CN116981765A - 用于培养肉类生产的补充型无血清培养基 - Google Patents

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Abstract

公开了一种用于扩增肌卫星细胞的无血清且无动物成分培养基。所公开的培养基可用于培养食品应用中。所公开的培养基可以包括无血清且无动物成分的基准培养基和重组形式的白蛋白。在使用时，该基准培养基为肌卫星细胞的扩增提供了基准生长能力，以用于培养食品应用。在使用时，所公开的培养基为肌卫星细胞的扩增提供了增强的生长能力。该增强的生长能力比基准生长能力高出至少50％。还公开了制备和使用所公开的培养基的方法。

Description

用于培养肉类生产的补充型无血清培养基
相关申请的交叉引用
本申请与2020年12月9日提交的第63/123,346号美国临时专利申请相关，要求其优先权并出于所有目的通过引用方式将其并入本文。
关于联邦资助研究的声明
不适用。
背景技术
细胞培养的肉类是一项新兴技术，它既提供了充满希望的可能性，也带来了重大的科学挑战。培养肉类的前景在于它有可能解决困扰集约式畜牧业的环境、伦理和人类健康问题。例如，有限生命周期分析表明，与传统牛肉相比，培养肉类所需的土地可减少>90％，并且所需的水量可减少>75％，同时有助于减少>75％的温室气体排放、减少>95％的富营养化以及减少>90％的颗粒物形成。与此同时，培养肉类可以改善动物福利、食物系统韧性和人类健康结局。培养肉类向市场成功进行技术转型所面临的挑战源于对低成本、可放大、食品安全且不含动物源性投入的生产系统的需求。在这里，由于几种原因，细胞培养基是一个格外棘手的障碍。首先，培养基构成了当前生产系统的大部分(>99％)成本。其次，肉类相关细胞诸如牛卫星细胞(BSC)的培养传统上依赖于胎牛血清(FBS)，众所周知，这是一种昂贵、不可持续且不稳定的成分，从而在本质上与培养肉类的目标背道而驰。最后，当用于卫星细胞的无血清培养基开发出来时，它们要么与含血清培养基相比较复杂、效率不佳，要么依赖于专有或动物来源的添加剂，要么含有可能引起监管问题的成分(例如，合成类固醇)。此外，还没有经过验证的无血清培养基可以使卫星细胞在多次传代中持续扩增。因此，尽管在开发卫星细胞培养系统方面已经开展了大量工作，但食品安全且完全不含动物来源成分的培养基仍然是该领域的一个关键限制。
因此，存在着对新型培养基的需求。
发明内容
在一个方面，本公开提供了一种用于扩增肌卫星细胞的无血清且无动物成分培养基，以用于培养食品应用。该培养基包括无血清且无动物成分的基准培养基和重组形式的白蛋白。在使用时，所述无血清且无动物成分的基准培养基为肌卫星细胞的扩增提供了基准生长能力，以用于培养食品应用。在使用时，所述培养基为肌卫星细胞的扩增提供了增强的生长能力，以用于培养食品应用。所述增强的生长能力比基准生长能力高出至少50％。
在另一方面，本公开提供了一种制备无血清且无动物成分培养基的方法。该方法包括将重组形式的白蛋白添加到无血清且无动物成分的基准培养基中。该添加产生所述无血清且无动物成分培养基。
在另外的方面，本公开提供了一种制备工程化细胞的方法。该方法包括在本文公开的无血清且无动物成分培养基中扩增肌卫星细胞。
附图说明
图1A是显示与B8混合的BSC-GM中的短期生长的数据图，如实施例1中所述。在BSC-GM(20％ FBS)和B8培养基的混合物中，3天和4天内的BSC增殖。在四天的时间点处，与单独的BSC-GM相比，高达62.5％ B8的混合物显著增强了生长，而高达87.5％ B8的混合物并未显著降低生长(p＝0.27)。与单独的BSC-GM相比，单独的B8在四天内显示出生长显著下降，并且在三天后显示出生长停滞。n＝6个不同的样品；通过对第4天的数据进行单因素ANOVA分析，将所有样品与BSC-GM对照进行比较，计算出统计学意义，并用星号表示，其中p<0.05(*)、p<0.01(**)、p<0.001(***)，并且p<0.0001(****)。
图1B示出了在实施例1中论述的明视野图像。在BSC-GM或B8培养基中生长三天的BSC的明视野图像。图像显示在含血清或无血清条件下细胞形态是一致的。图像中的细胞汇合度与图1A中所示的生长分析定性一致。比例尺为200μm。
图2A是显示与补充型B8混合的BSC-GM中的短期生长的数据图，如实施例1中所述。在补充有白细胞介素6(IL-6)、姜黄素、重组白蛋白(r白蛋白)、亚油酸、油酸或亚油酸和油酸混合物的B8中，4天内的BSC增殖。在第4天时通过dsDNA定量分析生长情况，并给出相对于B8的值。n＝6个不同的样品；通过进行补充型样品和B8对照之间的单因素ANOVA分析和多重比较，计算出统计学意义，并用星号表示，其中p<0.05(*)、p<0.01(**)、p<0.001(***)，并且p<0.0001(****)。虽然油酸在第4天单独测试时未发现显著性差异(下方中间小图)，但在第3天时存在显著性差异，因此将其纳入作为脂肪酸混合物分析的一部分(下方右侧小图)。
图2B是显示与补充型B8混合的BSC-GM中的短期生长的数据图，如实施例1中所述。在补充有因子组合的B8中，4天内的BSC增殖，其中：B8＝B8；I＝IL-6(0.01ng/mL)；A＝r白蛋白(800μg/mL)；C＝姜黄素(1ng/mL)；F＝亚油酸(400ng/mL)和油酸(400ng/mL)；并且BSC-GM＝含血清生长培养基。n＝6个不同的样品；通过进行所有样品之间的单因素ANOVA分析和多重比较，计算出统计学意义，并用星号表示，其中p<0.05(*)、p<0.01(**)、p<0.001(***)，并且p<0.0001(****)。示出了B8和其他样品之间具有统计学意义的差异，还示出了r白蛋白补充型B8和BSC-GM之间缺乏显著性(p>0.9990)。
图2C示出了在实施例1中论述的明视野图像。在第4天时对添加r白蛋白(800μg/mL)的B8中的BSC进行明视野成像显示，与图1B中的图像相比，补充白蛋白的B8中细胞形态得以保持。比例尺为200μm。
图3A是与在Beefy-9中传代相关的数据图，如实施例1中所述。在B8/Beefy-9培养基中传代的BSC生长分析。结果表明，细胞需要在缺乏补充白蛋白(“延迟r白蛋白”)的情况下进行传代，并且需要包被(例如，iMatrix-511层粘连蛋白)才能粘附和生长。具体而言，没有任何包被(“无包被”)的细胞不能生长，在白蛋白存在的情况下传代的具有iMatrix-511包被(“iMatrix-511；传代w/r白蛋白”)的细胞也是如此。相反，将细胞传代到iMatrix-511包被的培养瓶上并让其粘附过夜，然后再添加白蛋白(“延迟r白蛋白”)，这些细胞则显示出指数生长。n＝9个图像视场；通过进行条件之间的双因素ANOVA分析和多重比较，计算出统计学意义，并用星号表示“iMatrix-511；延迟r白蛋白”和所有其他条件之间的显著性差异，其中p<0.05(*)、p<0.01(**)、p<0.001(***)，并且p<0.0001(****)。通过非线性回归(最小二乘回归；指数(马尔萨斯)生长)计算出95％置信区间。
图3B是传代系统的示意图，如实施例1中所述。使用了B8/Beefy-9传代系统示意图。在第0天时，将BSC在相同条件(BSC-GM)下铺板，以确保最初有相同数量的细胞粘附在板上。在第1天时，用PBS冲洗细胞，并将培养基更换为Beefy-9。当汇合度达到70％时(第3天时)，使用TrypLE对细胞进行传代，并将其与粘附肽一起铺板于B8(无白蛋白)中。传代后一天时，将培养基更换为Beefy-9，让细胞增殖并分析其粘附性、生长性和肌原性。
图3C是与在Beefy-9中传代相关的数据图，如实施例1中所述。对涂有多种无动物源性包被物的BSC进行PrestoBlue粘附和生长分析。与iMatrix-511层粘连蛋白(Lmn)或聚-D-赖氨酸(PDL)相比，1.5μg/cm2的截短型玻连蛋白(Vtn-N)显示出更好的细胞贴附和生长。n＝3个不同的样品，并进行2次技术重复；通过分别进行第1天时或第4天时Vtn-N 1.5μg/cm2和所有其他样品之间的单因素ANOVA分析和多重比较，计算出统计学意义，并用星号(第1天时)或井号(第4天时)表示，其中p<0.05(*,#)、p<0.01(**,##)、p<0.001(***,###)，并且p<0.0001(****,####)。
