JP2014513968A - Ｈｃｍｖ感染細胞からの「高密度体」（ｄｂ）の産生 - Google Patents

Abstract

本発明は、「高密度体（ｄｅｎｓｅ ｂｏｄｉｅｓ：ＤＢ）」の産生およびＤＢを含有する医薬組成物に関する。

Description

本発明は、「高密度体（ｄｅｎｓｅ ｂｏｄｉｅｓ：ＤＢ）」の産生およびＤＢを含有する医薬組成物に関する。

ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）はヒトヘルペスウイルス５とも呼ばれる、エンベロープを持つ二本鎖ＤＮＡウイルスであり、ヘルペスウイルスに分類される。ＨＣＭＶは一般に、健康な成人には無害である。しかしながら、妊婦には特に危険であることが示されており、胎児の生命を脅かすことさえある。また、免疫系の働きが低下している人々の場合、ＨＣＭＶへの感染が致死的疾患の発病につながることもある。したがって、ＡＩＤＳ患者、移植レシピエント、幹細胞移植の後の白血病患者、細胞増殖抑制剤による治療を受けている患者などは、危険性が高い。

免疫系の働きが低下している患者がＨＣＭＶに感染した場合、たとえばガンシクロビル、ホスカルネット、シドホビル、また場合によってはアシクロビルといったウイルス増殖抑制剤が使用される。

さらに、ＨＣＭＶに対する接種剤またはワクチンを開発するための研究が、既に長年にわたって行われている。たとえば、弱毒化した生菌ワクチンを用いて所望の免疫を誘導することが試みられたが、限定的な防御が達成されたに過ぎなかった。

別のアプローチは、いわゆる「高密度体」（ＤＢ）による予防接種を行うことから成る。ＤＢは、ＨＣＭＶに由来する、電子顕微鏡で視認可能な構造である。ＤＢは、細胞の脂質膜に由来するエンベロープに包まれたサブウイルス粒子であり、エンベロープにはウイルス糖タンパク質が包埋されている。このようなウイルスタンパク質は、ウイルスの脂質膜中で天然の立体構造をとって存在する確率が高い。ＤＢは、ウイルス粒子と同様に感染細胞の細胞質内で形成され、その後細胞から放出される。ＤＢは、自体のタンパク質質量の９０％までが、ウイルスによりコードされたいわゆるｐｐ６５タンパク質（ＵＬ８３）から構成されている。またその他に、ＤＢにおいて検出され得るタンパク質としては、特にウイルスタンパク質ｐｐ１５０（ＵＬ３２）、ｇＨ（ＵＬ７５）、ｇＭ（ＵＬ１００）およびｇＢ（ＵＬ５５）が挙げられる。ＤＢはウイルスのＤＮＡもカプシドも一切含まないため、感染性はない。

公知技術において、ＤＢは、ＨＣＭＶに極めてよく似た抗原特性を備え、ＨＣＭＶ感染を予防するための、あるいはＨＣＭＶに感染した際の接種剤として適したものとされている。このような接種剤の有効性は特に高いことが判明している。ＤＢには感染性がないため、生菌ワクチンと比べて、リスクプロファイルおよび副作用は相当低いものと評価されている。そのため、「ＶＰＭ２００１」という名称のＤＢ含有接種剤が、既に臨床試験段階にある。ＤＢを用いた予防接種の原理および利点は、たとえば国際公開第００／５３７２号パンフレットに記載されている。

ＨＣＭＶの通常の感染サイクルにおいて、ｉ）ＤＢはごく少量しか形成されず、したがって限られた量しか利用できない、ｉｉ）ＤＢ調製物が感染性のＨＣＭＶで汚染されている可能性がある、という理由から、ＤＢの形成を目標とする量まで増加させ、かつ感染性ＨＣＭＶによる汚染を防止する方法が求められている。

Ｒｅｅｆｓｃｈｌａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４８，７５７−７６７およびＢｕｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５，９０７７−９０８６には、「ＢＡＹ３８−４７６６」という名称の、形成されるＤＢ量を増加させる物質が記載されている。

Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８１，１１６０４−１１６１１および同著者の（２００９），Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ５３，５０９５−５１０１には、ベンゾイミダゾール−Ｄ−リボヌクレオシドが記載されており、この物質もまた形成されるＤＢ量を増加させる目的に適している可能性がある。

しかしながら、ＤＢ形成の最適化に適していると思われる上記の各物質に関して、実際の値として証拠が得られているわけではない。

このような状況下、本発明の目的は、ＤＢの産生において添加剤として使用することによりｉ）ＤＢ調製物の感染性ＨＣＭＶによる汚染を防止し、ｉｉ）産生時のＤＢの収率を増加させるような物質を提供することである。

