JP2014531217A - ｃ−ＭｅｔのＳＥＭＡドメイン内のエピトープに特異的に結合する抗体 - Google Patents

ｃ−ＭｅｔのＳＥＭＡドメイン内のエピトープに特異的に結合する抗体 Download PDF

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Abstract

ｃ−ＭｅｔのＳＥＭＡドメイン内のエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、並びにそれと係わる医薬組成物、方法、キット及び細胞である。【選択図】図４

Description

本発明は、ｃ−ＭｅｔのＳＥＭＡドメイン内のエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、並びにそれと係わる医薬組成物、方法、キット及び細胞に関する。
肝細胞成長因子（ＨＧＦ：hepatocyte growth factor）は、チロシンキナーゼ受容体であるｃ−Ｍｅｔの細胞の外部位に結合し、多様な正常細胞及び腫瘍細胞において、分裂、移動、形態発生、および血管新生を誘発する間充織由来の多面発現性サイトカイン（mesenchyme-derived pleitrophic cytokine）の一種である。ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路の調節は、腫瘍の進行、転移、移動、浸襲及び血管新生のような、がんがんと係わる多様なメカニズムに関与する。また、ｃ−Ｍｅｔの増幅または突然変異は、リガンド非依存性発がん（ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ）を誘発するものと見られる。従って、ｃ−Ｍｅｔは、抗がん治療のための新たなターゲットとして注目されている。
特に、ｃ−Ｍｅｔは、従来知られている抗がん剤の作用メカニズムにおいて、薬物耐性に関与すると知られながら、さらに一層、いわゆるオーダーメイド医療における重要性が認識されている。ＥＧＦＲ（ＥＲＢＢ１）を標的とする代表的な抗がん治療剤であるエルビタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）またはタルセバ（Ｔａｒｃｅｖａ）のような薬物は、がん発生メカニズムと係わるシグナル伝達を遮断することによって作動する。また、乳癌治療剤として周知のハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）は、ＥＲｂＢ２（ＨＥＲ２）を標的として、細胞増殖に必要なシグナル伝達を遮断することによって作動する。しかし、前記薬剤に対する耐性がある患者のうち、ｃ−Ｍｅｔタンパク質の過剰発現などにより、抗がん剤の作動を避け、細胞増殖を誘導する他のシグナル伝達メカニズムが活性化されるという研究が最近発表されている。かような理由により、ｃ−Ｍｅｔは、抗がん剤と係わって、多数の製薬会社が注目している標的分子になっている。
関連技術は、ｃ−Ｍｅｔの作用を阻害する抗体治療剤を開示している。しかし、前記関連技術は、本来の構造を有する抗体は、ｃ−Ｍｅｔ分子の二量体化を誘導し、それによって、がんを誘発する問題点が発見された。
ｃ−Ｍｅｔの作用を阻害する抗体治療剤を開示する他の関連技術は、この抗体が、ｃ−ＭｅｔのリガンドであるＨＧＦｃ−Ｍｅｔへのｃ−Ｍｅｔの結合を阻害する機能はあるが、抗体自体のｃ−Ｍｅｔへの結合により、リガンドとは係わりなく、ｃ−Ｍｅｔの二量体化を誘発し、かえってがんを引き起こすシグナルを伝達させるアゴニストとして作用するという副作用が発見された。
他の関連技術は、ｃ−Ｍｅｔの二量体化を防止するために、本来は、アゴニストである両腕抗体（two-armed antibody）を、遺伝子組み換え技術を用いて修飾することで作製した、ｃ−Ｍｅｔに対する片腕拮抗（one-armed antagonistic）抗体を開示しており、現在、それに対する臨床試験段階の製品開発が進められている。しかし、前記関連技術において、前記抗体は、化学療法と併用する治療の場合にのみ効果を示し、抗体単独で処理する場合には、抗がん効果が大きくないことが確認された。 従って、従来技術によるとしても、ｃ−Ｍｅｔの作用を阻害する、がん予防用またはがん治療用の新たな医薬組成物を開発するために、ｃ−Ｍｅｔ上の標的部分を研究する必要性がある。
本発明の一実施形態は、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内のエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片を提供する。
本発明の他の実施形態は、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内のエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片を含むがん予防用またはがん治療用の医薬組成物、がんを治療する方法、ｃ−Ｍｅｔ拮抗剤をスクリーニングする方法、がん診断用キット、抗体または抗原結合断片をコードする核酸、核酸を含む細胞、及び抗体または抗原結合断片を作製する方法を提供する。
本発明の一実施形態は、配列番号１のアミノ酸配列で表示されるｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内のエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片を提供する。
本発明の一実施形態によるｃ−ＭｅｔのＳＥＭＡドメイン内のエピトープに特異的に結合する抗体、及びそれを含むがん予防用またはがん治療用の医薬組成物によれば、がんを効率的に予防または治療することができる。
図１は、所望するＣＤＲに変異を加えたｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖライブラリー遺伝子を得るためのオーバーラップ・エクステンションＰＣＲ（overlap extension ＰＣＲ）法を示す概路図である。 図２は、マウス抗体ＡｂＦ４６の全長ｃ−Ｍｅｔに対する認識力を確認する結果を示す図である。 図３は、マウス抗体ＡｂＦ４６のＳＥＭＡドメインに対する認識力を確認した結果を示す図である。 図４は、ｈｕＡｂＦ４６抗体のエピトープマッピングの酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示すグラフである。 図５Ａは、ＳＥＭＡドメイン上のｈｕＡｂＦ４６抗体のエピトープ位置を確認する図面である。 図５Ｂは、ＳＥＭＡドメイン上のｈｕＡｂＦ４６抗体のエピトープ位置を確認する図面である。 図６Ａは、ＢｒｄＵアッセイによる、ヒト化抗体ｈｕＡｂＦ４６のアゴニスト作用の程度を確認した結果を示すグラフである。 図６Ｂは、ＢｒｄＵアッセイによる、ヒト化抗体ｈｕＡｂＦ４６のアゴニスト作用の程度を確認した結果を示すグラフである。 図７は、一実施形態によるｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（Ｕ６−ＨＣ７），ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２ｈｉｎｇｅ）及びｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１（ＩｇＧ２Ｆｃ）抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞増殖（cell viability）分析を行った結果を示すグラフである。 図８Ａは、Ａｋｔリン酸化による、ヒト化抗体ｈｕＡｂＦ４６のアゴニスト作用の程度を確認した結果を示すグラフである。 図８Ｂは、Ａｋｔリン酸化による、ヒト化抗体ｈｕＡｂＦ４６のアゴニスト作用の程度を確認した結果を示すグラフである。 図９は、ｃ−Ｍｅｔの分解程度を測定によって、一実施形態によるｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１，ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ２，ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ３，およびｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ５抗体の抗がん効果を確認した結果を示すグラフである。 図１０は、一実施形態によるヒト化抗体ｈｕＡｂＦ４６のｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞増殖分析を行った結果を示すグラフである。 図１１Ａは、一実施形態による、マウス脳癌異種移植動物モデルまたは胃癌異種移植動物モデルを使用して、マウス抗体ＡｂＦ４６及びキメラ抗体ｃｈＡｂＦ４６のｉｎ ｖｉｖｏでの抗がん効果分析の結果を示すグラフである。 図１１Ｂは、一実施形態による、マウス脳癌異種移植動物モデルまたは胃癌異種移植動物モデルを使用して、マウス抗体ＡｂＦ４６及びキメラ抗体ｃｈＡｂＦ４６のｉｎ ｖｉｖｏでの抗がん効果分析の結果を示すグラフである。 図１１Ｃは、一実施形態による、マウス脳癌異種移植動物モデルまたは胃癌異種移植動物モデルを使用して、マウス抗体ＡｂＦ４６及びキメラ抗体ｃｈＡｂＦ４６のｉｎ ｖｉｖｏでの抗がん効果分析の結果を示すグラフである。 図１２は、一実施形態による、マウス抗体ＡｂＦ４６及びヒト化抗体ｈｕＡｂＦ４６のｉｎ ｖｉｖｏでの抗がん効果分析を、異種移植肺癌マウス動物モデルを対象にして行った結果を示すグラフである。
ここで、本発明の様々な実施形態が詳細に参照され、その実施例は添付図面に例証されているが、類似の番号は各図面を通して同一の要素を示している。この点については、この実施形態が異なる形態を持ちうること、および、ここに述べられる説明に限られているものとして解釈されるべきではない。したがって、実施形態は、図を参照することによって、この記述の様態を説明するために下記に単に記載されたのみである。ここに用いられているように、「および／または」という語は、関連する記載された項目の一つ以上のすべての組合せを含む。
本発明の一実施形態は、配列番号１のアミノ酸配列で表示されるｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内のエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片を提供する。
用語「ｃ−Ｍｅｔ」または「ｃ−Ｍｅｔタンパク質」は、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）と結合する受容体チロシンキナーゼを意味する。前記タンパク質は、例えば、GenBank Aceession Number ＮＭ＿０００２４５でもって提供されたヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチド、またはGenBank Aceession Number ＮＭ＿０００２３６でもって提供されたポリペプチド配列によってコードされたタンパク質、またはその細胞外ドメインを含む。受容体チロシンキナーゼｃ−Ｍｅｔは、例えば、発がん、がん転移、がん細胞移動、がん細胞浸透、新生血管生成過程のようなさまざまなメカニズムに関与する。
肝細胞成長因子（ＨＧＦ：hepatocyte growth factor）の受容体であるｃ−Ｍｅｔは、細胞外部位、膜透過部位、細胞内部位の３つの部分に区分され、細胞外部位の場合、二硫化結合によって、α−小単位体とβ−小単位体とが連結された形態で、ＨＧＦ結合ドメインであるＳＥＭＡドメイン、ＰＳＩドメイン（plexin-semaphorins-integrin homology domain）及びＩＰＴドメイン（immunoglobulin-like fold shared by plexins and transcriptional factors domain）からなる。すなわち、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメインは、ｃ−Ｍｅｔの細胞外部位に存在するドメインであり、ＨＧＦが結合する部位に該当する。特に、前記配列番号１のアミノ酸配列を有するエピトープ（epitope）は、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内のエピトープのうち、２番及び３番のプロペラドメイン間のループ（loop）部位に該当する。
用語「エピトープ」は、抗原決定部位（antigenic determinant）であり、抗体によって認識される抗原の一部分を意味するものであると解釈される。一実施形態によれば、前記エピトープは、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドでもありうる。前記ポリペプチドもまた、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内に存在するエピトープでもありうる。
前記配列番号２のアミノ酸配列を有するエピトープは、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内の２番及び３番のプロペラ構造のドメイン間のループ部位のうち、最外に位置した領域に該当し、前記配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープは、一実施形態による抗体または抗原結合断片が最も特異的に結合する部位である。