图4A示出了说明在FGF-2减少时B8和Beefy-9中短期生长的数据图，如实施例1中所述。在具有不同浓度FGF-2的B8或Beefy-9中，4天内的BSC增殖。在B8或Beefy-9中，可以分别将FGF-2减少至5ng/mL或1.25ng/mL，而在四天内不会显著影响细胞生长。n＝6个不同的样品；通过进行不同FGF-2浓度和40ng/mL对照条件之间的单因素ANOVA分析和多重比较，计算出统计学意义。在所有与40ng/mL无显著性差异的样品中，样品之间缺乏显著性用“ns”表示。
图4B是在不含FGF-2和含有减少的FGF-2的Beefy-9中短期生长的明视野图像，如实施例1中所述。在含有0或5ng/mL FGF-2的Beefy-9培养基中生长三天的BSC明视野图像。图像显示，从Beefy-9中完全去除FGF-2显著影响细胞形态，而与图1B和2C中的图像相比，减少至5ng/mL并不影响形态。比例尺为200μm。
图5A是与长期培养相关的数据，如实施例1中所述。在BSC-GM、B8、高FGF(40ng/mLFGF-2)Beefy-9或低FGF(5ng/mL FGF-2)Beefy-9中培养的BSC多次传代中的细胞倍增。结果表明，在四个星期内，添加白蛋白显著增强了B8中的细胞生长，尽管未达到血清的程度。与40ng/mL相比，将Beefy-9 FGF-2减少至5ng/mL降低了细胞倍增，尽管这种差异不太明显(低FGF-2在28天时倍增17.2次，而高FGF-2倍增18.2次)。n＝6(3个生物学重复的2次计数)，并且误差线以±标准差的形式给出(尽管在某些情况下比样品图标小)。
图5B是与长期培养相关的数据，如实施例1中所述。在长期细胞培养中计算倍增时间，并在培养基类型之间进行比较。发现在较高传代时倍增时间增加，特别是对于含有高或低FGF-2的Beefy-9。然而值得注意的是，在Beefy-9中，前五次传代(约13次倍增)的倍增时间保持<48小时。
图6A是与r白蛋白增加的长期培养相关的数据，如实施例1中所述。在BSC-GM、r白蛋白浓度为0.8mg/mL(数据来自图5)、1.6mg/mL、3.2mg/mL、6.4mg/mL(含有40或5ng/mLFGF-2)的Beefy-9和使用供应商提供的HiDef B8的HiDef Beefy-9中培养的BSC多次传代中的细胞倍增。结果表明，增加r白蛋白浓度增强了细胞生长，其中6.4mg/mL(20.2)和3.2mg/mL(19.8)的浓度提供了最高的细胞倍增次数。n＝6(3个生物学重复的2次计数)，并且误差线以±标准差的形式给出(尽管在某些情况下比样品图标小)。
图6B是与r白蛋白增加的长期培养相关的数据，如实施例1中所述。(B)中测试的培养基的最终(28天时)细胞计数，并且起始细胞数为24,000。结果表明，与0.8mg/mL相比，3.2和6.4mg/mL r白蛋白的细胞产量显著增加，并且当使用工程化生长因子(在供应商提供的HiDef B8中)时也有显著改善。n＝6(3个生物学重复的2次计数)；通过进行所有条件之间的单因素ANOVA分析和多重比较，计算出统计学意义，并用星号表示，其中p<0.05(*)、p<0.01(**)、p<0.001(***)，并且p<0.0001(****)。
图7是显示与B8混合的BSC-GM中的短期生长的数据图，如实施例1中所述。在BSC-GM(20％ FBS)和HiDef-B8培养基的混合物中，3天和4天内的BSC增殖。结果表明，与BSC-GM相比，高达50％的HiDef-B8显著提高了生长，而与BSC-GM相比，高达87.5％的HiDef-B8并未显著降低生长。n＝6个不同的样品；通过对第4天的数据进行单因素ANOVA分析，将所有样品与BSC-GM对照进行比较，计算出统计学意义，并用星号表示，其中p<0.05(*)、p<0.01(**)、p<0.001(***)，并且p<0.0001(****)。
图8是来自对在多种培养基中传代六次期间培养的BSC进行融合指数分析的数据图，如实施例1中所述。在多种培养基中培养并分化4天(P2和P4)或6天(P6)的BSC图像(放大10倍)的融合指数。融合指数表示为在ImageJ中阈值化(所有图像的阈值＝18)后与肌球蛋白重链(MHC)染色叠加的图像中成像细胞核的百分比。结果表明，无血清培养物中的分化得到增强；然而，有可能在无血清条件下总细胞数的减少有助于得出这一结论，而不仅仅是分化程度。n＝5-8个不同的图像，具体取决于是否有任何图像由于明显干扰图像分析的成像伪影(例如，气泡)而被排除；通过进行所测试的每个不同传代的培养基类型之间的双因素ANOVA分析和多重比较，计算出统计学意义，并用星号表示，其中p<0.05(*)、p<0.01(**)、p<0.001(***)，并且p<0.0001(****)。
图9是显示含有另外的r白蛋白的Beefy-9中的短期生长的图。在r白蛋白浓度增加(超过如原始Beefy-9培养基配制的800ug/mL)的情况下，3天和4天内的BSC增殖。结果显示，随着r白蛋白浓度的增加，生长急剧增加。事实上，虽然11.2mg/mL是所测试的最大浓度，但这并不是改善短期生长的极限。n＝6个不同的样品；通过对第4天的数据进行单因素ANOVA分析，将所有样品与Beefy-9(“800”)进行比较，计算出统计学意义，并用星号表示，其中p<0.05(*)、p<0.01(**)、p<0.001(***)，并且p<0.0001(****)。
发明详述
在进一步详细描述本发明之前，应当理解的是，本发明并不限于所描述的特定实施方式。还应当理解的是，本文使用的术语仅仅是为了描述特定的实施方案，而并非意在进行限制。本发明的范围将仅由权利要求书来限定。如本文所用的，单数形式的“一种/个(a)”、“一个/种(an)”和“所述/该(the)”包括复数实施方案，除非上下文另有明确规定。
对于本领域技术人员来说，应该显而易见的是，在不脱离本发明概念的情况下，除了已经描述的那些修改之外，还可以进行许多其他修改。在解释本公开时，所有术语都应以与上下文一致的尽可能广泛的方式来解释。术语“包括/包含(comprising)”的变型应解释为以非排他性方式提及要素、组分或步骤，因此可以将所提及的要素、组分或步骤与未明确提及的其他要素、组分或步骤相组合。被称为“包括/包含”某些要素的实施方案也被认为是“基本上由”和“由”那些要素“组成”。当列举某一特定值的两个或更多个范围时，本公开考虑了未明确列举的那些范围的上限和下限的所有组合。例如，列举1至10之间或2至9之间的值也考虑了1至9之间或2至10之间的值。
一方面，本公开提供了一种无血清且无动物成分培养基。本发明的培养基基于以下发现，即最近开发的用于诱导性多能干细胞的无血清且无动物产品培养基，该培养基以其原始形式时不适于肌卫星细胞的商业规模生长和扩增，可以通过添加重组形式的白蛋白相对容易地进行改进，以用于肌卫星细胞的生长和扩增。本发明的培养基可以适用于培养肌细胞的商业化生产。
重组形式白蛋白的存在量可以为至少50mg/L、至少100mg/L、至少200mg/L、至少250mg/L、至少500mg/L、至少750mg/L、至少1g/L、至少2g/L、至少5g/L、至少10g/L、至少15g/L或至少20g/L和至多60g/L、至多50g/L、至多40g/L、至多30g/L、至多25g/L、至多20g/L、至多15g/L、至多10g/L、至多5g/L、至多2g/L、至多1.5g/L或至多1g/L。在一些情况下，重组形式白蛋白的存在量为约800mg/L。在一些情况下，重组形式白蛋白的存在量为800mg/L至6400mg/L。
重组形式的白蛋白可以是重组形式的人白蛋白、牛白蛋白、猪白蛋白、鸡白蛋白或者本领域技术人员会认识到可能与所公开的白蛋白表现相似的另一种白蛋白。在某些情况下，白蛋白可以是来自植物和非动物物种的白蛋白或类似蛋白质。
