の演算処理を行う演算部３４と、演算部３４により画像処理が施された画像を出力する出力部３５と、これらの各部を統括的に制御する制御部３６とを備える。

入力部３１は、キーボード、各種ボタン、各種スイッチ等の入力デバイスや、マウスやタッチパネル等のポインティングデバイスを含み、ユーザにより外部からなされた操作に応じた信号を制御部３６に入力する。

画像取得部３２は、撮像部２００等の外部機器と接続可能なインタフェースであり、撮像部２００が生成した画像データを順次取得する。

記憶部３３は、更新記録可能なフラッシュメモリ、ＲＡＭ、ＲＯＭといった半導体メモリ等の記録装置や、内蔵若しくはデータ通信端子で接続されたハードディスク、ＭＯ、ＣＤ−Ｒ、ＤＶＤ−Ｒ等の記録媒体及び該記録媒体への情報の書き込み及び読み取りを行う書込読取装置を含む記録装置等によって構成される。記憶部３３は、演算部３４により画像処理が施された画像データを記憶する画像データ記憶部３３１を備える。

演算部３４は、撮像範囲に照射される光（以下、単に照射光ともいう）の輝度分布を推定する照明輝度分布推定部３４１と、顕微鏡装置２において撮像を１回行う毎に標本ステージ２０２を移動させる移動量（以下、ステージ移動量という）等を決定する位置決め部３４２と、撮像範囲が異なる複数の画像を貼り合わせて合成画像を作成する画像合成部３４３と、画像合成部３４３により作成された合成画像における輝度分布を補正する画像輝度分布補正部３４４とを備える。

照明輝度分布推定部３４１は、顕微鏡装置２において輝度分布測定用の標準サンプルを撮像することにより取得された画像に基づき、試料ＳＰを観察する際に照射する光の輝度分布を推定し、該光の輝度分布情報を作成する。

位置決め部３４２は、照明輝度分布推定部３４１により推定された輝度分布に基づき、上記ステージ移動量を決定する他、該ステージ移動量に基づき、画像合成部３４３において隣接する画像同士を貼り合わせる際の「のりしろ」に相当する画像領域の座標値を決定する。以下、「のりしろ」に相当する画像領域のことを、重畳領域という。

画像合成部３４３は、撮像範囲を変化させながら試料ＳＰを順次撮像することにより取得された複数の画像を貼り合わせることにより、広視野の合成画像を作成する。より詳細には、画像合成部３４３は、各画像から画像の合成に用いる領域をトリミングするトリミング部３４３ａと、トリミングされた画像同士を貼り合わせる合成部３４３ｂとを備える。

画像輝度分布補正部３４４は、照明輝度分布推定部３４１により推定された照射光の輝度分布に基づき、複数の画像を貼り合わせた合成画像における輝度分布を補正する。より詳細には、画像輝度分布補正部３４４は、照射光の輝度分布に基づき、画像を貼り合わせた重畳領域に生じる輝度ムラを算出する輝度ムラ算出部３４４ａと、算出した輝度ムラを補正するための補正ゲインを算出する補正ゲイン算出部３４４ｂと、該補正ゲインを用いて合成画像の重畳領域における輝度ムラを補正する補正部３４４ｃとを備える。

出力部３５は、演算部３４において作成された合成画像やその他所定の情報を、例えばＬＣＤ、ＥＬディスプレイ又はＣＲＴディスプレイ等の外部機器に出力する外部インタフェースである。なお、実施の形態１においては、合成画像等を表示する表示装置を顕微鏡システム１の外部に設けているが、顕微鏡システム１の内部に設けても良い。

制御部３６は、入力部３１から入力される各種命令や、顕微鏡装置２から入力される各種情報に基づき、顕微鏡システム１全体の動作を統括的に制御する。また、制御部３６は、照明輝度分布制御部３６１と、ステージ位置制御部３６２とを備える。

照明輝度分布制御部３６１は、照明輝度分布推定部３４１が作成した輝度分布情報に基づき、落射視野絞り２１４又は透過視野絞り２２４の開口の大きさを調節するための視野絞り制御信号を出力することにより、撮像範囲に照射される光の輝度分布を制御する。

図５は、撮像範囲Ｖにおける照射光の輝度プロファイルを示す模式図である。なお、図５は、対物レンズ２０５の光軸Ｌ０を通るｕ方向における輝度プロファイルを示している。ここで、一般的な顕微鏡装置においては、図３に示すように、落射視野絞り２１４（又波透過視野絞り２２４）の開口端部２１４ｄの像が撮像範囲Ｖと重ならないように、絞り部材２１４ａ、２１４ｂの位置（例えば、図３に示すＡｙ＝ｙ１）が決定される。或いは、開口端部２１４ｄを撮像範囲Ｖと隣接させて配置する場合もある。この場合、図５に示すように、照射光は、撮像範囲Ｖの端部（ｕ＝ｕ_min、ｕ_max）においても十分な強度が保たれる。