前記抗体または抗原結合断片は、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群から選択される一つ以上の重鎖相補性決定領域のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群から選択される一つ以上の軽鎖相補性決定領域のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含みうるものでもある。
前記重鎖可変領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域は、配列番号１１のアミノ酸配列を有していてもよい。
前記抗体またはその抗原結合断片（antigen binding fragment）は、モノクローナル抗体、またはｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２からなる群から選択される抗原結合断片でもあってもよい。
天然に存在するインタクトな抗体または免疫グロブリンは、下記４個のポリペプチドを含む：２個の全長軽鎖（light chain）、及び２個の全長重鎖（heavy chain）であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で結合されている。抗体の不変領域は、重鎖不変領域及び軽鎖不変領域に分けられ、重鎖不変領域は、ガンマ（γ）型、ミュー（μ）型、アルファ（α）型、デルタ（δ）型及びイプシロン（ε）型を有し、サブクラスとして、ガンマ１（γ１）型、ガンマ２（γ２）型、ガンマ３（γ３）型、ガンマ４（γ４）型、アルファ１（α１）型及びアルファ２（α２）型を有する。軽鎖の不変領域は、カッパ（κ）型及びラムダ（λ）型を有する。軽鎖は、抗体において配列が異なり、特定抗原に対する抗体の結合および特異性に利用される。
用語「重鎖」は、抗原への特異性を決定するアミノ酸配列を有する可変領域ＶＨと、３個の不変領域ドメインＣＨ１，ＣＨ２及びＣＨ３を有する不変領域と、を含む全長重鎖、およびその断片のいずれをも含む意味に解釈される。また、用語「軽鎖」は、抗原への特異性を決定するアミノ酸配列を有する可変領域ＶＬと、不変領域ドメインＣＬと、を含む全長軽鎖、およびその断片をいずれをも含む意味に解釈される。
用語「ＣＤＲ（complementarity determiningregion）」は、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の高度可変領域（hypervariable region）のアミノ酸配列を意味する。前記ＣＤＲは、抗体が、抗原またはエピトープに結合するにおいて、主な接触残基を提供することができる。重鎖及び軽鎖は、それぞれ３個のＣＤＲを含んでもよい（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、及びＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）。４個のフレームワーク領域は、ＣＤＲよりはさらに高度に保存されたアミノ酸配列を有し、ＶＨまたはＶＬにおいてＣＤＲ領域を分離する。
用語「抗原結合断片」は、免疫グロブリン全体構造に対するその断片であり、抗原が結合することができる部分を含むポリペプチドの一部を意味する。例えば、抗原結合断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片またはｓｃＦｖ断片があるが、それらに限定されるものではない。Ｆａｂ断片は、１個の抗原結合部位を有し、軽鎖及び重鎖の可変領域、軽鎖の不変領域、並びに重鎖の最初の不変領域ＣＨ１を含む。Ｆａｂ’断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に、一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（hinge region）を追加して含むという点で、Ｆａｂと違いがある。Ｆ（ａｂ’）２断片は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基が、ジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変部位及び軽鎖可変部位のみを有している最小の抗体断片であり、Ｆｖ断片を生成する組み換え技術は、当業者にとって周知である。二本鎖Ｆｖ（two-chain Ｆｖ）は、非共有結合によって、重鎖可変部位と軽鎖可変部位とが結合されている。単鎖Ｆｖ（single-chain Ｆｖ）は、一般的に、ペプチドリンカーを介して、重鎖の可変領域と、軽鎖の可変領域とが共有結合で連結されるか、あるいはＣ末端においてそのまま結合されており、二本鎖Ｆｖのように、ダイマーのような構造をなすことができる。前記抗原結合断片は、タンパク質加水分解酵素を利用して得られ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すれば、Ｆａｂを得ることができ、ペプシンで切断すれば、Ｆ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、遺伝子組み換え技術を用いて作製することができる。
前記ｃ−Ｍｅｔは、ヒトｃ−Ｍｅｔ、サルｃ−Ｍｅｔ、マウスｃ−Ｍｅｔ及びラットｃ−Ｍｅｔからなる群から選択されるｃ−Ｍｅｔから由来したものでもある。
本発明の他の実施形態は、配列番号１のアミノ酸配列で表示されるｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内のエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片の治療的有効量、薬学的に許容される担体、及び希釈剤または賦形剤を含むがん予防用またはがん治療用の医薬組成物を提供する。
前記がんは、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、皮膚癌、肌または眼球の黒色腫、直腸癌、肛門付近の癌、食道癌、小腸腫瘍、内分泌系腫瘍（Ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｇｌａｎｄ）、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、慢性または急性の白血病、リンパ球性リンパ腫、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頚部癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞腺腫、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺腫瘍、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌及び頭頚部癌からなる群から選択されるものでもある。
一実施形態によれば、前記エピトープは、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよい。
がん予防用または、がん治療用の前記医薬組成物は、作製薬学的に許容される担体を含んでもよい。前記組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム（アラビア・ゴム、gum acacia）、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、オキシ安息香酸メチル(メチルヒドロキシベンゾエート)、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウムおよび／またはミネラルオイルなどを含むが、それらに限定されるのではない。前記医薬組成物は、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤（flavor enhancer）、乳化剤、懸濁液剤、保存剤などをさらに含んでもよい。
前記がん予防用またはがん治療用の医薬組成物は、経口または非経口で投与することができる。非経口投与である場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与することができる。経口投与時、タンパク質またはペプチドは消化されることから、経口用組成物においては、分解を避ける為に、有効成分をコーティングすること、または剤形化することができる。また、前記医薬組成物は、投与後に標的細胞に向かうための能力を備えることができる。
前記がん予防用またはがん治療用の医薬組成物の適する投与量は、製剤化方法；投与方式；患者の年齢、体重、性別、病的状態、飲食物；投与時間；投与経路；排泄速度及び反応感応性；のような要因によって、多様に処方されることができる。前記組成物の望ましい投与量は、成人を基準にして、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲内である。用語「治療的有効量（therapeutically effective amount）」は、がんの予防または治療、または血管新生による疾患の予防または治療に十分な量を意味する。
前記組成物は、当業者が容易に実施することができる方法により、薬学的に許容される担体及び／または賦形剤を利用して、製剤化することによって、単位用量形態で作製されることも、あるいは多用量容器内に込められて作製されることもできる。このとき、剤形は、オイル内または水性媒質内の溶液、懸濁液、シロップ剤、乳化液状、エキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態でもあり、分散剤または安定化剤を追加して含んでもよい。また、前記組成物は、個別治療剤として投与することも、あるいは他の治療剤と併用して投与することもでき、従来の治療剤と、順次または同時に投与されもする。一方、前記組成物は、抗体またはその抗原結合断片を含むので、免疫リポソームに剤形化されもする。抗体を含むリポソームは、当業者に周知の方法によって作製される。前記免疫リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びポリエチレングリコール誘導体化されたホスファチジルエタノールアミンを含む脂質組成物であり、逆相蒸発法によって作製することもできる。例えば、抗体のＦａｂ’断片は、チオール・ジスルフィド交換反応を介して、リポソームに接合されうる。ドキソルビシンのような化学治療剤が追加してリポソーム内に含まれてもよい。
前記抗体または抗原結合断片は、ｃ−Ｍｅｔタンパク質の拮抗剤（antagonist）でもある。
用語「拮抗剤（アンタゴニスト）」は、標的物（例えば、ｃ−Ｍｅｔ）の生理活性のうち一つ以上を、部分的に、あるいは完全に遮断、抑制または中和させる全ての分子を含む概念に解釈される。例えば、アンタゴニスト（拮抗剤）抗体は、抗体に結合する抗原（例えば、ｃ−Ｍｅｔ）の生理活性を抑制する、あるいは低減する抗体を意味する。前記アンタゴニストは、リガンドに対する受容体の結合により、受容体リン酸化（phosphorylation）を低下させたり、あるいはリガンドによって活性化された細胞を不活性化させたり、あるいは死滅させたりすることができる。また、アンタゴニストは、受容体とリガンドとの間の相互作用を完全に断絶すること、あるいは受容体の三次構造の変化または減少調節（down regulation）することによって、前記相互作用を実質的に低減させることができる。
一実施形態において、前記抗体またはその抗原結合断片は、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択される一つ以上の重鎖相補性決定領域のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに配列番号９、配列番号１０及び配列番号１１からなる群から選択される一つ以上の軽鎖相補性決定領域のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含んでいてもよい。また、前記重鎖可変領域は、配列番号１２のアミノ酸配列からなり、前記軽鎖可変領域は、配列番号１３のアミノ酸配列を有していてもよい。
本発明の他の一実施形態においては、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内のエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片の治療的有効量であって、前記エピトープは、配列番号１のアミノ酸配列またはその部分であり、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含むがん予防用またはがん治療用の医薬組成物を個体に投与する段階を含むがん治療方法を提供する。
がん予防用またはがん治療用の医薬組成物及び、その投与方法は、前述の通りである。
前記がん予防用またはがん治療用の医薬組成物が投与される個体は、全ての動物を含む。例えば、前記動物は、ヒト、イヌ、ネコまたはマウスでもよい。
本発明のさらに他の一実施形態は、ｃ−Ｍｅｔ拮抗剤（アンタゴニスト）をスクリーニングする方法を提供し、該方法は、分析のためにｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内のエピトープと試料を接触させること（ここで、前記エピトープは配列番号１のアミノ酸配列、またはその部分を含む）、；および、エピトープの試料への結合を検出すること（ここで前記エピトープ及び試料が１ｐＭ〜１０ｎＭの範囲の結合親和力を示す場合、前記試料は候補ｃ−Ｍｅｔ拮抗剤とする）、を含む、ｃ−Ｍｅｔ拮抗剤をスクリーニングすること含む。