在一些情况下，无血清且无动物成分培养基可以进一步包括重组形式的以下一种或多种：白细胞介素6；乙醇胺；姜黄素；油酸；或亚油酸。
无血清且无动物成分培养基和基准培养基按重量计可以包括至少80％且至多99.99％的量的基础培养基。
无血清且无动物成分的基准培养基可以含有以下的混合物：基础培养基(例如，DMEM、DMEM/F12等)，含有浓度范围为0.01-10g/L的糖类(例如，葡萄糖)；浓度范围为0.001-5g/L的氨基酸(例如，谷氨酰胺、赖氨酸)；浓度范围为0.001-1g/L的维生素(例如，叶酸、烟酸)；浓度范围为0-15g/L的矿物质(例如，NaCl)；以及浓度范围为0.0001-10mg/L的微量元素(例如，铁、硒)。基础培养基可以补充浓度范围为0.01-100,000ng/mL的生长刺激因子或细胞信号传导因子(例如，胰岛素、成纤维细胞生长因子、转化生长因子等)，并辅以浓度范围为0.01-1g/L的运载蛋白(例如，转铁蛋白)。
无血清且无动物成分的基准培养基具有用于扩增肌卫星细胞的基准生长能力，以用于培养食品应用。然而，这种基准生长能力不适合培养食品的商业化生长。所公开的无血清且无动物成分培养基具有增强的生长能力，其比该基准生长能力高出至少50％。在某些情况下，增强的生长能力比基准生长能力高出至少100％、至少150％、至少200％、至少250％或至少300％。
所述基准和增强的生长能力可以用多种方式表示。举一个示例，可以将基准和增强的生长能力表示为短期生长能力，将其测量为一段较短时间(诸如1、2、3、4、5、6或7天)期间内的增殖。再举一个示例，可以将基准和增强的生长能力表示为长期生长能力，将其测量为肌卫星细胞多次传代期间的细胞倍增次数。另举一个示例，可以将基准和增强的生长能力表示为一段给定时间内的生物量增加。另外再举一个示例，可以将基准和增强的生长能力表示为在给定时间培养物中活跃倍增细胞的百分比(例如，通过细胞周期分析)。表示生长能力的具体方式并非意在进行限制。
在某些方面，该培养基可以包含比基准培养基中通常存在的浓度更低的FGF-2。在基准培养基中，FGF-2的浓度通常为约40ng/mL。本发明人惊奇地发现，对于包括重组形式的白蛋白的本发明培养基，培养基中FGF-2的浓度可以小于20ng/mL、小于15ng/mL、小于10ng/mL、小于7.5ng/mL、小于5ng/mL或小于2.5ng/mL。
在某些方面，该培养基可以包含比基准培养基中通常存在的浓度更低的转化生长因子(TGFβ3)。在某些情况下，培养基可以包含浓度小于0.1ng/mL、小于0.01ng/mL、小于0.001ng/mL的TGFβ3。在某些情况下，培养基可以不含TGFβ3。
在某些情况下，该培养基可以包含浓度比基准培养基中通常存在的浓度更低的神经调节蛋白(NRG1)。在某些情况下，培养基可以包含浓度小于0.1ng/mL、小于0.01ng/mL、小于0.001ng/mL的NRG1。在某些情况下，培养基可以不含NRG1。
在一些情况下，该培养基可以包含浓度比基准培养基中通常存在的浓度更低的其他成分。
在另一方面，本公开提供了一种使用本文公开的培养基的方法。在某些情况下，这是一种制备工程化细胞的方法。在一些情况下，本文公开的培养基可用于扩增用作食物成分(例如，培养肉类/海产品，或作为补充剂添加到基于植物的肉制品中)的肌细胞。在某些情况下，本文公开的培养基可用于在生物反应器中扩增肌细胞，可以是在中空纤维或微载体上，也可以是在单细胞悬液或细胞聚集物悬液中(例如，搅拌釜式生物反应器、流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、旋转壁式生物反应器、波浪式生物反应器、填充床式生物反应器、气升式生物反应器等)。在某些情况下，本文公开的培养基可用于扩增肌细胞以用于再生医学应用(例如，在上述生物反应器中用于治疗体积性肌损失)。在某些情况下，本文公开的培养基可用作分离培养基以用于产生原代肌细胞群。
一种制备工程化细胞的方法可以包括在本文公开的无血清且无动物成分培养基中扩增肌卫星细胞。在扩增肌细胞之前，该方法可以进一步包括：i)用细胞粘附肽包被肌卫星细胞；或者ii)将肌卫星细胞粘附在无血清且无动物成分的基准培养基和/或缺乏重组形式的白蛋白的不同的无血清且无动物成分的基准培养基中。
细胞粘附肽可以是重组形式的层粘连蛋白(例如，层粘连蛋白511)或其片段、玻连蛋白或其片段、聚-d-赖氨酸、聚-l-赖氨酸、纤维粘连蛋白或其片段、基质胶(Matrigel)或本领域技术人员理解的其他细胞粘附肽。
步骤ii)的粘附可以在B8培养基或本领域技术人员会认为适合这种粘附的其他培养基中进行。其他合适的培养基的实例包括essential 8培养基、TeSR-E8培养基、基础培养基(例如，DMEM、DMEM/F12等)、专有无血清培养基、含血清培养基以及本领域技术人员认为适于粘附的其他培养基。
本文论述的关于培养基和方法的肌卫星细胞可以来自动物来源，包括但不限于来自牛科动物、禽类(例如，鸡、鹌鹑)、猪科动物、海产品或鼠科动物来源。本文论述的关于培养基和方法的肌卫星细胞可以源自海产品，诸如鱼类(例如，鲑鱼、金枪鱼、罗非鱼、鲈鱼、鲭鱼、鳕鱼、沙丁鱼、鳟鱼等)、贝类(例如，蛤蜊、贻贝和牡蛎)；甲壳类动物(例如，龙虾、河虾、对虾和螯虾)以及棘皮动物(例如，海胆和海参)。本文论述的关于培养基和方法的肌卫星细胞可以是牛科动物、鸡类、绵羊属动物、猪科动物、马科动物、鼠科动物、山羊属动物、兔类或鱼类的。在某些情况下，肌卫星细胞是牛科动物、鸡类、猪科动物或鱼类的。
在另一方面，本公开提供了一种制备无血清且无动物成分培养基的方法。该方法包括将重组形式的白蛋白添加至无血清且无动物成分的基准培养基中，从而产生无血清且无动物成分培养基。在某些情况下，这可能涉及混合无血清且无动物成分培养基的所有成分。在一些情况下，某些部分可以在与其他部分组合之前预先混合。本领域技术人员将会认识到，制备本公开的本发明培养基的具体方法并非意在限制对培养基或使用该培养基的方法的保护。
在论述本公开的示例性方面之前，申请人强调，本公开的创造性在很大程度上在于本发明的培养基已经验证的事实。不希望受到特定理论的束缚，我们仍然处于培养肉制品的初级阶段，并且预测其功效仍然非常具有挑战性，特别是当它与传统上涉及血清或动物制品的配制品相关时。在本发明之前，据申请人所知，尚未开发出在不使用血清、其他动物制品或非食品安全成分的情况下用于长期增殖肌卫星细胞的成功培养基。此外，在本发明之前，据申请人所知，尚未开发出用于在无血清环境中对这些细胞进行传代和增殖的方法，事实上，在细胞传代期间培养基中暂时不存在白蛋白的需求非显而易见，并且代表了重要的方法学新颖性。因此，可能性的数量几乎是无限的，而来自成功实例的指导几乎是零。正因为如此，申请人认为，在这一领域中可以被视为具有创造性的标准需要适当考虑这些因素。
实施例
实施例1
材料和方法
原代牛卫星细胞的分离和维持