一方、実施の形態１においては、図４に示すように、落射視野絞り２１４（又は透過視野絞り２２４）の開口端部２１４ｄの像が撮像範囲Ｖ内の周縁領域に重なるように、絞り部材２１４ａ、２１４ｂの位置（例えば、図４に示すＡｙ＝ｙ２）を決定する。それにより、周縁領域において照射光を内側から外側に向かって徐々に減衰させる。好ましくは、撮像範囲Ｖの端部において、照射光の強度がゼロになるようにする。

即ち、実施の形態１においては、落射視野絞り２１４又は透過視野絞り２２４と、これらの視野絞りの開口の大きさを制御する照明輝度分布制御部３６１とが、撮像範囲Ｖに照射される光の輝度分布を制御する照明制御手段を構成する。

ステージ位置制御部３６２は、試料ＳＰが載置された標本ステージ２０２を対物レンズ２０５に対して相対的に移動させることにより、撮像範囲Ｖを変化させる撮像範囲移動制御手段である。ステージ位置制御部３６２は、位置決め部３４２が算出したステージ移動量に基づき、ステージ位置変更部２０９を動作させるためのステージ制御信号を出力することにより、撮像部２００の各撮像タイミングにおける標本ステージ２０２の位置を制御する。

なお、実施の形態１において、演算部３４及び制御部３６は、専用のハードウェアによって構成しても良いし、ＣＰＵ等のハードウェアに所定のプログラムを読み込むことによって構成しても良い。後者の場合、記憶部３３は、さらに、顕微鏡装置２及び制御装置３の動作をそれぞれ制御するための制御プログラムや、画像処理を含む各種演算処理を演算部３４に実行させるための画像処理プログラムや、これらのプログラムの実行中に使用される各種パラメータ及び設定情報を記憶する。

次に、顕微鏡システム１の動作について説明する。図６は、顕微鏡システム１の動作を示すフローチャートである。以下においては、蛍光染色が施された試料ＳＰに対し、落射照明光学系を介して励起光を照射し、該試料ＳＰから発生した蛍光の画像（蛍光観察画像）を取得する場合を説明する。

まず、ステップＳ１０において、試料ＳＰを観察する際の観察倍率を設定する。具体的には、レボルバ２３０を回転させ、所望の倍率の対物レンズ２０５を標本ステージ２０２と対向する位置に配置する。

続くステップＳ１１において、顕微鏡システム１は、撮像部２００の撮像範囲に照射される光（励起光）の輝度分布を取得する。図７は、撮像範囲に照射される光の輝度分布の取得処理を示すフローチャートである。本ステップＳ１１においては、顕微鏡装置２の標本ステージ２０２に、励起光の強度に応じた蛍光を均一に発生可能な蛍光試料を、標準サンプルとしてセットしておく。

図７のステップＳ１１１において、照明輝度分布制御部３６１は、視野絞り制御信号を出力し、落射視野絞り２１４の開口の大きさ（絞り部材２１４ａ、２１４ｂの位置）を調節する。なお、落射視野絞り２１４の調節開始時には、初期設定として、開口の大きさを最大値にしておく。

続くステップＳ１１２において、制御部３６は、標本ステージ２０２にセットされた標準サンプルを撮像部２００に撮像させる。

ステップＳ１１３において、演算部３４は、撮像部２００から出力された画像データに基づき、標準サンプルの画像を取得する。

ステップＳ１１４において、照明輝度分布推定部３４１は、標準サンプルの画像を構成する各画素の輝度値から、撮像範囲に照射された励起光の輝度分布を推定し、輝度分布情報を作成する。この際、励起光強度と蛍光強度との間の相関関係に基づきこの推定を実施する。

ステップＳ１１５において、照明輝度分布制御部３６１は、照明輝度分布推定部３４１が作成した輝度分布情報に基づいて、撮像範囲に照射された励起光の輝度分布が適正であるか否かを判定する。なお、この判定は、ユーザが標準サンプルの画像を見て判定しても良い。

ここで、図８は、撮像範囲に照射される光（励起光）の好ましい輝度分布の例を示す模式図である。なお、図８に示す輝度プロファイルＰ１は、撮像範囲Ｖ１に照射される励起光のｕ方向（ｕ(1)_min≦ｕ≦ｕ(1)_max）におけるプロファイルを示している。

図８に示すように、励起光の輝度分布は、撮像範囲Ｖ１内の周縁領域において内側から外側に向かって減衰し、端部（ｕ＝ｕ(1)_min、ｕ(1)_max）又は該端部の内側で強度がゼロとなる場合に、適正であると判定される。以下、撮像範囲Ｖ１において励起光の強度が概ね一定の中央部の領域を平坦領域といい、強度がゼロの領域を遮光領域という。また、光を減衰させる周縁領域のことを減衰領域ともいう。図８においては、撮像範囲Ｖ１の遮光領域に網掛けを附している。なお、撮像範囲Ｖ１の端部において励起光の強度がちょうどゼロとなるように、減衰領域における減衰率を制御しても良く、この場合、遮光領域は生じない。

