JP2014506447A - 多能性幹細胞から樹状細胞を製造する方法 - Google Patents
多能性幹細胞から樹状細胞を製造する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2014506447A JP2014506447A JP2013539023A JP2013539023A JP2014506447A JP 2014506447 A JP2014506447 A JP 2014506447A JP 2013539023 A JP2013539023 A JP 2013539023A JP 2013539023 A JP2013539023 A JP 2013539023A JP 2014506447 A JP2014506447 A JP 2014506447A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- culture
- cell
- csf
- days
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 55
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 26
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 148
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 50
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 31
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims description 27
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 26
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 claims description 23
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 claims description 23
- 102100020715 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Human genes 0.000 claims description 20
- 101710162577 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Proteins 0.000 claims description 20
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 18
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 claims description 17
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 claims description 15
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 claims description 15
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 14
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 14
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims description 12
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 11
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 10
- 101000762379 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 4 Proteins 0.000 claims description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 9
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 claims description 8
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 claims description 7
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 claims description 7
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 claims description 5
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 claims description 4
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 claims description 4
- 102100020880 Kit ligand Human genes 0.000 claims 5
- 101710177504 Kit ligand Proteins 0.000 claims 5
- 102100028123 Macrophage colony-stimulating factor 1 Human genes 0.000 claims 3
- 101710113649 Thyroid peroxidase Proteins 0.000 claims 3
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims 1
- 102100027188 Thyroid peroxidase Human genes 0.000 claims 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 26
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 22
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 15
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 15
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 15
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 13
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 12
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 12
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 9
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 108700014844 flt3 ligand Proteins 0.000 description 8
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 6
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- -1 Fbx15 Proteins 0.000 description 5
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 5
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 5
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 5
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 5
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 5
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 5
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 5
- YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M sodium;3-acetamido-5-[acetyl(methyl)amino]-2,4,6-triiodobenzoate;(2r,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound [Na+].CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I.O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 4
- NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N Valproic acid Chemical compound CCCC(C(O)=O)CCC NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 102000003964 Histone deacetylase Human genes 0.000 description 3
- 108090000353 Histone deacetylase Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101000595923 Homo sapiens Placenta growth factor Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 102100035194 Placenta growth factor Human genes 0.000 description 3
- 102000009524 Vascular Endothelial Growth Factor A Human genes 0.000 description 3
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 3
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 3
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 3
- 102100038511 AT-rich interactive domain-containing protein 3A Human genes 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 2
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102100039996 Histone deacetylase 1 Human genes 0.000 description 2
- 101000808887 Homo sapiens AT-rich interactive domain-containing protein 3A Proteins 0.000 description 2
- 101001035024 Homo sapiens Histone deacetylase 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 101150086694 SLC22A3 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 210000000688 human artificial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 229960000604 valproic acid Drugs 0.000 description 2
- JUNHQBJCWZVSAT-BQYQJAHWSA-N (e)-n-hydroxy-3-[1-methyl-4-(4-methylbenzoyl)pyrrol-2-yl]prop-2-enamide Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C(=O)C1=CN(C)C(\C=C\C(=O)NO)=C1 JUNHQBJCWZVSAT-BQYQJAHWSA-N 0.000 description 1
- 238000010600 3H thymidine incorporation assay Methods 0.000 description 1
- NMUSYJAQQFHJEW-UHFFFAOYSA-N 5-Azacytidine Natural products O=C1N=C(N)N=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 5-Methylcytidine Natural products O=C1N=C(N)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 5-azacytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 NMUSYJAQQFHJEW-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 5-methylcytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 1
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 1
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 1
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical compound CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100257372 Caenorhabditis elegans sox-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 101150099612 Esrrb gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100028971 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010052199 HLA-C Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010010378 HLA-DP Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000015789 HLA-DP Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010062347 HLA-DQ Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000011787 Histone Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108010036115 Histone Methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 101000762366 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000977692 Homo sapiens Iroquois-class homeodomain protein IRX-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000595669 Homo sapiens Pituitary homeobox 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 101000777245 Homo sapiens Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102100023527 Iroquois-class homeodomain protein IRX-6 Human genes 0.000 description 1
- 101150072501 Klf2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 108090000362 Lymphotoxin-beta Proteins 0.000 description 1
- 102100026894 Lymphotoxin-beta Human genes 0.000 description 1
- 101710151321 Melanostatin Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 101100335081 Mus musculus Flt3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100310657 Mus musculus Sox1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100310648 Mus musculus Sox17 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100257376 Mus musculus Sox3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 108700026495 N-Myc Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102100030124 N-myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 101150072008 NR5A2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102400000064 Neuropeptide Y Human genes 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 102100036090 Pituitary homeobox 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100040681 Platelet-derived growth factor C Human genes 0.000 description 1
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150001847 Sox15 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- 101150111019 Tbx3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- RTKIYFITIVXBLE-UHFFFAOYSA-N Trichostatin A Natural products ONC(=O)C=CC(C)=CC(C)C(=O)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 RTKIYFITIVXBLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100031278 Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010073925 Vascular Endothelial Growth Factor B Proteins 0.000 description 1
- 108010073923 Vascular Endothelial Growth Factor C Proteins 0.000 description 1
- 108010073919 Vascular Endothelial Growth Factor D Proteins 0.000 description 1
- 102100038217 Vascular endothelial growth factor B Human genes 0.000 description 1
- 102100038232 Vascular endothelial growth factor C Human genes 0.000 description 1
- 102100038234 Vascular endothelial growth factor D Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002756 azacitidine Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000801 calcium channel stimulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- GKTWGGQPFAXNFI-HNNXBMFYSA-N clopidogrel Chemical compound C1([C@H](N2CC=3C=CSC=3CC2)C(=O)OC)=CC=CC=C1Cl GKTWGGQPFAXNFI-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000005258 dental pulp stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 1
- 229960002986 dinoprostone Drugs 0.000 description 1