使用我们小组以前所用的方法，并基于之前描述的预先铺板(pre-plating)卫星细胞分离方案来分离原代牛卫星细胞(BSC)。参见，例如Stout,A.J.,Mirliani,A.B.,Soule-Albridge,E.L.,Cohen,J.M.&Kaplan,D.L.Engineering carotenoid productionin mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods.Accept.-Metab.Eng.62,126–137(2020)和Gharaibeh,B.等人Isolation of a slowly adheringcell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by thepreplate technique.Nat.Protoc.2008 39 3,1501–1509(2008)。简言之，根据批准的方法(IACUC方案编号G2018-36)，在塔夫茨大学卡明斯兽医学院(Tufts Cummings School ofVeterinary Medicine)从14日龄西门塔尔犊牛的半腱肌上切下约0.5克肌肉。将肌肉组织切碎成糊状，并在0.2％胶原酶II(Worthington Biochemical#LS004176,Lakewood,NJ,USA；275U/mg)中消化45分钟，并定期研磨。使用BSC生长培养基(BSC-GM)停止消化，该生长培养基由补充有20％胎牛血清(FBS；ThermoFisher#26140079)、1ng/mL人FGF-2(ThermoFisher#68-8785-63)和1％Primocin(Invivogen#ant-pm-1,San Diego,CA,USA)的DMEM+Glutamax(ThermoFisher#10566024,Waltham,MA,USA)构成，过滤细胞并将其以100,000个细胞/cm2的密度铺到未包被的组织培养瓶上。在37℃和5％CO2条件下孵育24小时后，将所铺的悬液(含有卫星细胞)转移至包被有1μg/cm2小鼠层粘连蛋白(Sigma#CC095,St.Louis,MO,USA)的培养瓶中，将其放置三天不动，然后更换生长培养基，并使用标准操作规程在包被有0.25ug/cm2 iMatrix重组层粘连蛋白-511(Iwai North America#N892021,San Carlos,CA,USA)的组织培养塑料器具上培养细胞。培养两周之后，将生长培养基中的Primocin替换为1％抗生素-抗真菌剂(ThermoFisher#1540062)。对于定期细胞维持，将细胞在37℃、5％CO2中培养至最大70％汇合度，使用NC-200自动细胞计数器(Chemometec,Allerod,Denmark)进行计数，并使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(ThermoFisher#25200056)进行传代或者冷冻在含有10％二甲基亚砜(DMSO,Sigma#D2650)的FBS中。对于常规的成肌分化，如上所述将细胞培养至汇合，然后在不更换培养基的情况下孵育一周。
分离细胞的表征
为了表征分离细胞，对增殖性BSC进行配对盒7(Pax7)染色，Pax7是一种卫星细胞身份的标志物。细胞用4％多聚甲醛(ThermoFisher#AAJ61899AK)固定30分钟，在PBS中洗涤，使用含0.5％Triton-X(Sigma#T8787)的PBS透化15分钟，使用含0.05％叠氮钠(Sigma#S2002)的PBS中的5％山羊血清(ThermoFisher#16210064)封闭45分钟，并用含0.1％Tween-20(Sigma#P1379)的PBS洗涤。将一级Pax7抗体(ThermoFisher#PA5-68506)在含有1:100鬼笔环肽594(ThermoFisher#A12381)的封闭溶液中以1:100稀释，加入到细胞中，并在4℃孵育过夜。然后用PBS+Tween-20洗涤细胞，在室温与Pax7的二抗(ThermoFisher#A-11008,1:500)一起孵育1小时，用PBS+tween-20洗涤，并用含DAPI的Fluoroshield封固介质(Abcam#ab104139,Cambridge,UK)进行封固，之后再进行成像。通过荧光显微镜(KEYENCE,BZ-X700,Osaka,Japan)进行成像。使用BZ-X800图像细胞术软件对多张图像进行批量共定位分析，以计数Pax7呈阳性的细胞核，从而对分离的细胞群中的卫星细胞纯度进行定量测量。
为了验证分离的BSC的肌原性，按照所述将细胞分化7天。然后，如前所述，使用肌球蛋白重链的一级抗体(Developmental studies hybridoma bank#MF-20,Iowa City,IA,USA)、鬼笔环肽594(1:100)、适当的二抗(ThermoFisher#A-11001,1:1000)和含有DAPI的Fluoroshield封固介质对细胞进行固定、染色和成像。
短期生长分析
自制B8培养基是使用市售的成分以及先前描述的制剂配方和制备方法而制备的。参见，Kuo,H.H.等人Negligible-Cost and Weekend-Free Chemically Defined HumaniPSC Culture.Stem Cell Reports 14,256–270。表1包括配方。另外，HiDef-B8培养基等分试样由Defined Bioscience(Defined Bioscience#LSS-201,San Diego,CA,USA)慷慨提供，并添加了含1％抗生素/抗真菌剂的DMEM/F12。对含血清和无血清培养基的混合物，以及含有较低生长因子浓度和/或添加多种培养基补充剂的纯B8培养基(表2)进行了短期BSC生长(3天和4天)分析。简言之，将BSC解冻(传代数<2)，并对于每个时间点都将BSC置于BSC-GM中，在0.25ug/cm2 iMatrix重组层粘连蛋白-511存在的情况下，以2,500个细胞/cm2的密度铺在96孔组织培养塑料板上。24小时后，去除BSC-GM，用DPBS洗涤细胞1次，并加入新培养基(例如，B8+/-补充)。补充剂和浓度列表见表2。在第3天时更换培养基，并在第3天和第4天时对细胞进行成像，从适当的板中吸出培养基，并将板冷冻在-80℃。一旦冷冻了所有时间点，就根据推荐方案使用FluoReporter dsDNA定量试剂盒(ThermoFisher#F2962)来分析细胞数量，并在Synergy H1微孔板检测仪(BioTek Instruments,Winooski,VT,USA)上分别使用以360和490nm为中心的激发和发射滤光片进行荧光读数。相对于纯B8或HiDef培养基，分析第3天和第4天时的细胞数量。
表1
成分 浓度 供应商 目录号
DMEM/F12基础培养基 不适用 ThermoFisher 11320033
2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐 200μg/mL Sigma 49752-10G
胰岛素(人,重组) 20μg/mL Sigma 91077C-250MG
转铁蛋白(人,重组) 20μg/mL InVitria 777TRF029
亚硒酸钠 20ng/mL Sigma S5261-10G
成纤维细胞生长因子(FGF-2) 40ng/mL PeproTech 100-18B
神经调节蛋白(NRG1) 0.1ng/mL PeproTech 100-03
转化生长因子(TGFβ3) 0.1ng/mL R&D Systems 8420-B3-005/CF
超纯水 5.8％(v/v) ThermoFisher 10977015
抗生素/抗真菌剂 1％(v/v) ThermoFisher 1540062
培养基成分中的功能性种类以粗体显示。为了制备培养基，首先制备两份等分试样。对于等分试样‘A’，在水中缓慢制备400mg/mL 2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐，将其灭菌，并分装成250μL等份。对于等分试样‘B’，将40mg/mL胰岛素加入水中，并加入1N HCl直至胰岛素溶解。缓慢地加入1NNaOH以使pH值升至约6。接下来，加入40mg/mL转铁蛋白、40μg/mL亚硒酸钠、80μg/mL FGF-2、0.2μg/mL NRG1和0.2μg/mL TGFβ3，将溶液灭菌并分装成250μL等份。为了制备培养基，将DMEM/F12(500mL)与5.3mL的100x抗生素/抗真菌剂和31mL水通过无菌过滤器一起进行灭菌，并在灭菌后添加等分试样A和B。按照先前描述的B8培养基的方案，本研究中所用的培养基在从冷冻等分试样制备的一个月内使用，并且在饲养细胞之前将培养基加热至室温。
表2
成分 供应商 目录号 范围(ng/mL)
氢化可的松 Sigma H0888-1G 3.125—100
雌二醇 Sigma E8875-1G 1—5,000
孕酮 Sigma P8783-1G 0.3125—10
地塞米松 Sigma D4902-100MG 3.125—400
BMS 564929 Tocris Bioscience 5274 0.1—500
牛生长激素 MP Biomedical 02160074.1 7.8125—250
姜黄素 Sigma C7727-500MG 1—5,000
亚精胺 Sigma S2626-1G 100—500,000
乙醇胺 Acros Organics 149582500 10—50,000
亚油酸 Sigma L5900-10MG 25—3,200
油酸 Sigma O1257-10MG 25—3,200
Stat3抑制剂 Sigma 573096-1MG 100—500,000
白细胞介素-6 BioRad PBP021 0.01—50
白血病抑制因子 Peprotech 300-05 0.3125—40
肝细胞生长因子 Novus Biologicals NBP2517300.1MG 0.3125—40
血小板来源生长因子BB ThermoFisher PHG0045 0.15625—20
色素上皮来源因子 R&D Systems 1177SF025 0.390625—50
胰岛素样生长因子 ThermoFisher PHG0078 0.1—50
心肌营养素1 Novus Biologicals NBP199745 0.15625—20
重组人白蛋白 Sigma A9731-1G 50,000—60,000,000
在Beefy-9培养基中传代
为了测试使用B8+r白蛋白(Beefy-9)的多种传代条件，将BSC铺板于BSC-GM中，在0.25ug/cm2 iMatrix重组层粘连蛋白-511存在的情况下，以2,500个细胞/cm2的密度铺到T-75培养瓶上。24小时后，去除BSC-GM，用DPBS洗涤细胞1次，并加入Beefy-9培养基。将细胞培养至70％汇合度，用TrypLE Express(ThermoFisher#12604021)收获，以300g离心，并在iMatrix层粘连蛋白-511存在或不存在的情况下将细胞重悬在B8或Beefy-9培养基中。将细胞以5,000个细胞/cm2(0.25ug/cm2 iMatrix层粘连蛋白)的密度接种到12孔板上，并使用活细胞监测系统(Olympus Provi CM20,Tokyo,Japan)分析生长情况。24小时后，吸出培养基，并向所有细胞添加Beefy-9培养基。比较7天内的细胞生长情况，以确定接种+/-r白蛋白和+/-iMatrix层粘连蛋白的效果。
为了测试不同包被物的效果，根据生产商的说明书，在预先包被有聚-D-赖氨酸(Sigma#P1024-10MG)存在或不存在的情况下准备48孔板。然后，如上所述培养和收获细胞，以300g离心，并在不同浓度的iMatrix层粘连蛋白和/或截短型重组人玻连蛋白(ThermoFisher#A14700)存在的情况下将细胞重悬于B8培养基中。以5,000个细胞/cm2的密度接种细胞。24小时后，吸出培养基，并用DPBS冲洗细胞1次。然后向细胞添加含有10％PrestoBlue试剂(ThermoFisher#A13262)的Beefy-9培养基，并在37℃孵育。2.5小时后，将PrestoBlue培养基移至96孔板中，并分别使用以560和590nm为中心的激发和发射滤光片，用Synergy H1微孔板检测仪进行读取。然后将细胞培养基重新换为Beefy-9，并在第4天时重复进行PrestoBlue分析。
长期生长分析
为了生成长期生长曲线，将BSC解冻并置于BSC-GM中，在0.25ug/cm2 iMatrix层粘连蛋白-511存在的情况下，将BSC铺到(P1)6孔培养板上(孔一式三份)。让细胞粘附过夜后，移除培养基，用DPBS洗涤细胞1次，并向细胞中加入BSC-GM、B8、Beefy-9(40ng/mL FGF-2)或Beefy-9(5ng/mLFGF-2)。当达到约70％汇合度时，用DPBS冲洗细胞，用TrypLE Express收获细胞，并使用NC-200自动细胞计数器进行计数(每孔两次计数)。然后以300g沉淀细胞，重悬于BSC-GM或B8培养基中，重新计数，并在0.25ug/cm2 iMatrix层粘连蛋白-511(将细胞置于BSC-GM中)或1.5ug/cm2重组玻连蛋白(将细胞置于B8中)存在的情况下，以2,500个细胞/cm2的密度将细胞接种到新的6孔板上。让细胞粘附过夜后，将培养基替换为适当的培养基(BSC-GM、B8、Beefy-9(40ng/mL FGF-2)或Beefy-9(5ng/mL FGF-2))。在28天和7次传代内重复进行这一过程。在整个培养过程中，每两天对细胞进行一次补给。当接种细胞进行第2、4、6和7次传代时，接种另外的孔用于肌球蛋白重链(P2、P4和P6)和脂质积聚(P7)的染色。
无血清分化
在整个长期培养过程中，将第2、4和6代的细胞群在含血清或无血清条件下培养至汇合，并将培养基更换为先前描述的无血清分化培养基，该无血清分化培养基由Neurobasal(Invitrogen#21103049,Carlsbad,CA,USA)和L15(Invitrogen#11415064)基础培养基(1:1)组成，补充有1％抗生素/抗真菌剂、10ng/mL胰岛素样生长因子1(IGF-1；Shenandoah Biotechnology#100-34AF-100UG,Warminster,PA,USA)和100ng/mL表皮生长因子(EGF；Shenandoah Biotechnology#100-26-500UG)。将细胞分化4-6天(每两天更换培养基)。
培养和分化细胞的表征
为了验证在无血清培养基中分化的细胞的肌原性，如前所述，使用MHC的一级抗体(Developmental studies hybridoma bank#MF-20)、鬼笔环肽594(1:100)、适当的二抗(ThermoFisher#A-11001,1:1000)和含有DAPI的Fluoroshield封固介质对上述细胞进行固定、染色和成像。
为了分析培养物中的脂质积聚，将培养基替换为含有2μMBODIPYTM493/503(ThermoFisher#D3922)的PBS。将细胞在37℃孵育20分钟，用PBS洗涤2次，并用4％多聚甲醛固定30分钟。然后用PBS洗涤细胞3次，如前所述进行透化和封闭，并在室温在含有鬼笔环肽594(1:100)和1μg/mLDAPI(ThermoFisher#62248)的封闭溶液中孵育1小时。将染色的细胞用PBS冲洗3次，并如前所述通过荧光显微术成像。
统计学分析
使用GraphPad Prism 9.0软件(San Diego,CA,USA)进行统计学分析。根据情况，通过单因素或双因素ANOVA分析进行短期细胞生长分析，并使用Tukey’s HSD后续检验进行多重比较。通过非线性回归(最小二乘法；指数(马尔萨斯)生长)进行回归分析(图3A)，并与95％置信区间一起显示。对于每次传代的每个生物学重复(孔)，通过非线性回归(最小二乘法；指数(马尔萨斯)生长)确定倍增时间(图5B)，在生成非线性回归时使用技术重复(两次计数)。将p值<0.05视为具有显著性。除非另有说明，误差以±标准差给出。
结果
B8培养基可以在短期生长期间降低BCS的血清需求。