輝度分布が適正である場合（ステップＳ１１５：Ｙｅｓ）、処理はメインルーチンに戻る。一方、輝度分布が適正でない場合（ステップＳ１１５：Ｎｏ）、処理はステップＳ１１１に戻る。この場合、続くステップＳ１１１において、照明輝度分布制御部３６１は、ステップＳ１１４において推定された輝度分布に基づき、輝度分布が適正な方向にシフトするように落射視野絞り２１４を調節する。

ステップＳ１１に続くステップＳ１２において、位置決め部３４２は、ステップＳ１１において取得された最終的な輝度分布に基づき、撮像１回あたりのステージ移動量、及び撮像範囲が隣接する画像同士を貼り合わせる際の「のりしろ」である重畳領域の座標値を決定する。

図８に示すように、ｕ方向に対応する標本ステージ２０２のＸ方向におけるステージ移動量ΔＸは、撮像範囲Ｖ１の一端（ｕ＝ｕ(1)_min又はｕ(1)_max）から隣接する撮像範囲Ｖ２の一端（ｕ＝ｕ(2)_min又はｕ(2)_max）までの距離に対応する。このステージ移動量ΔＸは、隣接する撮像範囲Ｖ１、Ｖ２の間で輝度プロファイルＰ１の減衰領域同士が重複するように決定される。より詳細には、撮像範囲Ｖ１、Ｖ２において重複する領域Ｃにおける励起光の累積光量が、平坦領域における強度と同程度となるように、輝度プロファイルＰ１をもとにステージ移動量ΔＸが決定される。

また、位置決め部３４２は、撮像範囲Ｖ１、Ｖ２間で重複する領域Ｃに対応する画像上の領域を重畳領域として決定し、画像上の座標系における重畳領域の座標値を取得する。
位置決め部３４２は、同様にして、Ｙ方向におけるステージ移動量及び重畳領域の座標値を決定する。

ステップＳ１３において、顕微鏡システム１は、標本ステージ２０２にセットされた観察対象の試料ＳＰを、撮像範囲を変化させながら順次撮像する。即ち、ステップＳ１１において取得された輝度分布を有する励起光を試料ＳＰに照射して撮像を行い、その後、ステップＳ１２において決定されたステージ移動量だけ標本ステージ２０２を移動させるという動作を、試料ＳＰ全体を網羅するまで繰り返す。これにより、撮像部２００から、撮像範囲が異なる画像の画像データが順次出力される。

このとき、励起光の輝度分布は撮像範囲の周縁領域において減衰しているので、周縁領域に励起光が複数回照射されることによる累積光量は、平坦領域に照射される光量と同程度となる。即ち、試料ＳＰに照射される励起光の累積光量は、位置によらず、全域でほぼ一定となる。
なお、試料ＳＰの劣化を抑制するため、撮像（露光）時以外においては、試料ＳＰを遮光しておくことが望ましい。

ステップＳ１４において、演算部３４は、撮像部２００から出力された画像データに基づき、撮像範囲が異なる画像を順次取得する。この際、演算部３４は、画像データと共に各画像の撮像時における標本ステージ２０２の位置情報を位置検出部２３６（図２参照）から取得する。

ステップＳ１５において、画像合成部３４３は、ステップＳ１２において決定された重畳領域の座標値に基づき、順次入力される複数の画像を貼り合わせる。図９は、画像の貼り合わせ処理を示すフローチャートである。また、図１０は、画像の貼り合わせ処理を説明する模式図であり、ｕ方向において撮像範囲が隣接する画像Ｍ１、Ｍ２を貼り合わせる場合を示している。

まず、ステップＳ１５１において、トリミング部３４３ａは、順次入力される画像の各々に対し、合成に用いる領域を切り出すトリミングを行う。具体的には、図１０（ａ）に示すように、各画像Ｍ１、Ｍ２から平坦領域及び減衰領域に対応する画像領域をトリミングする（即ち、遮蔽領域に対応する画像領域ｍ１、ｍ２を除去する）ことにより、トリミング画像Ｍ１’、Ｍ２’を作成する。なお、撮像範囲の端部（ｕ＝ｕ_min、ｕ_max）において励起光強度がちょうどゼロになるように輝度分布を制御した場合、取得された画像に遮光領域は生じないので、ステップＳ１５１を省略しても良い。

続くステップＳ１５２において、合成部３４３ｂは、位置検出部２３６から取得した標本ステージ２０２の位置情報をもとに、トリミング画像Ｍ１’に対するトリミング画像Ｍ２’の相対位置を算出する。

ステップＳ１５３において、合成部３４３ｂは、位置決め部３４２が算出した重畳領域の座標値に基づき、画像Ｍ１’、Ｍ２’間で重ね合わせる重畳領域を決定する。

さらに、ステップＳ１５４において、合成部３４３ｂは、図１０（ｂ）に示すように、ステップＳ１５３において決定した重畳領域において互いに重なるように、画像Ｍ１’、Ｍ２’を貼り合わせる。