この目的は、以下より選択される物質の使用により達成される。

本発明の基礎をなす別の目的は、ＤＢを産生するための新しい方法を提供することである。

このさらなる目的は、１）適切な培地中で、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）感染生体細胞を調製するステップ、および２）感染生体細胞を、上記物質（Ａ）〜（Ｄ）から選択される物質を用いて培養するステップ、を含む方法により達成される。

本発明者らは、ＤＢの産生に上記物質が非常に適していることを確認した。具体的には、これらの化合物の存在下、ＨＣＭＶに感染した、たとえば初代線維芽細胞などの生体細胞を用いることにより、細胞質内にＤＢが密度高く蓄積し、培地中に放出されることを観察することができた。この場合、物質（Ａ）〜（Ｄ）により、細胞核内における無傷のウイルス粒子の形成が防止され、その結果感染細胞からの感染性ＨＣＭＶの放出が確実に防止され、非常に有利であることが確認されている。したがって、感染性ウイルス粒子による汚染について懸念することなく、培地または感染細胞溶解物から容易にＤＢを単離することができる。

本発明によれば、この方法において、ＨＣＭＶに対して許容状態にある生体細胞を使用することが適している。

本発明によれば、「適切な培地」は慣用の細胞培養培地と定義される。この場合、好ましく使用される培地は、それぞれの場合に使用される細胞の種類により異なる。適切な培地としては、たとえば、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）＋１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）＋２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ；ペニシリンＧナトリウム１，０００μｇ／ｍｌ；０．８５％硫酸ストレプトマイシン）、ゲンタマイシン１００μｇ／ｍｌ、ヘパリン５Ｕ／ｍｇ、内皮細胞成長因子５０μｇ／ｍｌ、１５％ヒト血清（ＨＣＭＶに対して血清反応陰性）およびシプロベイ１２μｇ／ｍｌを含むＥＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＮａＰ）＋１％非必須アミノ酸＋１％Ｐｅｎ／ＳｔｒｅｐまたはＲＰＭＩ１６４０などが挙げられる。

この場合、本発明によれば、生体細胞は、ヒト内皮細胞、ヒト線維芽細胞、ヒト樹状細胞、ヒト上皮細胞およびヒトマクロファージから選択される初代細胞であることが好ましい。

このような細胞を選択すれば、ＨＣＭＶに対して許容状態にあり、そのためＤＢの産生に特に適した細胞が使用されることになり、有利である。

さらに、培地中の前記物質の濃度を約１ｎｍｏｌ／ｌ〜１００μｍｏｌ／ｌとして生体細胞の培養を行うことが好ましい。

この範囲であれば、本発明者らの知見に基づき、特に良好な結果につながる濃度範囲が選択されることになり、有利である。厳密な濃度は、使用する生体細胞、および感染に使用するＨＣＭＶの菌株により異なる。個々の場合における厳密な濃度は、当業者であれば、希釈系列を用いた簡単な用量設定試験を行うことにより容易に求めることができる。このようにして、本発明者らは、濃度５０ｎｍｏｌ／ｌの物質（Ａ）とＨＣＭＶのＡＤ１６９株に感染したヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）とを用いて最適な結果を得ることができた。同様にして、物質（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）についても、濃度５ｎｍｏｌ／ｌ、５００ｎｍｏｌ／ｌ、５００ｎｍｏｌ／ｌで最適な結果が得られた。ＨＣＭＶのＴＢ４０／Ｅ株に感染したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の培養においては、物質（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）について、濃度３００ｎｍｏｌ／ｌ、３００ｎｍｏｌ／ｌ、３μｎｍｏｌ／ｌ、３０μｍｏｌ／ｌで最適な結果が得られた。ＨＣＭＶの臨床分離株に感染したＨＦＦと非感染ＨＦＦとの共培養においては、濃度３００ｎｍｏｌ／ｌ、３００ｎｍｏｌ／ｌ、３μｍｏｌ／ｌ、３０μｍｏｌ／ｌで良好な結果が得られた。

さらに、培養は１〜１４日間、好ましくは３〜１０日間、さらに好ましくは５日間にわたって行われることが好ましい。

培養に上記の時間をかければ、十分な量のＤＢが得られることになり、有利である。

本発明によれば、前記物質を用いた生体細胞の培養後にＤＢの単離が行われることも好ましい。

このようにすれば、そのまま次の処理、たとえば製剤化してワクチンとすることなどが可能となる形態でＤＢが得られるため、有利である。ＤＢの単離は、当業者に知られている方法で行われる。たとえば、無細胞培地を遠心分離機にかけると、ＤＢは沈殿する。この沈殿は、上清から容易に分離することできる。

このような状況下、本発明はさらに、（１）「高密度体」（ＤＢ）を産生するステップ、（２）ステップ（１）で産生したＤＢを調製するステップ、および（３）ステップ（２）で調製したＤＢを薬学的に許容される賦形剤を用いて製剤化するステップを有する、医薬組成物、好ましくはワクチンを製造するための方法に関し、ステップ（１）の産生は、本発明の上記方法によって行われる。

薬学的に許容される賦形剤は、公知技術として広く知られており、たとえば結合剤、崩壊剤、充填剤、潤滑剤、緩衝剤、塩類、および薬剤の製剤化に適した他の物質が含まれる（Ｒｏｗｅ，Ｅ． ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＰｒｅｓｓまたはＢａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｌｅｈｒｂｕｃｈ ｄｅｒ ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］， ６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｌｉｃｈｅ Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ ｍｂＨを参照のこと）。これらの刊行物の内容は、参照により本出願の構成要素となる。

ワクチンの製造において、免疫反応を増強するアジュバントを提供することもできる。この場合、アジュバントは、油水混合物、リポ多糖類、水酸化アルミニウムなどであってよい。アジュバントは、公知技術において包括的に記載されている。

このような状況下、本発明はさらに、上記の方法で製造される医薬組成物、好ましくはワクチンに関する。

本発明による使用、および本発明によるＤＢを産生するための方法に関して説明された特徴、特性および利点は、本発明による医薬組成物を製造するための方法、および本発明による医薬組成物に関しても、同程度に当てはまる。

続いて、本発明の好ましい実施形態について説明するが、これらは単なる例示に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。ここでは、以下に示す添付の図を参照されたい。

ＨＣＭＶ感染細胞との共培養後、物質（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）とともに培養した細胞が、未処理細胞（Ｅ）と比較して、細胞質内に大量のＤＢ（矢印）を蓄積することを示す電子顕微鏡像である。

１． 本発明の物質（Ａ）〜（Ｄ）
物質（Ａ） （４Ｓ）−｛８−フルオロ−２−［４−（３−メトキシフェニル）−１−ピペラジニル］−３−［２−メトキシ−５−（トリフルオロメチル）−フェニル］−３，４−ジヒドロ−４−キナゾリニル｝酢酸の合成は、国際公開第２００４／０９６７７８号パンフレット、７２〜７３ページの実施形態１４および１５に詳細に記載されている。

物質（Ｂ） Ｎ−｛１−メチル−２−［（４−（５−メチル−ピリジン−２−イル）−ピペラジン−１−イル）カルボニル］−１Ｈ−イミダゾール−４−イル｝−Ｎ’−［４−（トリフルオロメトキシ）フェニル］尿素の合成は、国際公開第２００６／０８９６６４号パンフレット、３９〜４０ページの実施形態２に詳細に記載されている。

物質（Ｃ） １−［６−フルオロ−８−メトキシ−３−（｛［２−メチル−４−（トリフルオロメトキシ）ベンジル］アミノ｝カルボニル）−４−オキソ−１−（２，２，２−トリフルオロエチル）−１，４−ジヒドロキノリン−７−イル］ピペリジン−４−カルボン酸の合成は、国際公開第２００７／０９０５７９号パンフレット、９６〜９７ページの実施形態４７に詳細に記載されている。

物質（Ｄ） Ｎ−｛３−［（｛４−［５−（６−アミノピリジン−２−イル）−１，２，４−オキサジアゾール−３−イル］フェニル｝スルフォニル）アミノ］−５−フルオロフェニル｝−１−シアノシクロプロパンカルボキサミドの合成は、国際公開第２００７／１０１５７３号パンフレット、４９ページの実施形態１に詳細に記載されている。

これらの先行技術文献、すなわち国際公開第２００４／０９６７７８号パンフレット、国際公開第２００６／０８９６６４号パンフレット、国際公開第２００７／０９０５７９号パンフレットおよび国際公開第２００７／１０１５７３号パンフレットの内容、特にここで特定した合成の説明に関しては、参照により本開示の構成要素となる。

２． 「高密度体」（ＤＢ）の産生
２．１ ＨＣＭＶのＡＤ１６９株に感染した線維芽細胞における産生
ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）は、感染の前日に、５個のＴ７５細胞培養フラスコに、１フラスコ当たり１×１０^６個ずつ加えた。ＨＣＭＶのＡＤ１６９株は、感染後期の細胞から得て凍結した無細胞ウイルス調製物として準備した。本発明の物質（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）は、それぞれ５０ｍｍｏｌ／ｌでＤＭＳＯに溶解した原液として提供された。

上記の原液を１：１０００で希釈し、終濃度５０μｍｏｌ／ｌとした。これらの溶液を、さらに以下のように希釈した。
Ａ： １：１０００（５０ｎｍｏｌ／ｌ）１２ｍｌのＭＥＭ中１２μｍｌ
Ｂ： １：１０，０００（５ｎｍｏｌ／ｌ）１２ｍｌのＭＥＭ中１．２μｍｌ
Ｃ： １：１００（５００ｎｍｏｌ／ｌ）１２ｍｌのＭＥＭ中１２０μｍｌ
Ｄ： １：１００（５００ｎｍｏｌ／ｌ）１２ｍｌのＭＥＭ中１２０μｍｌ

ＨＦＦ細胞は、ＭＯＩ．（感染多重度）≧≧１ ＴＣＩＤ_５０／細胞（１：２０希釈）のウイルス調製物とともに１時間培養した。次いで、ウイルス上清を除去し、以下の濃度の本発明の物質を用いて感染細胞の培養を行った。
Ａ：５０ｎｍｏｌ／ｌ；Ｂ：５ｎｍｏｌ／ｌ；Ｃ：５００ｎｍｏｌ／ｌ；Ｄ：５００ｎｍｏｌ／ｌ

細胞培養は５日間行い、１日目および４日目の終わりに前記物質を含んだ培地を交換した。培養後、感染細胞を電子顕微鏡で観察し、ＤＢの形成について調べた。

結果を添付の図１に示す。本発明の物質（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）で処理した細胞はいずれもＤＢを細胞質内に密度高く蓄積したが、未処理細胞（Ｅ）はＤＢを実質的に全く蓄積しないことが示された。矢印で示したものがＤＢである。さらに、処理した細胞の細胞質内に感染性ウイルス粒子は全く見られなかったが、未処理細胞の細胞質では比較的多くの感染性ウイルス粒子が検出された。
２．２ ＨＣＭＶのＴＢ４０／Ｅ株に感染した内皮細胞における産生

別の実験において、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を感染後期の細胞から単離したＨＣＭＶのＴＢ４０／Ｅ株に感染させた。実験は２．１と同様に設計し、以下の濃度の本発明の物質を用いて細胞の培養を行った。
Ａ：３００ｎｍｏｌ／ｌ；Ｂ：３００ｎｍｏｌ／ｌ：Ｃ：３μｍｏｌ／ｌ；Ｄ：３０，０００μｍｏｌ／ｌ

電子顕微鏡で調べたところ、ここでも、本発明の物質（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）を用いて培養した感染細胞の細胞質にはＤＢが密度高く存在した。対照の（Ｅ）では、わずか数個のＤＢしか確認できなかった。２．１での観察結果と同様、処理した細胞の細胞質内では、ウイルス粒子は検出されなかった。

２．３ 非感染線維芽細胞と共培養した、ＨＣＭＶ臨床分離株感染線維芽細胞における産生
２．１で詳述した方法と同様に、感染後期の細胞から分離したＨＣＭＶ臨床分離株にＨＦＦを感染させた。ミニトレー（３，０００細胞／ウェル）を用いて、感染したＨＦＦを非感染ＨＦＦと共培養した。感染細胞と非感染細胞の割合は、希釈率の異なる３種類（無希釈；１：２希釈；１：４希釈）を用意した。以下の濃度の本発明の物質を用いて、細胞の培養を行った。
Ａ：３００ｎｍｏｌ／ｌ；Ｂ：３００ｎｍｏｌ／ｌ；Ｃ：３μｍｏｌ／ｌ；Ｄ：３０μｍｏｌ／ｌ

３７℃で５日間培養した後、電子顕微鏡による検査を行った。感染細胞が最も高い割合で存在する「無希釈」の場合、本発明の物質を用いて行った培養後の細胞質には、非常に大量のＤＢが蓄積した。非感染細胞による希釈率が高いほど、細胞質中に蓄積するＤＢは減少した。本発明の物質を使用しない対照の場合、ＤＢはほとんど確認できなかった。さらに、本発明の物質を添加することで、感染性粒子の細胞核からの放出が防止された。

３． 高密度体の単離
高密度体の単離に関しては、公知技術、たとえばＰｅｐｐｅｒｌ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４，６１３２−６１４６およびＩｒｍｉｅｒｅ， Ａ． ａｎｄ Ｗ． Ｇｉｂｓｏｎ（１９９３），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １３０，１１８−１３３に詳細に記載されている。これらの刊行物の内容は、参照により本出願の構成要素となる。

その内容に従い、以下のように、感染細胞の培地から目的の粒子を精製する。感染の６日後、細胞培養フラスコの底から感染細胞をこすり取り、培地に再懸濁する。この懸濁液を４℃で１０分間、低速（たとえば１，５００ｇ）で遠心分離する。得られた無細胞培地を、０．１ＭＮａＣｌを含むｐＨ７．４のトリス塩酸緩衝液（ＴＮ緩衝液；Ｔａｌｂｏｔ ａｎｄ Ａｌｍｅｄａ，１９７７）０．０５ｍｌを用いて調製した酒石酸カリウム−グリセリン勾配液に加え、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｒｏｔｏｒ ＳＷ４１およびＳｏｒｖａｌｌ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ＯＴＤ−５０を用いて、低加速の「すくい取り（ｒａｋｉｎｇ）」モード、４０，０００ｒｐｍに設定し、４℃で１５分間遠心分離する。ＤＢを含むバンドは特徴的な光散乱特性を有するため、勾配液中で同定することができる。遠心管の壁に３２ゲージの針を刺して、該当するバンドを吸引する。必要に応じ、同じ勾配液および遠心分離条件下、平衡状態まで（すなわち１８時間）、別の適切な沈降法またはより長時間の遠心分離を行い、ＤＢをさらに精製することができる。

４． 結果
本発明者らは、本発明の物質（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）を用いることにより、並外れた効率で多量の高密度体が産生されることを示すことができた。この高密度体は、単離精製後、たとえばワクチンとして使用することができる。前述の物質の使用により高純度のＤＢを単離できることは、特に有利である。

Claims (18)

1. 「高密度体」（ＤＢ）を産生するための、以下の物質：
   

   

   から選択される物質の使用。
2. 前記物質を用いてヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）に感染した生体細胞を適切な培地中で培養することを特徴とする、請求項１に記載の使用。
3. 生体細胞が初代細胞であることを特徴とする、請求項２に記載の使用。
4. 生体細胞がヒト線維芽細胞、ヒト内皮細胞、ヒト樹状細胞、ヒト上皮細胞およびヒトマクロファージから成る群から選択されることを特徴とする、請求項２または３に記載の使用。
5. 培地中の前記物質の濃度を約１ｎｍｏｌ／ｌ〜１００μｍｏｌ／ｌとして培養が行われることを特徴とする、請求項２〜４のいずれかに記載の使用。
6. 培養が１〜１４日間、好ましくは３〜１０日間、さらに好ましくは５日間にわたって行われることを特徴とする、請求項２〜５のいずれかに記載の使用。
7. 培養後にＤＢが単離されることを特徴とする、請求項２〜６のいずれかに記載の使用。
8. 前記単離が無細胞培地からＤＢを分離することによって行われ、その手段として遠心分離が用いられることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
9. （１）適切な培地中で、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）感染生体細胞を調製するステップ、および
   （２）感染生体細胞を、以下の物質：
   

   

   から選択される物質を用いて培養するステップ
   を含む、「高密度体」（ＤＢ）を産生するための方法。
10. 生体細胞が初代細胞であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
11. 生体細胞がヒト内皮細胞、ヒト線維芽細胞、ヒト樹状細胞、ヒト上皮細胞およびヒトマクロファージから成る群から選択されることを特徴とする、請求項９または１０に記載の方法。
12. ステップ（２）が培地中の前記物質の濃度を約１ｎｍｏｌ／ｌ〜１μｍｏｌ／ｌとして行われることを特徴とする、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
13. ステップ（２）が１〜１４日間、好ましくは３〜１０日間、さらに好ましくは５日間にわたって行われることを特徴とする、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
14. ステップ（２）の後に、さらなるステップである
    （３）ＤＢの単離
    が続くことを特徴とする、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
15. ステップ（３）において、無細胞培地を遠心分離することによってＤＢが該培地から分離されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
16. （１）「高密度体」（ＤＢ）を産生するステップ、
    （２）ステップ（１）で産生したＤＢを調製するステップ、および
    （３）ステップ（２）で調製したＤＢを薬学的に許容される賦形剤を用いて製剤化するステップ、
    を有する医薬組成物の製造方法であって、このうち産生ステップ（１）が請求項９〜１５のいずれかに記載の方法によって行われることを特徴とする方法。
17. 医薬組成物がワクチンであることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
18. 請求項１６または１７の方法によって製造される医薬組成物。

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