JP2015033336A - 無タンパク質・無脂質培地馴化細胞株、その製造方法及び培地 - Google Patents
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Abstract
Description
〔2〕 細胞株が受託番号NITE P−01641である、前記〔1〕記載の細胞;
〔3〕 株化されたCHO細胞由来の無タンパク質・無脂質培地馴化細胞を培養するための無タンパク質・無脂質培地であって、通常の3〜5倍のグルコースを含有するDMEM培地に、さらにプトレッシン、チミジン、ヒポキサンチン及びモノエタノールアミンを含有し、外因性の増殖因子を含有しないことを特徴とする培地;
〔4〕 2000〜5000mg/Lのグルコース、0.001〜2mg/Lのプトレッシン、0.01〜1mg/Lのチミジン、0.1〜10mg/Lのヒポキサンチン及び0.1〜5mg/Lのモノエタノールアミンを含有する、前記〔3〕記載の無タンパク質・無脂質培地;
〔5〕 1〜20mg/Lのインスリンをさらに含む、前記〔3〕又は〔4〕記載の無タンパク質・無脂質培地;
〔6〕 前記〔3〕〜〔5〕のいずれか1項記載の培地を製造するための組成物であって、培地として使用する際の各成分の最終濃度が、DMEM培地の組成に、2000〜5000mg/Lのグルコース、0.001〜2mg/Lのプトレッシン、0.01〜1mg/Lのチミジン、0.1〜10mg/Lのヒポキサンチン及び0.1〜5mg/Lのモノエタノールアミンを含有することとなるようにこれらの各成分を含む組成物;
〔7〕 CHO細胞を、前記〔3〕〜〔5〕のいずれか1項記載の培地で継代培養する工程を含む、前記〔1〕記載の馴化細胞株の作製方法;
〔8〕 CHO細胞を、タンパク質及び/又は脂質あるいはそれらを含む添加物を含有する培地で培養する工程の後、前記〔3〕〜〔5〕のいずれか1項記載の培地で継代培養する工程を含む、前記〔7〕記載の方法;
〔9〕 タンパク質及び/又は脂質あるいはそれらを含む添加物を含有する培地で培養する工程を、タンパク質及び/又は脂質あるいはそれらを含む添加物の含有量を次第に下げながら行う、前記〔8〕記載の方法;
〔10〕 CHO細胞を、前記〔3〕〜〔5〕のいずれか1項記載の培地で培養する工程の後、タンパク質及び/又は脂質あるいはそれらを含む添加物を含有する培地で培養する工程を行い、その後再び前記〔3〕〜〔5〕のいずれか1項記載の培地で培養する工程を含む、前記〔7〕〜〔10〕のいずれか1項記載の馴化細胞株の作製方法。
本発明の無タンパク質・無脂質培地は、DMEM培地を改変したものである。DMEM培地は、元株のCHO細胞が血清添加DMEM培地で長期間継代されているため、元株のCHO細胞はDMEM培地の培地組成に適応しており、容易に馴化できる可能性が高いと考えられたため、これを基本の培地として使用した。
元株のCHO細胞は、市販のものを入手して使用することができる。通常、血清を添加した培地で維持培養されているCHO細胞を、次第に血清の添加量を低下させながら継代培養し、最終的には血清及び増殖因子を含まない培地で安定的に増殖するようになるまで馴化させる。この馴化の過程において使用する培地としては、DMEM培地等の標準的な培地を用いることができるが、無血清状態での安定的な増殖性を得るために、本発明のNPL培地を使用することが好ましい。また、インスリン及び/又はGM3を添加したNPL培地は、より短期間で馴化させることができるので、好ましい。
本発明の無タンパク質・無脂質培地馴化細胞株は、所望のタンパク質をコードする遺伝子を導入することにより、組換えタンパク質の生産に使用することができる。導入遺伝子を担持するベクターの製造法及び遺伝子導入法は、CHO細胞に適用可能な方法であれば特に制限はなく、当該技術分野で用いられている方法を使用することができる。本発明の無タンパク質・無脂質培地馴化細胞株は、大容量の浮遊系で培養することができ、CHO細胞と比較して数倍のタンパク質生産性を有するので、トランジェント法でも十分に生産量を確保できる。組換えタンパク質を生産する場合、培地としては、DMEM、NPLなどの任意の無タンパク質・無脂質培地培地を使用することができるが、トランスフェクション前の培養において、GM3及び/又はインスリンを添加して培養し、トランスフェクションを行う際にはGM3を含まない培地中で行うことにより、効率的に組換えタンパク質生産を行うことができる。