このような貼り合わせ処理を、撮像部２００から画像データが入力されるごとに順次行うことにより、広視野の合成画像が作成される。例えば、図１１に示すように、３×２のマトリックス状に並んだ撮像範囲に対しては、図１１の矢印で示すように、コの字状に撮像範囲を移動させながら撮像を行い、画像を取得した順に貼り合わせ処理を行う。即ち、ｕ方向にトリミング画像Ｍ１’〜Ｍ３’を順次貼り合わせた後、−ｖ方向にトリミング画像Ｍ４’を貼り合わせ、さらに、−ｕ方向にトリミング画像Ｍ５’、Ｍ６’を順次貼り合わせる。
その後、処理はメインルーチンに戻る。

ステップＳ１５に続くステップＳ１６において、画像輝度分布補正部３４４は、ステップＳ１５において作成された合成画像における輝度分布の補正を行う。図１２は、合成画像における輝度分布の補正処理を示すフローチャートである。また、図１３は、合成画像における輝度分布の補正処理を説明する模式図である。

まず、ステップＳ１６１において、輝度ムラ算出部３４４ａは、照明輝度分布推定部３４１から、標準サンプル（ステップＳ１１参照）を撮像した際に発生した蛍光の輝度分布を取得し、該輝度分布から、隣接する画像間で重畳領域同士を重ね合わせた場合に生じる輝度ムラを算出する。図１３（ａ）に示すように、蛍光強度Ｉ（ｕ）の蛍光強度Ｉ₀に対する差分が、ｕ方向における輝度ムラである。

続くステップＳ１６２において、補正ゲイン算出部３４４ｂは、ステップＳ１６１において算出された蛍光強度に基づき、重畳領域の各点における補正ゲインＧ（ｕ）を算出し、ゲインマップを作成する（図１３（ｂ）参照）。なお、画像輝度分布補正部３４４は、照明輝度分布推定部３４１が励起光の輝度分布を推定した時点で（ステップＳ１１参照）輝度分布情報を取り込み、ゲインマップを作成して保持しておいても良い。

ステップＳ１６３において、補正部３４４ｃは、ステップＳ１６２において作成されたゲインマップを用いて、合成画像の重畳領域における輝度ムラを補正する。
その後、処理はメインルーチンに戻る。

ステップＳ１６に続くステップＳ１７において、演算部３４は、作成した合成画像を出力し、表示装置等の外部機器に表示させると共に、記憶部３３に記憶させる。
その後、顕微鏡システム１の動作は終了する。

以上説明したように、実施の形態１によれば、撮像範囲内の周縁領域において照射光が減衰するように、該照射光の輝度分布を制御すると共に、隣接する撮像範囲同士が周縁領域において重なるように標本ステージ２０２を移動させながら撮像を行うので、周縁領域に対する照射光の累積光量を撮像範囲の中央部と同程度にすることができる。即ち、試料ＳＰに対する照射光の累積光量を全体的に均一にすることができるので、光照射に起因する試料ＳＰの局所的な劣化を抑制することが可能となる。

また、実施の形態１によれば、落射視野絞り２１４の開口端部の像が撮像範囲と重なるように開口の大きさを調節することにより、照射光の輝度分布を制御するので、撮像範囲に適合した光の照射が可能となる。

なお、上記実施の形態１においては、顕微鏡装置２において蛍光観察を行う場合について説明したが、透過観察、位相差観察、微分干渉観察等、顕微鏡装置２において行われる他の検鏡法にも上記実施の形態１を適用することができる。これらの場合、検鏡法に応じて、落射視野絞り２１４又は透過視野絞り２２４の開口の大きさを制御すれば良い。

また、上記実施の形態１においては、対物レンズ２０５を含む観察光学系の位置を固定し、試料ＳＰが載置された標本ステージ２０２を移動させることにより撮像視野を変化させたが、試料ＳＰ側を固定し、観察光学系側を移動させても良い。或いは、試料ＳＰ及び観察光学系の双方を相対的に移動させるようにしても良い。

（変形例１−１）
次に、本発明の実施の形態１の変形例１−１について説明する。
図１４は、本変形例１−１における視野絞りの配置を説明する模式図であり、図１５は、図１４に示す配置に応じた照射光の輝度プロファイルを示すグラフである。本変形例１−１においては、視野絞りの開口の大きさを調節すると共に、視野絞りの光軸方向における位置を調節することにより、照射光の輝度分布を制御する。

図１４に示すように、落射視野絞り２１４は通常、試料ＳＰと共役な位置Ａｚ＝ｚ０に配置される。この場合、図１５の破線に示すように、照射光の輝度分布の立ち上がりは比較的シャープであり、照射光の照射領域の境界におけるコントラストは明確である。

これに対し、本変形例１−１においては、落射視野絞り２１４を共役な位置Ａｚ＝ｚ０からずらして配置する（例えば、位置Ａｚ＝ｚ１）。これにより、図１５の実線に示すように、周縁領域における照射光の強度の立ち上がりがなだらかになり、減衰領域がＡｚ＝ｚ０の場合よりも広くなる。即ち、隣接する撮像範囲間で重複させる領域が広がるので、画像を貼り合わせる際の位置決め精度を向上させることが可能となる。

以上説明したように、変形例１−１によれば、落射視野絞り２１４のＡｚ方向における位置を調節することにより、減衰領域の幅や減衰領域における輝度の減衰率を所望の値に制御することができる。