在整个实验过程中均使用牛卫星细胞。首先，在分离细胞分化之前和之后针对Pax7和肌球蛋白重链(MHC)进行染色，以验证这些干细胞的初始和终末状态。参见，Relaix,F.,Rocancourt,D.,Mansouri,A.&Buckingham,M.A Pax3/Pax7-dependent population ofskeletal muscle progenitor cells.Nat.2005 4357044 435,948–953(2005)和Jankowski,R.J.,Deasy,B.M.&Huard,J.Muscle-derived stem cells.Gene Ther.9,642–647(2002)。定量图像细胞术显示，96.3％的分离细胞呈Pax7阳性(如有必要，可以将与该分析相对应的图像提供给专利局，并且在本专利申请公开后，任何读者都可以通过搜索本发明人和其他共同作者描述这些实验的期刊文章来找到图像)，表明卫星细胞是高纯度的细胞群。在验证细胞身份后，通过在BSC-GM与自制B8或供应商提供的HiDef-B8(图1和图7)组合的混合物中进行短期BSC生长测定(3天和4天)，分析B8替换含血清培养基的能力。之所以选定这些时间点，是因为在快速生长条件下的细胞在第5天时达到汇合(数据未显示)。结果显示，与单独的BSC-GM相比，混合有BSC-GM的B8培养基在4天内显著增强了生长(图1A)，并且这种优势在FBS减少多达62.5％的情况下(62.5％ B8培养基)仍然存在。另外，血清减少87.5％在4天内未显著降低细胞生长。另一方面，虽然单独的B8培养基在3天内促进细胞生长(图1A&B)，但在第3天和第4天之间没有变化，表明生长未持续到第4天。这些结果表明，B8能够降低BSC的血清需求，但不能完全消除这些需求。
B8培养基补充增强细胞增殖。
为了克服单独使用B8培养基的不足，在一系列浓度下测试了许多补充剂(完整列表见表2)，并在四天内再次分析了生长情况。与单独使用B8培养基相比，其中六种因子显著增强了BSC增殖(如果有必要的话，可以提供图2A以及在表2中列出但图2A中没有的数据，或者可以在与本专利申请相对应的期刊出版物的补充材料中找到)。它们是白细胞介素-6(IL-6)、姜黄素、重组人白蛋白(r白蛋白)、血小板来源生长因子(PDGF-BB)、亚油酸和油酸。其中，r白蛋白特别有效，与普通B8相比，其使生长速度提高了约4倍。相比之下，与普通B8相比，其他补充剂最多只能产生约50％的增强。为了测试这些补充剂的组合是否可以为细胞生长提供协同效应，对最佳浓度的上述因子(但PDGF-BB除外，对于巨大的成本而言，认为它不够有效)进行了组合和测试(图2B)。在此，r白蛋白(800μg/mL)是所有显著增强的驱动因子。虽然与单独使用r白蛋白相比，IL-6(0.01ng/mL)和r白蛋白的组合略微增强了生长，但这种差异并不具有统计学意义。为了最大限度地简化培养基并最大限度地降低成本，通过单独补充800μg/mL r白蛋白，建立了具有9种成分的增强型B8培养基。之所以将这种培养基称为Beefy-9，是因为其成分数目和针对牛肌细胞培养而设计。这种培养基能够维持短期生长，与含血清BSC-GM相当，并能够在体外维持细胞形态(图2B&C)。
在Beefy-9培养基中传代。
虽然短期生长实验可用于确定补充r白蛋白的益处，从而调整B8培养基以满足BSC短期培养需求，但长期培养和传代对于培养肉类所需的稳健细胞扩增是必须的。然而，证明在初始传代后直接将细胞接种到Beefy-9培养基中是无效的，因为细胞不会重新粘附到组织培养塑料器具上。对于这一结果，假设了两种可能的解释。第一是，在不存在血清中其他粘附因子(例如，玻连蛋白和纤维粘连蛋白)的情况下，所用的包被物(0.25μg/cm2的层粘连蛋白-511)不足以实现细胞粘附。第二是，高浓度的白蛋白比层粘连蛋白更容易吸附到组织培养塑料器具上，从而进一步阻碍细胞粘附。为了克服这些可能的限制，研究了在白蛋白不存在的情况下进行BSC传代，并在铺板后一天添加白蛋白，以使细胞粘附到培养瓶上，以及在多种浓度的不同粘附蛋白存在的情况下传代细胞。由于这项工作的一个首要任务是简化培养基和细胞培养工作流程，因此重点关注成本相对较低且已经证明无需预先包被的重组粘附蛋白[例如，层粘连蛋白-511片段(iMatrix-511)和截短型玻连蛋白(Vtn-N)]。还研究了在粘附肽存在或不存在的情况下，聚-D-赖氨酸(PDL)包被物(这可以从市场上购买预先包被的板)是否增强细胞贴附。结果表明，延迟添加r白蛋白对于细胞粘附和生长是必要的，包被有细胞粘附肽诸如iMatrix-511也是如此(图3A)。然而，当比较各种细胞粘附肽时，结果表明与Vtn-N相比，iMatrix-511是次优的(图3C)。具体而言，与单独的PDL、单独的层粘连蛋白、PDL+层粘连蛋白或者在PDL存在或不存在的情况下的较低浓度Vtn-N相比，1.5μg/cm2的Vtn-N表现出更好的细胞粘附(第1天时)和生长(第4天时)。一旦确定了合适的传代方法，就用补充有多种生长因子的Beefy-9再次进行短期生长曲线，以排除吸附的血清蛋白可能对之前进行的短期生长曲线(其中在血清存在的情况下接种细胞)产生的混淆效应。未发现这些因子的显著影响，这再次证实了单独补充r白蛋白在多次传代中是最佳的。
在Beefy-9培养基中扩增后的无血清分化。
在确定延迟r白蛋白和1.5μg/cm2的Vtn-N作为BSC在Beefy-9中多次传代的合适参数后，测定了扩增细胞的肌原性。具体而言，将Beefy-9传代的细胞(P2)在Beefy-9中扩增至汇合，并在先前公布的无血清分化培养基中分化5天。参见，Mcaleer,C.W.,Rumsey,J.W.,Stancescu,M.&Hickman,J.J.Functional myotube formation from adult ratsatellite cells in a defined serum-free system.Biotechnol.Prog.31,997–1003(2015)。分化的细胞显示出形成多核肌管，其对成肌标志物肌球蛋白重链(MHC)染色呈阳性(图3C)。结果证实了在Beefy-9培养基中培养和传代的细胞的肌原性得以维持。总之，这些结果证明了一种用于增殖、传代和分化BSC的完全不含动物成分的培养系统(如果有必要的话，可以向专利局提供视频，或者读者可以在描述这些实验的期刊文章附带的补充材料中找到视频)。
Beefy-9培养基的成本降低策略。
接下来，我们通过降低FGF-2的浓度来研究Beefy-9的成本降低策略，FGF-2是基线浓度为40ng/mL时B8和Beefy-9配方的主要成本贡献者。如前所述，在B8和Beefy-9培养基中分析四天内的生长情况，其中FGF-2浓度范围为0-80ng/mL。结果显示，对于B8和Beefy-9，可以将FGF-2分别降低到5ng/mL和1.25ng/mL，而不会显著影响生长(图4A)。相反，从培养基中完全去除FGF-2会显著影响细胞生长和形态(图4A&B)。结果表明，大幅度减少FGF-2有可能降低Beefy-9的成本，而不会对短期生长速率产生负面影响。
Beefy-9培养基中的长期培养。
验证了用于短期生长的Beefy-9并建立了适当的传代方案之后的最后一步是验证BSC在Beefy-9中的长期扩增。如前所述接种BSC，并添加含血清BSC-GM、B8、含高FGF-2(40ng/mL)的Beefy-9或含低FGF-2(5ng/mL)的Beefy-9。保守选择低FGF-2浓度为不会显著影响B8或Beefy-9中短期生长的浓度。按照所述地对细胞进行培养和传代(图3B)，在28天内进行7次传代，并使用细胞计数来确定四周时间内的累积细胞倍增。虽然BSC-GM仍然是较长生长期内的最佳培养基，但含有高或低FGF-2含量的Beefy-9比未添加r白蛋白的B8培养基表现出显著增强(图5A)。事实上，单独的B8中的BSC在三次传代后就停止增殖(4.4次倍增)，而Beefy-9中的BSC则在至少七次传代内继续呈指数级扩增(40ng/mL FGF-2和5ng/mL FGF-2的倍增分别为18.2次和17.2次)。
将生长数据转换为倍增时间显示，在Beefy-9培养基中，倍增时间在七次传代内连续增加，而在BSC-GM中倍增时间增加更慢(即，持续得更好的增殖)(图5B)；然而，Beef-9培养基在前5次传代中的倍增时间仍低于48小时(13.7次倍增)，并且在所有7次传代中均低于56小时(18.2次倍增)。在含有高或低FGF-2浓度的Beefy-9中，七次传代内的平均倍增时间分别为约39小时和约41小时。这些时间高于已报道的体内卫星细胞约17小时的倍增时间，但是根据以前关于体外培养BSC的报道，仍处于预期范围之内。总之，这些结果表明，含有高和低FGF-2浓度的Beefy-9培养基对于牛卫星细胞的长期扩增均有效，但需要进一步优化以提高多次传代期间的生长速率。
长期培养期间的BSC表型和肌原性。
在整个长期培养过程中，在含血清和无血清条件下验证了BSC的肌原性。将来自第2、4和6代的细胞培养至汇合，在无血清分化培养基中分化，并如前所述针对肌球蛋白重链(MHC)进行染色。显示六次传代期间在BSC-GM和Beefy-9配制品中形成MHC阳性多核肌管(图像未显示，但如果有必要的话可以提供给专利局)。有趣的是，与BSC-GM相比，在Beefy-9培养基中培养的BSC在多次传代中的分化似乎有所增强，无论是在肌管大小和密度方面，还是在定量融合指数方面(图8)。这一结果可能是因为在分析点处，在BSC-GM中培养的细胞比在Beefy-9中培养的细胞经历了更多倍增，或者是因为非成肌细胞(例如，成纤维细胞样细胞)比成肌卫星细胞在含血清培养基中过度生长得更快。虽然在Beefy-9培养基中，肌原性在整个扩增过程中得以保持，但值得注意的是，肌管直径和密度在后期传代时出现降低。还注意到，在无血清条件下培养的细胞在长期培养期间似乎会积聚脂滴，而在BSC-GM中培养的细胞则不会(图像未显示，但如有必要可以提供给专利局)。这种异常的脂质积聚可能是由于在B8和Beefy-9中胰岛素浓度相对较高而导致细胞中的胰岛素抵抗，并且因此可以通过调节胰岛素水平来指向可能的培养基优化策略。或者，脂质积聚可能表明BSC在Beefy-9培养基中向成脂表型驱动，尽管BSC在无血清条件下的持续肌原性证实了这些培养基维持用于培养肉类的相关卫星细胞功能的能力。最后，在未来的研究中有必要对这一现象进行进一步探索。
培养基成本分析。
一旦证明了Beefy-9的功效，就进行简易的成本分析以了解目前依赖含血清培养基(例如，20％ FBS+1ng/mL FGF-2，如本研究中所用的)进行培养肉类研究的研究小组如何实施这种培养基。价格比较显示，即使使用购买的生长因子并且没有批量订购(如在本研究中)，Beefy-9培养基的成本也大大低于含血清培养基(分别为217美元/升和290美元/升)。在FGF-2为较低的5ng/mL的情况下，Beefy-9的价格进一步降至189美元/升。通过增加培养基成分订单的规模并使用粉状基础培养基，可以轻松实现进一步的价格成倍降低。具体而言，当批量订购成分时，含有高或低FGF-2浓度的Beefy-9的成本分别降至74美元/升和46美元/升(可以根据专利审查员的要求向他们提供成分采购的全面核算，或者读者可以找到与本实施例中描述的实验相关的期刊文章的补充材料)。与批量订购的BSC-GM相比，这相当于降低了75％的成本。在这项研究中，Beefy-9的价格主要由r白蛋白、基础培养基、FGF-2(高浓度)和胰岛素决定。如果对市售成分采用批量订购，则价格主要由FGF-2(高浓度)、r白蛋白和胰岛素决定，而基础培养基带来的影响明显减少。虽然Beefy-9易于在内部生产，但通过购买HiDef-B8培养基并简单地添加r白蛋白来制备HiDef-Beefy-9，可以实现进一步的易用性；然而，按目前的价格计算，这会导致成本大幅增加。
增加r白蛋白浓度增强生长。
虽然在上述工作中使用了800μg/mL的r白蛋白，但短期生长分析并未表明这是r白蛋白的最佳浓度，而仅仅是最初测试浓度中最好的。由于r白蛋白增加引起生长增强(图2)，因此研究了r白蛋白的额外增加是否可以进一步改进结果。对浓度高达11.2mg/mL的r白蛋白进行的短期分析表明，随着r白蛋白的增加会出现继续增强，与Beefy-9的800ug/mL(0.8mg/mL)相比，最高浓度使4天生长增强了8.5倍(图9)。有鉴于此，又研究了随着r白蛋白浓度的增加而进行的长期生长，并与最初的Beefy-9测试、HiDef Beefy-9(使用供应商提供的含有工程化生长因子的B8)和BSC-GM进行了比较(图7A-B)。虽然短期生长分析显示11.2mg/mL的r白蛋白提供了所测试浓度的最好结果，但成本分析显示，到6.4mg/mL r白蛋白时，Beefy-9的成本已经超过了含血清的BSC-GM。由于成本是本研究的一个关键因素，因此对高达但不超过6.4mg/mL的r白蛋白浓度进行了长期生长分析(图6A)。结果显示，在一个月的细胞扩增期间，白蛋白的增加增强了生长，对于含有3.2和6.4mg/mL r白蛋白的Beefy-9，总倍增分别超过19和20次(相比之下，含有0.8mg/mL r白蛋白的原始Beefy-9为18次)。以第28天时的总细胞计数计算，这些分别代表细胞产量提高了3倍和4倍(图6B)。第28天时，与0.8mg/mL的r白蛋白相比，1.6mg/mL r白蛋白未见提高，尽管在更早期传代中观察到连续提高。当比较生长增强与成本时，将r白蛋白增加至3.2mg/mL可使细胞数量增加3倍，而成本仅增加2倍。对于6.4mg/mL r白蛋白，这些值分别是4倍和3倍。因此，含有3.2mg/mL的r白蛋白的Beefy-9(称为“Beefy-9+”)可以提供细胞生长与培养基成本(148美元/升)的最佳比率，尽管在给定情况下使用的确切培养基可能取决于所讨论的应用的具体限制和优先事项。在含有额外r白蛋白的Beefy-9中培养的整个过程中，细胞保持了它们的肌原性，尽管对于在含有6.4mg/mL r白蛋白的培养基中生长的细胞(尤其是在较低FGF的情况下)，MF20染色的程度以及肌管密度和直径似乎有所降低。虽然在这项工作中未研究含有较低FGF的Beefy-9+，但有可能这会进一步提高性能/成本比率。另外，使用工程化生长因子(如在最初的B8工作中，以及在供应商提供的HiDef B8中)可以提高性能。这一点在长期生长研究中得到证实，其中与标准Beefy-9相比，观察到HiDef Beefy-9的细胞数量增加了2倍。
讨论。
培养肉类研究和开发自从其出现以来由于缺乏适合肌肉干细胞扩增的无血清培养基一直受到阻碍。这一缺陷导致该领域依赖FBS进行大多数研究，从而阻碍了研究结果的相关性。当期待无血清生产工艺时，情况尤其如此。因此，为相关细胞类型(例如，肌肉和脂肪)和相关物种(例如，牛科动物、猪科动物、鸡类等)开发无血清培养基对于加速该领域的研究至关重要。这些培养基至少应该是负担得起的、由食品安全成分组成、可靠且易于使用(例如，不要过于复杂)，以促进它们在广泛研究工作中的采用，并走向规模化生产工艺。在这项工作中，描述了两种培养基(Beefy-9和Beefy-9+)作为用于牛卫星细胞简易无血清培养的有希望候选者。这包括验证以下各项：1)这些培养基在促进BSC增殖方面的功效，2)当与不含r白蛋白的B8和截短型玻连蛋白组合使用时，这些培养基能够实现长期扩增的能力，3)当在Beefy-9和Beefy-9+中扩增时卫星细胞肌原性的保持，以及4)与含血清培养基相比，显著节约成本。
r白蛋白对Beefy-9针对BSC功效的重大影响是值得注意的，特别是考虑到在最初开发出B8时，添加白蛋白并没有显示出对iPSC生长产生如此深远的影响。白蛋白在细胞培养基中具有许多作用，并且实际上占血清中总蛋白的约60％。对于这些作用的深度总结，读者可以参考几篇详尽的综述。不过，简言之，白蛋白在培养基中发挥作用，以结合、运载和稳定化合物，诸如脂肪酸、金属离子、信号传导分子、氨基酸和其他因子。因此，它是一种强效且多层面的抗氧化剂，其可以隔离这些物质免受氧化还原或其他降解反应的影响，增加对细胞有益因子的半衰期、利用度和溶解性，同时减少有害副产物的积累。这些调节作用可能使Beefy-9和Beefy-9+比单独的B8更具优势，因为后者并非不能在短期内促进BSC的细胞分裂，而只是不能促进稳健且长期的扩增。有趣的是，也提出将白蛋白作为一种潜在保护剂用于抵御各种生物反应器中由于喷出气泡而造成的细胞应激，因此Beefy-9培养基可以在这些规模放大的生物工艺中提供额外的好处。