以下のようにして、培地馴化法を用い、2種類のCHO細胞株を樹立した。
培地馴化法のために用いたCHO−K1細胞は、欧州細胞カルチャーコレクション(European Collection of Cell Cultures;ECACC)より購入した。この細胞は、10%ウシ胎児血清(Fetal bovine serum;FBS)を添加したダルベッコ改変イーグル(Dulbecco’s Modified Eagle’s MEM;DMEM)培地(極東製薬工業)で維持培養を行った。
CHO細胞に培地馴化法を試みるに当って、培地としては、表1に示すDMEM培地(極東製薬工業)及びNPL培地を使用した。
(3−1)DMEM培地による馴化
DMEM培地による馴化は次の手順に従った(図1、パネルA)。まず、元株細胞の維持培地である10%FBS添加DMEM培地から、血清濃度が3%になるまで、順次、血清濃度を下げて約1週間培養を行った。さらに1ヶ月の間、1%FBS添加DMEM培地で培養を継続した。細胞増殖性が安定するまで1%FBS添加DMEM培地で培養を行い、安定した段階で血清の添加を止めて培養した。
NPL培地による馴化は次の手順に従った(図1、パネルB)。まず、元株細胞の維持培地である10%FBS添加DMEM培地から、血清濃度が3%になるまで、順次、血清濃度を下げてDMEM培地で約1週間培養を行った。さらに2週間の間、1%FBS添加NPL培地に移し替えて培養を継続した。細胞増殖性が安定するまで1%FBS添加NPL培地で培養を行い、安定した段階で血清の添加を止めて培養した。
DMEM培地及びNPL培地のいずれを用いた場合も、馴化細胞株を樹立することができた。樹立した馴化株の細胞と元株の細胞の形態を図2に示す。継代培養中のNPLAd CHO細胞(パネルA)及びDMAd CHO細胞(パネルB)、ならびに元株のCHO−K1細胞株(パネルC)を、倒立位相差顕微鏡で観察した(倍率100倍)。元株であるCHO細胞は敷石状に増殖するのに対して(パネルC)、無タンパク質・無脂質培地に馴化したDMAd CHO細胞(パネルB)及びNPLAd CHO細胞(パネルA)は、単一で又は集塊状に浮遊していた。通常、CHO細胞の浮遊化には振とうや、界面活性剤などの浮遊剤の添加が必要であるが、馴化株の細胞はこのような操作を加えなくとも集塊状に浮遊培養することができた。
一般的に血清を用いて培養されている接着系細胞では、自らが出しているインテグリンなどの細胞接着因子でフィブロネクチンなどの血清中のECMを介して結合することで培養器壁に接着する。馴化細胞の培養形態が接着性から浮遊形態に至った原因は、無タンパク質・無脂質培地からECMが供給されていないことである可能性がある。そこで、フィブロネクチン、I型コラーゲン等のECM及びアルブミンでコートしたプレートにNPLAd CHO細胞を播種、培養することにより、NPLAd CHO細胞が接着形態に戻るかを観察した。
以下の培養基質を用いた:(1)フィブロネクチンコート24ウェルプレート(日本ベクトン・ディッキンソン社製、「フィブロネクチンコート24ウェルプレート」)、(2)I型コラーゲンコート24ウェルプレート(日本ベクトン・ディッキンソン社製、「I型コラーゲンコート24ウェルプレート」)、(3)アルブミンコート24ウェルプレート(日本ベクトン・ディッキンソン社製の24ウェルプレートに、1mg/mLのウシ血清アルブミン(Bovine Serum Albumin;BSA)/リン酸緩衝生理食塩水(Phosphate Buffered Saline;PBS)1mLを注入して37℃で2時間インキュベート後、2回PBSでリンスして余分なBSAを洗い流し、クリーンベンチ内で無菌乾燥したもの)、及び(4)無処理プレート(日本ベクトン・ディッキンソン社製の24ウェルプレート)。