- 239000003968 dna methyltransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000001842 enterocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000000597 exocrine pancreas cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000002980 germ line cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000003572 glycogen synthase kinase 3 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000002768 hair cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 108010028309 kalinin Proteins 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001821 langerhans cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 101150111214 lin-28 gene Proteins 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003697 methyltransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108091072810 miR-294 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091030789 miR-302 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002829 mitogen activated protein kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000000472 morula Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- FMURUEPQXKJIPS-UHFFFAOYSA-N n-(1-benzylpiperidin-4-yl)-6,7-dimethoxy-2-(4-methyl-1,4-diazepan-1-yl)quinazolin-4-amine;trihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.C=12C=C(OC)C(OC)=CC2=NC(N2CCN(C)CCC2)=NC=1NC(CC1)CCN1CC1=CC=CC=C1 FMURUEPQXKJIPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 1
- URPYMXQQVHTUDU-OFGSCBOVSA-N nucleopeptide y Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 URPYMXQQVHTUDU-OFGSCBOVSA-N 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000005134 plasmacytoid dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010017992 platelet-derived growth factor C Proteins 0.000 description 1
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UQOQENZZLBSFKO-POPPZSFYSA-N prostaglandin J2 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@@H]1[C@@H](C\C=C/CCCC(O)=O)C=CC1=O UQOQENZZLBSFKO-POPPZSFYSA-N 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 229940082569 selenite Drugs 0.000 description 1
- MCAHWIHFGHIESP-UHFFFAOYSA-L selenite(2-) Chemical compound [O-][Se]([O-])=O MCAHWIHFGHIESP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001988 somatic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- RTKIYFITIVXBLE-QEQCGCAPSA-N trichostatin A Chemical compound ONC(=O)/C=C/C(/C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 RTKIYFITIVXBLE-QEQCGCAPSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
- C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
- C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/145—Thrombopoietin [TPO]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/26—Flt-3 ligand (CD135L, flk-2 ligand)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
以下の工程により多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞から樹状細胞を製造する。
（１）BMPファミリータンパク質を含有し、血清を含まない培養液を用いて接着培養する工程、
（２）VEGFを含有し、血清を含まない培養液を用いて接着培養する工程、
（３）造血因子を含有し、血清を含まない培養液を用いて接着培養する工程、および
（４）血清を含まない培養液を用いて浮遊培養する工程。
（１）BMPファミリータンパク質を含有し、血清を含まない培養液を用いて接着培養する工程、
（２）VEGFを含有し、血清を含まない培養液を用いて接着培養する工程、
（３）造血因子を含有し、血清を含まない培養液を用いて接着培養する工程、および
（４）血清を含まない培養液を用いて浮遊培養する工程。
Description
本発明は多能性幹細胞から効率よく樹状細胞を製造する方法およびそれによって得られた樹状細胞に関する。
樹状細胞は、ナイーブT細胞の予備刺激等において重要な役割を果たす抗原提示細胞の中で最も強力な細胞の一つである。そこで、抗原をパルスした樹状細胞を用いたガン免疫療法等への応用が提案されている（特許文献１）。
一方、胚性幹細胞（ES細胞）や体細胞へ未分化細胞特異的遺伝子を導入することで得られる人工多能性幹細胞（iPS細胞）など多能性を有する細胞がこれまでに報告されている（特許文献２または特許文献３）。そこで、これらの多能性幹細胞から分化誘導された樹状細胞を移植する再生医療やこの樹状細胞を用いたin vitroでの病態モデルを作製することに注目が置かれている。
これまでES細胞またはiPS細胞から樹状細胞を作製する方法として、サイトカインを添加した培養液で胚様体を形成させ誘導する方法（非特許文献１）または異種由来のストローマ細胞上で培養する方法（非特許文献２）が用いられている。しかし、胚様体を経る方法では、一部の細胞のみが目的の細胞となり、その他の多くは別の細胞種へと分化誘導されてしまい、誘導効率が悪くなってしまう。また、異種細胞を用いた場合、誘導された細胞を移植用に用いることは困難である。さらに、病態モデルを作製する場合において、常に同等の樹状細胞を用意するために、ロット差等の不確定要素を含む培養条件をできる限り用いないことが好ましい。
しかし、これまで、胚様体の形成や異種細胞との共培養法を用いず、尚且つ限定された成分の培養液を用いる方法での多能性幹細胞から樹状細胞の作製は報告されていない。
Zhan X, et al, Lancet. 2004, 364, 163-71
Senju S, et al, Stem Cells. 2007, 25, 2720-9
本発明の目的は、多能性幹細胞から限定された成分を用いて効率よく樹状細胞を製造することである。したがって、本発明の課題は、ヒト多能性幹細胞、特にヒト人工多能性幹細胞を樹状細胞へ分化誘導する培養条件を提供することである。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、多能性幹細胞をフィーダー細胞のない条件下で、BMP4、VEGFおよび種々の造血因子を含み血清を含まない培養液を適宜交換し、接着培養と浮遊培養を行ったところ、目的の樹状細胞が得られることを見出した。
以上の結果から、本発明者らは、多能性幹細胞を適切な培養条件で培養し、限定的な条
件で樹状細胞を製造することに成功し、本発明を完成するに至った。
件で樹状細胞を製造することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
本発明の一つの態様は、以下の工程により多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞より樹状細胞を製造する方法を提供することである。
（１）BMPファミリータンパク質を含有し、血清を含まない培養液を用いて接着培養する工程、
（２）VEGFを含有し、血清を含まない培養液を用いて接着培養する工程、
（３）造血因子を含有し、血清を含まない培養液を用いて接着培養する工程、および
（４）血清を含まない培養液を用いて浮遊培養する工程。
本発明の他の態様は、前記工程（１）から工程（３）における接着培養が、細胞外基質をコーティングしたディッシュで行われる、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記細胞外基質がマトリゲルである、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、BMPファミリータンパク質がBMP4である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記工程（２）において、培養が、さらにbFGFおよび／またはSCFを含む培地において行われる、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記造血因子が、SCF、TPO、IL-3、Flt3-ligand、GM-CSFおよびM-CSFから成る群より選択される少なくとも一つの造血因子である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記工程（３）において、SCF、TPO、IL-3、Flt3-ligand を含む培養液で培養した後、さらにGM-CSF、M-CSFおよびFlt3-ligandを含む培養液で培養する、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記工程（３）において、SCF、TPO、IL-3、Flt3-ligand を含む培養液で培養した後、さらにSCF、Flt3-ligand、GM-CSFおよびM-CSFを含む培養液で培養する、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記工程（４）の浮遊培養において、GM-CSFおよびIL-4を含有する培養液を用いる、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記工程（４）の浮遊培養において、さらにLPSおよびTNF-αを含む培養液で培養する工程を含む、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記樹状細胞が、HLA-DR陽性ならびにCD14陰性の樹状細胞である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記樹状細胞が、CD83陽性である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記工程（１）が、４日間である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記工程（２）が、２日間である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記多能性幹細胞が、ヒトiPS細胞である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記いずれかに記載の方法で製造された樹状細胞を提供することである。
本発明の一つの態様は、以下の工程により多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞より樹状細胞を製造する方法を提供することである。
（１）BMPファミリータンパク質を含有し、血清を含まない培養液を用いて接着培養する工程、
（２）VEGFを含有し、血清を含まない培養液を用いて接着培養する工程、
（３）造血因子を含有し、血清を含まない培養液を用いて接着培養する工程、および
（４）血清を含まない培養液を用いて浮遊培養する工程。
本発明の他の態様は、前記工程（１）から工程（３）における接着培養が、細胞外基質をコーティングしたディッシュで行われる、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記細胞外基質がマトリゲルである、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、BMPファミリータンパク質がBMP4である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記工程（２）において、培養が、さらにbFGFおよび／またはSCFを含む培地において行われる、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記造血因子が、SCF、TPO、IL-3、Flt3-ligand、GM-CSFおよびM-CSFから成る群より選択される少なくとも一つの造血因子である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記工程（３）において、SCF、TPO、IL-3、Flt3-ligand を含む培養液で培養した後、さらにGM-CSF、M-CSFおよびFlt3-ligandを含む培養液で培養する、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記工程（３）において、SCF、TPO、IL-3、Flt3-ligand を含む培養液で培養した後、さらにSCF、Flt3-ligand、GM-CSFおよびM-CSFを含む培養液で培養する、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記工程（４）の浮遊培養において、GM-CSFおよびIL-4を含有する培養液を用いる、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記工程（４）の浮遊培養において、さらにLPSおよびTNF-αを含む培養液で培養する工程を含む、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記樹状細胞が、HLA-DR陽性ならびにCD14陰性の樹状細胞である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記樹状細胞が、CD83陽性である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記工程（１）が、４日間である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記工程（２）が、２日間である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記多能性幹細胞が、ヒトiPS細胞である、前記方法を提供することである。
本発明の他の態様は、前記いずれかに記載の方法で製造された樹状細胞を提供することである。
本発明を以下に詳細に説明する。
本発明は、上記のとおり、（１）BMPファミリータンパク質を含有し、血清を含まない培養液を用いて接着培養する工程、（２）VEGFを含有し、血清を含まない培養液を用いて接着培養する工程、（３）造血因子を含有し、血清を含まない培養液を用いて接着培養する工程、および（４）血清を含まない培養液を用いて浮遊培養し、それにより樹状細胞を得る工程を含む、多能性幹細胞から樹状細胞を含む細胞を製造する方法に関する。
＜多能性幹細胞＞
本発明で使用可能な多能性幹細胞は、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、以下のものに限定されないが、例えば胚性幹(ES)細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞、精子幹細胞（「GS細胞」）、胚性生殖細胞（「EG細胞」）、人工多能性幹(iPS)細胞などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ES細胞、ntES細胞、およびiPS細胞である。
本発明で使用可能な多能性幹細胞は、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、以下のものに限定されないが、例えば胚性幹(ES)細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞、精子幹細胞（「GS細胞」）、胚性生殖細胞（「EG細胞」）、人工多能性幹(iPS)細胞などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ES細胞、ntES細胞、およびiPS細胞である。
(A) 胚性幹細胞
ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
ES細胞は、受精卵の8細胞期、桑実胚後の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ES細胞は、マウスで1981年に発見され(M.J. Evans and M.H. Kaufman (1981), Nature 292:154-156)、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもES細胞株が樹立された (J.A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165)。
ES細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor (LIF))、塩基性線維芽細胞成長因子(basic fibroblast growth factor (bFGF))などの物質を添加した培養液を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのES細胞の樹立と維持の方法については、例えばUSP5,843,780; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92:7844-7848； Thomson JA, et al. (1998), Science. 282:1145-1147； H. Suemori et al. (2006),
Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932； M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559； H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279;H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585；Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485などに記載されている。
Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932； M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559； H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279;H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585；Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485などに記載されている。
ES細胞作製のための培養液として、例えば0.1mM 2-メルカプトエタノール、0.1mM 非必須アミノ酸、2mM L-グルタミン酸、20% KSR及び4ng/ml β‐FGFを補充したDMEM/F-12培養
液を使用し、37℃、2% CO2/98% 空気の湿潤雰囲気下でヒトES細胞を維持することができる(O. Fumitaka et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:215-224)。また、ES細胞は、3〜4日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば1mM CaCl2及び20% KSRを含有するPBS中の0.25% トリプシン及び0.1mg/mlコラゲナーゼIVを用いて行うことができる。
液を使用し、37℃、2% CO2/98% 空気の湿潤雰囲気下でヒトES細胞を維持することができる(O. Fumitaka et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:215-224)。また、ES細胞は、3〜4日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば1mM CaCl2及び20% KSRを含有するPBS中の0.25% トリプシン及び0.1mg/mlコラゲナーゼIVを用いて行うことができる。
ES細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Oct-3/4、Nanogなどの遺伝子マーカーの発現を指標にしてReal-Time PCR法で行うことができる。特に、ヒトES細胞の選択では、OCT-3/4、NANOG、ECADなどの遺伝子マーカーの発現を指標とすることができる(E. Kroon et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:443-452)。
ヒトＥＳ細胞株は、例えばWA01(H1)およびWA09(H9)は、WiCell Reserch Instituteから、KhES-1、KhES-2及びKhES-3は、京都大学再生医科学研究所(京都、日本)から入手可能である。
(B) 精子幹細胞
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)。神経膠細胞系由来神経栄養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))を含む培養液で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる(竹林正則ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊),41〜46頁,羊土社(東京、日本))。
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)。神経膠細胞系由来神経栄養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))を含む培養液で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる(竹林正則ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊),41〜46頁,羊土社(東京、日本))。
(C) 胚性生殖細胞
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)。
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)。
(D) 人工多能性幹細胞
人工多能性幹(iPS)細胞は、特定の初期化因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNAまたはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2
008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell
Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al.