前記スクリーニング方法によれば、まず、配列番号１のアミノ酸配列またはその部分を有するｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内のエピトープを、分析する試料と接触させる。前記ｃ−Ｍｅｔは、ヒトｃ−Ｍｅｔ、サルｃ−Ｍｅｔ、マウスｃ−Ｍｅｔ及びラットｃ−Ｍｅｔからなる群から選択されるｃ−Ｍｅｔから由来したものでもあるが、それらに限定されるものではない。本明細書で使用された用語「試料（サンプル）」は、該試料が、配列番号１のアミノ酸配列またはその部分を有するｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内のエピトープと結合するか否かということを確認するスクリーニング方法において使用された未知の物質を意味する。前記試料は、例えば、抗体・抗原結合断片のようなポリペプチド、化学物質、ポリヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ（short hairpin ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（small interference ＲＮＡ）及び天産抽出物を含むが、それらに限定されるのではない。
次に、分析する試料と、配列番号１のアミノ酸配列またはその部分を有するｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内のエピトープとの結合親和力が測定される。前記結合親和力の測定は、当業者に公知の多様な方法を介して実施される。例えば、前記結合親和力は、ビアコア（Biacore）装置を使用して測定することができる。一般的に、治療用薬品として、前記結合親和力が認められる範囲は、結合定数であるＫＤ値が１０ｎＭ以下であると定義される。すなわち、例えば、配列番号１のアミノ酸配列として表示されるｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内のエピトープと、分析する試料（例えば、抗体）との結合親和力は、ビアコア装置を用いて表面プラズモン共鳴（surface Plasmon resonance）方法で測定したとき、１ｐＭ〜１０ｎＭ、または１０ｐＭ〜１０ｎＭ、または１００ｐＭ〜１０ｎＭである場合、前記試料（例えば、抗体）をがん予防用またはがん治療用の候補物質と判断する。
前記エピトープは、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよい。すなわち、前記スクリーニング方法で、配列番号１のアミノ酸配列、またはその部分を有するｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内のエピトープの代わりに、前記配列番号２または３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを使用する場合にも、前述と同様のスクリーニング結果を得ることができる。
本発明の他の一実施形態は、前記抗体またはその抗原結合断片、抗体、抗体断片及びタンパク質のエピトープ結合を利用する多様な適用のための生命工学的ツールを含むがん診断用キットを提供する。
前記がんは、例えば、肺癌または卵巣癌であってもよいが、それらに限定されるものではない。一部の肺癌患者または卵巣癌患者において、前記ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内で、配列番号３で表示されるエピトープのうち、１６８番目のアミノ酸であるＧｌｕが、Ａｓｐに変異が起こったと知られている（Ｍ．Sattler ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒ．Ａｄｖ．Ｍｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．２０１１、３（４）：１７１−１８４）。
前記配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号３のアミノ酸配列を有するｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内のエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片は、生物学的試料に含まれてもよい。例えば、前記生物学的試料は、がんの疑いがある患者の組織、細胞または全血であってもよいが、それらに限定されるものではない。
配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号３のアミノ酸配列を有するｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内のエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片は、前記配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープに対する高い結合親和力を有し、前記変異を有するｃ−Ｍｅｔタンパク質のエピトープ（配列番号７０）に対する低い結合親和力を有する。従って、がんの疑いのある患者に由来する生物学的試料を、配列番号３のアミノ酸配列を有するエピトープと接触させた場合、抗原−抗体複合体が形成され、配列番号７０のアミノ酸配列を有するエピトープと接触させた場合、抗原−抗体複合体が形成されなければ、前記患者は、がんを患っていると診断される。
前記抗原−抗体複合体の形成は、比色法（colormetric method）、電気化学法（electrochemical method）、蛍光法（fluorimetric method）、発光法（luminometry）、粒子計数法（particle counting method）、肉眼測定法（visual assessment）または閃光計数法（scintillation counting method）のような多様な検出（detection）方法を使用して確認することができる。
本明細書で使用された前記用語「検出」は、抗原−抗体複合体を検出するためのものであり、さまざまなマーカーを使用して行われる方法をいう。マーカーの例としては、酵素、蛍光物質、リガンド、発光物質、ナノ粒子または放射性同位体を含むが、それらに限定されるものではない。
前記酵素の例としては、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）及びβ−ラクタマーゼを含む。蛍光物質の例としては、フルオレシン、Ｅｕ３＋、Ｅｕ３＋キレート及びクリプテートを含む。リガンドは、ビオチン誘導体などであり得る。発光物質は、アクリジニウムエステル及びイソルミノール誘導体などでもあり得る。ナノ粒子の例としては、コロイド金ナノ粒子、及び着色されたラテックスナノ粒子を含む。放射性同位体の例としては、５７Ｃｏ、３Ｈ、１２５Ｉ及び１２５Ｉ−ボントン（Bonton）ハンター（Hunter）試薬を含む。
例えば、抗原−抗体複合体は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を利用して検出される。ＥＬＩＳＡの例としては、固体支持体に付着された抗原を認知する標識された抗体を利用する直接的ＥＬＩＳＡ（直接法）、固体支持体に付着された抗原を認知する抗体の複合体において、捕獲抗体を認知する標識された二次抗体を利用する間接的ＥＬＩＳＡ（間接法）、固体支持体に付着された抗体と抗原との複合体において、抗原を認知する標識された他の抗体を利用する直接的サンドイッチＥＬＩＳＡ（）、並びに固体支持体に付着された抗体と抗原との複合体において、抗原を認知する他の抗体と反応させた後、該抗体を認知する標識された二次抗体を利用する間接的サンドイッチＥＬＩＳＡを含む。前記抗体またはその抗原結合断片は、検出標識を有することができる。抗体またはその抗原結合断片が検出標識を有さない場合は、前記抗体または抗原結合断片は、これらを捕獲することができ、さらに検出標識を有する他の抗体で処理される。
一実施形態によれば、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内のエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸であって、前記エピトープは、配列番号１のアミノ酸配列またはその部分を有する、核酸が提供される。前記抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、選択的にベクターに挿入されたものであってもよい。
本発明の他の一実施形態によれば、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内のエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を含む細胞が提供される。前記エピトープは配列番号１のアミノ酸配列またはその部分を有する。
本発明の他の一実施形態によれば、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内のエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を作製する方法が提供される。前記エピトープは配列番号１のアミノ酸配列またはその部分を有し、前記抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を細胞で発現させる。
以下、一つ以上の具体例について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、一つ以上の具体例を例示的に説明するためのものであり、発明の範囲がそれら実施例に限定されるものではない。
実施例１：ｃ−Ｍｅｔに対するマウス抗体ＡｂＦ４６の生産
（１）マウスの免疫処理
ハイブリドーマ細胞株の開発に必要な免疫化されたマウスを得るために、５匹のマウスに、１匹当たり１００μｇのヒトｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ Systems社製）と、同量の完全フロイントアジュバント（complete Freund’s adjuvant）とを混合し、４〜６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本エスエルシー株式会社製）の腹腔内に注射した。２週後に、前述と同様の方法で、抗原（先に注射した量の半分）を、不完全フロイントアジュバント（incomplete Freund’s adjuvant）と混合し、マウスの腹腔内に注射した。１週間後、最後のブースティング（boosting）を行い、３日後に、前記マウスの尾から採血して血清を得た後、１／１，０００で、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、ＥＬＩＳＡで、ｃ−Ｍｅｔを認知する抗体の力価（titer）が増大することを確認した。その後、得られた結果から抗体の量が十分に得られるマウスを選別し、細胞融合工程を遂行した。
（２）細胞融合及びハイブリドーマ細胞の作製
細胞融合実験の３日前、５０μｇのＰＢＳと、ヒトｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合タンパク質との混合物を腹腔内に注射して免疫化させたマウスに麻酔をかけ、胴体の左側に位置した脾臓（spleen）を摘出した。摘出した脾臓をメッシュですりつぶして細胞を分離し、培養培地（ＤＭＥＭ）と混合し、脾臓細胞懸濁液を作った。前記懸濁液を遠心分離し、細胞層を回収した。前記得られた脾臓細胞１×１０８個と、骨髄腫細胞（Ｓｐ２／０）１×１０８個とを混合した後、遠心分離し、細胞を沈澱させた。遠心分離された沈殿物を徐々に分散させ、培養培地（ＤＭＥＭ）に入っている４５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（１ｍｌ）で処理し、３７℃で１分間維持した後、培養培地（ＤＭＥＭ）１ｍｌを添加した。その後培養培地（ＤＭＥＭ）１０ｍｌを１分間添加し、３７℃の水で５分間放置した後、５０ｍｌに合わせてさらに遠心分離した。細胞沈殿物を分離培地（ＨＡＴ培地）に、１〜２×１０５／ｍｌに再懸濁させ、９６ウェル（well）プレートに０．１ｍｌずつ分注した後、３７℃二酸化炭素細菌培養器で培養し、ハイブリドーマ細胞を作製した。
（３）ｃ−Ｍｅｔタンパク質に対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞の選別
前記（２）で作製されたハイブリドーマ細胞群において、ｃ−Ｍｅｔタンパク質にだけ特異的に反応するハイブリドーマ細胞を選別するために、ヒトｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合タンパク質と、ヒトＦｃタンパク質とを抗原として利用したＥＬＩＳＡ分析法を介してスクリーニングした。
マイクロタイタープレートに、ヒトｃ−Ｍｅｔ／Ｆｃ融合タンパク質を、１ウェル当たりそれぞれ５０μｌ（２μｇ／ｍｌ）ずつ加えてプレート表面に付着させ、反応していない抗原は、洗浄して除去した。ｃ−ＭｅｔではないＦｃに結合される抗体を選別して除外させるために、ヒトＦｃタンパク質を、前述のところと同一方法で、プレート表面に付着させた。ハイブリドーマ細胞の培養液を、それぞれウェルに５０μｌずつ加え、１時間反応させた後、リン酸緩衝溶液・トゥイーン２０（ＴＢＳＴ）溶液で十分に洗浄し、反応していない培養液を除去した。ここに、ヤギ抗マウスＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼ（goat anti-mouse ＩｇＧ−ＨＲＰ）を加え、１時間室温で反応させた後、ＴＢＳＴ溶液で十分に洗浄した。次に、ペルオキシダーゼの基質溶液（ＯＰＤ）を加えて反応させ、その反応程度は、ＥＬＩＳＡ解読器（reader）を用いて、４５０ｎｍでの吸光度を測定することで評価した。この方法を通じて、ヒトＦｃには結合しないが、ヒトｃ−Ｍｅｔタンパク質にだけ特異的に結合する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を反復して選別した。反復選別によって得たハイブリドーマ細胞株に対して、限界希釈（limiting dilution）を行い、モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞株１個のクローンを最終的に得た。最終選別されたモノクローナル抗体生産ハイブリドーマを、韓国細胞株銀行に寄託し、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００２２０を受けた。
（４）モノクローナル抗体の生産及び精製
前記（３）で得たハイブリドーマ細胞を無血清培地で培養し、培養液からモノクローナル抗体を生産精製した。
まず、１０％ＦＢＳが含まれた培養培地（ＤＭＥＭ）培地５０ｍｌで培養された前記ハイブリドーマ細胞を遠心分離し、細胞沈殿物を２０ｍｌＰＢＳで２回以上洗浄し、ＦＢＳが除去された状態で、培養培地（ＤＭＥＭ）培地５０ｍｌを細胞沈殿物に再懸濁させた後、３日間３７℃二酸化炭素培養基で培養した。その後、遠心分離を介して、抗体を生産する細胞を除去し、抗体が分泌された培養液を分離して４℃で保管するか、あるいは即座に集めて５０ｍｌないし３００ｍｌの培養液から、親和性カラム（Protein Ｇ agarose column、Pharmacia、米国）を装着したＡＫＴＡ精製機器（ＧＥ Health）を利用して、抗体を精製した後、タンパク質濃縮用フィルター（Amicon）を使用して、ＰＢＳで上澄み液を取り替え、精製された抗体を保管し、その後の実験に使用した。
実施例２：ｃ−Ｍｅｔに対するキメラ抗体ｃｈＡｂＦ４６の作製
一般的に、マウス抗体は、治療目的で人間に注入されたとき、免疫拒否反応（immunogenicity）を示す可能性が高いので、それを解決するために、前記実施例１で作製されたマウス抗体ＡｂＦ４６から、抗原結合に係わる変異領域（variable region）を除外した不変領域（constant region）を、ヒトＩｇＧ１抗体の配列で置換するキメラ抗体ｃｈＡｂＦ４６を作製した。
重鎖に該当する塩基配列は、「ＥｃｏＲＩ−シグナル配列−ＶＨ−ＮｈｅＩ−ＣＨ−ＴＧＡ−ＸｈｏＩ」（配列番号１２）から、軽鎖に該当する塩基配列は、「ＥｃｏＲＩ−シグナル配列−ＶＬ−ＢｓｉＷＩ−ＣＬ−ＴＧＡ−ＸｈｏＩ」（配列番号１３）から構成されるように、それぞれデザインして遺伝子を合成した。その後、インヴィトロジェン（Invitrogen）社のＯｐｔｉＣＨＯＴＭ抗体発現キット（Antibody Express Kit）（Ｃａｔ ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣＴＭ−ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Cloning Kit）に、前記重鎖に該当する塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１２）を、ｐｃＤＮＡＴＭ３．３−ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Cloning Kit）（Ｃａｔ ｎｏ．８３００−０１）に、前記軽鎖に該当する塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１３）を、それぞれＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ，Ｒ０１０１Ｓ）制限酵素とＸｈｏＩ（ＮＥＢ，Ｒ０１４６Ｓ）制限酵素とを使用してクローニングすることにより、キメラ抗体の発現のためのベクターを作製した。
前記作製されたベクターは、それぞれキアゲン マキシプレップキット（Qiagen Maxiprep kit）（Ｃａｔ ｎｏ．１２６６２）を利用して増幅し、前記重鎖を含むベクター及び軽鎖を含むベクターは、４：１の比率（８０μｇ：２０μｇ）で２９３Ｔ細胞（２．５ｘ１０７）に、２Ｍ ＣａＣｌ２を３６０μｌ添加し、形質移入（トランスフェクション、transfection）した。その後、１０％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ２条件下で５時間培養した後、ＦＢＳが添加されていないＤＭＥＭ培地で、４８時間３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
前記培養された細胞を遠心分離し、上澄み液それぞれ１００ｍｌを取り、ＡＫＴＡ Prime（ＧＥヘルスケア社製）を利用して精製した。ＡＫＴＡ Primeに、Protein Ａカラム（ＧＥヘルスケア社製，１７−０４０５−０３）を設け、培養液を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、ＩｇＧ溶出緩衝液（サーモサイエンティフィック社製，２１００４）で溶出した。それに対して、ＰＢＳ緩衝液で交換し、最終的に、キメラ抗体ＡｂＦ４６（以下、ｃｈＡｂＦ４６と命名）を精製した。
実施例３：キメラ抗体ｃｈＡｂＦ４６からのヒト化抗体ｈｕＡｂＦ４６の作製
（１）重鎖のヒト化（heavy chain humanization）
Ｈ１−重鎖及びＨ３−重鎖のデザインをするために、まず、ＮＣＢＩのＩｇ Blast（ｈｔｔｐ：／／www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）を介して、マウス抗体ＡｂＦ４６のＶＨ遺伝子と、最も相同性が高いヒト生殖細胞系（germline）遺伝子を分析した。その結果、ＶＨ３−７１が、アミノ酸レベルで、８３％の相同性を有するということを確認し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３を、カバットのナンバリング（Kabat numbering）で定義し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ部分が、ＶＨ３−７１のフレームワーク（framework）に導入されるようにデザインした。このとき、３０番（Ｓ→Ｔ），４８番（Ｖ→Ｌ），７３番（Ｄ→Ｎ），７８番（Ｔ→Ｌ）アミノ酸は、本来マウスＡｂＦ４６抗体のアミノ酸配列に復帰変異（back−mutation）した。その後、Ｈ１については、追加して８３番（Ｒ→Ｋ）と８４番（Ａ→Ｔ）とのアミノ酸に変異を与え、最終的にＨ１−重鎖（配列番号１４）とＨ３−重鎖（配列番号１５）とを作製した。
Ｈ４−重鎖のデザインのために、ヒト抗体のフレームワーク配列を調査した。その結果、マウス抗体ＡｂＦ４６のフレームワーク配列と、配列相同性がかなり高く、最も安定していると知られた既存のＶＨ３サブタイプ（subtype）を用いて、カバットのナンバリング（Kabat numbering）によって定義された配列を有するマウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３を確認し、Ｈ４−重鎖（配列番号１６）を作製するために作製使用した。
（２）軽鎖のヒト化（light chain humanization）
Ｈ１−軽鎖（配列番号１７）及びＨ２−軽鎖（配列番号１８）のデザインのために、マウス抗体ＡｂＦ４６のＶＬ遺伝子と最も相同性が高いヒト生殖細胞系遺伝子を、ＮＣＢＩのＩｇ Blastを介して分析した。その結果、ＶＫ４−１がアミノ酸レベルにおいて、７５％の相同性を有するということを確認し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３をカバットのナンバリング（Kabat numbering）で定義し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲが、ＶＫ４−１遺伝子のフレームワークに導入された。このとき、Ｈ１軽鎖において、３６番、４６番、４９番のアミノ酸を、マウス抗体ＡｂＦ４６の最初アミノ酸配列に復帰変異（back−mutation）し（すなわち、それぞれ（Ｙ→Ｈ）、（Ｌ→Ｍ）及び（Ｙ→Ｉ））、Ｈ２重鎖において、４９番アミノ酸のみを復帰変異し（すなわち、（Ｙ→Ｉ））、Ｈ１軽鎖、Ｈ２重鎖のコンストラクションを完成した。
Ｈ３軽鎖（配列番号１９）をデザインするために、マウス抗体ＡｂＦ４６のＶＬ遺伝子と最も相同性が高いヒト生殖細胞系遺伝子を、ＮＣＢＩ Blastを介して分析した。その結果、前記ＶＫ４−１以外にＶＫ２−４０を確認した。ＶＫ２−４０は、マウス抗体ＡｂＦ４６ＶＬと、アミノ酸レベルで、６１％の相同性を有するということを確認し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３をカバットのナンバリング（Kabat numbering）で定義し、マウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ領域を、ＶＫ４−１のフレームワークに導入した。Ｈ３軽鎖において、３６番、４６番及び４９番アミノ酸を復帰変異させた（すなわち、それぞれＹ→Ｈ、Ｌ→Ｍ及びＹ→Ｉ）。
Ｈ４軽鎖（配列番号２０）をデザインするために、ヒト抗体のフレームワーク配列を調査した。その結果、最も安定していると知られた既存のＶｋ１のサブタイプ（subtype）を使用して、カバットのナンバリング（Kabat numbering）で定義されたマウス抗体ＡｂＦ４６のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３を導入した。このとき、Ｈ４軽鎖は、３６番、４６番及び４９番のアミノ酸を追加して復帰変異して作製した（すなわち、それぞれＹ→Ｈ、Ｌ→Ｍ及びＹ→Ｉ）。
その後、前記重鎖に該当する塩基配列を有するＤＮＡ断片（Ｈ１軽鎖：配列番号２１、Ｈ３重鎖：配列番号２２、Ｈ４重鎖：配列番号２３）を、インヴィトロジェン社のＯｐｔｉＣＨＯＴＭ抗体発現キット（Ｃａｔ ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれたｐＯｐｔｉＶＥＣＴＭ−ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキットに、制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ，Ｒ０１０１Ｓ）を使用してクローニングし、前記軽鎖に該当する塩基配列を有するＤＮＡ断片（Ｈ１−軽鎖：配列番号２４、Ｈ２−軽鎖：配列番号２５、Ｈ３−軽鎖：配列番号２６、Ｈ４−軽鎖：配列番号２７）を、インヴィトロジェン社のＯｐｔｉＣＨＯＴＭ抗体発現キット（Ｃａｔ ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれたｐｃＤＮＡＴＭ ３．３−ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキットに、制限酵素ＸｈｏＩ（ＮＥＢ，Ｒ０１４６Ｓ）を使用してクローニングすることにより、ヒト化抗体の発現のためのベクターを作製した。
前記構築されたベクターを、それぞれキアゲン マキシプレップキット（Ｃａｔ ｎｏ．１２６６２）を利用して増幅した。前記重鎖を含むベクター及び軽鎖を含むベクターは、４：１の比率（８０μｇ：２０μｇ）で、２．５×１０７個の２９３Ｔ細胞に、３６０μｌの２Ｍ ＣａＣｌ２を添加して形質移入（transfection）させた。その後、形質移入された細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で、１０％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ培地で５時間培養した後、３７℃、５％ＣＯ２で、ＦＢＳが添加されていないＤＭＥＭ培地で４８時間培養した。
前記培養された細胞を遠心分離し、上澄み液それぞれ１００ｍｌを収得し、ＡＫＴＡ Prime（ＧＥヘルスケア社製）を利用して精製した。Protein Ａカラム（ＧＥ ヘルスケア社製，１７−０４０５−０３）をＡＫＴＡ Primeに設け、培養液を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、ＩｇＧ溶出緩衝液（サーモサイエンティフィック社製、２１００４）で溶出した。それをＰＢＳ緩衝液で交換することにより、最終的に、ヒト化抗体ＡｂＦ４６（以下、ｈｕＡｂＦ４６と命名）を得た。このとき、後続実施例で使用したヒト化抗体ｈｕＡｂＦ４６は、Ｈ４重鎖及びＨ４軽鎖を含んでいる。ｈｕＡｂＦ４６の重鎖可変領域（ＶＨ）は、「ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＤＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＧＦＩＲＮＫＡＮＧＹＴＴＥＹＳＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＮＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ」（配列番号８３）のアミノ酸配列を有し、ｈｕＡｂＦ４６の軽鎖可変領域（ＶＬ）は、「ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＬＡＳＧＮＱＮＮＹＬＡＷＨＱＱＫＰＧＫＡＰＫＭＬＩＩＷＡＳＴＲＶＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＡＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ」（配列番号８４）のアミノ酸配列を有する。
実施例４：ｈｕＡｂＦ４６抗体からの親和性成熟された抗体の選別及びその結合親和力の同定
（１）ｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖライブラリーの作製作製
ｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖを作製するための遺伝子を、ｈｕＡｂＦ４６抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を利用してデザインした。それぞれの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を、「ＶＨ−リンカー−ＶＬ」の形態を有するようにデザインし、前記リンカーは、「ＧＬＧＧＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳＳＧＶＧＳ」（配列番号２８）のアミノ酸配列を有するようにデザインした。かようにデザインされたｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチド（配列番号２９）を合成し（バイオニア社製）、ポリペプチドを発現するためのベクターを配列番号３０として示した。その後、前記ベクターから発現された結果物を分析し、ｃ−Ｍｅｔ特異的な結合を確認した。
（２）親和性成熟（affinity maturation）のためのライブラリー遺伝子の作製
１）標的ＣＤＲの選定及びプライマー作製
ｈｕＡｂＦ４６抗体の親和性成熟（affinity maturation）のために、６個の相補性決定領域（ＣＤＲ：complementary determining region）を、前記作製したマウス抗体ＡｂＦ４６から、カバットのナンバリング（Kabat numbering）によって定義した。それぞれのＣＤＲを表１に示した。
抗体ＣＤＲのランダムな配列導入のために、次のようにプライマーを作製した。既存のランダムな配列導入方式によれば、突然変異を与える部位に、同一比率の塩基（２５％Ａ、２５％Ｇ、２５％Ｃ、２５％Ｔ）が導入されるようにＮコドンを利用した。しかし、本実施例によれば、ｈｕＡｂＦ４６抗体のＣＤＲに無作為塩基を導入するために、各ＣＤＲのアミノ酸をコーディングする３個の野生型（wild-type）ヌクレオチドのうち、最初と２番目のヌクレオチドの８５％は、そのまま保存し、残りの３個の塩基をそれぞれ５％ずつ導入した。また、三種の塩基が３番目のヌクレオチドに導入されるように（３３％Ｇ、３３％Ｃ、３３％Ｔ）、プライマーをデザインした。
２）ｈｕＡｂＦ４６抗体のライブラリー作製及びｃ−Ｍｅｔに対する結合力の確認
ＣＤＲの無作為配列導入を介した抗体ライブラリー遺伝子の構築は、前記（１）に記載の方法で作製されたプライマーを利用して行った。テンプレートとして、ｈｕＡｂＦ４６抗体のｓｃＦｖを含むポリヌクレオチドを利用した。図１に示した方法のように、２個のＰＣＲ断片を作製し、６個のＣＤＲそれぞれに係わるライブラリーをオーバーラップ・エクステンションＰＣＲ（overlap extension ＰＣＲ）を利用して作製した。
野生型抗体（ｈｕＡｂＦ４６のｓｃＦｖ）と、ライブラリー抗体とのｃ−Ｍｅｔに対する結合力を確認した。ほとんどのライブラリー抗体のｃ−Ｍｅｔに対する結合力は、野生型抗体の結合力より低かったが、ｃ−Ｍｅｔに対する結合力が低下していない突然変異を確認した。
（３）ライブラリーからの改善された親和性を有する抗体の選別
向上したｃ−Ｍｅｔ結合力を有するライブラリー抗体を配列決定した。得られた配列を、下記表２に示し、ＩｇＧに変換した。下記クローンのうち、Ｌ３−１、Ｌ３−２、Ｌ３−３及びＬ３−５から生産された４種の抗体を選別し、後続実験を行った。Ｌ３−１から生産された抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）は、「ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＳＳＱＳＬＬＡＳＧＮＱＮＮＹＬＡＷＨＱＱＫＰＧＫＡＰＫＭＬＩＩＷＡＳＴＲＶＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＲＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ」（配列番号８５）のアミノ酸配列を有する。
（４）選別された抗体のＩｇＧへの変換
選別された４種の抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチドは、「ＥｃｏＲＩ−シグナル配列−ＶＨ−ＮｈｅＩ−ＣＨ−ＸｈｏＩ」（配列番号５１）からなり、重鎖の場合、親和性成熟後に、抗体のアミノ酸が変更されず、従って、ｈｕＡｂＦ４６抗体の重鎖をそのまま使用した。ただし、ヒンジ領域（hinge region）は、ヒトＩｇＧ１のヒンジではない、Ｕ６−ＨＣ７ヒンジ（配列番号５２）で置換した。軽鎖の遺伝子は、「ＥｃｏＲＩ−シグナル配列−ＶＬ−ＢｓｉＷＩ−ＣＬ−ＸｈｏＩ」を有するようにデザインされ、親和性成熟後に、選別された前記４種抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号５３ないし配列番号５６）を、バイオニア社によって合成した。次に、向上した親和性を有する抗体発現のためのベクターを、インヴィトロジェン社のＯｐｔｉＣＨＯＴＭ抗体発現キット（Ｃａｔ ｎｏ．１２７６２−０１９）に含まれているｐＯｐｔｉＶＥＣＴＭ−ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキットに、重鎖に該当する配列を有するＤＮＡ断片（配列番号５１）を、制限酵素ＸｈｏＩ（ＮＥＢ，Ｒ０１４６Ｓ）を使用してクローニングして作製し、軽鎖に相応するＤＮＡ断片（Ｌ３−１由来ＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ断片（配列番号５３）、Ｌ３−２由来ＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ断片（配列番号５４）、Ｌ３−３由来ＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ断片（配列番号５５）、及びＬ３−５由来ＣＤＲ−Ｌ３を含むＤＮＡ断片（配列番号５６））を、ｐｃＤＮＡＴＭ３．３−ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Ｃａｔ ｎｏ．８３００−０１）に、制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ，Ｒ０１０１Ｓ）を使用してクローニングした。
前記作製されたベクターを、それぞれキアゲン マキシプレップキット（Ｃａｔ ｎｏ．１２６６２）を利用して増幅し、前記重鎖を含むベクター及び軽鎖を含むベクターは、４：１の比率（８０μｇ：２０μｇ）で、２９３Ｔ細胞（２．５ｘ１０７）に、２Ｍ ＣａＣｌ２を３６０μｌ添加して形質移入させた。その後、混合物を、３７℃、５％ＣＯ２条件で、１０％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ培地で５時間培養した後、３７℃、５％ＣＯ２条件で、ＦＢＳのないＤＭＥＭ培地で４８時間培養した。
前記培養された細胞を遠心分離し、１００ｍｌの各上澄み液を、ＡＫＴＡ Prime（ＧＥ ヘルスケア社製）を利用して精製した。Protein Ａカラム（ＧＥ ヘルスケア社製，１７−０４０５−０３）をＡＫＴＡ Primeに設け、培養液を５ｍｌ／ｍｉｎの流速で流した後、ＩｇＧ溶出緩衝液（サーモサイエンティフィック社製，２１００４）で溶出した。それをＰＢＳ 緩衝液で交換し、最終的に、親和性成熟された４種の抗体（以下、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ２、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ３、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ５と命名）を精製した。
（５）選別された抗体の結合親和力分析
前記作製された４種抗体のｃ−Ｍｅｔ抗原に対する親和力を、ビアコア（ＧＥ ヘルスケア社製）を使用して測定した。ＣＭ５チップ上に、それぞれの抗体を、およそ８０〜１１０ＲＵで固定させ、抗原として、ヒトｃ−Ｍｅｔタンパク質を、１００ｎＭから０．３９ｎＭまでの濃度範囲内で、互いに異なる９つの濃度で、３０μｌ／ｍｉｎの速度で注入し、表３に示したように、ｋｏｎ値及びｋｏｆｆ値を収得した。それにより、ＫＤ値を計算した。ｃ−Ｍｅｔ抗原に対するｈｕＡｂＦ４６の結合力は、約２．１９ｎＭであり、改善した親和性を有する４種の抗体の結合力は、０．０６ｎＭ〜０．５０ｎＭ範囲であった（表３）。これは、ｓｃＦｖ形態で親和性が改善した抗体の親和性が、ＩｇＧに変換された後、約５倍〜約３７倍ほどまで向上したということを示す。
実施例５：マウス抗体ＡｂＦ４６のｃ−Ｍｅｔに対する認識能力の確認
（１）全長ｃ−Ｍｅｔに対するマウス抗体ＡｂＦ４６の認識能力確認
ｃ−Ｍｅｔの細胞外ドメイン（extracellular domain）を含むタンパク質に対するマウス抗体ＡｂＦ４６の認識能力を確認するために、ｃ−Ｍｅｔを発現させるためのポリヌクレオチド（配列番号５７）を、ｐｃＤＮＡ５ベクター（インヴィトロジェン）にクローニングし、in vitro 転写／翻訳（transcription and translation）キット（ＴｎＴｔ kit，プロメガ社，マディソン，米国）を使用して、２９３Ｔ細胞（韓国細胞株銀行）で発現させた。その後、マウス抗体ＡｂＦ４６を、プロテイン−結合アガロースビーズ（protein Ｇ−conjugated agarose bead）（インヴィトロジェン）と混合し、合成されたｃ−Ｍｅｔタンパク質を含む２９３Ｔ細胞溶解物、またはin vitro転写／翻訳キットからの反応によって作られたｃ−Ｍｅｔを添加し、免疫沈降法（immunoprecipitation）を遂行した。前記免疫沈降された結果物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して電気泳動した後、ウエスタンブロット法を使用して分析した。
図２から分かるように、マウス抗体ＡｂＦ４６は、全長ｃ−Ｍｅｔ抗原を正確に認識するということを確認した。
（２）マウス抗体ＡｂＦ４６のＳＥＭＡドメインに対する認識能力の確認
マウス抗体ＡｂＦ４６が、ｃ−Ｍｅｔの細胞外ドメインのうち、いずれの部位に結合するかいうことを確認するために、まず、ｃ−Ｍｅｔの細胞外ドメインを３つの部分に分け、それぞれの部分をコーディングするＤＮＡ断片を、ｐｃＤＮＡ５ベクターにクローニングした。前記３つの部分は、それぞれＳＥＭＡドメイン（配列番号５８）、ＰＳＩ−ＩＰＴドメイン（配列番号５９）、ＴｙｒＫｃドメイン（配列番号６０）であり、ｐｃＤＮＡ５ベクターにクローニングするためのそれぞれのドメインをコードするＤＮＡ断片を、それぞれ配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３で示した。
前記ベクターにクローニングした後、それぞれをin vitro転写／翻訳キット（ＴｎＴｔ kit，プロメガ社，マディソン，米国）を使用して、２９３Ｔ細胞（韓国細胞株銀行）で発現させた。その後、マウス抗体ＡｂＦ４６を、プロテインＧ−結合アガロースビーズ（インヴィトロジェン）と混合し、合成されたｃ−Ｍｅｔタンパク質を含む２９３Ｔ細胞溶解物、またはin vitro転写／翻訳キットからの反応によって作製したｃ−Ｍｅｔを添加し、免疫沈降法を遂行した。前記免疫沈降された結果物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して電気泳動した後、ウエスタンブロット法を使用して分析した。
図３から分かるように、マウスＡｂＦ４６抗体は、ｃ−ＭｅｔのＳＥＭＡドメインに結合されるということを確認することができた。マウスＩｇＧを陰性対照群として使用し、５Ｄ５抗体（ＡＴＣＣ Ｃａｔ．＃ ＨＢ１１８９５ハイブリドーマ細胞で分離精製）を陽性対照群として使用した。一方、図３で、「Input」は、ゲルにローディングした免疫沈降を行わない、合成された全ての結果物をいう。結果から、すべての合成されたｃ−Ｍｅｔが抗体の結合いかんと関係なく、完全であるということを確認した。
実施例６：ｈｕＡｂＦ４６抗体のエピトープ分析
（１）エピトープ・マッピング
１）ｈｕＡｂＦ４６のエピトープ・マッピングのためのペプチド作製
ｃ−ＭｅｔのＳＥＭＡドメインを含む５４３個のアミノ酸配列及びその構造は、ＰＤＢ（protein database）ＩＤ：１ＵＺＹに示されており、それらアミノ酸配列を基にして、ＣＬＩＰＳ（chemically linked peptides on scaffolds）技術を利用して、構造エピトープ（conformational epitope）と、不連続なエピトープ（discontinuous epitope）とを作ることができる６，０６３個の他の配列がデザインされて合成された（Timmerman ｅｔ ａｌ．，２００７ Functional reconstruction and synthetic mimicry of a conformational epitope using ＣＬＩＰＳＴＭ technology，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２０：２８３−００）。ここでペプチドアレイ作製過程について詳細に説明する。ＣＬＩＰＳ技術は、ＰｅｐＳｃａｎ社によって開発され、既存の典型的な方法である約１５個のアミノ酸長を有する線形ペプチド以外に、ＣＬＩＰＳと呼ばれる固有の構造を有するペプチドの作製に用いられる。ｈｕＡｂＦ４６抗体と、これら線形ペプチド及びＣＬＩＰＳペプチドとの結合親和力を測定した。ＣＬＩＰＳペプチドのうち、Ｔ２ ＣＬＩＰＳペプチドはペプチドが人工的な構造を有するように、ループ構造を形成するために２つのシステイン残基が結合して作製し、Ｔ３ ＣＬＩＰＳペプチドはペプチドが人工的な構造を有するように、ループ構造を形成するために３つのシステイン残基が結合して作製した。また、Ｔ２Ｔ３またはＴ２Ｔ２のような結合型ペプチドを制作することもできる。
エピトープ・マッピングのために、全６，０６３個のペプチドを作製した（ペプチドアレイ作製は、ＰｅｐＳｃａｎに依頼する）。１番〜５２９番のペプチドは、典型的な線形ペプチドであって、１５個のアミノ酸を有し、特定の領域間でオーバーラッピング（overlapping）されるように作製した。５３０番〜１０５８番のペプチドは、Ｔ２ ＣＬＩＰＳペプチドに、１番ないし５２９番のペプチドを導入して作製した。１０５９番〜２０１４番のペプチドは、Ｔ３ ＣＬＩＰＳペプチドに、１５個のアミノ酸を有するペプチド２個を連結し、全９５６個を作製した。２０１５番〜６０６３番のペプチドは、８個〜３５個のアミノ酸残基を有するペプチドグループ間の結合を介して、線形的及び非線形的な構造を有するエピトープを探索するためのペプチドであって、全４，０４８個が作製された。
例えば、Ｔ２ ＣＬＩＰＳペプチドを含むペプチドアレイは、次のような方法で作製した。０．５ｍＭのＴ２ ＣＬＩＰＳペプチドが含まれた１，３−ビス（ブロモメチル）ベンゼン溶液を、アンモニウムビカルボネート（２０ｍＭ、ｐＨ７．９）／アセトンニトリル（１：１（ｖ／ｖ））に溶解させ、前記結果物溶液をペプチドアレイに添加した。テンプレートとしてのＴ２ ＣＬＩＰＳペプチドは、ペプチドアレイ（３μｌのウェルを有する４５５個のウェルプレート）の固相結合されたペプチド内に存在する２個のシステイン側鎖に結合させた。前記溶液で完全に覆われるように、３０分間〜６０分間、前記溶液内でペプチドアレイを徐々に振り動かした。最後に、前記ペプチドアレイを過量の水で十分に洗浄し、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）内で、１％ＳＤＳ／０．１％ベータ−メルカプトエタノールが含まれた破砕緩衝液で、３０分間７０℃の温度条件で超音波粉砕した後、４５分間水中で超音波粉砕を行った。Ｔ３ ＣＬＩＰＳペプチドは、テンプレートとしてのＴ３ ＣＬＩＰＳペプチドは３個のシステイン側鎖に結合させたこと以外は前記と同様の方法を用いて作製した。
前記ペプチドを使用して、ＥＬＩＳＡを介して、エピトープ・マッピングを行った結果、ｈｕＡｂＦ４６のコアエピトープ（core epitope）は、ｃ−Ｍｅｔタンパク質の、１６８番アミノ酸〜１７１番アミノ酸からなるペプチドであるＥＥＰＳＱ（配列番号３）であることを確認した。
２）ｈｕＡｂＦ４６抗体のエピトープ・マッピングのためのＥＬＩＳＡ分析
エピトープ・マッピングのために、全５２９個の線形ペプチド及びＣＬＩＰＳペプチドを使用して、ＰＥＰＳＣＡＮに基づくＥＬＩＳＡ分析を行った。前記ペプチドは、５％ブロッキング溶液（４％オボアルブミン（ovalbumin）、５％ウマ血清（horse serum）及び１％トゥイーン（Tween）８０）を利用して、３０分間常温で反応させた。その後、１％トゥイーン８０が添加されたＰＢＳで、４℃で一晩中反応させた１〜１００μｇ／ｍｌ範囲のｈｕＡｂＦ４６抗体を、前記ペプチドに反応させた後で洗浄した。その後、ウサギ抗ヒツジ抗体（rabbit−anti−sheep antibody）（シグマ（ＳＩＧＭＡ）社製）を処理し、ＰＢＳで洗浄した後、ペルオキシダーゼを付加したブタ抗ウサギ抗体（swine−anti−rabbit antibody）（シグマ社製）を処理し、ＰＢＳで洗浄した。その後、結果物を３％Ｈ２Ｏ２中、２μｌ／ｍｌのペルオキシダーゼ２，２’−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリンスルフェート（ＡＢＴＳ）（シグマ社製）で処理し、１時間後に発色反応を測定した。
その結果、図４から分かるように、線形ペプチド及びＣＬＩＰＳペプチドにおいて、いずれも「ＥＥＰＳＱ」配列（配列番号３）を含むペプチドでのみ特異的なＥＬＩＳＡ陽性反応を示し、それにより、前記ｈｕＡｂＦ４６は、ｃ−Ｍｅｔの線形エピトープ及び構造エピトープをいずれも認知する抗体であるということを確認した。
また、前記「ＥＥＰＳＱ」（配列番号４）を含むペプチドを含むエピトープうち、一部の肺癌患者または卵巣癌患者で観られることが知られているｃ−Ｍｅｔの代表的なＳＥＭＡドメインの突然変異であるＥ１６８Ｄ変異を有するポリペプチドを使用し、上述と同様の方法でＥＬＩＳＡを遂行した。その結果を下記表４に示した。
前記結果から、ｈｕＡｂＦ４６抗体は、Ｅ１６８Ｄ変異を有したｃ−ＭｅｔＳＥＭＡドメインには、結合されないということを確認した。それは、前記抗体ががん発生情報を提供するための診断方法に利用可能であるということを示す。
３）ｈｕＡｂＦ４６抗体のエピトープ・マッピング結果分析
前記結果から、ｈｕＡｂＦ４６抗体は、ｃ−Ｍｅｔタンパク質の１６８番アミノ酸〜１７１番アミノ酸からなるペプチドである「ＥＥＰＳＱ」配列を含む線形ペプチド及びＣＬＩＰＳペプチドのいずれにおいても、非特異的反応なしに、特異的な結合反応を示した。それは、ｈｕＡｂＦ４６抗体が、ｃ−Ｍｅｔタンパク質のうち、線形エピトープ及び構造的エピトープのいずれにも結合するということを示す。分子構造（ＰｙＭＯＬ １．４．１（www.pymol.org）、Ｃｎ３Ｄ４．１（ＮＣＢＩ））に関して、図５に示したように、ｈｕＡｂＦ４６抗体のエピトープは、ＳＥＭＡドメインに位置するということを確認した。また、ＨＧＦの結合部位が、直接的な結合部位の近傍のループに相当する位置であるということを確認した。
（２）フルポジションスキャニング（full positional scanning）結果の分析
ＥＥＰＳＱ配列の各アミノ酸部位を、本来のアミノ酸ではない、他の２０種のアミノ酸で置換し、それらそれぞれのペプチドが、ｈｕＡｂＦ４６抗体との結合力に、いかなる変化を生じさせるかということを、７種のペプチドアレイを介して詳細に分析した。
分析結果、ＥＥＰＳＱ（配列番号３）のアミノ酸配列のうちどのアミノ酸が、前記抗体の結合に重要であるかということを確認した。特に、ＥＥＰＳＱ（配列番号３）のＥＥＰ配列が、抗体との結合に非常に重要な役割を果たしていることが確認された。
実施例７：ＳＥＭＡドメインの突然変異によるｈｕＡｂＦ４６抗体の結合親和力分析
ＥＥＰＳＱ配列の各アミノ酸部位、または５個アミノ酸全体を、本来のアミノ酸ではないアラニンで置換し、それぞれのペプチド（「ＡＡＡＡＡ」（配列番号７７）、「ＡＥＰＳＱ」（配列番号７８）、「ＥＡＰＳＱ」（配列番号７９）、「ＥＥＡＳＱ」（配列番号８０）、「ＥＥＰＳＱ」（配列番号８１）、「ＥＥＰＳＡ」（配列番号８２））と、ｈｕＡｂＦ４６抗体との結合親和力を、ビアコア（ＧＥ ヘルスケア社製）を使用して測定した。ＣＭ５チップ上に、８０〜１１０ＲＵほどのｈｕＡｂＦ４６抗体を固定させ、配列番号７７ないし配列番号８２のアミノ酸配列を有する１００ｎＭ〜０．３９ｎＭのペプチドを、９つの互いに異なる濃度で、３０μｌ／ｍｉｎの速度で注入することにより、下記表５に示したように、ｋｏｎ値及びｋｏｆｆ値を収得し、それによりＫＤ値を計算した。その結果、ｈｕＡｂＦ４６抗体は、アミノ酸が置換されたペプチドに結合することがないということを確認した。その結果から、「ＥＥＰＳＱ」（配列番号３）配列が、ｈｕＡｂＦ４６抗体の必須なエピトープであるということを確認した。
実施例８：ｈｕＡｂＦ４６抗体のアゴニズム（ａｇｏｎｉｓｍ）機能障害の程度（ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｄｅｇｒｅｅ）の比較
（１）ＢｒｄＵ分析
ｈｕＡｂＦ４６抗体に対するアゴニズム（agonism）の程度を比較するために、ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を使用して、ＢｒｄＵ分析を行った。ヒト肺癌細胞であるＮＣＩ−Ｈ４４１を、ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ（商標登録））に、２×１０５細胞／ｍｌで、懸濁し、懸濁液を１００μｌずつ９６ウェル組織培養プレート（tissue culture plate）（コーニング，ローウェル，ＭＡ）に分注した。２４時間３７℃で、５％ＣＯ２の条件で培養し、培地を完全に除去した後、抗体を希釈したＲＰＭＩ １６４０培地で置換した。２１時間３７℃で、５％ＣＯ２の条件で培養した後、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（５−bromo−２’−deoxyuridine，ＢｒｄＵ）を添加し、３時間培養した後、ＢｒｄＵ分析（ロシュ，インディアナポリス，ＩＮ）を行った。細胞を、プレート上で、変性／固定（denaturation／fixation）した後、抗ＢｒｄＵ抗体を入れ、１時間後に基質を添加し、３７０ｎｍで、ＥＬＩＳＡスペクトラマックスリーダー（ｓｐｅｃｔｒａＭａｘ reader）（モレキュラーデバイス，サニーベール、ＣＡ）で発色反応を測定した。比較対象は、マウスＡｂＦ４６抗体の作用性を基準にした。マウスのＩｇＧを陰性対照群として使用し、アゴニスト（agonist）として知られた５Ｄ５抗体を陽性対照群として使用した。
図６Ａから分かるように、ｈｕＡｂＦ４６抗体は、５Ｄ５抗体と類似した程度のアゴニズム（ａｇｏｎｉｓｍ）機能障害（ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）を低減させるということを確認した。また、図６Ｂから分かるように、４種の親和性改善抗体のうちの３種で、アゴニズム（ａｇｏｎｉｓｍ）機能障害が低減するということが分かった。従って、その安全性が、１０μｇ／ｍｌの処理濃度で、それぞれ２５％（ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１）、２８％（ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ２）、１３％（ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ３）及び２１％（ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ５）まで向上したということを確認された。
（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞増殖分析法
親和性を改善した４種の抗体のがん細胞増殖抑制による抗がん効果を確認するために、ｃ−Ｍｅｔ分子を、細胞表面に発現するＭＫＮ４５胃癌細胞（日本がん研究細胞株銀行（ＪＣＲＢ：Japanese Cancer Research Bank，東京）を利用したｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞増殖分析法を遂行した。
９６ウェルプレートに、ウェル当たり１×１０４個のＭＫＮ４５細胞を、５０μｌの５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培養液と分注した。その後、前記細胞を、処理なし、または０．００８，０．０４，０．２または１μｇ／ｍｌの濃度の前記作製された４種の抗体５０μｌで処理した後、７２時間培養し、CellTiter-Glo（商標登録）Luminescent Cell Viability Assay Kit（プロメガ社製，Ｇ７５７０）を使用して、ルミノメーター（ｌｅｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）（パーキンエルマー，２１０４ マルチラベルリーダー）で細胞数を定量した。
図７から分かるように、実験濃度のうち、最低濃度である０．００８μｇ／ｍｌで、親和性改善前の抗体（ｈｕＡｂＦ４６）の相対的細胞生存率が７７％であり、親和性を改善した抗体ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ２及びｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ５は、それぞれ７４％、７３％、７２％と効果が類似しており、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ３は、６６％と、効果が確実に上昇しているということを観察された。また、最大効果を示す０．０４μｇ／ｍｌ濃度では、前記抗体４種がいずれも５Ｄ５抗体の生存率である５３％以下の数値を示すということを確認することができた。従って、親和性改善の結果、対照群に比べて、親和性、効果及び安全性において、有意に改善されたということを確認した。
（３）Ａｋｔリン酸化
ｈｕＡｂＦ４６抗体に対するアゴニズム程度を比較するために、Ｃａｋｉ−１細胞（韓国細胞株銀行）を使用して、ｃ−Ｍｅｔの下流シグナル伝達及び細胞増殖に係わる指標であるＡｋｔタンパク質のリン酸化程度を確認した。マウスのＩｇＧを陰性対照群として使用し、アゴニストとして周知である５Ｄ５抗体を陽性対照群として使用した。
２×１０５細胞／ｍｌのＣａｋｉ−１細胞を、９６ウェルプレートに分注した後、２４時間後に、無血清状態で、それぞれ５μｇ／ｍｌの抗体で、３０分間処理した。抗体で処理した細胞を溶解（lysis）し、PathScan（商標登録） phospho−ＡＫＴ１（Ｓｅｒ４７３）、chemiluminescent Sandwich ＥＬＩＳＡ kit（Cell Signaling社，ｃａｔ．ｎｏ ＃７１３４Ｓ）を利用して、Ａｋｔタンパク質のリン酸化の程度を測定し、分析した。
図８Ａ及び図８Ｂから分かるように、ｈｕＡｂＦ４６抗体処理した場合、Ａｋｔタンパク質のリン酸化程度が３０％未満であるということが分かった。この結果から、ｈｕＡｂＦ４６抗体は、低減されたアゴニズム機能障害を有するということを確認した。
（４）ｃ−Ｍｅｔの分解程度の同定
４種の親和性を改善した抗体の抗がん効果を同定するために、抗体と結合したｃ−Ｍｅｔタンパク質の分解程度を評価した。相対的な全ｃ−Ｍｅｔ量は、抗体が内在化を介して、ｃ−Ｍｅｔを分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）分解するためにｃ−Ｍｅｔに結合した後のｃ−Ｍｅｔの全量変化を測定することによって得た。この様に、抗体の効果は評価した。
ＭＫＮ４５細胞（２×１０５セル／ｍｌ）と、４種の抗体（５μｇ／ｍｌ）のそれぞれとを、９６ウェルプレートに同時に導入し、２４時間培養した。その後、抗体処理した細胞を溶解し、ヒト全（Ｈｕｍａｎ tｏｔａｌ）ＨＧＦ Ｒ／ｃ−ＭＥＴ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ，ＤＹＣ３５８）を利用して、全ｃ−Ｍｅｔ量の変化を測定し、分析した。
その結果、図９から分かるように、４種の親和性を改善した抗体は、いずれもｈｕＡｂＦ４６抗体に比べて、ｃ−Ｍｅｔ分解程度が上昇することが確認された。ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ１は、ｈｕＡｂＦ４６に比べて、３７％ほどｃ−Ｍｅｔ分解程度が上昇し、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ２、ｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ３及びｈｕＡｂＦ４６−Ｈ４−Ａ５は、２８％ほどｃ−Ｍｅｔ分解程度が上昇したということを確認した。
実施例９：ｈｕＡｂＦ４６抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗がん効果分析
ｈｕＡｂＦ４６抗体のがん細胞増殖抑制による抗がん効果を確認するために、ｃ−Ｍｅｔ分子を、細胞表面に発現するＭＫＮ４５胃癌細胞（日本がん研究細胞株銀行（ＪＣＲＢ：Japanese Cancer Research Bank），東京）を利用したｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞増殖分析法を遂行した。
９６ウェルプレートにウェル当たり、１×１０４個のＭＫＮ４５細胞を、５０μｌの５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培養液と分注した。その後、前記細胞を、処理なし、または０．００８，０．０４，０．２または１μｇ／ｍｌの濃度のｈｕＡｂＦ４６抗体で処理した後、７２時間培養し、CellTiter−Glo（商標登録）Luminescent Cell Viability Assay Kit（プロメガ，Ｇ７５７０）を使用して、ルミノメーター（パーキンエルマー社製，２１０４ マルチラベルリーダー）で、細胞数を定量した。
図１０から分かるように、陰性対照群として使用されたマウスＩｇＧは、がん細胞の増殖を抑制する効果が全くない一方、ｈｕＡｂＦ４６抗体は、がん細胞の増殖を抑制する効果があることが確認された。
実施例１０：マウス抗体ＡｂＦ４６、ｃｈＡｂＦ４６及びｈｕＡｂＦ４６のｉｎ ｖｉｖｏでの抗がん効果の確認
前記実施例で作製されたＡｂＦ４６のマウス抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体の抗がん効果を確認するために、Ｕ８７ＭＧ脳癌細胞（韓国細胞株銀行）、胃癌細胞株ＭＫＮ４５細胞（日本がん研究細胞株銀行（ＪＣＲＢ：Japanese Cancer Research Bank），東京）または肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞（ＡＴＣＣ Ｃａｔ．＃ＨＴＢ−１７４）を投与した異種移植マウス動物モデルを対象にして、ｉｎ ｖｉｖｏで、これらの抗体の投与によって、腫瘍サイズが減少するか否かを確認した。前記３種の抗体は、いずれも同様のＣＤＲ（complimentarity determining region）を有しており、ｃ−Ｍｅｔの同一のエピトープに結合されると予想される抗体である。
マウス動物モデルは、５０μｌのＵ８７ＭＧ脳癌細胞、胃癌細胞株ＭＫＮ４５細胞または肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞（３×１０６個）を、６週齢の雄性ＢＡＬＢ／Ｃヌードマウス（オリエントバイオ株式会社から得た）に皮下注射し、１週間経過後にがんが発生するマウスを、各グループ当たり１２匹ずつランダムに選別し、実験に使用した。前記３種の抗体は、がん細胞の形成後、週１回、静脈注射によって、１０ｍｇ／ｋｇの濃度でマウスに投与した。また、対照群として、マウスＡｂＦ４６抗体は、腹腔注射によって、１０ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇとの濃度で週２回投与した。
図１１Ａ〜図１１Ｃから分かるように、異種移植マウスグループ（Ｕ８７ＭＧ脳癌細胞、胃癌細胞株ＭＫＮ４５）で、経時的な腫瘍サイズの測定を行った結果、マウス抗体ＡｂＦ４６及びｃｈＡｂＦ４６抗体は、著しい抗がん効果があるということが確認された。実験群（マウス抗体ＡｂＦ４６及びｃｈＡｂＦ４６）と対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ）との各グループ当たりマウスは、１２匹であり、各グループの平均とＳＥＭとを表示した。図１１Ａ〜図１１Ｃで、反復測定分散分析（Repeated measures ANOVA）を用いて、２つの実験群と対照群とを比較したｐ−Ｖａｌｕｅを星印（＊）で表示した（＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１）。
また、図１２から分かるように、肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ４４１異種移植マウスグループにおいて、経時的な腫瘍サイズを測定した結果、マウス抗体ＡｂＦ４６及びｈｕＡｂＦ４６抗体は、著しい抗がん効果があるということが確認された。実験群（マウス抗体ＡｂＦ４６及びｈｕＡｂＦ４６）と対照群との各グループ当たりマウスは、１５匹であり、各グループの平均とＳＥＭとを示した。図１２において反復測定分散分析で、２つの実験群と対照群とを比較したｐ−Ｖａｌｕｅを星印（＊）で表示した（＊：ｐ＜０．０５、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１）。
上述のように、この発明に係る上述の１以上の実施形態によると、Ｃ−ＭｅｔのＳＥＭＡドメインにおけるエピトープに特異的に結合する抗体、および抗体を含んだがんの予防および治療のための医薬組成物が提供され、がんは効果的に予防および治療することが可能となる。
ここに記述した代表的な実施形態は、記述的な意味としてのみ考えられるべきであり、限定を目的とするものではない。それぞれの実施形態の特徴または側面の記述は、典型的に、他の実施形態における他の同様な特徴または側面のために利用できるものとして考えられるべきである。

Claims (19)

  1. ｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内のエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片であって、前記エピトープは、配列番号１のアミノ酸配列またはその部分を有する、抗体またはその抗原結合断片。
  2. 前記エピトープは、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  3. 前記抗体または抗原結合断片は、
    配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群から選択される一つ以上の重鎖相補性決定領域アミノ酸配列を含む重鎖可変領域、並びに配列番号７、配列番号８及び配列番号９からなる群から選択される一つ以上の軽鎖相補性決定領域アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  4. 前記重鎖可変領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  5. モノクローナル抗体、二重特異抗体、多重特異抗体、またはｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２からなる群から選択される抗原結合断片であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  6. 前記ｃ−Ｍｅｔタンパク質は、ヒトｃ−Ｍｅｔ、サルｃ−Ｍｅｔ、マウスｃ−Ｍｅｔ及びラットｃ−Ｍｅｔであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のその抗体または抗原結合断片。
  7. ｃ−Ｍｅｔタンパク質の拮抗剤であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片の治療的有効量、及び薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含むがん予防用またはがん治療用の医薬組成物。
  9. 前記がんは、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、皮膚癌、肌または眼球の黒色腫、直腸癌、肛門付近の癌、食道癌、小腸腫瘍、内分泌系腫瘍（Ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｇｌａｎｄ）、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、慢性または急性の白血病、リンパ球性リンパ腫、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頚部癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞腺腫、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺腫瘍、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、及び頭頚部癌からなる群から選択されることを特徴とする請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、または、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体若しくは抗原結合断片、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を、個体に投与することを含む、がん治療方法。
  11. 分析のためにｃ−Ｍｅｔタンパク質のＳＥＭＡドメイン内のエピトープと試料を接触させること（ここで、前記エピトープは配列番号１のアミノ酸配列を含む）、；および、
    エピトープの試料への結合を検出すること（ここで前記エピトープ及び試料が１ｐＭ〜１０ｎＭの範囲の結合親和力を示す場合、前記試料は候補ｃ−Ｍｅｔ拮抗剤とする）、
    を含む、ｃ−Ｍｅｔ拮抗剤をスクリーニングする方法。
  12. 前記エピトープは、配列番号２または配列番号３からなることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
  13. 前記試料は、抗体を含むことを特徴とする請求項１１または１２に記載の方法。
  14. がんを診断、予防または治療するための候補物質をスクリーニングするために使用される、請求項１１に記載の方法。
  15. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、がん診断用キット。
  16. 前記がんは、肺癌または卵巣癌であることを特徴とする、請求項１５に記載のキット。
  17. 選択的にベクター中にある、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸。
  18. 請求項１７に記載の核酸を含む細胞。
  19. 細胞中の請求項１７に記載の核酸を発現させることを含む、抗体または抗原結合断片を作製する方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015129755A (ja) * 2014-01-07 2015-07-16 三星電子株式会社Ｓａｍｓｕｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ． ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測または効能検証のためのバイオマーカー

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140154251A1 (en) * 2011-10-05 2014-06-05 Samsung Electronics Co., Ltd. Anti c-met antibody and uses thereof
KR20130037153A (ko) * 2011-10-05 2013-04-15 삼성전자주식회사 항 ｃ-Ｍｅｔ 항체 및 그의 용도
EP2708556B1 (en) * 2012-09-12 2018-11-07 Samsung Electronics Co., Ltd Pharmaceutical composition for the use in a combination therapy for prevention or treatment of c-met or angiogenesis factor induced diseases
US9168300B2 (en) 2013-03-14 2015-10-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. MET-binding agents and uses thereof
KR102049990B1 (ko) * 2013-03-28 2019-12-03 삼성전자주식회사 c-Met 항체 및 VEGF 결합 단편이 연결된 융합 단백질
EP2786764B1 (en) 2013-04-01 2017-03-08 Samsung Electronics Co., Ltd. Combination therapy using anti-c-met antibody and sorafenib
KR102060540B1 (ko) * 2013-04-03 2019-12-31 삼성전자주식회사 항 c-Met 항체 및 항 Ang2 항체를 포함하는 병용 투여용 약학 조성물
WO2014178791A1 (en) * 2013-04-30 2014-11-06 Agency For Science, Technology And Research Mab 2 anti-met antibody
KR102190220B1 (ko) * 2013-05-29 2020-12-14 삼성전자주식회사 타겟 특이적 세포막 단백질 제거용 조성물
CN104211814A (zh) * 2013-05-29 2014-12-17 三星电子株式会社 用于消耗靶膜蛋白的组合物
KR102236367B1 (ko) * 2013-07-26 2021-04-05 삼성전자주식회사 DARPin을 포함하는 이중 특이 키메라 단백질
KR102089591B1 (ko) * 2013-07-29 2020-03-18 삼성전자주식회사 항 EGFR scFv 단편 및 이를 포함하는 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체
KR102186363B1 (ko) * 2013-09-06 2020-12-04 삼성전자주식회사 c-Met 저해제 및 베타-카테닌 저해제를 포함하는 병용 투여용 약학 조성물
KR102192591B1 (ko) * 2013-09-09 2020-12-18 삼성전자주식회사 c-Met 저해제 및 c-Myc 저해제를 포함하는 병용 투여용 약학 조성물
KR102178323B1 (ko) 2013-11-29 2020-11-13 삼성전자주식회사 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체
KR20150083689A (ko) * 2014-01-10 2015-07-20 삼성전자주식회사 항 c-Met 항체 정제 방법
EP2937421B1 (en) * 2014-04-03 2018-10-24 Samsung Electronics Co., Ltd Biomarker for predicting effect of an anti-C-met antibody
US9975960B2 (en) * 2014-05-09 2018-05-22 Samsung Electronics Co., Ltd. Anti-HER2 antibody and anti-c-Met/anti-HER2 bispecific antibodies comprising the same
KR102401595B1 (ko) * 2014-05-09 2022-05-24 삼성전자주식회사 항 HER2 scFv 단편 및 이를 포함하는 항 c-Met/항 HER2 이중 특이 항체
KR102223502B1 (ko) * 2014-05-09 2021-03-05 삼성전자주식회사 항 c-Met/항 EGFR/항 Her3 다중 특이 항체 및 이의 이용
KR20150133576A (ko) * 2014-05-20 2015-11-30 삼성전자주식회사 화학적 개질된 표적화 단백질 및 그의 이용
US20170233489A1 (en) * 2014-05-26 2017-08-17 Samsung Electronics Co., Ltd. Composition for combination therapy comprising anti-her2 antibody and anti-c-met antibody
KR102244434B1 (ko) * 2014-08-11 2021-04-23 삼성전자주식회사 재조합 벡터 및 이를 이용한 목적 폴리펩타이드의 생산 방법
KR102259232B1 (ko) * 2014-08-25 2021-05-31 삼성전자주식회사 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체
JP6897952B2 (ja) * 2014-09-16 2021-07-07 国立大学法人東京海洋大学 濃縮された生着能をもつ未分化生殖細胞を用いた生殖細胞系列への分化誘導方法
CN107613974B (zh) * 2015-03-16 2021-01-15 塞尔德克斯医疗公司 抗-met抗体及其使用方法
GB201611123D0 (en) 2016-06-27 2016-08-10 Euremab Srl Anti met antibodiesand uses thereof
KR20180046256A (ko) * 2016-10-27 2018-05-08 삼성전자주식회사 c-Met 저해제의 효능 예측을 위한 바이오마커 HGF
TWI782930B (zh) 2016-11-16 2022-11-11 美商再生元醫藥公司 抗ｍｅｔ抗體，結合ｍｅｔ之雙特異性抗原結合分子及其使用方法
WO2018156180A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Kindred Biosciences, Inc. Anti-il31 antibodies for veterinary use
IT201800000535A1 (it) 2018-01-03 2019-07-03 Procedimenti per la cura del cancro.
KR102396194B1 (ko) * 2018-12-07 2022-05-10 서울대학교 산학협력단 항 c-Met 아고니스트 항체 및 이의 용도
KR102433184B1 (ko) * 2018-12-07 2022-08-17 서울대학교 산학협력단 항 c-Met 아고니스트 항체 및 이의 용도
JOP20210233A1 (ar) 2019-02-26 2023-01-30 Janssen Biotech Inc علاجات مركبة وتطابق المريض مع الأجسام ثنائية النوعية المضادة لـ EGFR/c-Met.
JOP20210304A1 (ar) 2019-05-14 2023-01-30 Janssen Biotech Inc علاجات مركبة باستخدام الأجسام المضادة ثنائية النوعية المضادة لمستقبل عامل نمو البشرة (EGFR)/ مستقبل عامل نمو خلايا الكبد (c-Met) ومثبطات كيناز التيروسين الخاصة بمستقبل عامل نمو البشرة (EGFR) من الجيل الثالث
JP2022547274A (ja) 2019-09-16 2022-11-11 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 免疫ｐｅｔ撮像のための放射標識されたｍｅｔ結合タンパク質

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110104176A1 (en) * 2009-10-30 2011-05-05 Samsung Electronics Co., Ltd. Antibody specifically binding to c-met and use thereof

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU675916B2 (en) * 1991-06-14 1997-02-27 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
DE602005020799D1 (de) 2004-08-05 2010-06-02 Genentech Inc Humanisierte anti-cmet-antagonisten
NZ561211A (en) 2005-03-25 2011-03-31 Genentech Inc Methods and compositions for modulating hyperstabilized C-met
KR20080004514A (ko) * 2005-03-25 2008-01-09 제넨테크, 인크. 폐암에서의 ｃ-ｍｅｔ 돌연변이
RU2008142833A (ru) * 2006-03-30 2010-05-10 Новартис АГ (CH) КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ АНТИТЕЛ К c-Met
KR20090078349A (ko) * 2006-10-12 2009-07-17 제넨테크, 인크. 림포톡신-알파에 대한 항체
US8039598B2 (en) * 2007-01-19 2011-10-18 Van Andel Research Institute Met fab and SCFV fragments
EP2014681A1 (en) 2007-07-12 2009-01-14 Pierre Fabre Medicament Novel antibodies inhibiting c-met dimerization, and uses thereof
KR101499278B1 (ko) * 2007-12-17 2015-03-06 화이자 리미티드 간질성 방광염의 치료
EP2352763B2 (en) 2008-10-01 2022-09-21 Amgen Research (Munich) GmbH Bispecific single chain antibodies with specificity for high molecular weight target antigens
PA8849001A1 (es) 2008-11-21 2010-06-28 Lilly Co Eli Anticuerpos de c-met
AR074439A1 (es) * 2008-12-02 2011-01-19 Pf Medicament Anticuerpo anti-cmet (receptor c-met)
EP2287197A1 (en) * 2009-08-21 2011-02-23 Pierre Fabre Medicament Anti-cMET antibody and its use for the detection and the diagnosis of cancer
KR101748707B1 (ko) 2009-11-27 2017-06-20 삼성전자주식회사 ｃ-Ｍｅｔ에 특이적으로 결합하는 항체 및 그를 이용한 암 진단용 키트
WO2012059562A1 (en) * 2010-11-03 2012-05-10 Argen-X-Bv C-met antibody combinations
KR101865223B1 (ko) * 2011-10-05 2018-06-08 삼성전자주식회사 항 ｃ-Ｍｅｔ 인간화 항체 및 그의 용도
WO2013064700A2 (en) * 2011-11-03 2013-05-10 Argen-X B.V. Chimeric polypeptides and methods of use

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110104176A1 (en) * 2009-10-30 2011-05-05 Samsung Electronics Co., Ltd. Antibody specifically binding to c-met and use thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
菅村和夫他, サイトカイン・増殖因子 用語ライブラリー, vol. 第1刷発行, JPN6016050654, 1 March 2005 (2005-03-01), pages 第217〜221頁 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015129755A (ja) * 2014-01-07 2015-07-16 三星電子株式会社Ｓａｍｓｕｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ． ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の効能予測または効能検証のためのバイオマーカー

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KR20130036993A (ko) 2013-04-15
CN103987730A (zh) 2014-08-13
US9394367B2 (en) 2016-07-19
IL231952A0 (en) 2014-05-28
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