細胞はNPLAd CHO細胞を用い、培地はNPL培地を使用した。NPL培地で維持しているNPLAd CHO細胞を、NPL培地で2回洗浄した。洗浄後、NPL培地で懸濁して細胞集塊をほぐした後に、改良ノイバウェル血球計算盤とトリパンブルーを用いた色素排除法で細胞数を計測し、生存率を算定した。生存率が90%以上であることが確認した後、NPL培地で5万個/mLになるように細胞数を調整し、フィブロネクチンコート24ウェルプレート、I型コラーゲンコート24ウェルプレート、アルブミンコート24ウェルプレート及び無処理の24ウェルプレートに、1mL/ウェルの量で播種した。
各プレートで培養5日目の細胞形態を図3に示す。細胞の形態は、フィブロネクチンコートプレート(パネルB)、I型コラーゲンコートプレート(パネルC)及びアルブミンコートプレート(パネルD)のいずれも、無処理のプレート(パネルA)と同様に集塊状の形態を示し、接着せずに浮遊しており、差は見られなかった。細胞が一度培養基に接着し、その後コンフルエントになって培養基から細胞が剥離している可能性も否定できなかったので、継続的な観察を行なった。しかし、NPLAd CHO細胞は培養初期から培養基に接着することなく、増殖していることが観察された。以上の結果から、馴化細胞株の浮遊化はECMの不足によるものではないと考えられた。
元株のCHO細胞は、無タンパク質・無脂質培地では増殖することができないが、馴化細胞株は、培地に馴化したことにより貧栄養状態でも増殖することが可能になっている。この形質の変化は、ある遺伝子変異により増殖可能になったクローンの細胞が培養に伴ってドミナントになり形質が変化したためである可能性がある。CHO細胞の形質変化が遺伝子変異によるものならば、遺伝子のポイント変異、染色体の一部脱落による遺伝子の欠失や染色体の欠損等で予測できない形質転換を伴う可能性があり、細胞機能そのものに障害が起こる場合も考えられる。そのような細胞は生産系の細胞として安定性が保証されない。さらに、同じ手法を用いても同様の性質を持つ株が得られるとは限らず、培地馴化法の再現性も保証されないことになる。そこで、樹立した馴化細胞株の形質変化は遺伝子変異を伴っているかを検証するため、この形質変化が可逆的であるか、すなわち馴化細胞株を再度血清添加の培地に戻し、元株のCHO細胞と同様な形態、増殖速度に戻るかを検討した。
(1−1)DMAd CHO細胞、NPLAd CHO細胞の逆馴化培養
細胞は樹立後30継代を越えたDMAd CHO細胞、及び樹立後280継代を越えたNPLAd CHO細胞を用い、培地は10%FBS添加DMEM培地を使用した。
元株のCHO細胞、DMAd CHO細胞及び逆馴化培養を25継代以上した逆馴化DMAd CHO細胞を用いた。培地は、元株のCHO細胞及び逆馴化DMAd CHO細胞には10%FBS添加DMEM培地を、DMAd CHO細胞にはDMEMを用いた。
元株のCHO細胞、DMAd CHO細胞及びNPLAd CHO細胞、血清入りDMEM培地で逆馴化培養した逆馴化DMAd CHO細胞及び逆馴化NPLAd CHO細胞の形態を図4に示す。細胞形態の変化を、倒立位相差顕微鏡にて倍率40倍で観測した。逆馴化培養を開始したDMAd CHO細胞及びNPLAd CHO細胞は、培地に血清を加えて培養を開始した直後から、一部に接着した細胞が観察された。継代培養を継続することで接着性の細胞形態へと移行し、3継代目逆馴化DMAd CHO細胞(パネルB)及び2継代目逆馴化NPLAd CHO細胞(パネルE)では接着形態と球状の浮遊形態の細胞が混在した。20継代目の逆馴化DMAd CHO細胞(パネルC)、9継代目逆馴化NPLAd CHO細胞(パネルF)は、元株のCHO細胞(パネルG)と比較して形態的な差異は見られなかった。
産業用途に用いられる細胞株では高増殖能、高物質産生能が求められる。本発明の馴化細胞株の細胞増殖速度を向上させるために、細胞増殖因子に対する応答性を検討した。
抗EGF中和抗体(R&D Systems, Inc.)及び遺伝子組換えインスリン(Sigma-Aldrich)は市販のものを使用した。
元株のCHO細胞及びNPLAd CHO細胞を用いた。NPLAd CHO細胞には10mg/Lのインスリン(Sigma-Aldrich)を添加したNPL培地を用いた。また、元株のCHO細胞には10%FBS添加DMEM培地を用いた。
EGF、及びCHO細胞に対して増殖誘導の効果があるとされているインスリンが馴化細胞の増殖に与える影響を検討した。NPLAd CHO細胞の培養5日目のインスリン濃度依存的細胞増殖を図6に示す。
細胞膜は、主にホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン等のリン脂質が無数に並んで形成される脂質二重膜層より成っており、その間に膜貫通タンパク質やアンカータンパク質等の各種タンパク質などが絡んで形成されている。脂質ラフトは、特にスフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質及びコレステロールを多く含む膜の構造物であり、受容体の膜貫通タンパク質が集中していることから、細胞内に情報伝達を行なっているとされている(図9)。特に、脂質ラフトのスフィンゴ糖脂質であるガングリオシドがシグナル伝達の制御に関与するという報告は多い。さらに、EGFの受容体も脂質ラフトに局在していることが報告されている(Balbisら,J Cell Biochem., 2010; 109(6): 1103-8.)。したがって、この脂質ラフトの形成が不十分な場合には、受容体からの情報伝達が十分に行われない可能性がある。
ガングリオシドGM3(Neu5A, Enzo Life Sciences)は市販のものを使用した。細胞はNPLAd CHO細胞を用いた。NPLAd CHO細胞はNPL培地で懸濁して細胞集塊をほぐした後に、改良ノイバウェル血球計算盤とトリパンブルーを用いた色素排除法で細胞数を計測し、生存率を算定した。
細胞は、NPLAd CHO細胞と元株のCHO細胞を用いた。元株のCHO細胞は、接着しているので、トリプシンで剥離分散させ、改良ノイバウェル血球計算盤とトリパンブルーを用いた色素排除法で細胞数を計測し、生存率を算定した。NPLAd CHO細胞は、NPL培地で懸濁して細胞集塊をほぐした後に、改良ノイバウェル血球計算盤とトリパンブルーを用いた色素排除法で細胞数を計測し、生存率を算定した。
GM3の添加による細胞形態の変化についての観察結果を図10に示す。GM3の添加の有無及び濃度(2,500ng/mLまで)にかかわらず、接着性細胞の増加や細胞集塊の大きさの変動等の形態の変化は観察されなかった。
物質の生産系の検証にトランジェント法を用い、無タンパク質・無脂質培地馴化細胞株が元株のCHO細胞に対してどの程度の遺伝子組換えタンパク質の生産能力があるかを、図14に示す手順にしたがって分泌型ルシフェラーゼの発現を指標に比較検討した。
(1−1)分泌型ルシフェラーゼ遺伝子発現ベクターの導入
元株のCHO細胞は、10%FBS添加DMEM培地で培養した。DMAd CHO細胞は、DMEM培地で培養した。NPLAd CHO細胞は、インスリン(10mg/L)添加NPL培地、又はインスリン(10mg/L)+GM3(2,500ng/mL)添加NPL培地のいずれかで培養した。
トランスフェクション試薬として「TransIT-LT1 Transfection Reagent」(タカラ、MIR2304)、分泌型ルシフェラーゼ発現ベクターとして「NanoLuc(登録商標)reporter vector pNL1.3.CMV [secNluc/CMV]」(プロメガ、N1101)(図15)をそれぞれ使用した。
ルシフェラーゼアッセイキットとして、「Nano-Glo Luciferase Assay System」(プロメガ、N1110)を使用した。
細胞を播種し、トランスフェクションの終わったプレートから5、24、48、72及び120時間毎に上清を10μL分取し、上清中の分泌型ルシフェラーゼの活性を「Nano-Glo Luciferase Assay System」を用いて、ルミノメーターで測定した。
(1−3)ルシフェラーゼ比活性の算定
ルシフェラーゼ比活性は経時的にサンプリングした中の元株のCHO細胞の培養上清の発光量に対して、培養条件毎の馴化細胞株の培養上清の発光量を比較したもので、計算法は以下のとおりとした。
細胞毎の発光量比較はトランスフェクション後に経時的にサンプリングした各細胞の培養上清の発光量を、同じ細胞を用いて、同一培地組成、培養条件で培養した際の経時的な細胞の増加数で割っており、細胞当たりの発光量を推定的に算出した。
馴化細胞株のタンパク質生産性を検討する目的で、CMVプロモーターの下流に分泌型ルシフェラーゼcDNAを組み込んだプラスミドpNL1.3.CMVベクターをリポフェクション法でトランスフェクションし、馴化細胞株と元株のCHO細胞の培地に分泌されるルシフェラーゼ活性を発光量定量比較した。結果を図16に示す。GM3添加NPLAd CHO細胞は、トランスフェクション直後の産生の立ち上がりは遅いものの、120時間後には元株のCHO細胞に対するルシフェラーゼ比活性に有意差は見られなかった。最終的な産生量は元株のCHO細胞と同等であった(−●−)。また、DMAd CHO細胞(−▲−)及びGM3非添加NPLAd CHO細胞(−○−)はトランスフェクション後120時間で元株のCHO細胞の3倍以上のルシフェラーゼ比活性(有意差は各々p<0.05、p<0.005)を示した。したがって、樹立した細胞株のタンパク質生産性は元株のCHO細胞より高いものと考えられた。
Claims (10)
- 外因性の増殖因子を含有しない無タンパク質・無脂質培地において浮遊状態で増殖可能であることを特徴とする、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞由来の無タンパク質・無脂質培地馴化細胞株の細胞。
- 細胞株が受託番号NITE P−01641である、請求項1記載の細胞。
- 株化されたCHO細胞由来の無タンパク質・無脂質培地馴化細胞を培養するための無タンパク質・無脂質培地であって、通常の3〜5倍のグルコースを含有するDMEM培地に、さらにプトレッシン、チミジン、ヒポキサンチン及びモノエタノールアミンを含有し、外因性の増殖因子を含有しないことを特徴とする培地。
- 2000〜5000mg/Lのグルコース、0.001〜2mg/Lのプトレッシン、0.01〜1mg/Lのチミジン、0.1〜10mg/Lのヒポキサンチン及び0.1〜5mg/Lのモノエタノールアミンを含有する、請求項3記載の無タンパク質・無脂質培地。
- 1〜20mg/Lのインスリンをさらに含む、請求項3又は請求項4記載の無タンパク質・無脂質培地。
- 請求項3〜5のいずれか1項記載の培地を製造するための組成物であって、培地として使用する際の各成分の最終濃度が、DMEM培地の組成に、2000〜5000mg/Lのグルコース、0.001〜2mg/Lのプトレッシン、0.01〜1mg/Lのチミジン、0.1〜10mg/Lのヒポキサンチン及び0.1〜5mg/Lのモノエタノールアミンを含有することとなるようにこれらの各成分を含む組成物。
- CHO細胞を、請求項3〜5のいずれか1項記載の培地で継代培養する工程を含む、請求項1記載の馴化細胞株の作製方法。
- CHO細胞を、タンパク質及び/又は脂質あるいはそれらを含む添加物を含有する培地で培養する工程の後、請求項3〜5のいずれか1項記載の培地で継代培養する工程を含む、請求項7記載の方法。
- タンパク質及び/又は脂質あるいはそれらを含む添加物を含有する培地で培養する工程を、タンパク質及び/又は脂質あるいはそれらを含む添加物の含有量を次第に下げながら行う、請求項8記載の方法。
- CHO細胞を、請求項3〜5のいずれか1項記載の培地で培養する工程の後、タンパク質及び/又は脂質あるいはそれらを含む添加物を含有する培地で培養する工程を行い、その後再び請求項3〜5のいずれか1項記載の培地で培養する工程を含む、請求項7〜10のいずれか1項記載の方法。
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佐々木哲二, 筑波大学博士論文要旨[ONLINE], vol. 12102甲第6655号, JPN6017009361, 30 April 2013 (2013-04-30), pages 1 - 3, ISSN: 0003520984 * |
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