(2010), Stem Cells. 28:713-720に記載の組み合わせが例示される。
人工多能性幹(iPS)細胞は、特定の初期化因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNAまたはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2
008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell
Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al.
(2010), Stem Cells. 28:713-720に記載の組み合わせが例示される。
上記初期化因子には、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸 (VPA)、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool(登録商標)(Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、MEK阻害剤（例えば、PD184352、PD98059、U0126、SL327およびPD0325901）、Glycogen synthase kinase-3阻害剤（例えば、BioおよびCHIR99021）、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、5-azacytidine）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、BIX-01294
等の低分子阻害剤、Suv39hl、Suv39h2、SetDBlおよびG9aに対するsiRNAおよびshRNA等の核酸性発現阻害剤など）、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644)、酪酸、TGFβ阻害剤またはALK5阻害剤（例えば、LY364947、SB431542、616453およびA-83-01）、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA）、ARID3A阻害剤（例えば、ARID3Aに対するsiRNAおよびshRNA）、miR-291-3p、miR-294、miR-295およびmir-302などのmiRNA、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）、神経ペプチドY、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンE2およびプロスタグランジンJ2）、hTERT、SV40LT、UTF1、IRX6、GLISl、PITX2、DMRTBl等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれており、本明細書においては、これらの樹立効率の改善目的にて用いられた因子についても初期化因子と別段の区別をしないものとする。
等の低分子阻害剤、Suv39hl、Suv39h2、SetDBlおよびG9aに対するsiRNAおよびshRNA等の核酸性発現阻害剤など）、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644)、酪酸、TGFβ阻害剤またはALK5阻害剤（例えば、LY364947、SB431542、616453およびA-83-01）、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA）、ARID3A阻害剤（例えば、ARID3Aに対するsiRNAおよびshRNA）、miR-291-3p、miR-294、miR-295およびmir-302などのmiRNA、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）、神経ペプチドY、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンE2およびプロスタグランジンJ2）、hTERT、SV40LT、UTF1、IRX6、GLISl、PITX2、DMRTBl等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれており、本明細書においては、これらの樹立効率の改善目的にて用いられた因子についても初期化因子と別段の区別をしないものとする。
初期化因子は、タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、HIV由来のTATおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
一方、DNAの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター(Science, 322, 945-949, 2008)、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（WO 2010/008054）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC、PAC)などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる(Science, 322:949-953, 2008)。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にLoxP配列を有
してもよい。
してもよい。
また、RNAの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良く、分解を抑制するため、5-メチルシチジンおよびpseudouridine (TriLink Biotechnologies)を取り込ませたRNAを用いても良い（Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7:618-630）。
iPS細胞誘導のための培養液としては、例えば、10〜15％FBSを含有するDMEM、DMEM/F12又はDME培養液（これらの培養液にはさらに、LIF、penicillin/streptomycin、puromycin、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）または市販の培養液[例えば、マウスES細胞培養用培養液(TX-WES培養液、トロンボＸ社)、霊長類ES細胞培養用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTeSR、Stemcell Technology社）]などが含まれる。
培養法の例としては、たとえば、37℃、5％CO2存在下にて、10％FBS含有DMEM又はDMEM/F12培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約4〜7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞(たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培養液で培養し、該接触から約30〜約45日又はそれ以上ののちにiPS様コロニーを生じさせることができる。
あるいは、37℃、5% CO2存在下にて、フィーダー細胞(たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上で10％FBS含有DMEM培養液（これにはさらに、LIF、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約25〜約30日又はそれ以上ののちにES様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067またはWO2010/137746）、もしくは細胞外基質（例えば、Laminin-5（WO2009/123349）およびマトリゲル（BD社））を用いる方法が例示される。
この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される（Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725）。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（0.1％以上、15％以下の酸素濃度）によりiPS細胞を樹立しても良い（Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:237-241またはWO2010/013845）。
上記培養の間には、培養開始2日目以降から毎日1回新鮮な培養液と培養液交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ100cm2あたり約5×103〜約5×106細胞の範囲である。
iPS細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Oct3/4、Nanog）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したiPS細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、iPS細胞を選択することができる。
本明細書中で使用する「体細胞」なる用語は、卵子、卵母細胞、ES細胞などの生殖系列細胞または分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）をいう。体細胞には、非限定的に、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、及び成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継
代細胞、及び株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
代細胞、及び株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
また、iPS細胞を移植用細胞の材料として用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のHLA遺伝子型が同一もしくは実質的に同一である体細胞を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にHLA遺伝子型が一致していることであり、例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座あるいはHLA-Cを加えた4遺伝子座が一致するHLA型を有する体細胞である。
(E) 核移植により得られたクローン胚由来のES細胞
nt ES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している （T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al.
(2007), Nature, 450:497-502）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がnt ES(nuclear transfer ES)細胞である。nt ES細胞の作製のためには、核移植技術（J.B. Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646）とES細胞作製技術(上記)との組み合わせが利用される(若山清香ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊), 47〜52頁)。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
nt ES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している （T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al.