这项工作的一个主要目标是开发一种简易且低成本的培养基，因为这两个因素可以有助于降低培养肉类研究的进入门槛，以及有助于为更分散式生产系统(一些集中式企业之间的合并较少)奠定基础。成本分析表明，Beefy-9和Beefy-9+培养基应该易于实施，并且对于目前使用含血清(例如，20％ FBS)培养基进行培养肉类研究的学术实验室来说也是负担得起的(特别是在Beefy-9的情况下)。然而，应该注意的是，从工业角度来看，为了使培养肉类生产在经济上可行，仍然需要大幅降低无血清培养基的成本。在这里，降低白蛋白、生长因子和基础培养基的成本(例如，通过使用植物或藻类水解物)将是必要的。另外，将肉类相关细胞与产生营养或生长因子的细胞共培养可以提供宝贵的成本节约机会。当考虑Beefy-9时，很明显重组蛋白是成本的主要驱动因素。因此，进一步的研究应该探索这些重组蛋白的成本降低，或者替代或排除这些因子的机会。此外，应该注意的是，在不存在FBS中细胞粘附蛋白的情况下，需要大幅增加组织-容器包被物的浓度，以实现无血清培养过程中充分的BSC粘附和生长。在讨论大规模细胞培养的成本时，这一因素往往被忽视；然而，本研究依赖于1.5μg/cm2的Vtn-N，它增加了约0.18美元/cm2，或每个T-175培养瓶(我们实验室所用的标准容器，适用于在标准接种和传代密度下进行约5次倍增)31.75美元。降低与细胞粘附相关的成本的机会包括使细胞适应或工程化为悬浮培养，在其他因子存在或不存在的情况下用Vtn-N预先包被培养瓶，降低重组粘附蛋白生产的成本，或者探索重组物生产的低成本替代物。
虽然这项工作为研究人员提供了一种有前景的资源，并为进一步的培养基开发奠定了实用的基础，但很明显，有必要针对成本和长期功效进行进一步的培养基优化。具体而言，本项工作依赖于对培养基成分的一次一因素探索，以找到合适的补充剂来为牛肌肉干细胞定制B8。由于培养基成分与其对细胞生物学的影响密切相关，因此Beefy-9或Beefy-9+按原样不太可能是最佳的。事实上，在这项工作中看似无关紧要的培养基成分(例如，肝细胞生长因子或乙醇胺)可能会在Beefy-9开发过程中为未测试的其他培养基组合方式提供优势。针对培养基开发的计算方法更适合解决这种多因素问题，因此应该利用这些方法进一步优化Beefy-9和其他无血清培养基，以用于培养肉类应用。在这里，可以把工作重点放在脂肪和肌肉组织上，例如通过在Beefy-9中添加游离脂肪酸来诱导BSC转分化为脂质积聚细胞。此外，需要进一步的工作来克服在Beefy-9中七次传代期间培养的BSC中出现的长期生长较慢和异常脂质积聚。这方面有前景的选项包括使用自发性或遗传性永生化干细胞，这可以改善Beefy-9中的长期结果，以及探索不同浓度的胰岛素、脂肪酸或其他信号传导因子，以更好地控制沿着成肌与成脂途径的分化。
本项工作为改进培养肉类研究提供了一种简单、负担得起且有效的Beefy-9和Beefy-9+无血清培养基。然而，这些培养基的成本和功效将需要针对培养肉类的工业规模生产进一步优化，从而达到与传统肉类的价格持平。未来解决这些需求的工作可以集中在工程化尝试(例如，提高重组生长因子产率、产生物种特异性重组蛋白、优化培养基配方、培养基回收和细胞系工程化)和科学发现(例如，新型蛋白质类似物或替代物，或者对细胞信号传导通路的深入了解)上，以推动生产成本的降低。此外，对细胞来源和分离技术、细胞谱系控制(例如，成肌与成脂分化的控制)和生物反应器系统的探索可以建立在大量前期工作的基础上，并有助于提高生产效率和推动成本降低。在这里，培养肉类开发可能会为生物医学研究，诸如针对体积性肌肉损失的组织工程学或基于细胞的生物制药生产带来附带好处。最终，需要持续努力开发无血清培养基，以随着时间的推移不断降低成本并提高培养肉类的可扩展性，使产品更接近市场可行性，并使培养肉类的可能优势更接近现实。

Claims (20)

1.一种用于扩增肌卫星细胞的无血清且无动物成分培养基，其用于培养食品应用，所述培养基包括：
无血清且无动物成分的基准培养基，其在使用时为肌卫星细胞的扩增提供基准生长能力，以用于培养食品应用；
重组形式的白蛋白，
其中所述无血清且无动物成分培养基在使用时为肌卫星细胞的扩增提供改善的生长能力，以用于培养食品应用，
其中所述改善的生长能力比所述基准生长能力高出至少50％。
2.权利要求1所述的无血清且无动物成分培养基，其中所述无血清且无动物成分的基准培养基包含：
基础培养基；
一种或多种糖，浓度为0.01g/L至10g/L；
一种或多种氨基酸，浓度为0.001g/L至5g/L；
一种或多种维生素，浓度为0.001g/L至1g/L；
一种或多种任选的矿物质，浓度为0g/L至15g/L；
一种或多种微量元素，浓度为0.0001mg/L至10mg/L；
一种或多种生长刺激因子和/或细胞信号传导因子，浓度为0.01ng/mL至100,000ng/mL；以及
一种或多种运载蛋白，浓度为0.01g/L至1g/L。
3.权利要求1或2所述的无血清且无动物成分培养基，所述无血清且无动物成分培养基进一步包括以下一种或多种的重组形式：
白细胞介素6；
乙醇胺；
姜黄素；
油酸；或
亚油酸。
4.前述权利要求中任一项所述的无血清且无动物成分培养基，其中所述重组形式的白蛋白的存在量为至少50mg/L、至少100mg/L、至少200mg/L、至少250mg/L、至少500mg/L、至少750mg/L、至少1g/L、至少2g/L、至少5g/L、至少10g/L、至少15g/L或至少20g/L和至多60g/L、至多50g/L、至多40g/L、至多30g/L、至多25g/L、至多20g/L、至多15g/L、至多10g/L、至多5g/L、至多2g/L、至多1.5g/L或至多1g/L。
5.前述权利要求中任一项所述的无血清且无动物成分培养基，其中所述重组形式白蛋白的存在量为约800mg/L。
6.前述权利要求中任一项所述的无血清且无动物成分培养基，其中所述重组形式的白蛋白是重组形式的人白蛋白。
7.前述权利要求中任一项所述的无血清且无动物成分培养基，所述无血清且无动物成分培养基包含重组形式的白细胞介素6。
8.前述权利要求中任一项所述的无血清且无动物成分培养基，所述无血清且无动物成分培养基包含重组形式的乙醇胺。
9.前述权利要求中任一项所述的无血清且无动物成分培养基，所述无血清且无动物成分培养基包含重组形式的姜黄素。
10.前述权利要求中任一项所述的无血清且无动物成分培养基，所述无血清且无动物成分培养基包含重组形式的油酸。
11.前述权利要求中任一项所述的无血清且无动物成分培养基，所述无血清且无动物成分培养基包含重组形式的亚油酸。
12.前述权利要求中任一项所述的无血清且无动物成分培养基，其中所述无血清且无动物成分的基准培养基是B8培养基。
13.前述权利要求中任一项所述的无血清且无动物成分培养基，其中所述无血清且无动物成分的基准培养基包含基础培养基、L-抗坏血酸2-磷酸盐、重组胰岛素、重组转铁蛋白、亚硒酸钠、重组成纤维细胞生长因子2、重组神经调节蛋白1和重组转化生长因子β3。
14.前述权利要求中任一项所述的无血清且无动物成分培养基，其中所述肌卫星细胞是牛科动物、鸡类、绵羊属动物、猪科动物、马科动物、鼠科动物、山羊属动物、兔类或鱼类的。
15.前述权利要求中任一项所述的无血清且无动物成分培养基，其中所述肌卫星细胞是牛科动物、鸡类、猪科动物或鱼类的。
16.一种制备无血清且无动物成分培养基的方法，所述方法包括将重组白蛋白添加至无血清且无动物成分的基准培养基中，从而产生所述无血清且无动物成分培养基。
17.一种制备工程化细胞的方法，所述方法包括在前述权利要求中任一项所述的无血清且无动物成分培养基中扩增肌卫星细胞。
18.前一项权利要求所述的方法，所述方法进一步包括：
在扩增所述肌卫星细胞之前：i)用重组形式的细胞粘附肽包被所述肌卫星细胞；或者ii)将所述肌卫星细胞粘附在所述无血清且无动物成分的基准培养基和/或不同的无血清且无动物成分的基准培养基中，所述不同的无血清且无动物成分的基准培养基缺乏所述重组形式的白蛋白。
19.前一项权利要求所述的方法，所述方法包括步骤i)的包被和步骤ii)的粘附。
20.前两项权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组形式的细胞粘附肽选自下组：重组形式的层粘连蛋白或其片段、玻连蛋白或其片段、聚-d-赖氨酸、聚-l-赖氨酸、纤维粘连蛋白或其片段、基质胶(Matrigel)及其组合。
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