なお、透過照明光学系を用いる場合には、透過視野絞り２２４の位置を光軸方向において調節することで、照射光の輝度分布を制御することができる。

（変形例１−２）
次に、本発明の実施の形態１の変形例１−２について説明する。
上記実施の形態１においては、遮光部材からなる絞り部材２１４ａ、２１４ｂ（図３及び図４参照）を用いて、落射視野絞り２１４及び透過視野絞り２２４を構成した。しかしながら、開口端部から離れるに従って透過率が連続的に変化（減少）する部材によって絞り部材２１４ａ、２１４ｂを形成しても良い。具体的には、ガラス等の透明部材に金属を蒸着することにより薄膜を形成し、この際の膜厚を調節することにより透過率を変化させることができる。

この場合、絞り部材２１４ａ、２１４ｂを光軸Ａｚ方向に沿って移動させることなく、撮像範囲の周縁領域において照射光を徐々に減衰させることができる。また、絞り部材２１４ａ、２１４ｂの透過率の大きさや透過率の変化率を適宜設計することにより、検鏡法や蛍光の種類に応じた照射光の輝度分布を実現することが可能となる。

（変形例１−３）
次に、本発明の実施の形態１の変形例１−３について説明する。
上記実施の形態１においては、標準サンプルを撮像した結果に基づいて、各種制御情報（視野絞りの位置情報、ステージ移動量、重畳領域の座標値）を取得したが、一様な蛍光を発するものであれば、観察対象の試料を用いてこれらの制御情報等を取得しても良い。この場合、試料内の観察対象領域の劣化を防ぐため、観察対象領域以外の領域を撮像すると良い。

（実施の形態２）
次に、本発明の実施の形態２について説明する。
図１６は、本発明の実施の形態２に係る顕微鏡システムの構成を示す図である。図１６に示すように、実施の形態２に係る顕微鏡システム４は、顕微鏡装置２及び制御装置５を備える。このうち、顕微鏡装置２の構成及び動作は、実施の形態１と同様である。

制御装置５は、図１に示す制御装置３に対し、テーブル記憶部５１１をさらに有する記憶部５１を備える。記憶部５１以外の制御装置５の各部の構成及び動作は、実施の形態１と同様である。

テーブル記憶部５１１は、顕微鏡装置２における観察倍率に応じた照射光の輝度分布と、該輝度分布を実現するための視野絞りの制御情報、即ち、絞り部材２１４ａ、２１４ｂのＡｘ、Ａｙ、Ａｚ方向における位置情報とが格納された輝度分布テーブルを記憶している。このような輝度分布テーブルは、当該顕微鏡装置２において事前に標準サンプルを撮像し、該撮像結果に基づいて作成しても良いし、別途実測又はシミュレーションを行った結果に基づいて作成しても良い。

次に、顕微鏡システム４の動作について説明する。図１７は、顕微鏡システム４の動作を示すフローチャートである。
まず、ステップＳ２０において、試料ＳＰを観察する際の観察倍率を設定する。具体的には、レボルバ２３０を回転させて、所望の倍率の対物レンズ２０５を標本ステージ２０２と対向する位置に配置する。これにより、レボルバ２３０に設けられたエンコーダの出力値が制御装置５に入力される。制御部３６は、該出力値に基づいて、顕微鏡装置２における観察倍率を取得する。

続くステップＳ２１において、制御部３６は、顕微鏡装置２における観察倍率に対応する照射光の輝度分布及び視野絞りの制御情報を、輝度分布テーブルから取得する。また、位置決め部３４２は、制御部３６が取得した照射光の輝度分布に基づいて、撮像１回あたりのステージ移動量、及び隣接する画像間における重畳領域の座標値を算出する。
続くステップＳ１３〜Ｓ１７の動作は、実施の形態１と同様である。

以上説明したように、実施の形態２によれば、予め作成された輝度分布テーブルから、観察倍率に応じた視野絞りの制御情報を取得するので、事前に標準サンプルを撮像して視野絞りの位置を調節するといった作業を行う必要がなくなる。従って、より短時間に試料ＳＰが写った広視野の画像を取得することが可能となる。

なお、上記実施の形態２においては、輝度分布テーブルから取得した照射光の輝度分布からステージ移動量及び重畳領域の座標値を算出することとしたが、ステージ移動量及び重畳領域の座標値についても、観察倍率と関連付け、予めテーブル化しておいても良い。

（実施の形態３）
次に、本発明の実施の形態３について説明する。
図１８は、本発明の実施の形態３に係る顕微鏡システムの構成を示す図である。図１８に示すように、実施の形態３に係る顕微鏡システム６は、顕微鏡装置２及び制御装置７を備える。このうち、顕微鏡装置２の構成及び動作は、実施の形態１と同様である。

制御装置７は、図１に示す制御装置３に対し、画像合成部３４３の代わりに画像合成部７１１を有する演算部７１を備える。画像合成部３４３以外の制御装置７の各部の構成及び動作は、実施の形態１と同様である。