(2007), Nature, 450:497-502）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がnt ES(nuclear transfer ES)細胞である。nt ES細胞の作製のためには、核移植技術（J.B. Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646）とES細胞作製技術(上記)との組み合わせが利用される(若山清香ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊), 47〜52頁)。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
＜多能性幹細胞から樹状細胞を製造する方法＞
本発明において、樹状細胞とは、細胞突起を有し樹状あるいは樹枝状の形態を呈する細胞であって、T細胞への抗原提示能を有する免疫細胞であって、骨髄系樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、ランゲルハンス細胞、指状嵌入細胞、ヴェ−ル細胞および真皮内樹状細胞等を含む。好ましくは、骨髄系樹状細胞であって、CD11a、MHC-classII（例えば、ヒトの場合、HLA-DR、HLA-DPおよびHLA-DQ）、CD40 、CD80およびCD86からなる表面抗原の少なくともいずれか一つのマーカーを発現する細胞である。より好ましくは、HLA-DRおよびCD83陽性ならびにCD14陰性の細胞である。
本発明において、樹状細胞とは、細胞突起を有し樹状あるいは樹枝状の形態を呈する細胞であって、T細胞への抗原提示能を有する免疫細胞であって、骨髄系樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、ランゲルハンス細胞、指状嵌入細胞、ヴェ−ル細胞および真皮内樹状細胞等を含む。好ましくは、骨髄系樹状細胞であって、CD11a、MHC-classII（例えば、ヒトの場合、HLA-DR、HLA-DPおよびHLA-DQ）、CD40 、CD80およびCD86からなる表面抗原の少なくともいずれか一つのマーカーを発現する細胞である。より好ましくは、HLA-DRおよびCD83陽性ならびにCD14陰性の細胞である。
本発明の多能性幹細胞から樹状細胞を製造する方法は、以下の工程により多能性幹細胞を培養することを含む方法である；
（１）BMPファミリータンパク質を含有し、血清を含まない培養液を用いて接着培養する工程、
（２）VEGFを含有し、血清を含まない培養液を用いて接着培養する工程、
（３）造血因子を含有し、血清を含まない培養液を用いて接着培養する工程、および
（４）血清を含まない培養液を用いて浮遊培養する工程。
（１）BMPファミリータンパク質を含有し、血清を含まない培養液を用いて接着培養する工程、
（２）VEGFを含有し、血清を含まない培養液を用いて接着培養する工程、
（３）造血因子を含有し、血清を含まない培養液を用いて接着培養する工程、および
（４）血清を含まない培養液を用いて浮遊培養する工程。
本明細書において「血清」とは、ヒト血清、サル血清、ウシ胎児血清、ウシ血清、ブタ血清、ウマ血清、ロバ血清、ニワトリ血清、ウズラ血清、羊血清、ヤギ血清、イヌ血清、ネコ血清、ウサギ血清、ラット血清、モルモット血清及びマウス血清などを指し、血清を含まない培養液とは、成分が規定された培養液であることが好ましく、アルブミンまたはアルブミン代替物、トランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、インシュリンまたはインシュリン代替物、および亜セレン酸の少なくとも一つを含有した培養液であってもよく、より好ましくは、Insulin-Transferrin-Selenium-X Supplement (ITS) （インビトロジェン社）を含有した培養液である。本発明において、好ましい血清を含まない培養液
として、最小必須培養液（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培養液（DMEM）、イスコフ改変ダルベッコ培養液（IMDM）、StemPro-34SFM (インビトロジェン社)、Stemline II（Sigma-Aldrich社）等へITSを添加した培養液もしくは血清代替物を予め含有した霊長類ES細胞培養用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTeSR、Stemcell Technology社）が例示される。より好ましい血清を含まない培養液は、ITSを含有したStemline IIである。
として、最小必須培養液（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培養液（DMEM）、イスコフ改変ダルベッコ培養液（IMDM）、StemPro-34SFM (インビトロジェン社)、Stemline II（Sigma-Aldrich社）等へITSを添加した培養液もしくは血清代替物を予め含有した霊長類ES細胞培養用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTeSR、Stemcell Technology社）が例示される。より好ましい血清を含まない培養液は、ITSを含有したStemline IIである。
「BMPファミリータンパク質」とは、TGF-βスーパーファミリーに属するタンパク質であり、骨形成、細胞増殖、細胞分化、器官発生、器官形成などに関与する約20種類のサブタイプを有するサイトカインであり、本発明において好ましいBMPファミリータンパク質は、BMP2および／またはBMP4であり、さらに好ましいBMPファミリータンパク質はBMP4である。
「VEGF」とは、脈管形成および血管新生に関与する一群の糖タンパクであり、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、PlGF（placental growth factor）-1、PlGF-2およびこれらの選択的スプライシングバリアント（例えば、VEGF-Aでは、121個、165個、189個および206個のアミノ酸から成るバリアントである。）を含む。本発明において、好ましいVEGFは、VEGF-Aである。
上記工程（２）の好ましい態様において、培地はさらに、bFGFおよび／またはSCFを含んでもよい。
上記工程（２）の好ましい態様において、培地はさらに、bFGFおよび／またはSCFを含んでもよい。
「造血因子」とは、血球の分化・増殖を促進する因子であり、ステムセルファクター(Stem Cell Factor（SCF）)、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球単球コロニー刺激因子（GM-CSF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、エリスロポエチン（Erythropoietin (EPO)）、トロンボポエチン（Thrombopoietin（TPO））、インターロイキン類およびFlt3-ligandなどがある。ここで、インターロイキン類は、白血球から分泌されるタンパク質で、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、およびIL-9などを含む30種以上がある。本発明において、造血因子は、好ましくは、SCF、TPO、IL-3、Flt3-ligand 、GM-CSFおよびM-CSFから成る群から選択される造血因子である。本発明において、造血因子は、単独で用いても良いが（例えば、GM-CSFのみ）、好ましくは、組み合わせて用いる。組み合わせで用いる場合、上記工程（３）において、SCF、TPO、IL-3およびFlt3-ligandから成る群より選択される組み合わせの後、SCF、GM-CSF、M-CSFおよびFlt3-ligandから成る群より選択される組み合わせを造血因子として用いる工程が例示される。より好ましくは、SCF、TPO、IL-3およびFlt3-ligandから成る組み合わせの後、GM-CSF、M-CSFおよびFlt3-ligandから成る組み合わせを用いる工程、もしくは、SCF、TPO、IL-3およびFlt3-ligandから成る組み合わせの後、SCF、GM-CSF、M-CSFおよびFlt3-ligandから成る組み合わせを用いる方法である。
また、上記工程（４）においても、造血因子を含有させてもよく、工程（４）で用いる好ましい造血因子は、GM-CSFおよびIL-4から成る群から選択される組み合わせが例示される。さらに、樹状細胞を成熟させるために、さらにリポ多糖（LPS）および腫瘍壊死因子を用いても良い。ここで、リポ多糖とは、グラム陰性菌細胞壁外膜の構成成分であり脂質及び多糖から構成される物質である。また、腫瘍壊死因子とは、TNF-α、TNF-β（リンホトキシン（LT）-α）およびLT-βから成る群より選ばれるサイトカインであり、本発明において、好ましくは、TNF-αである。
本発明において、中間体である骨髄単球系細胞（CD14陽性細胞）に対して工程（４）を実施することで所望する樹状細胞が得られることを考慮し、樹状細胞への誘導効率を高める観点から、上記工程（３）後に産生された浮遊細胞のうち、CD14陽性細胞を精製して上記工程（４）に用いることが望ましい。 CD14陽性細胞の精製は、当業者に周知の方法で行
うことができ、特に限定されないが、CD14 MicroBeads（#130-050-201, Miltenyi Biotec）を用いてautoMACS pro（Miltenyi Biotec）またはフローサイトメーターにより精製することができる。また、工程（４）に用いる浮遊細胞は、フローサイトメーターまたはLymphoprep（AXIS-SHIELD PoC AS）等を用いた密度勾配遠心法により死細胞を除去して用いることが望ましい。
うことができ、特に限定されないが、CD14 MicroBeads（#130-050-201, Miltenyi Biotec）を用いてautoMACS pro（Miltenyi Biotec）またはフローサイトメーターにより精製することができる。また、工程（４）に用いる浮遊細胞は、フローサイトメーターまたはLymphoprep（AXIS-SHIELD PoC AS）等を用いた密度勾配遠心法により死細胞を除去して用いることが望ましい。
各工程で用いる造血因子を含むサイトカイン等の濃度は、目的の細胞が得られる濃度であれば特に問わないが、BMP4の場合は、5 ng/mlから150 ng/mlでもよく、好ましくは、10
ng/mlから100 ng/mlであり、より好ましくは、20 ng/mlから80 ng/mlである。VEGFの場合は、20 ng/mlから100 ng/mlでもよく、好ましくは、30 ng/mlから70 ng/mlであり、より好ましくは、50 ng/mlである。bFGFの場合は、10 ng/mlから100 ng/mlでもよく、好ましくは、20 ng/mlから50 ng/mlであり、より好ましくは、25 ng/mlである。SCFの場合は、20 ng/mlから100 ng/mlであり、好ましくは、30 ng/mlから70 ng/mlであり、より好ましくは、50 ng/mlである。IL-3の場合は、5 ng/mlから100 ng/mlであり、好ましくは、30
ng/mlから70 ng/mlであり、より好ましくは、50 ng/mlである。TPOの場合は、1 ng/mlから25 ng/mlであり、好ましくは、1 ng/mlから10 ng/mlであり、より好ましくは、5 ng/mlである。Flt3-ligandの場合は、10 ng/mlから100 ng/mlであり、好ましくは、30 ng/mlから70 ng/mlであり、より好ましくは、50 ng/mlである。GM-CSFの場合は、5 ng/mlから100
ng/mlであり、好ましくは、10 ng/mlから50 ng/mlであり、より好ましくは、25 ng/mlである。M-CSFの場合は、5 ng/mlから100 ng/mlであり、好ましくは、30 ng/mlから70 ng/mlであり、より好ましくは、50 ng/mlである。IL-4の場合は、5 ng/mlから100 ng/mlであり、好ましくは、10 ng/mlから70 ng/mlであり、より好ましくは、40 ng/mlである。TNF-αの場合は、0.05 ng/mlから1 ng/mlであり、好ましくは、0.1 ng/mlから0.5 ng/mlであり、より好ましくは、0.2 ng/mlである。LPSの場合は、0.01 μg/mlから10 μg/mlであり、好ましくは、0.1 μg/mlから1 μg/mlであり、より好ましくは、0.2μg/mlである。
ng/mlから100 ng/mlであり、より好ましくは、20 ng/mlから80 ng/mlである。VEGFの場合は、20 ng/mlから100 ng/mlでもよく、好ましくは、30 ng/mlから70 ng/mlであり、より好ましくは、50 ng/mlである。bFGFの場合は、10 ng/mlから100 ng/mlでもよく、好ましくは、20 ng/mlから50 ng/mlであり、より好ましくは、25 ng/mlである。SCFの場合は、20 ng/mlから100 ng/mlであり、好ましくは、30 ng/mlから70 ng/mlであり、より好ましくは、50 ng/mlである。IL-3の場合は、5 ng/mlから100 ng/mlであり、好ましくは、30
ng/mlから70 ng/mlであり、より好ましくは、50 ng/mlである。TPOの場合は、1 ng/mlから25 ng/mlであり、好ましくは、1 ng/mlから10 ng/mlであり、より好ましくは、5 ng/mlである。Flt3-ligandの場合は、10 ng/mlから100 ng/mlであり、好ましくは、30 ng/mlから70 ng/mlであり、より好ましくは、50 ng/mlである。GM-CSFの場合は、5 ng/mlから100
ng/mlであり、好ましくは、10 ng/mlから50 ng/mlであり、より好ましくは、25 ng/mlである。M-CSFの場合は、5 ng/mlから100 ng/mlであり、好ましくは、30 ng/mlから70 ng/mlであり、より好ましくは、50 ng/mlである。IL-4の場合は、5 ng/mlから100 ng/mlであり、好ましくは、10 ng/mlから70 ng/mlであり、より好ましくは、40 ng/mlである。TNF-αの場合は、0.05 ng/mlから1 ng/mlであり、好ましくは、0.1 ng/mlから0.5 ng/mlであり、より好ましくは、0.2 ng/mlである。LPSの場合は、0.01 μg/mlから10 μg/mlであり、好ましくは、0.1 μg/mlから1 μg/mlであり、より好ましくは、0.2μg/mlである。
各工程の期間として、前記工程（１）では、2日以上であり、好ましくは、2日以上6日以下であり、より好ましくは、4日である。前記工程（２）では、1日以上であり、好ましくは、1日以上5日以下であり、より好ましくは、2日である。前記工程（３）では、10日以上であり、好ましくは、10日以上30日以下であり、より好ましくは、24日である。前記工程（３）にて、造血因子の組み合わせを変える場合、SCF、TPO、IL-3およびFlt3-ligandから成る群より選択される造血因子の組み合わせを用いる期間は、7日以上、好ましくは、7日以上14日以内、より好ましくは、9日、さらに、SCF、GM-CSF、M-CSFおよびFlt3-ligandから成る群より選択される造血因子の組み合わせを用いる期間は、3日以上、好ましくは、3日以上20以内であり、より好ましくは15日である。前記工程（４）では、3日以上であり、好ましくは、3日以上14日以下であり、より好ましくは、7日である。前記工程（４）にて、造血因子を用いる場合、GM-CSFおよびIL-4から成る群より選択される造血因子を用いた培養期間は、3日以上、好ましくは、3日以上10日以内、より好ましくは、5日であり、さらに、TNF-αおよびLPSから成る群より選択される組み合わせを添加する場合、その培養期間は、1日以上、好ましくは、1日以上7日以内であり、より好ましくは2日である。
本発明を以下の実施例でさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はそれら実施例に限定されないものとする。
なお、ヒトES細胞（KhES-1）は、京都大学再生医科学研究所より受領し、ヒトiPS細胞（201B7および253G4）は、京都大学の山中教授より受領した。ヒトES細胞およびヒトiPS細胞は、growth factor-reduced Matrigel （#354230; Becton-Dickinson）でコートしたディッシュ上でmTeSR1（#05850; STEMCELL Technologies）を用いて培養した。
［実施例１］
下記の方法により、ヒトiPS細胞（253G4）をCD14陽性の単球を経て樹状細胞へと分化誘導した後、フローサイトメトリーを用いて分析したところ、CD14陰性HLA-DR陽性細胞が含有されていることが確認された（図１）。
1. iPS細胞コロニーを１ウェルあたり5個以下のコロニー数になるようにgrowth factor-reduced Matrigelでコートした6ウェルプレート上へ播種し、mTeSR1を用いて各コロニーの直径が約１mmになるまで培養した。
2. 培養液をInsulin-Transferrin-Selenium-X Supplement (ITS)（#51500-056; Invitrogen）および20 ng/mLのBMP4（#314-BP-010; R&D Systems）を含有するStemline II serum-free hematopietic stem cell expansion medium（Stemline II）（#S0192; Sigma-Aldrich）へ交換し、4日間培養した。
3. 培養液をITS 、50 ng/mLのVEGF（#293-VE-050; R&D Systems）および50 ng/mLのSCF（#255-SC-050; R&D Systems）を含有するStemline IIへ交換し、2日間培養した。
4. 培養液をITS 、50 ng/mLのSCF、50ng/mLのIL-3（#203-IL-050; R&D Systems）、5 ng/mLのTPO（#288-TPN-025; R&D Systems）および50 ng/mLのFlt-3 ligand（#308-FK-025; R&D Systems）を含有するStemline IIへ交換し、７〜9日間培養した。
5. 培養液をITS 、50 ng/mLのFlt-3 ligand 、25 ng/mL のGM-CSF、50 ng/mLのM-CSFを含有するStemline IIへ交換し、15日間培養した。この時、5日おきに新しい培養液へ交換した。
6. 培養上清中の浮遊細胞を回収し、Lymphoprep（#1114740; AXIS-SHIELD PoC AS）を用いて密度勾配遠心法により死細胞を除去した後、CD14 MicroBeads（#130-050-201, Miltenyi Biotec）を用いてautoMACS pro（Miltenyi Biotec）によりCD14陽性細胞を分離した。3×104個の分離したCD14陽性細胞をUltra-Low Attachment Surface （#3471; CORNING）でコートした6ウェルディッシュを用いて、GM-CSF(50 ng/mL) +IL-4(40 ng/mL) とITSを含有する Stemline II中で6日間浮遊培養を行った。
下記の方法により、ヒトiPS細胞（253G4）をCD14陽性の単球を経て樹状細胞へと分化誘導した後、フローサイトメトリーを用いて分析したところ、CD14陰性HLA-DR陽性細胞が含有されていることが確認された（図１）。
1. iPS細胞コロニーを１ウェルあたり5個以下のコロニー数になるようにgrowth factor-reduced Matrigelでコートした6ウェルプレート上へ播種し、mTeSR1を用いて各コロニーの直径が約１mmになるまで培養した。
2. 培養液をInsulin-Transferrin-Selenium-X Supplement (ITS)（#51500-056; Invitrogen）および20 ng/mLのBMP4（#314-BP-010; R&D Systems）を含有するStemline II serum-free hematopietic stem cell expansion medium（Stemline II）（#S0192; Sigma-Aldrich）へ交換し、4日間培養した。
3. 培養液をITS 、50 ng/mLのVEGF（#293-VE-050; R&D Systems）および50 ng/mLのSCF（#255-SC-050; R&D Systems）を含有するStemline IIへ交換し、2日間培養した。
4. 培養液をITS 、50 ng/mLのSCF、50ng/mLのIL-3（#203-IL-050; R&D Systems）、5 ng/mLのTPO（#288-TPN-025; R&D Systems）および50 ng/mLのFlt-3 ligand（#308-FK-025; R&D Systems）を含有するStemline IIへ交換し、７〜9日間培養した。