画像合成部７１１は、画像取得部３２を介して取得された各画像から画像の合成に用いる領域をトリミングするトリミング部７１１ａと、隣接する画像間の重畳領域における特徴に基づいて画像間の相対位置を補正する相対位置補正部７１１ｂと、該相対位置補正部７１１ｂにより位置を補正された画像同士を貼り合わせる合成部７１１ｃとを備える。なお、トリミング部７１１ａの動作は、図１に示すトリミング部３４３ａと同様である。

ここで、顕微鏡システム６においては、実施の形態１と同様に、照射光の輝度分布に基づいてステージ移動量及び隣接する画像間の重畳領域の座標値を算出し、上記ステージ移動量に従って標本ステージ２０２を移動させながら撮像を行う。しかしながら、実際に撮像を連続的に行っていると、バックラッシュ等の影響により、標本ステージ２０２に位置ズレが生じることがある。このような場合に、照射光の輝度分布に基づいて算出された重畳領域の座標値を用いて、一律に画像の貼り合わせを行うと、貼り合わせ精度が低下してしまう。そこで、実施の形態３においては、実際に取得した画像の重畳領域から特徴領域を抽出し、該特徴領域をもとに個別に位置合わせを行うことにより、画像同士の貼り合わせ精度を向上させる。

図１９は、相対位置補正部７１１ｂの構成を示すブロック図である。図１９に示すように、相対位置補正部７１１ｂは、各画像の重畳領域にシェーディング補正を施すシェーディング補正部７１１ｂ−１と、シェーディング補正がなされた重畳領域から特徴領域を抽出する特徴領域抽出部７１１ｂ−２と、抽出された特徴領域をもとに、重畳領域間における相関の高い領域を探索する探索部７１１ｂ−３と、該探索の結果に基づいて、隣接する画像間の相対位置を補正する位置補正部７１１ｂ−４とを備える。

次に、顕微鏡システム６の動作について説明する。
顕微鏡システム６の動作は、全体として図６と同様であり、ステップＳ１５における画像の貼り合わせ処理が実施の形態１と異なる。図２０は、実施の形態３における画像の貼り合わせ処理を示すフローチャートである。なお、ステップＳ１５１〜Ｓ１５３の処理は、実施の形態１と同様である（図９参照）。

ステップＳ１５３に続くステップＳ３０１において、シェーディング補正部７１１ｂ−１は、各画像の重畳領域に対してシェーディング補正を行う。図２１は、隣接する２つの画像の重畳領域の一部を示す模式図である。このうち、図２１に示す重畳領域Ｃ１は、図８に示す撮像範囲Ｖ１の右端の領域Ｃに対応する画像領域であり、重畳領域Ｃ２は、撮像範囲Ｖ２の左端の領域Ｃに対応する画像領域である。また、図２２は、重畳領域に対するシェーディング補正処理を説明する模式図である。

ここで、輝度プロファイルＰ１に示すように、各撮像範囲Ｖ１、Ｖ２に照射される光は、周縁領域において内側から外側に向かって減衰するように制御されている。このため、互いに重ね合わせられる重畳領域Ｃ１、Ｃ２には、対照的なシェーディングが生じており、両者間の相関演算を行うことが困難である。そこで、シェーディング補正部７１１ｂ−１は、各重畳領域Ｃ１、Ｃ２に対してシェーディング補正を行うことにより、輝度を規格化する。

具体的には、照射光の輝度プロファイルＰ１をもとに、重畳領域Ｃ１及び重畳領域Ｃ２に対し、図２２（ａ）に示すように、シェーディング成分の輝度プロファイルｐ１、ｐ２を事前にそれぞれ求めておく。そして、図２２（ｂ）に示すように、重畳領域Ｃ１に対しては、シェーディング成分の輝度プロファイルｐ１の中央値Ｉ_medを基準に、画像の内側（図の左側）で輝度を低下させ、画像の外側（図の右側）で輝度を上昇させる補正ゲインを適用する。一方、重畳領域Ｃ２に対しては、シェーディング成分の輝度プロファイルｐ２の中央値Ｉ_medを基準に、画像の内側（図の右側）で輝度を低下させ、画像の外側（図の左側）で輝度を上昇させる補正ゲインを適用する。このように、シェーディング成分の輝度プロファイルｐ１、ｐ２における中央値Ｉ_medを基準に各重畳領域Ｃ１、Ｃ２におけるゲインを調整することにより、暗部からのゲインアップの比率を少なくすることができるので、ノイズの発生を抑制することができる。

続くステップＳ３０２において、特徴領域抽出部７１１ｂ−２は、図２３に示すように、シェーディング補正がなされた重畳領域Ｃ１’、Ｃ２’のいずれかから、位置合わせに用いる特徴領域ｃ_n（ｎ＝１、２、…）を抽出する。図２３は、重畳領域Ｃ１’から２つの特徴領域ｃ₁、ｃ₂を抽出した例を示している。

ステップＳ３０３において、探索部７１１ｂ−３は、一方の重畳領域Ｃ１’から抽出した特徴領域ｃ_nをもとに他方の重畳領域Ｃ２’を探索し、特徴領域ｃ_nと相関の高い領域ｃ_n’を検出する。

ステップＳ３０４において、位置補正部７１１ｂ−４は、図２２（ｃ）に示すように、ステップＳ３０３における検出結果に基づき、重畳領域Ｃ１’、Ｃ２’間の位置ズレ量を算出し、該位置ズレ量の分だけ、重畳領域Ｃ１、Ｃ２をそれぞれ含む画像同士を貼り合わる際の相対位置座標を補正する。

ステップＳ３０５において、シェーディング補正部７１１ｂ−１は、各重畳領域Ｃ１、Ｃ２に対し、ステップＳ３０１において行った補正したシェーディングを復元する。

ステップＳ３０６において、合成部３４３ｂは、ステップＳ３０４において補正した相対位置座標に基づいて、重畳領域Ｃ１、Ｃ２をそれぞれ含む画像同士を貼り合わせる。
その後、処理はメインルーチン（図６参照）に戻る。

以上説明したように、実施の形態３によれば、シェーディング補正により各重畳領域における輝度を規格化するので、重畳領域に存在する特徴領域に基づく相関演算を行うことができるようになる。従って、隣接する画像同士を貼り合わせる際の位置ズレを補正し、貼り合わせ精度を向上させることが可能となる。特に、蛍光画像のバックグラウンドは、特徴量の乏しい暗黒の領域であるため、重畳領域から抽出した特徴領域を相関演算の窓とすることにより、画像間の位置ズレ量を正確に算出することが可能となる。
なお、実施の形態３における画像の貼り合わせ処理を、実施の形態２に適用しても良い。

（変形例３−１）
次に、本発明の実施の形態３の変形例３−１について説明する。
上記実施の形態３においては、シェーディング成分の輝度プロファイルｐ１、ｐ２の中央値Ｉ_medを基準に補正ゲインを決定した。しかしながら、図２４（ａ）、（ｂ）に示すように、シェーディング成分の輝度プロファイルｐ１、ｐ２の最大値Ｉ_maxを基準として、低輝度側のゲインを上げるようにシェーディング補正行っても良い。

この場合、図２４（ｃ）に示すように、十分な輝度を有する特徴領域ｃ_nに基づいて相関演算を行うことができるので、画像間の位置ズレ量をさらに正確に算出することができる。

本発明は、上述した各実施の形態１〜３及び変形例そのままに限定されるものではなく、各実施の形態１〜３及び変形例に開示されている複数の構成要素を適宜組み合わせることによって、種々の発明を形成することができる。例えば、実施の形態１〜３及び変形例に示される全構成要素からいくつかの構成要素を除外して形成してもよい。或いは、異なる実施の形態に示した構成要素を適宜組み合わせて形成してもよい。

１、４、６ 顕微鏡システム
２ 顕微鏡装置
３、５、７ 制御装置
３１ 入力部
３２ 画像取得部
３３、５１ 記憶部
３４、７１ 演算部
３５ 出力部
３６ 制御部
２００ 撮像部
２０１ アーム
２０２ 標本ステージ
２０３ 鏡筒
２０４ 三眼鏡筒ユニット
２０５ 対物レンズ
２０６ 蛍光キューブ
２０７ 接眼レンズ
２０８ 接眼筒
２０９ ステージ位置変更部
２１０ 落射照明ユニット
２１１ 落射照明用光源
２１２ コレクタレンズ
２１３ 落射フィルタ
２１４ 落射視野絞り
２１４ａ、２１４ｂ 絞り部材
２１４ｃ 開口調節部
２１４ｄ 開口端部
２１５ 落射開口絞り
２２０ 透過照明ユニット
２２１ 透過照明用光源
２２２ コレクタレンズ
２２３ 透過フィルタ
２２４ 透過視野絞り
２２５ 透過開口絞り
２２６ 反射ミラー
２２７ 窓レンズ
２２８ 透過コンデンサレンズ
２３０ レボルバ
２３１ 励起フィルタ
２３２ ダイクロイックミラー
２３３ 吸収フィルタ
２３４、２３５ モータ
２３６ 位置検出部
３３１ 画像データ記憶部
３４１ 照明輝度分布推定部
３４２ 位置決め部
３４３、７１１ 画像合成部
３４３ａ、７１１ａ トリミング部
３４３ｂ、７１１ｃ 合成部
３４４ 画像輝度分布補正部
３４４ａ 輝度ムラ算出部
３４４ｂ 補正ゲイン算出部
３４４ｃ 補正部
３６１ 照明輝度分布制御部
３６２ ステージ位置制御部
５１１ テーブル記憶部
７１１ｂ 相対位置補正部
７１１ｂ−１ シェーディング補正部
７１１ｂ−２ 特徴領域抽出部
７１１ｂ−３ 探索部
７１１ｂ−４ 位置補正部

Claims (13)

1. 撮像範囲内の被写体を撮像して画像データを生成する撮像手段と、
   前記撮像範囲に照射される光を発生する照明手段と、
   前記撮像範囲内の周縁領域において前記光が減衰するように、前記光の輝度分布を制御する照明制御手段と、
   前記被写体に対する前記撮像範囲を順次変化させる撮像範囲移動制御手段と、
   前記撮像範囲が異なる複数の画像の画像データを前記撮像手段から順次取得し、前記複数の画像を貼り合わせて合成画像を作成する演算手段と、
   を備え、
   前記撮像範囲移動制御手段は、互いに隣接する撮像範囲において、前記光が減衰する前記周縁領域同士が重複するように、前記撮像範囲を変化させ、
   前記演算手段は、前記互いに隣接する撮像範囲にそれぞれ対応する画像を、前記周縁領域に対応する画像領域同士が重複するように貼り合わせる、
   ことを特徴とする撮像装置。
2. 前記照明制御手段は、前記照明手段から前記被写体までの前記光の光路に設けられた視野絞りを備えることを特徴とする請求項１に記載の撮像装置。
3. 前記照明制御手段は、前記視野絞りの開口端部の像が前記撮像範囲の周縁部と重なるように、前記視野絞りの開口の大きさを調節する開口調節手段をさらに含み、
   前記撮像範囲移動制御手段は、前記開口の大きさに応じて前記撮像範囲を順次変化させる、
   ことを特徴とする請求項２に記載の撮像装置。
4. 前記照明制御手段は、前記視野絞りを前記照明手段の光軸に沿って移動させる位置調節手段をさらに含み、
   前記撮像範囲移動制御手段は、前記視野絞りの前記光軸方向における位置に応じて前記撮像範囲を順次変化させる、
   ことを特徴とする請求項２又は３に記載の撮像装置。
5. 前記視野絞りは、開口端部から離れるに従って前記光の透過率が連続的に変化する部材によって形成されていることを特徴とする請求項３に記載の撮像装置。
6. 前記演算手段は、さらに、前記互いに隣接する撮像範囲にそれぞれ対応する画像の前記画像領域から特徴領域を抽出し、該特徴領域に基づいて、前記対応する画像同士の位置合わせを行うことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の撮像装置。
7. 前記演算手段は、前記互いに隣接する撮像範囲にそれぞれ対応する画像の前記画像領域に対してシェーディング補正を行い、シェーディング補正済みの前記画像領域に基づいて前記位置合わせを行うことを特徴とする請求項６に記載の撮像装置。
8. 前記演算手段は、前記画像領域におけるシェーディング成分の最大値を基準として、前記シェーディング補正におけるゲインを決定することを特徴とする請求項７に記載の撮像装置。
9. 前記演算手段は、前記画像領域におけるシェーディング成分の中央値を基準として、前記シェーディング補正におけるゲインを決定することを特徴とする請求項７に記載の撮像装置。
10. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の撮像装置と、
    前記被写体が載置されるステージと、
    前記ステージと対向して設けられた対物レンズと、
    を備えることを特徴とする顕微鏡システム。
11. 前記被写体は、蛍光観察用の染色が施された試料であり、
    前記照明手段は、前記試料を励起する励起光を発生する落射照明手段である、
    ことを特徴とする請求項１０に記載の顕微鏡システム。
12. 撮像手段の撮像範囲内の周縁領域において光が減衰するように、該光の輝度分布を制御する輝度分布制御ステップと、
    輝度分布が制御された前記光を前記撮像範囲に照射する光照射ステップと、
    前記光が照射された前記撮像範囲内の被写体を撮像して画像データを生成する撮像ステップと、
    前記被写体に対する前記撮像範囲を順次変化させる撮像範囲移動制御ステップと、
    前記撮像ステップにおいて生成された画像データに基づき、前記撮像範囲が異なる複数の画像を順次取得し、該複数の画像を貼り合わせて合成画像を作成する演算ステップと、
    を含み、
    前記撮像範囲移動制御ステップは、互いに隣接する撮像範囲において、前記光が減衰する前記周縁領域同士が重複するように、前記撮像範囲を変化させ、
    前記演算ステップは、前記互いに隣接する撮像範囲にそれぞれ対応する画像を、前記周縁領域に対応する画像領域同士が重複するように貼り合わせる、
    ことを特徴とする撮像方法。
13. 撮像手段の撮像範囲内の周縁領域において光が減衰するように、該光の輝度分布を制御する輝度分布制御ステップと、
    照明手段に、輝度分布が制御された前記光を前記撮像範囲に照射させる光照射ステップと、
    撮像手段に、前記光が照射された前記撮像範囲内の被写体を撮像させ、画像データを生成させる撮像ステップと、
    前記被写体に対する前記撮像範囲を順次変化させる撮像範囲移動制御ステップと、
    前記撮像ステップにおいて生成された画像データに基づき、前記撮像範囲が異なる複数の画像を順次取得し、該複数の画像を貼り合わせて合成画像を作成する演算ステップと、
    をコンピュータに実行させ、
    前記撮像範囲移動制御ステップは、互いに隣接する撮像範囲において、前記光が減衰する前記周縁領域同士が重複するように、前記撮像範囲を変化させ、
    前記演算ステップは、前記互いに隣接する撮像範囲にそれぞれ対応する画像を、前記周縁領域に対応する画像領域同士が重複するように貼り合わせる、
    ことを特徴とする撮像プログラム。

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