5. 培養液をITS 、50 ng/mLのFlt-3 ligand 、25 ng/mL のGM-CSF、50 ng/mLのM-CSFを含有するStemline IIへ交換し、15日間培養した。この時、5日おきに新しい培養液へ交換した。
6. 培養上清中の浮遊細胞を回収し、Lymphoprep（#1114740; AXIS-SHIELD PoC AS）を用いて密度勾配遠心法により死細胞を除去した後、CD14 MicroBeads（#130-050-201, Miltenyi Biotec）を用いてautoMACS pro（Miltenyi Biotec）によりCD14陽性細胞を分離した。3×104個の分離したCD14陽性細胞をUltra-Low Attachment Surface （#3471; CORNING）でコートした6ウェルディッシュを用いて、GM-CSF(50 ng/mL) +IL-4(40 ng/mL) とITSを含有する Stemline II中で6日間浮遊培養を行った。
［実施例２］
下記の方法により、ヒトiPS細胞（253G4）を樹状細胞へ分化誘導を行い、メイ・ギムザ染色を行ったところ、得られた細胞は末梢血由来の樹状細胞と類似した形状であることが確認された（図２）。
1. iPS細胞コロニーを１ウェルあたり5個以下のコロニー数になるようにgrowth factor-reduced Matrigelでコートした6ウェルディッシュ上へ播種し、mTeSR1を用いて各コロニーの直径が約１mmになるまで培養した。
2. 培養液をITSおよび20 ng/mLのBMP4を含有するStemline IIへ交換し、4日間培養した。
3. 培養液をITS 、50 ng/mLのVEGFおよび50 ng/mLのSCFを含有するStemline IIへ交換し、2日間培養した。
4. 培養液をITS 、50 ng/mLのSCF、50ng/mLのIL-3、5 ng/mLのTPOおよび50 ng/mLのFlt-3 ligandを含有するStemline IIへ交換し、７〜9日間培養した。
5. 培養液をITS 、50 ng/mLのFlt-3 ligand、25 ng/mL のGM-CSFおよび50 ng/mLのM-CSFを含有するStemline IIへ交換し、15日間培養した。
6. 培養上清中の浮遊細胞を回収し、Lymphoprepを用いて密度勾配遠心法により死細胞を除去した後、CD14 MicroBeadsを用いてautoMACS proによりCD14陽性細胞を分離した。3×104個の分離したCD14陽性細胞をUltra-Low Attachment Surfaceでコートした6ウェルディッシュを用いて、ITS, 25 ng/mL のGM-CSFおよび40 ng/mL のIL-4を含有するStemline II中で5日間浮遊培養を行った。さらに、培養液へ0.2ng/mL のTNF-α と1.0 μg/mlのLPSを添加し、2日間培養を続けた。
下記の方法により、ヒトiPS細胞（253G4）を樹状細胞へ分化誘導を行い、メイ・ギムザ染色を行ったところ、得られた細胞は末梢血由来の樹状細胞と類似した形状であることが確認された（図２）。
1. iPS細胞コロニーを１ウェルあたり5個以下のコロニー数になるようにgrowth factor-reduced Matrigelでコートした6ウェルディッシュ上へ播種し、mTeSR1を用いて各コロニーの直径が約１mmになるまで培養した。
2. 培養液をITSおよび20 ng/mLのBMP4を含有するStemline IIへ交換し、4日間培養した。
3. 培養液をITS 、50 ng/mLのVEGFおよび50 ng/mLのSCFを含有するStemline IIへ交換し、2日間培養した。
4. 培養液をITS 、50 ng/mLのSCF、50ng/mLのIL-3、5 ng/mLのTPOおよび50 ng/mLのFlt-3 ligandを含有するStemline IIへ交換し、７〜9日間培養した。
5. 培養液をITS 、50 ng/mLのFlt-3 ligand、25 ng/mL のGM-CSFおよび50 ng/mLのM-CSFを含有するStemline IIへ交換し、15日間培養した。
6. 培養上清中の浮遊細胞を回収し、Lymphoprepを用いて密度勾配遠心法により死細胞を除去した後、CD14 MicroBeadsを用いてautoMACS proによりCD14陽性細胞を分離した。3×104個の分離したCD14陽性細胞をUltra-Low Attachment Surfaceでコートした6ウェルディッシュを用いて、ITS, 25 ng/mL のGM-CSFおよび40 ng/mL のIL-4を含有するStemline II中で5日間浮遊培養を行った。さらに、培養液へ0.2ng/mL のTNF-α と1.0 μg/mlのLPSを添加し、2日間培養を続けた。
［実施例３］
下記の方法により、ヒトiPS細胞（253G4）をCD14陽性の単球を経て樹状細胞へと分化誘導した後、フローサイトメトリーを用いて分析した（図３および４）。その結果、工程6にてTNF-αおよびLPSを添加した方が、HLA-DRおよびCD83陽性細胞がより多く含まれていた。つまり、TNF-αおよびLPSを含む培養液で培養する工程により樹状細胞が成熟することが示唆された。
さらに、ナイーブT細胞を、iPS細胞から分化させた単球、未成熟樹状細胞または成熟樹状細胞と接触させた後の、増殖活性を３Hチミジン取り込みアッセイで調べた（図５）。その結果、iPS細胞から分化させた成熟樹状細胞はナイーブT細胞に対して増殖刺激能を有することがわかった。
1. iPS細胞コロニーを１ウェルあたり5個以下のコロニー数になるようにgrowth factor-reduced Matrigelでコートした6ウェルディッシュ上へ播種し、mTeSR1を用いて各コロニーの直径が約１mmになるまで培養した。
2. 培養液をITSおよび20 ng/mLのBMP4を含有するStemline IIへ交換し、4日間培養した。
3. 培養液をITS 、50 ng/mLのVEGF 25ng/ml bFGF (#133-FB-025; R&D Systems)および50
ng/mLのSCFを含有するStemline IIへ交換し、2日間培養した。
4. 培養液をITS 、50 ng/mLのSCF、50ng/mLのIL-3、5 ng/mLのTPOおよび50 ng/mLのFlt-3 ligandを含有するStemline IIへ交換し、7〜9日間培養した。
5. 培養液をITS、50 ng/mLのFlt-3 ligand 、25 ng/mL のGM-CSFおよび50 ng/mLのM-CSFを含有するStemline IIへ交換し、15日間培養した。
6. 培養上清中の浮遊細胞を回収し、Lymphoprepを用いて密度勾配遠心法により死細胞を除去した後、CD14 MicroBeadsを用いてautoMACS proによりCD14陽性細胞を分離した。1.5×106個の分離したCD14陽性細胞(単球として使用)を、Ultra-Low Attachment Surfaceでコートした6ウェルディッシュを用いて、（i）ITS, 25 ng/mL のGM-CSFおよび40 ng/mL のIL-4を含有するStemline IIで7日間浮遊培養（未成熟樹状細胞として使用）、または（ii）ITS, 25 ng/mL のGM-CSF、40 ng/mL のIL-4を含有するStemline II中で5日間浮遊培養し、続いて0.2ng/mL のTNF-αおよび1 μg/mLのLPSを加えてさらに2日間浮遊培養した（成熟樹状細胞として使用）。
下記の方法により、ヒトiPS細胞（253G4）をCD14陽性の単球を経て樹状細胞へと分化誘導した後、フローサイトメトリーを用いて分析した（図３および４）。その結果、工程6にてTNF-αおよびLPSを添加した方が、HLA-DRおよびCD83陽性細胞がより多く含まれていた。つまり、TNF-αおよびLPSを含む培養液で培養する工程により樹状細胞が成熟することが示唆された。
さらに、ナイーブT細胞を、iPS細胞から分化させた単球、未成熟樹状細胞または成熟樹状細胞と接触させた後の、増殖活性を３Hチミジン取り込みアッセイで調べた（図５）。その結果、iPS細胞から分化させた成熟樹状細胞はナイーブT細胞に対して増殖刺激能を有することがわかった。
1. iPS細胞コロニーを１ウェルあたり5個以下のコロニー数になるようにgrowth factor-reduced Matrigelでコートした6ウェルディッシュ上へ播種し、mTeSR1を用いて各コロニーの直径が約１mmになるまで培養した。
2. 培養液をITSおよび20 ng/mLのBMP4を含有するStemline IIへ交換し、4日間培養した。
3. 培養液をITS 、50 ng/mLのVEGF 25ng/ml bFGF (#133-FB-025; R&D Systems)および50
ng/mLのSCFを含有するStemline IIへ交換し、2日間培養した。
4. 培養液をITS 、50 ng/mLのSCF、50ng/mLのIL-3、5 ng/mLのTPOおよび50 ng/mLのFlt-3 ligandを含有するStemline IIへ交換し、7〜9日間培養した。
5. 培養液をITS、50 ng/mLのFlt-3 ligand 、25 ng/mL のGM-CSFおよび50 ng/mLのM-CSFを含有するStemline IIへ交換し、15日間培養した。
6. 培養上清中の浮遊細胞を回収し、Lymphoprepを用いて密度勾配遠心法により死細胞を除去した後、CD14 MicroBeadsを用いてautoMACS proによりCD14陽性細胞を分離した。1.5×106個の分離したCD14陽性細胞(単球として使用)を、Ultra-Low Attachment Surfaceでコートした6ウェルディッシュを用いて、（i）ITS, 25 ng/mL のGM-CSFおよび40 ng/mL のIL-4を含有するStemline IIで7日間浮遊培養（未成熟樹状細胞として使用）、または（ii）ITS, 25 ng/mL のGM-CSF、40 ng/mL のIL-4を含有するStemline II中で5日間浮遊培養し、続いて0.2ng/mL のTNF-αおよび1 μg/mLのLPSを加えてさらに2日間浮遊培養した（成熟樹状細胞として使用）。
［実施例４］
分化効率が変化するかどうかについて他の基礎培地を評価した。その結果、次の方法でもiPS細胞から樹状細胞を得ることができた。
1. ES細胞またはiPS細胞コロニーを１ウェルあたり5個以下のコロニー数になるようにgrowth factor-reduced Matrigelでコートした6ウェルディッシュ上へ播種し、mTeSR1を用いて各コロニーの直径が約１mmになるまで培養した。
2. 培養液を80 ng/mLのBMP4を含有するStemPro-34SFM (#10639-011; Invitrogen)へ交換し、4日間培養した。
3. 培養液を100ng/mLのVEGF、25ng/ml のbFGFおよび10 ng/mLのSCFを含有するStemPro-34SFMへ交換し、2日間培養した。
4. 培養液を50 ng/mLのSCF、50ng/mLのIL-3、5 ng/mLのTPOおよび50 ng/mLのFlt-3 ligandを含有するStemPro-34SFMへ交換し、７〜9日間培養した。
5. 培養液を50 ng/mLのFlt-3 ligand、25 ng/mL のGM-CSF、50 ng/mLのM-CSFを含有するStemPro-34SFMへ交換し、3日から15日間培養した。この時、5日おきに新しい培養液へ交換した。
6. 培養上清中の浮遊細胞を回収し、Lymphoprepを用いて密度勾配遠心法により死細胞を除去した後、CD14 MicroBeadsを用いてautoMACS proによりCD14陽性細胞を分離した。1.5×106個の分離したCD14陽性細胞をUltra-Low Attachment Surfaceでコートした6ウェルディッシュを用いて、25 ng/mL のGM-CSFおよび40 ng/mL のIL-4を含有するStemPro-34SFM中で浮遊培養を行った。浮遊培養開始から5日目に、培養液へ1 μg/mL のLPSおよび0.2ng/mL のTNF-α を添加し、さらに2日間培養を続けた。
分化効率が変化するかどうかについて他の基礎培地を評価した。その結果、次の方法でもiPS細胞から樹状細胞を得ることができた。
1. ES細胞またはiPS細胞コロニーを１ウェルあたり5個以下のコロニー数になるようにgrowth factor-reduced Matrigelでコートした6ウェルディッシュ上へ播種し、mTeSR1を用いて各コロニーの直径が約１mmになるまで培養した。
2. 培養液を80 ng/mLのBMP4を含有するStemPro-34SFM (#10639-011; Invitrogen)へ交換し、4日間培養した。
3. 培養液を100ng/mLのVEGF、25ng/ml のbFGFおよび10 ng/mLのSCFを含有するStemPro-34SFMへ交換し、2日間培養した。
4. 培養液を50 ng/mLのSCF、50ng/mLのIL-3、5 ng/mLのTPOおよび50 ng/mLのFlt-3 ligandを含有するStemPro-34SFMへ交換し、７〜9日間培養した。
5. 培養液を50 ng/mLのFlt-3 ligand、25 ng/mL のGM-CSF、50 ng/mLのM-CSFを含有するStemPro-34SFMへ交換し、3日から15日間培養した。この時、5日おきに新しい培養液へ交換した。
6. 培養上清中の浮遊細胞を回収し、Lymphoprepを用いて密度勾配遠心法により死細胞を除去した後、CD14 MicroBeadsを用いてautoMACS proによりCD14陽性細胞を分離した。1.5×106個の分離したCD14陽性細胞をUltra-Low Attachment Surfaceでコートした6ウェルディッシュを用いて、25 ng/mL のGM-CSFおよび40 ng/mL のIL-4を含有するStemPro-34SFM中で浮遊培養を行った。浮遊培養開始から5日目に、培養液へ1 μg/mL のLPSおよび0.2ng/mL のTNF-α を添加し、さらに2日間培養を続けた。
本発明により、ES細胞やiPS細胞などの多能性幹細胞から、樹状細胞を作製することが可能になる。製造された樹状細胞は、ガン免疫療法などの治療、または樹状細胞が関連する自己免疫疾患等の治療方法の開発に有用である。
Claims (16)
- 以下の工程により多能性幹細胞を培養することを含む、多能性幹細胞より樹状細胞を製造する方法；
（１）BMPファミリータンパク質を含有し、血清を含まない培養液を用いて接着培養する工程、
（２）VEGFを含有し、血清を含まない培養液を用いて接着培養する工程、
（３）造血因子を含有し、血清を含まない培養液を用いて接着培養する工程、および
（４）血清を含まない培養液を用いて浮遊培養する工程。 - 前記工程（１）から工程（３）における接着培養が、細胞外基質をコーティングしたディッシュで行われる、請求項１に記載の方法。
- 前記細胞外基質がマトリゲルである、請求項２に記載の方法。
- 前記BMPファミリータンパク質が、BMP4である、請求項１に記載の方法。
- 前記工程（２）において、培養が、さらにbFGFおよび／またはSCFを含む培地において行われる、請求項１に記載の方法。
- 前記造血因子が、SCF、TPO、IL-3、Flt3-ligand、GM-CSFおよびM-CSFから成る群より選択される少なくとも一つの造血因子である、請求項１に記載の方法。
- 前記工程（３）において、SCF、TPO、IL-3、Flt3-ligand を含む培養液で培養した後、さらにGM-CSF、M-CSFおよびFlt3-ligandを含む培養液で培養する、請求項６に記載の方法。
- 前記工程（３）において、SCF、TPO、IL-3、Flt3-ligand を含む培養液で培養した後、さらにSCF、Flt3-ligand、GM-CSFおよびM-CSFを含む培養液で培養する、請求項６に記載の方法。
- 前記工程（４）の浮遊培養において、GM-CSFおよびIL-4を含有する培養液を用いる、請求項１に記載の方法。
- 前記工程（４）の浮遊培養において、さらにLPSおよびTNF-αを含む培養液で培養する工程を含む、請求項９に記載の方法。
- 前記樹状細胞が、HLA-DR陽性ならびにCD14陰性の樹状細胞である、請求項１に記載の方法。
- 前記樹状細胞が、さらにCD83陽性である、請求項１１に記載の方法。
- 前記工程（１）が、４日間である、請求項１に記載の方法。
- 前記工程（２）が、２日間である、請求項１に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞が、ヒトiPS細胞である、請求項１に記載の方法。
- 請求項１〜１５のいずれかに記載の方法で製造された樹状細胞。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201161445856P | 2011-02-23 | 2011-02-23 | |
| US61/445,856 | 2011-02-23 | ||
| PCT/JP2012/055152 WO2012115276A1 (en) | 2011-02-23 | 2012-02-23 | Method for producing dendritic cells from pluripotent stem cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2014506447A true JP2014506447A (ja) | 2014-03-17 |
| JP5995247B2 JP5995247B2 (ja) | 2016-09-21 |
Family
ID=46721042
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2013539023A Active JP5995247B2 (ja) | 2011-02-23 | 2012-02-23 | 多能性幹細胞から樹状細胞を製造する方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9499789B2 (ja) |
| EP (1) | EP2678425B1 (ja) |
| JP (1) | JP5995247B2 (ja) |
| WO (1) | WO2012115276A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016010002A1 (ja) * | 2014-07-14 | 2016-01-21 | 中外製薬株式会社 | タンパク質のエピトープを同定するための方法 |
| WO2018124207A1 (ja) * | 2016-12-27 | 2018-07-05 | レグセル株式会社 | 抗原特異的制御性ｔ細胞調製方法 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SG11201507829SA (en) | 2013-03-21 | 2015-12-30 | Univ Kyoto | Pluripotent stem cell for neuronal differentiation induction |
| EP3109312B1 (en) | 2014-02-20 | 2019-08-28 | Sinfonia Technology Co., Ltd. | Cell culture container |
| GB201601503D0 (en) | 2016-01-27 | 2016-03-09 | Isis Innovation | Dendritic cells |
| US10767164B2 (en) | 2017-03-30 | 2020-09-08 | The Research Foundation For The State University Of New York | Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation |
| EP4151723A4 (en) * | 2020-05-13 | 2024-06-19 | Agc Inc. | METHOD FOR PRODUCING HUMAN PROFESSIONAL ANTIGEN PRESENTING CELLS |
| US20230257705A1 (en) | 2020-06-17 | 2023-08-17 | Kyoto University | Chimeric antigen receptor-expressing immunocompetent cells |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009120891A2 (en) * | 2008-03-27 | 2009-10-01 | Geron Corporation | Differentiation of primate pluripotent stem cells to hematopoietic lineage cells |
| WO2010096746A1 (en) * | 2009-02-20 | 2010-08-26 | Cellular Dynamics International, Inc. | Methods and compositions for the differentiation of stem cells |
| WO2010099539A1 (en) * | 2009-02-27 | 2010-09-02 | Cellular Dynamics International, Inc. | Differentiation of pluripotent cells |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69333433T2 (de) * | 1992-04-01 | 2004-12-02 | The Rockefeller University | Verfahren zur in vitro kultivierung dendritischer vorläuferzellen und deren verwendung zur immunogen herstellung |
| JPH10504284A (ja) | 1994-06-14 | 1998-04-28 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 抗原パルス化樹状細胞によるｉｎ ｖｉｖｏ Ｔ細胞活性化法 |
| US5843780A (en) | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
| EP0983345A1 (en) * | 1997-05-21 | 2000-03-08 | THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services | Methods and compositions for making dendritic cells from expanded populations of monocytes and for activating t cells |
| CA2504451A1 (en) * | 2004-08-10 | 2006-02-10 | Geron Corporation | Dendritic cell vaccines for treating cancer made from embryonic stem cells |
| JP4695087B2 (ja) | 2004-08-27 | 2011-06-08 | 田辺三菱製薬株式会社 | 霊長類動物胚性幹細胞から樹状細胞の製造方法 |
| EP1885845A2 (en) * | 2005-06-01 | 2008-02-13 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method of forming dendritic cells from embryonic stem cells |
| WO2008048671A1 (en) | 2006-10-18 | 2008-04-24 | University Of Illinois | Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use |
| EP2208786B1 (en) | 2005-12-13 | 2018-08-01 | Kyoto University | Nuclear reprogramming factor |
-
2012
- 2012-02-23 JP JP2013539023A patent/JP5995247B2/ja active Active
- 2012-02-23 US US14/001,004 patent/US9499789B2/en active Active
- 2012-02-23 EP EP12749212.2A patent/EP2678425B1/en not_active Not-in-force
- 2012-02-23 WO PCT/JP2012/055152 patent/WO2012115276A1/en active Application Filing
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009120891A2 (en) * | 2008-03-27 | 2009-10-01 | Geron Corporation | Differentiation of primate pluripotent stem cells to hematopoietic lineage cells |
| WO2010096746A1 (en) * | 2009-02-20 | 2010-08-26 | Cellular Dynamics International, Inc. | Methods and compositions for the differentiation of stem cells |
| WO2010099539A1 (en) * | 2009-02-27 | 2010-09-02 | Cellular Dynamics International, Inc. | Differentiation of pluripotent cells |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| PLOS ONE, vol. 8, 4, JPN6016000098, April 2013 (2013-04-01), pages 59243, ISSN: 0003360424 * |
| REGENERATIVE MEDICINE, vol. 4, 4, JPN6016000102, 2009, pages 513 - 526, ISSN: 0003360425 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016010002A1 (ja) * | 2014-07-14 | 2016-01-21 | 中外製薬株式会社 | タンパク質のエピトープを同定するための方法 |
| JPWO2016010002A1 (ja) * | 2014-07-14 | 2017-04-27 | 中外製薬株式会社 | タンパク質のエピトープを同定するための方法 |
| US10718781B2 (en) | 2014-07-14 | 2020-07-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for identifying epitope on protein |
| JP7012432B2 (ja) | 2014-07-14 | 2022-01-28 | 中外製薬株式会社 | タンパク質のエピトープを同定するための方法 |
| WO2018124207A1 (ja) * | 2016-12-27 | 2018-07-05 | レグセル株式会社 | 抗原特異的制御性ｔ細胞調製方法 |
| JPWO2018124207A1 (ja) * | 2016-12-27 | 2019-11-14 | レグセル株式会社 | 抗原特異的制御性ｔ細胞調製方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20130330822A1 (en) | 2013-12-12 |
| WO2012115276A1 (en) | 2012-08-30 |
| EP2678425A4 (en) | 2015-01-21 |
| EP2678425A1 (en) | 2014-01-01 |
| JP5995247B2 (ja) | 2016-09-21 |
| EP2678425B1 (en) | 2017-08-23 |
| US9499789B2 (en) | 2016-11-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5777115B2 (ja) | 多能性幹細胞から中胚葉細胞への分化誘導法 | |
| JP5995247B2 (ja) | 多能性幹細胞から樹状細胞を製造する方法 | |
| JP7166631B2 (ja) | 新規軟骨細胞誘導方法 | |
| JP6429280B2 (ja) | 効率的な心筋細胞の誘導方法 | |
| JP6143027B2 (ja) | アストロサイトの誘導方法 | |
| JP6373253B2 (ja) | 新規心筋細胞マーカー | |
| WO2015199127A1 (ja) | 中胚葉細胞および造血細胞の製造方法 | |
| JP6025067B2 (ja) | 新規心筋細胞マーカー | |
| JPWO2016133208A1 (ja) | 新規軟骨細胞誘導方法 | |
| JP6646311B2 (ja) | 多能性幹細胞から中胚葉前駆細胞および血液血管前駆細胞への分化誘導法 | |
| WO2021085462A1 (ja) | 多能性幹細胞から造血性内皮細胞および／または造血前駆細胞を製造する方法 | |
| JP5842289B2 (ja) | 効率的な内皮細胞の誘導方法 | |
| JP7072756B2 (ja) | 多能性幹細胞から中胚葉前駆細胞および血液血管前駆細胞への分化誘導法 | |
| WO2017073794A1 (ja) | 多能性幹細胞から３次元の心筋組織を製造する方法 | |
| JP2014143954A (ja) | 多能性幹細胞を効率的に作製する方法 | |
| WO2022102742A1 (ja) | 骨格筋系譜細胞および骨格筋幹細胞の高効率純化用細胞表面マーカーおよびその利用 | |
| WO2021015086A1 (ja) | 骨格筋幹細胞から成熟筋管細胞を製造する方法 | |
| JP6024880B2 (ja) | 環状デプシペプチドの新規使用方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20150223 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160112 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160314 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160719 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160817 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5995247 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |