JP2014505021A - アポトーシス用petイメージング剤 - Google Patents
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Abstract
本発明は、インビボでのアポトーシス及び他の形態の細胞死の放射性医薬品イメージングに関する。本発明は、アポトーシス細胞の表面に露出しているアミノリン脂質のホスファチジルエタノールアミン(PE)への選択的結合によってアポトーシス細胞を標的化するPETイメージング剤を提供する。また、医薬組成物、キット及びインビボイメージング方法も提供される。
【選択図】なし
【選択図】なし
Description
本発明は、インビボでのアポトーシス及び他の形態の細胞死の放射性医薬品イメージングに関する。本発明は、アポトーシス細胞の表面に露出しているアミノリン脂質のホスファチジルエタノールアミン(PE)への選択的結合によってアポトーシス細胞を標的化するPETイメージング剤を提供する。また、医薬組成物、キット及びインビボイメージング方法も提供される。
アポトーシス又はプログラム細胞死(PCD)は最も普遍的な細胞死経路であり、高度に調節されたエネルギー保存機構によって進行する。健常状態では、アポトーシスは細胞増殖の制御において中心的な役割を果たし、細胞数の調節、形態形成の促進及び有害又は異常な細胞の除去を行う。PCD過程のディスレギュレーション(dysregulation)は、癌及び自己免疫障害のようなアポトーシスの阻害に関連するもの、並びに神経変性疾患、血液学的疾患、AIDS、虚血症及び同種移植片拒絶のような過活性アポトーシスに関連するものを含め、多数の疾患状態と関係づけられている。したがって、アポトーシスの可視化及び定量化は、かかるアポトーシス関連病態生理学の診断において有用である。
これらの疾患に関する治療学的処置は、場合に応じてPCD過程を促進又は抑制することにより、バランスの取れたアポトーシスを回復することを目指している。したがって、細胞及び組織におけるアポトーシスをインビボで非侵襲的にイメージングすることは、治療学的介入に対する応答の早期評価のために非常に大きな価値を有し、破壊的な病理学的過程に対する新しい洞察を与えることができる。特に興味深いのは、癌療法の効力の早期モニタリングにより、状態が末期になる前に悪性増殖を確実に制御することである。
その結果、アポトーシスに関するイメージング剤の開発に大きな関心が寄せられてきた[例えば、Zeng et al,Anti−cancer Agent Med.Chem.,9(9),986−995(2009)、Zhao,ibid,9(9),1018−1023(2009)及びM.De Saint−Hubert et al,Methods,48,178−187(2009)を参照されたい]。細胞死をイメージングするために利用できるプローブのうち、放射性標識アネキシンVは最も多くの注目を集めた。アネキシンVは負に帯電したリン脂質のみに結合し、そのためにアポトーシスと壊死とを識別することができない。
ランチオニン含有抗生物質ペプチド(「ランチビオチック」)であるジュラマイシン及びシンナマイシンは、コンパクトな四環式構造を有する2種の密接に関係した19量体ペプチドである[Zhao,AminoAcids,DOI 10.1007/s00726−009−0386−9,Springer−Verlag(2009)及びそこに引用された参考文献]。これらは4つの共有結合した分子内橋によって架橋されており、2位のただ1つのアミノ酸残基のみによって異なっている。ジュラマイシン及びシンナマイシンの構造を下記に模式的に示すが、式中の番号は19量体配列中における連結アミノ酸の位置を表している。
ジュラマイシン及びシンナマイシンは共に、PE頭部基の回りに嵌合する疎水性ポケットを形成することにより、同様な特異性及び高い親和性をもって中性のアミノリン脂質PEと結合する。かかる結合は、β−ヒドロキシアスパラギン酸残基(HO−Asp15)とエタノールアミン基とのイオン性相互作用によって安定化される。この残基に対する修飾はジュラマイシンを不活性化することが知られている[Zhao et al,J.Nucl.Med,49,1345−1352(2008)]。Zhao[Amino Acids,DOI 10.1007/s00726−009−0386−9,Springer−Verlag(2009)]は、Wakamatsu et al[Biochemistry,29,113−188(1990)]による初期の研究を引用している。そこでは、NMR試験によれば、シンナマイシンの5つの末端アミノ酸の1H NMR共鳴はいずれもPEとの結合後にシフトしないことが示され、これらはPEとの相互作用に関与しないことが示唆されている。
米国特許出願公開第2004/0147440号(University of Texas System)は、前アポトーシス又はアポトーシス細胞の検出或いは癌のイメージングにおいて使用できる標識抗アミノリン脂質抗体を記載している。また、癌療法用のジュラマイシンとビオチン、タンパク質又は抗ウイルス薬物とのコンジュゲーションも提供されている。
国際公開第2006/055855号は、タンパク質のホスファチジルセリン結合C2ドメインを含む放射性標識化合物を用いたアポトーシスのイメージング方法を開示している。
国際公開第2009/114549号は、下記の方法によって製造される放射性医薬品を開示している。かかる方法は、
(i)CKQSCSFGPFTFVCDGNTKと70%以上の配列類似性を有するポリペプチドを用意する段階であって、ポリペプチドはアミノ酸残基1−18、4−14及び5−11の間にチオエーテル結合を含むと共に、アミノ酸残基6−19の間にアミド結合を含み、かつ次の構造を有する1以上の末端部分がポリペプチドの1位、2位又は1位及び2位のアミノ酸に共有結合している段階、
(i)CKQSCSFGPFTFVCDGNTKと70%以上の配列類似性を有するポリペプチドを用意する段階であって、ポリペプチドはアミノ酸残基1−18、4−14及び5−11の間にチオエーテル結合を含むと共に、アミノ酸残基6−19の間にアミド結合を含み、かつ次の構造を有する1以上の末端部分がポリペプチドの1位、2位又は1位及び2位のアミノ酸に共有結合している段階、
並びに
(ii)99mTcx、(99mTc=O)3+、(99mTc≡N)2+、(O=99mTc=O)+又は[99mTc(CO)3]+(式中、xは+7、+6、+5、+4、+3、+2、+1、0及び−1からなる群から選択されるレドックス又は酸化状態である。)或いはその塩、溶媒和物又は水和物で1以上の末端部分をキレート化する段階
を含んでいる。
国際公開第2009/114549号の「末端部分」は放射性同位体99mTcに対する錯化剤であって、これはヒドラジノニコチンアミド(普通「HYNIC」と略す)に基づいている。HYNICは文献中で公知であり[例えば、Banerjee et al,Nucl.Med.Biol,32,1−20(2005)を参照されたい。]、ペプチド及びタンパク質を99mTcで標識するための好ましい方法である[R.Alberto,Chapter 2,pages 19−40 in IAEA Radioisotopes and Radiopharmaceuticals Series 1:“Technetium−99m Radiopharmaceuticals Status and Trends”(2009)]。
国際公開第2009/114549号は、具体的には99mTc−HYNIC−ジュラマイシンを開示し、そこに教示された放射性医薬品がアポトーシス及び/又は壊死、粥状斑或いは急性心筋梗塞をイメージングするために有用であることを示唆している。
Zhao et al[J.Nucl.Med,49,1345−1352(2008)]は、99mTc−HYNIC−ジュラマイシンの製法を開示している。Zhao et alは、ジュラマイシンがHYNICへのコンジュゲーションのために利用し得る2つのアミン基、即ちN末端(Cys1残基)のアミン基及びLys2残基のε−アミン側鎖を有することに注目している。彼らは、99mTcでの放射性標識に先立ち、HYNIC−ジュラマイシンコンジュゲートをHPLCで精製してビス−HYNIC官能化ジュラマイシンを除去した。Zhao et alは、試験した99mTc標識モノ−HYNIC−ジュラマイシンコンジュゲートが恐らくは異性体の混合物の形態であることを認めている。
HYNICは安定な99mTc錯体を形成するものの、テクネチウム金属錯体の配位球を完成するために追加の補助リガンドを必要とする。HYNICは、近傍にあるアミノ酸側鎖官能基の性質に応じて単座リガンド又は仁座キレーターとして機能し得る[King et al,Dalton Trans.,4998−5007(2007)、Meszaros et al[Inorg.Chim.Acta,363,1059−1069(2010)]。即ち、環境に応じて、HYNICは1つ又は2つの金属ドナー原子を有する金属錯体を形成する。Meszaros et alは、HYNICと共に使用する補助リガンドの性質が系の挙動に顕著な効果を及ぼし得ることに注目し、いずれの補助リガンドも理想的でないと述べている。
本発明は、特に異常なアポトーシスが関与している哺乳動物体の疾患状態をイメージングするための放射性医薬品イメージング剤を提供する。かかるイメージング剤は、18F放射性標識ランチビオチックペプチドを含んでいる。本発明は、高い放射化学純度(RCP)で再現可能に生成する放射性トレーサーを提供する。本発明者らはまた、本明細書中の式IIのランチビオチックペプチドのN末端(Cysa残基)における放射性ラベル錯体の結合が著しく好ましいことも立証した。これは、N末端に隣接したアミノ酸(式IIのXaa)における結合であっても、ホスファチジルエタノールアミンへの結合に対して有害な効果を有するからである。このような効果は、以前には先行技術において認識されておらず、したがって結合親和性に対する影響の程度は新規なものと考えられる。
本発明の18F標識イメージング剤はPET(陽電子放出断層撮影法)のために適しており、これは先行技術のイメージング剤に比べて画像の定量化が一層容易であるという利点を有している。
第1の態様では、本発明は、次の式Iの化合物を含んでなるイメージング剤を提供する。
Z1−(L)n−[LBP]−Z2
(I)
式中、
LBPは次の式IIのランチビオチックペプチドであり、
Cysa−Xaa−Gln−Serb−Cysc−Serd−Phe−Gly−Pro−Phe−Thrc−Phe−Val−Cysb−(HO−Asp)−Gly−Asn−Thra−Lysd
(II)
(式中、
XaaはArg又はLysであり、
Cysa−Thra、Serb−Cysb及びCysc−Thrcはチオエーテル結合を介して共有結合しており、
Serd−Lysdはリシノアラニン結合を介して共有結合しており、
HO−Aspはβ−ヒドロキシアスパラギン酸である。)
Z1−(L)n−はLBPのCysa及び任意には(XaaがLysである場合に)Xaaにも結合しており、ここでZ1は18F又は金属錯体の金属に配位した18Fであり、
Z2はLBPのC末端に結合していて、OH又はOBc(式中、Bcは生体適合性陽イオンである。)であり、
Lは式−(A)m−(式中、各Aは独立に−CR2−、−CR=CR−、−C≡C−、−CR2CO2−、−CO2CR2−、−NRCO−、−CONR−、−CR=N−O−、−NR(C=O)NR−、−NR(C=S)NR−、−SO2NR−、−NRSO2−、−CR2OCR2−、−CR2SCR2−、−CR2NRCR2−、C4-8シクロヘテロアルキレン基、C4-8シクロアルキレン基、−Ar−、−NR−Ar−、−O−Ar−、−Ar−(CO)−、アミノ酸、糖又は単分散ポリエチレングリコール(PEG)構成単位であり、ここで各Arは独立にC5-12アリーレン基又はC3-12ヘテロアリーレン基であり、各Rは独立にH、C1-4アルキル、C2-4アルケニル、C2-4アルキニル、C1-4アルコキシアルキル及びC1-4ヒドロキシアルキルから選択され、mは1〜20の値を有する整数である。)の合成リンカー基であり、
nは0又は1の値を有する整数である。
Z1−(L)n−[LBP]−Z2
(I)
式中、
LBPは次の式IIのランチビオチックペプチドであり、
Cysa−Xaa−Gln−Serb−Cysc−Serd−Phe−Gly−Pro−Phe−Thrc−Phe−Val−Cysb−(HO−Asp)−Gly−Asn−Thra−Lysd
(II)
(式中、
XaaはArg又はLysであり、
Cysa−Thra、Serb−Cysb及びCysc−Thrcはチオエーテル結合を介して共有結合しており、
Serd−Lysdはリシノアラニン結合を介して共有結合しており、
HO−Aspはβ−ヒドロキシアスパラギン酸である。)
Z1−(L)n−はLBPのCysa及び任意には(XaaがLysである場合に)Xaaにも結合しており、ここでZ1は18F又は金属錯体の金属に配位した18Fであり、
Z2はLBPのC末端に結合していて、OH又はOBc(式中、Bcは生体適合性陽イオンである。)であり、
Lは式−(A)m−(式中、各Aは独立に−CR2−、−CR=CR−、−C≡C−、−CR2CO2−、−CO2CR2−、−NRCO−、−CONR−、−CR=N−O−、−NR(C=O)NR−、−NR(C=S)NR−、−SO2NR−、−NRSO2−、−CR2OCR2−、−CR2SCR2−、−CR2NRCR2−、C4-8シクロヘテロアルキレン基、C4-8シクロアルキレン基、−Ar−、−NR−Ar−、−O−Ar−、−Ar−(CO)−、アミノ酸、糖又は単分散ポリエチレングリコール(PEG)構成単位であり、ここで各Arは独立にC5-12アリーレン基又はC3-12ヘテロアリーレン基であり、各Rは独立にH、C1-4アルキル、C2-4アルケニル、C2-4アルキニル、C1-4アルコキシアルキル及びC1-4ヒドロキシアルキルから選択され、mは1〜20の値を有する整数である。)の合成リンカー基であり、
nは0又は1の値を有する整数である。
本発明のイメージング剤は、18F標識ランチビオチックペプチドである。「18F放射性標識」又は「18F標識」という用語は、ランチビオチックペプチドがそれに共有結合した放射性同位体18Fを有することを意味する。18Fは、好適にはC−Fフルオロアルキル又はフルオロアリール結合によって結合される。これは、かかる結合がインビボで比較的安定であり、したがってペプチドからの18F放射性ラベルの代謝開裂に対する抵抗性を与えるからである。
「イメージング剤」という用語は、哺乳動物体をイメージングするのに適した化合物を意味する。好ましくは、哺乳動物はインタクトな哺乳動物生体であり、さらに好ましくはヒト被験体である。好ましくは、イメージング剤は最小限に侵襲的なやり方(即ち、職業的な医学専門技術の下で実施した場合に哺乳動物被験体に対して実質的な健康リスクのないやり方)で哺乳動物体に投与できる。かかる最小限に侵襲的な投与は、好ましくは、局所又は全身麻酔の必要なしに行われる、前記被験体の末梢静脈への静脈内投与である。第1の態様のイメージング剤は、第6の態様(下記)に記載されるように、アポトーシス及び他の形態の細胞死をイメージングするため特に適している。
本明細書中で使用される「インビボイメージング」という用語は、哺乳動物被験体の内部構造の全部又は一部の画像を非侵襲的に生成する技法をいう。本発明の好ましいイメージング技法は、陽電子放出断層撮影法(PET)である。
「金属錯体」という用語は、非放射性金属の配位錯体を意味する。好ましいかかる錯体はキレート化剤を含んでいる。本発明の好ましい非放射性金属には、アルミニウム、ガリウム及びインジウムがある。
「アミノ酸」という用語は、L−又はD−アミノ酸、アミノ酸類似体(例えば、ナフチルアラニン)或いはアミノ酸模倣体を意味し、これらは天然のもの又は純粋に合成由来のものであってよく、光学的に純粋なもの(即ち、単一の鏡像異性体)、したがってキラルなものであるか、或いは鏡像異性体の混合物であってよい。本明細書中では、アミノ酸にする通常の三文字略語又は一文字略語が使用される。好ましくは、本発明のアミノ酸は光学的に純粋なものである。
「単分散ポリエチレングリコール(PEG)構成単位」という用語は、次の式IA又はIBのPEGバイオモディファイアーを意味する。
「ペプチド」という用語は、ペプチド結合(即ち、1つのアミノ酸のアミンを別のアミノ酸のカルボキシルに連結するアミド結合)によって連結された(上記に定義したような)2以上のアミノ酸を含む化合物を意味する。
「ランチビオチックペプチド」という用語は、1以上のランチオニン結合を含むペプチドをいう。「ランチオニン」はその通常の意味を有し、下記に示す化学構造を有するシスチンのスルフィド類似体をいう。
「リシノアラニン結合」という用語は、Lys残基のε−アミン基がSerのヒドロキシル官能基の脱水素によって示されたSer残基に対するアミン結合として連結されて、アミノ酸残基の2つのα−炭素原子を連結する−(CH2)−NH−(CH2)4−結合を与えることを意味する。
Z1がCysaに結合している場合、それはLBPのN末端に結合している。Z1がXaaにも結合している場合、それは、XaaがLysであり、Z1がLys残基のε−アミノ基に結合していることを意味する。
Z2基は、LBPの最後のアミノ酸残基のカルボニル基(即ち、カルボキシ末端)を置換する。したがって、Z2がOHである場合、LBPのカルボキシ末端は最後のアミノ酸残基の遊離CO2H基で終わり、Z2がOBcである場合、その末端カルボキシ基はCO2Bc基としてイオン化されている。
「生体適合性陽イオン」(Bc)という用語は、イオン化して負に帯電した基と共に塩を形成する正に帯電した対イオンを意味する。この場合、前記正に帯電した対イオンも無毒性であり、したがって哺乳動物体(特に人体)への投与に適している。好適な生体適合性陽イオンの例には、アルカリ金属であるナトリウム及びカリウム、アルカリ土類金属であるカルシウム及びマグネシウム、並びにアンモニウムイオンがある。好ましい生体適合性陽イオンはナトリウム及びカリウムであり、最も好ましくはナトリウムである。
好ましい実施形態
第1の態様のイメージング剤では、Z1は好ましくはLBPのCysaのみに結合している。XaaがArgである場合、それはZ1がCysa残基の遊離アミン基の位置でLBPのN末端に結合されることを意味する。XaaがLysである場合、それは
(i)Xaa残基のε−アミン基に優先して、Cysa残基の位置でLBPペプチドを選択的に官能化する段階、又は
(ii)Cysa又はXaaの位置においてZ1で官能化されたLBPを含む組成物を調製し、次いでXaa官能化化学種を除去する段階
が採用されることを意味する。
第1の態様のイメージング剤では、Z1は好ましくはLBPのCysaのみに結合している。XaaがArgである場合、それはZ1がCysa残基の遊離アミン基の位置でLBPのN末端に結合されることを意味する。XaaがLysである場合、それは
(i)Xaa残基のε−アミン基に優先して、Cysa残基の位置でLBPペプチドを選択的に官能化する段階、又は
(ii)Cysa又はXaaの位置においてZ1で官能化されたLBPを含む組成物を調製し、次いでXaa官能化化学種を除去する段階
が採用されることを意味する。
第1の態様のイメージング剤では、Xaaは好ましくはArgである。Z2は好ましくはOH又はOBcである。
式I中では、nは好ましくは1であり、即ちリンカー基(L)は存在している。Z1が18Fである場合、好ましい放射性フッ素化置換基18F−(L)n−は次の式Xを有し、−(L)n−は−X1−(A)x−であるように選択される。
18F−X1−(A)x− (X)
式中、
xは0〜5の値を有する整数であり、
X1は−Ar−、−Ar−NR−、−Ar−O−、−Ar−(CO)−及び−Si(Ra)2−から選択され、
A、Ar及びRはL基に関して(上記に)定義した通りであり、
各Raは独立にC1-9アルキルである。
18F−X1−(A)x− (X)
式中、
xは0〜5の値を有する整数であり、
X1は−Ar−、−Ar−NR−、−Ar−O−、−Ar−(CO)−及び−Si(Ra)2−から選択され、
A、Ar及びRはL基に関して(上記に)定義した通りであり、
各Raは独立にC1-9アルキルである。
X1のAr基は好ましくはC1-6アリール基であり、この場合に18F基は前記アリール基に共有結合している。X1は好ましくは、フェニル環或いはトリアゾール、イソキサゾール及びピリジン環から選択される複素環を含んでいる。
X1が−Si(Ra)2−である場合、Raは線状のもの又は枝分れしたもの或いはこれらの組合せであり得る。Raは好ましくは枝分れしたものであり、好ましくは−C(CH3)3である。さらに好ましくは、両Ra基が−C(CH3)3である。
一実施形態では、式Xの最も好ましい置換基は、フッ素化活性エステルによるLBP中のCys残基のNα−アミノ基又はLysのNε−アミノ基のN−アシル化、或いはCys又はLysアミン残基のアミノオキシ誘導体と放射性フッ素化ベンズアルデヒドとの縮合から得られ、下記の構造要素を含んでいる。
別の実施形態では、式Xの最も好ましい置換基は、18F−Si結合を有する有機ケイ素誘導体を含んでいる。
好ましくは、イメージング剤は無菌形態で、即ち第4の態様(下記)に記載されるような哺乳動物への投与に適した形態で提供される。
第1の態様のイメージング剤は、第3の態様(下記)に記載するようにして得ることができる。
第2の態様では、本発明は次の式IIIの前駆体を提供する。
Z3−(L)n−[LBP]−Z2
(III)
式中、
L、n、LBP及びZ2は第1の態様で定義した通りであり、
Z3は
(i)アミノオキシ基、
(ii)アジド基、
(iii)アルキン基、
(iv)ニトリルオキシド、及び
(v)アミノカルボキシレートリガンドのアルミニウム、インジウム又はガリウム金属錯体
から選択される官能基である。
Z3−(L)n−[LBP]−Z2
(III)
式中、
L、n、LBP及びZ2は第1の態様で定義した通りであり、
Z3は
(i)アミノオキシ基、
(ii)アジド基、
(iii)アルキン基、
(iv)ニトリルオキシド、及び
(v)アミノカルボキシレートリガンドのアルミニウム、インジウム又はガリウム金属錯体
から選択される官能基である。
第2の態様におけるL、n、LBP及びZ2及び金属錯体の好ましい態様は、第1の態様(上記)で定義した通りである。
「アミノオキシ基」という用語は、式IIIのLBPペプチドに共有結合したアミノオキシ官能基を意味する。かかる基は式−O−NH2、好ましくは−CH2O−NH2を有するものであり、アミノオキシ基のアミンはアルデヒドと縮合してオキシムエーテルを形成する反応においてLysアミン基より反応性が高いという利点を有している。かかるアミノオキシ基は、好適にはLBPのCys又はLys残基の位置に結合している。
第2の態様の前駆体は非放射性である。好ましくは、第4の態様(下記)に記載されるような医薬組成物形態のイメージング剤の製造を容易にするため、前駆体は無菌形態で提供される。
式III中では、Z3は好ましくはLBPのCysaに結合しており、任意にはXaaにも結合している。好ましくは、Z3はLBPのCysaのみに結合している。
アミノオキシ官能化LBPペプチドは、Poethko et al[J.Nucl.Med.,45,892−902(2004)]、Schirrmacher et al[Bioconj.Chem.,18,2085−2089(2007)]、Solbakken et al[Bioorg.Med.Chem.Lett,16,6190−6193(2006)]又はGlaser et al[Bioconj.Chem.,19,951−957(2008)]の方法によって製造できる。アミノオキシ基は、任意には2つの段階でコンジュゲートすることができる。第一に、N−保護アミノオキシカルボン酸又はN−保護アミノオキシ活性化エステルをLBPペプチドにコンジュゲートする。第二に、中間のN−保護アミノオキシ官能化LBPペプチドを脱保護して所望の生成物を得る[上記に引用されたSolbakken及びGlaserの論文を参照されたい]。Boc−NH−O−CH2(C=O)OH及びEei−N−O−CH2(C=O)OHのようなN−保護アミノオキシカルボン酸は、例えばNovabiochem社及びIRIS社から商業的に入手できる。「保護」という用語は、保護基の使用をいう。「保護基」という用語は、望ましくない化学反応を阻止又は抑制するが、分子の残部を変質させない程度に温和な条件下で問題の官能基から脱離させ得るのに十分な反応性を有するように設計された基を意味する。脱保護後には所望の生成物が得られる。アミン保護基は当業者にとって公知であり、好適にはBoc(ここでBocはtert−ブチルオキシカルボニルである。)、Eei(ここでEeiはエトキシエチリデンである。)、Fmoc(ここでFmocはフルオレニルメトキシカルボニルである。)、トリフルオロアセチル、アリルオキシカルボニル、Dde[即ち、1−(4,4−ジメチル−2,6−ジオキソシクロヘキシリデン)エチル]及びNpys(即ち、3−ニトロ−2−ピリジンスルフェニル)から選択される。さらに他の保護基の使用は、‘Protective Groups in Organic Synthesis’,4th Edition,Theodora W.Greene and Peter G.M.Wuts[Wiley Blackwell,(2006)]に記載されている。好ましいアミン保護基はBoc及びEeiであり、最も好ましくはEeiである。
ペプチドをアジド基で官能化する方法は、Nwe et al[Cancer Biother.Radiopharm.,24(3),289−302(2009)]によって記載されている。Li et alは、N3−L1−CO2H型(式中、L1は−(CH2)4−である。)の化合物の合成法及びアミン含有生体分子にコンジュゲートするためのそれの使用を記載している[Bioconj.Chem.,18(6),1987−1994(2007)]。Hausner et alは、N3−L1−CO2H(式中、L1は−(CH2)2−である。)についての関連方法を記載している[J.Med.Chem.,51(19),5901−5904(2008)]。De Graaf et al[Bioconj.Chem.,20(7),1281−1295(2009)]は、アジド側鎖を有する非天然アミノ酸及び続くクリックコンジュゲーションのためのペプチド又はタンパク質中へのそれの部位特異的組込みを記載している。
ペプチドをアルキン基で官能化する方法は、Nwe et al[Cancer Biother.Radiopharm.,24(3),289−302(2009)]によって記載されている。Smith et alはアルキン官能化イサチン前駆体の合成法を記載しており、ここでイサチン化合物はカスパーゼ−3カスパーゼ−7に対して特異的である[J.Med.Chem.,51(24),8057−8067(2008)]。De Graaf et al[Bioconj.Chem.,20(7),1281−1295(2009)]は、アルキン側鎖を有する非天然アミノ酸及び続くクリックコンジュゲーションのためのペプチド又はタンパク質中へのそれの部位特異的組込みを記載している。
「ニトリルオキシド」という用語は、式−C≡N+−O-の置換基をいう。上記に記載した条件下で18F標識アルキンのクリック環付加を行えば、イソキサゾール環が得られる。ニトリルオキシドは、Ku et al[Org.Lett.,3(26),4185−4187(2001)]及びその引用文献中に記載された方法によって得ることができる。即ち、これらは通例、α−ハロアルドキシムをトリエチルアミンのような有機塩基で処理することによってインサイチュで生成される。好ましい生成方法、並びに続くクリック環化によって所望のイソキサゾールを得るための条件は、Hansen et al[J.Org.Chem.,70(19),7761−7764(2005)]によって記載されている。また、K.B.G.Torsell“Nitrile Oxides,Nitrones and Nitronates in Organic Synthesis”[VCH,New York(1988)]も参照されたい。
官能化NOTAキレーターの製造方法、それのペプチドとのコンジュゲーション、及び18Fによるキレーターコンジュゲートの放射性標識は、McBride et al[J.Nucl.Med.,51(3),454−461(2009);Bioconj.Chem.,21(7),1331−1340(2010)]及びLaverman et al[J.Nucl.Med.,51(3),454−461(2010)]によって記載されている。
第3の態様では、本発明は、第1の態様のイメージング剤の製造方法であって、第2の態様の前駆体又は第1の態様で定義されたLBPペプチドを適当な溶媒中で適当な化学形態の18F供給物と反応させることを含んでなる方法を提供する。
第3の態様における前駆体及びLBPペプチドの好ましい態様は、それぞれ本発明の第1及び第2の態様(上記)に記載した通りである。
「適当な溶媒」は、通例は水性のものであり、好ましくは第4の態様(下記)で定義されるような生体適合性キャリヤー溶媒である。
「適当な化学形態の18F供給物」は、前駆体又はLBPペプチドの官能基に応じて選択される。Lys残基のアミン基又はLBPペプチドのCysaのアミノ基を使用する場合には、18Fの化学形態は、好適には活性エステル又は活性化剤の存在下での18F標識カルボン酸である。「活性化剤」という用語は、アミンとカルボン酸とのカップリングによるアミドの生成を容易にするために使用される試薬を意味する。好適なかかる活性化剤は当技術分野で公知であり、EDC[N−(3−ジメチルアミノプロピル)−N’−エチルカルボジイミド]のようなカルボジイミド及びジシクロヘキシルカルボジイミド又はジイソプロピルカルボジイミドのようなN,N’−ジアルキルカルボジイミド、並びにHBTU[O−(ベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート]、HATU[O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート]及びPyBOP[ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ)トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート]のようなトリアゾールを包含する。かかる活性化剤は商業的に入手できる。さらなる詳細は、“March's Advanced Organic Chemistry”,5th Edition,pages 508−510,Wiley Interscience(2001)に示されている。好ましいかかる活性化剤はEDCである。
[18F]SFBのような18F標識活性化エステルは、Glaser et al[J.Lab.Comp.Radiopharm.,52,327−330(2009)]及びその中の参考文献に記載された方法、或いはMarik et al[Appl.Rad.Isot.,65(2),199−203(2007)]の自動化方法によって製造できる。
18F標識カルボン酸は、上記に引用したMarik et alの方法によって得ることができる。
前駆体がアミノオキシ基を含む場合、好適な化学形態は18F−フッ素化アルデヒド、好ましくは18F−フルオロベンズアルデヒド又はp−(ジ−tert−ブチル−18F−フルオロシリル)ベンズアルデヒド(18F−SiFA−A)、さらに好ましくは18F−フルオロベンズアルデヒドである。式18F(CH2)2O[CH2CH2O]qCH2CHO(式中、qは3である。)の18F標識脂肪族アルデヒドは、Glaser et al[Bioconj.Chem.,19(4),951−957(2008)]の方法によって得ることができる。18F−フルオロベンズアルデヒドは、Glaseretal[J.Lab.Comp.Radiopharm.,52,327−330(2009)]の方法によって得ることができる。18F−フルオロベンズアルデヒドの前駆体、即ちMe3N+−C6H4−CHO・CF3SO3 -は、Haka et al[J.Lab.Comp.Radiopharm.,27,823−833(1989)]の方法によって得られる。
18F−SiFA−A、即ち18F−Si(But)2−C6H4−CHOは、Schirrmacher et al[Ang.Chem.Int.Ed.Engl.,45(36),6047−6050(2006)、Bioconj.Chem.,18(6),2085−2089(2007)及びBioconj.Chem.,20(2),317−321(2009)]の方法によって得ることができる。Schirrmacher et alはまた、18F−SiFA−Aを用いてアミノオキシ官能化ペプチド前駆体を18F放射性標識する方法も開示している。
前駆体がアジド官能化LBPペプチドからなる場合、好適な化学形態は18F標識末端アルキンである。かかる放射性フッ素化アルキンは、Kim et al[Appl.Rad.Isotop.,68(2),329−333(2010)]又はMarik et al[Tet.Lett.,47,6681−6684(2006)]の方法によって得ることができる。
前駆体がアルキン官能化LBPペプチドからなる場合、好適な化学形態は18F標識末端アジドである。好ましいかかる化合物は、Gaeta et al[Bioorg.Med.Chem.Lett.,20(15),4649−4652(2010)]及びGlaser et al[Bioconj.Chem.,18(3),989−993(2007)]によって記載されているような18F−フルオロエチルアジドである。
前駆体がアルキン官能化又はアジド官能化LBPペプチドからなる場合、放射性フッ素化反応はクリック化学を含んでいる。かかるクリック反応用の好適な溶媒は、例えば、アセトニトリル、C1-4アルキルアルコール、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン又はジメチルスルホキシド或いはこれらのいずれかの水性混合物又は水である。水性緩衝液は、4〜8のpH範囲内、さらに好ましくは5〜7のpH範囲内で使用できる。反応温度は、好ましくは5〜100℃、さらに好ましくは75〜85℃、最も好ましくは周囲温度(通例15〜37℃)である。クリック環付加は、Meldal and Tornoe[Chem.Rev.108,(2008)2952,Table1(2008)]によって記載されているように、任意には有機塩基の存在下で実施できる。
クリック反応は、クリック環付加触媒の存在下で実施される。「クリック環付加触媒」という用語は、それぞれトリアゾール又はイソキサゾール環を与えるクリック(アルキン+アジド)又はクリック(アルキン+イソニトリルオキシド)環付加反応を触媒することが知られている触媒を意味する。クリック環付加反応で使用するための好適なかかる触媒は、当技術分野で公知である。好ましいかかる触媒はCu(I)を含むと共に、下記に説明される。好適な触媒のさらなる詳細は、Wu and Fokin[Aldrichim.Acta,40(1),7−17(2007)]及びMeldal and Tornoe[Chem.Rev.,108,2952−3015(2008)]によって記載されている。
好ましいクリック環付加触媒はCu(I)を含んでいる。Cu(I)触媒は、反応が進行するのに十分な量、通例は触媒量又は過剰量(例えば、アジド又はイソニトリルオキシド試薬に対して0.02〜1.5モル当量)で存在する。好適なCu(I)触媒には、CuI又は[Cu(NCCH3)4][PF6]のようなCu(I)塩がある。しかし有利には、硫酸銅(II)のようなCu(II)塩を還元剤の存在下で使用してCu(I)をインサイチュで生成させることができる。好適な還元剤には、アスコルビン酸又はその塩(例えば、アスコルビン酸ナトリウム)、ヒドロキノン、金属銅、グルタチオン、システイン、Fe2+及びCo2+がある。Cu(I)はまた、元素銅粒子の表面上にも本質的に存在しており、したがって例えば粉末又は顆粒の形態の元素銅を触媒として使用することもできる。管理された粒度を有する元素銅が好ましいCu(I)触媒源である。さらに好ましいかかる触媒は、0.001〜1mmの範囲内、好ましくは0.1〜0.7mmの範囲内、さらに好ましくは約0.4mmの粒度を有する銅粉末としての元素銅である。別法として、0.01〜1.0mmの範囲内、好ましくは0.05〜0.5mmの範囲内、さらに好ましくは0.1mmの直径を有するコイル銅線を使用することができる。Cu(I)触媒は、任意には、クリック化学においてCu(I)を安定化するために使用されるバトフェナントロリンの存在下で使用することができる。
クリック活性化エステル及び金属錯体方法を用いるペプチドの18F標識のさらなる詳細は、Olberg et al[J.Med.Chem.,53(4),1732−1740(2010)及びCurr.Top.Med.Chem.,10(16),1669−1679(2010)]によって記載されている。
若干のLBPペプチドは商業的に入手できる。即ち、シンナマイシン及びジュラマイシンはSigma−Aldrich社から入手できる。ジュラマイシンは、Streptoverticillium cinnamoneus由来の菌株D3168 Duramycinによって産生される。シンナマイシンは、例えばStreptomyces cinnamoneus又はStreptoverticillium griseoverticillatum由来の複数の菌株によって生化学的に産生することができる。C.Chatterjee et al[Chem.Rev.,105,633−683(2005)]による総説を参照されたい。
他のペプチドは、P.Lloyd−Williams,F.Albericio and E.Girald;Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins,CRC Press,1997に記載されているような固相ペプチド合成によって得ることができる。
第4の態様では、本発明は、第1の態様のイメージング剤を、哺乳動物への投与に適した形態で生体適合性キャリヤーと共に含んでなる放射性医薬組成物を提供する。
第4の態様におけるイメージング剤の好ましい態様は、本発明の第1の態様(上記)に記載した通りである。
「哺乳動物への投与に適した形態で」という語句は、無菌でパイロジェンフリーであり、毒性又は有害効果を生じる化合物を含まず、生体適合性pH(およそpH4.0〜10.5)で製剤化される組成物を意味する。かかる組成物は、インビボで塞栓を生じる危険性を有し得る粒状物質を含まないと共に、生物学的流体(例えば、血液)と接触した際に沈殿が起こらないように製剤化される。かかる組成物はまた、生物学的に適合性の賦形剤のみを含み、好ましくは等張性である。
「生体適合性キャリヤー」とは、組成物が生理学的に認容され得るようにして(即ち、毒性又は過度の不快感なしに哺乳動物体に投与できるようにして)イメージング剤を懸濁又は好ましくは溶解し得る流体(特に液体)である。生体適合性キャリヤーは、好適には、無菌のパイロジェンフリー注射用水、(有利には注射用の最終生成物が等張性になるように平衡させ得る)食塩水のような水溶液、生体適合性緩衝剤を含む水性緩衝液(例えば、リン酸緩衝液)、或いは1種以上の張度調整物質(例えば、血漿陽イオンと生体適合性対イオンとの塩)、糖(例えば、グルコース又はスクロース)、糖アルコール(例えば、ソルビトール又はマンニトール)、グリコール(例えば、グリセロール)又は他の非イオン性ポリオール物質(例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど)の水溶液のような注射可能なキャリヤー液体である。好ましくは、生体適合性キャリヤーはパイロジェンフリー注射用水、等張食塩水又はリン酸緩衝液である。
イメージング剤及び生体適合性キャリヤーはそれぞれ、注射器又はカニューレによる溶液の追加及び抜取りを許しながら、無菌保全性及び/又は放射能安全性の維持、さらに任意には不活性ヘッドスペースガス(例えば、窒素又はアルゴン)の維持を可能にする密封容器からなる適当なバイアル又は容器に入れた状態で供給される。好ましいかかる容器は、気密クロージャーを(通例はアルミニウムからなる)オーバーシールと共にクリンプ加工した隔壁密封バイアルである。クロージャーは、無菌保全性を維持しながら皮下注射針による1回又は数回の穿刺に適したもの(例えば、クリンプ加工した隔壁シールクロージャー)である。かかる容器は、(例えば、ヘッドスペースガスの交換又は溶液のガス抜きのために)所望される場合にはクロージャーが真空に耐え得ると共に、酸素又は水蒸気のような外部大気ガスの侵入を許すことなしに減圧のような圧力変化にも耐え得るという追加の利点を有している。
好ましい複数用量容器は、複数の患者用量を含む(例えば、容積10〜30cm3の)単一のバルクバイアルからなり、したがって臨床的状況に合わせて製剤の実用寿命中に様々な時間間隔で1回分の患者用量を臨床グレードの注射器中に抜き取ることができる。予備充填注射器は1回分のヒト用量又は「単位用量」を含むように設計され、したがって好ましくは臨床用に適した使い捨て注射器又は他の注射器である。本発明の医薬組成物は、好ましくは1人の患者用に適した用量を有し、上述したような適当な注射器又は容器に入れて供給される。
かかる医薬組成物は、抗菌防腐剤、pH調整剤、フィラー、放射線防護剤、可溶化剤又は重量オスモル濃度調整剤のような追加の任意賦形剤を含むことができる。「放射線防護剤」という用語は、水の放射線分解から生じる含酸素フリーラジカルのような高反応性フリーラジカルを捕捉することにより、レドックス過程のような分解反応を阻止する化合物を意味する。本発明の放射線防護剤は、好適には、アスコルビン酸、p−アミノ安息香酸(即ち、4−アミノ安息香酸)、ゲンチシン酸(即ち、2,5−ジヒドロキシ安息香酸)及びかかる酸と上記に記載した生体適合性陽イオンとの塩から選択される。「可溶化剤」という用語は、溶媒に対するイメージング剤の溶解性を高める、組成物中に存在する添加剤を意味する。好ましいかかる溶媒は水性媒質であり、したがって可溶化剤は好ましくは水に対する溶解性を高める。好適なかかる可溶化剤には、C1-4アルコール、グリセリン、ポリエチレングリコール(PEG)、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノオレエート、ポリソルベート、ポリ(オキシエチレン)ポリ(オキシプロピレン)ポリ(オキシエチレン)ブロック共重合体(Pluronics(商標))、シクロデキストリン(例えば、α−、β−又はγ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン或いはヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン)及びレシチンがある。
「抗菌防腐剤」という用語は、潜在的に有害な微生物(例えば、細菌、酵母又はかび)の増殖を阻止する薬剤を意味する。抗菌防腐剤はまた、使用する用量に応じて多少の殺菌性を示すこともある。本発明の抗菌防腐剤の主な役割は、医薬組成物中におけるこのような微生物の増殖を阻止することである。しかし、抗菌防腐剤は、任意には投与に先立って前記組成物を製造するために使用されるキットの1以上の成分中における潜在的に有害な微生物の増殖を阻止するためにも使用できる。好適な抗菌防腐剤には、パラベン類(即ち、メチル、エチル、プロピル又はブチルパラベン或いはこれらの混合物)、ベンジルアルコール、フェノール、クレゾール、セトリミド及びチオメルサールがある。好ましい抗菌防腐剤はパラベン類である。
「pH調整剤」という用語は、組成物のpHがヒト又は哺乳動物への投与のために許容される範囲(およそpH4.0〜10.5)内にあることを保証するために有用な化合物又は化合物の混合物を意味する。好適なかかるpH調整剤には、トリシン、リン酸塩又はTRIS[即ち、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン]のような薬学的に許容される緩衝剤、及び炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム又はこれらの混合物のような薬学的に許容される塩基がある。組成物をキットの形態で使用する場合には、pH調整剤を任意には独立のバイアル又は容器に入れて供給することができ、その結果としてキットのユーザーは多段操作の一部としてpHを調整することができる。
「フィラー」という用語は、製造及び凍結乾燥中における材料の取扱いを容易にすることができる薬学的に許容される増量剤を意味する。好適なフィラーには、塩化ナトリウムのような無機塩、及びスクロース、マルトース、マンニトール又はトレハロースのような水溶性糖又は糖アルコールがある。
第4の態様の放射性医薬組成物は、無菌製造条件下で(即ち、クリーンルーム内で)製造することで、所望の無菌で非発熱性の生成物を得ることができる。基本構成部分、特に関連する試薬並びにイメージング剤に接触する装置部品(例えば、バイアル)は無菌であることが好ましい。かかる構成部分及び試薬は、無菌濾過或いは(例えば、γ線照射、オートクレーブ処理、乾熱又は(例えば、エチレンオキシドによる)化学処理を用いる)終末滅菌をはじめとする、当技術分野で公知の方法によって滅菌できる。一部の構成部分を予め滅菌しておけば、最小数の操作を実施すれば済むので好ましい。しかし、予防策として、医薬組成物の製造における最終段階として少なくとも無菌濾過段階を含めることが好ましい。
本発明の放射性医薬組成物は、以下のような様々な方法によって製造できる。即ち、
(i)18F放射性標識段階をクリーンルーム環境中で実施する無菌製造技法、
(ii)無菌製造を用いずに18F放射性標識を実施した後、最終段階で滅菌[例えば、γ線照射、オートクレーブ処理、乾熱又は(例えば、エチレンオキシドによる)化学処理]を行う終末滅菌方法、
(iii)式IIIの好適な前駆体及び任意の賦形剤を含む無菌の非放射性キット製剤を適当な18F供給物と反応させるキット方法、並びに
(iv)自動化合成装置を用いて18F放射性標識段階を実施する無菌製造技法。
方法(iv)が好ましい。この方法で使用するためのキットは第5の実施形態(下記)に記載される。
(i)18F放射性標識段階をクリーンルーム環境中で実施する無菌製造技法、
(ii)無菌製造を用いずに18F放射性標識を実施した後、最終段階で滅菌[例えば、γ線照射、オートクレーブ処理、乾熱又は(例えば、エチレンオキシドによる)化学処理]を行う終末滅菌方法、
(iii)式IIIの好適な前駆体及び任意の賦形剤を含む無菌の非放射性キット製剤を適当な18F供給物と反応させるキット方法、並びに
(iv)自動化合成装置を用いて18F放射性標識段階を実施する無菌製造技法。
方法(iv)が好ましい。この方法で使用するためのキットは第5の実施形態(下記)に記載される。
「自動化合成装置」という用語は、Satyamurthy et al[Clin.Positr.Imag.,2(5),233−253(1999)]によって記載されているような単位操作の原理に基づく自動化モジュールを意味する。「単位操作」という用語は、複雑なプロセスが一連の簡単な操作又は反応に還元されることを意味し、これは一定範囲の材料に適用できる。かかる自動化合成装置は、特に放射性医薬組成物が所望される場合、本発明の方法にとって好ましい。これらは、GE Healthcare社、CTI Inc、Ion Beam Applications S.A.(Chemin du Cyclotron 3,B−1348 Louvain−La−Neuve,ベルギー)、Raytest社(ドイツ)及びBioscan社(米国)を含む一連の供給業者から商業的に入手できる[Satyamurthy et al,上記]。
市販の自動化合成装置はまた、放射性医薬品製造の結果として生じる液体放射性廃棄物用の適当な容器を提供する。通例、自動化合成装置は放射線遮蔽を備えていないが、それはかかる装置が適宜に構成された放射能作業セル内で使用するように設計されているからである。放射能作業セルは、オペレーターを潜在的な放射線量から保護するために適した放射線遮蔽を与えると共に、化学薬品蒸気及び/又は放射性蒸気を除去するための換気を可能にする。自動化合成装置は、好ましくはカセットを含んでいる。「カセット」という用語は、合成装置の可動部分の機械的運動がカセットの外側から(即ち、外部から)カセットの動作を制御するようにして、(上記に定義したような)自動化合成装置上に着脱自在かつ交換可能に装着し得るように設計された装置部分を意味する。好適なカセットは直線状に並んだ弁の列を含み、その各々は倒立隔壁密封バイアルの針穿刺又は気密連結継手によって試薬又はバイアルを装着することができるポートに連結されている。各弁は、自動化合成装置の対応する可動アームとかみ合う雄雌継手を有している。かくして、カセットを自動化合成装置に装着した場合、アームの外部回転が弁の開閉を制御する。自動化合成装置の追加の可動部分は、注射器のプランジャー先端をつかみ、それによって注射器外筒を上昇又は降下させるように設計されている。
カセットは融通性の高いものであって、通例は試薬を装着することができる複数の位置、及び試薬のシリンジバイアル又はクロマトグラフィー用カートリッジ(例えば、固相抽出又はSPE)を装着するために適した複数のポートを有している。カセットは常に反応器を含んでいる。かかる反応器は好ましくは1〜10cm3、最も好ましくは2〜5cm3の容積を有しており、カセット上の様々なポートからの試薬又は溶媒の移送を可能にするため、カセットの3以上のポートが反応器に連結されるように構成されている。好ましくは、カセットは直線状に並んだ15〜40の弁、最も好ましくは20〜30の弁を有しており、25の弁が特に好ましい。カセットの弁は好ましくはそれぞれ同一であり、最も好ましくは三方弁である。かかるカセットは放射性医薬品製造のために適するように設計されており、したがって医薬品グレードの材料であって理想的には放射線分解にも耐える材料で製造されている。
本発明の好ましい自動化合成装置は、放射性フッ素化放射性医薬品の所定バッチの製造を実施するために必要なすべての試薬、反応器及び機器を含む使い捨て又は1回使用のカセットを含んでいる。かかるカセットは、単にカセットを交換するだけで、自動化合成装置が相互汚染のリスクを最小限に抑えながら各種の放射性医薬品を製造できる融通性を有することを意味する。カセットアプローチはまた、次の利点も有する。即ち、装置構成が単純化されてオペレーターエラーのリスクが低減すること、GMP(医薬品製造品質管理基準)コンプライアンスが向上すること、マルチトレーサーの使用が可能になること、製造作業間の変更が迅速になること、カセット及び試薬の作業前自動診断検査が行えること、実施すべき合成に対して化学試薬の自動バーコードクロスチェックが行えること、試薬が追跡可能であること、1回使用であるために相互汚染、不正改造及び乱用による耐性のリスクがないことがある。
本発明のこの態様には、第2の態様の放射性医薬組成物を製造するための自動化合成装置の使用も包含される。
第5の態様では、本発明は、第4の態様の放射性医薬組成物を製造するためのキットであって、第2の態様の前駆体又は第1の態様で定義されたLBPペプチドを無菌固体形態で含んでいる結果、適当な化学形態の無菌18F供給物で再構成すれば溶解が起こって所望の放射性医薬組成物を与えるキットを提供する。
「適当な化学形態」という用語は、第3の態様(上記)で定義した通りである。
第5の態様における前駆体の好ましい態様は、本発明の第2の態様(上記)に記載した通りである。
「キット」という用語は、所望の放射性医薬組成物を製造するために必要な化学薬品を使用説明書と共に含んでなる1以上の非放射性医薬品グレード容器を意味する。キットは、18Fで再構成することで、最小限の操作でヒトへの投与に適した溶液を与えるように設計されている。
無菌固体形態は、好ましくは凍結乾燥固体である。
非放射性キットはさらに、上記に記載したようなトランスキレーター、放射線防護剤、抗菌防腐剤、pH調整剤又はフィラーのような追加成分を任意に含むことができる。
本発明のこの態様には、第5の態様のキットを含むカセットを自動化合成装置と共に使用して第2の態様の放射性医薬組成物を製造するためのカセットの使用も包含される。
第6の態様では、本発明は、ヒト又は動物の身体をイメージングする方法であって、当該方法はPETを用いて第1の態様のイメージング剤又は第4の態様の組成物が分布した前記身体の少なくとも一部の画像を生成する段階を含み、前記イメージング剤又は前記組成物は前記身体に予め投与されている方法を提供する。
第6の態様におけるイメージング剤又は組成物の好ましい態様は、本発明のそれぞれ第1及び第4の態様(上記)に記載した通りである。第6の態様の方法は、好ましくは、身体の一部が異常なアポトーシスが関与している疾患状態である場合に実施される。「異常なアポトーシス」という用語は、プログラム細胞死過程のディスレギュレーションを意味する。かかるディスレギュレーションは、癌及び自己免疫障害のようなアポトーシスの阻害に関連するもの、並びに神経変性疾患、血液学的疾患、AIDS、虚血症及び同種移植片拒絶のような過活性アポトーシスに関連するものを含む、多数の疾患状態に関係づけられている。
また、アポトーシスがアテローム性動脈硬化病変の不安定性の一因であるという新たな証拠も出現している。破裂しやすいプラークは、通例大きい壊死コア及び薄くなった繊維質キャップを有していて、後者はマクロファージ及びリンパ球の著しい浸潤を受ける。進行病変内での細胞死の結果は明確には決定されていないが、形態学的データは、マクロファージのアポトーシスが壊死コアのサイズに大きく寄与する一方、平滑筋細胞(SMS)のアポトーシスが繊維質キャップの薄化をもたらすことを示唆している。マクロファージの顕著なアポトーシスはプラーク破裂の部位で起こると考えられ、恐らくは破裂過程の一因である。したがって、アポトーシスの検出は破裂しやすいアテローム性動脈硬化病変を確認するための助けとなろう。
したがって、アポトーシスの可視化及び定量化は、かかるアポトーシス関連病態生理学の診断において有用である。
第6の態様のイメージング方法は、任意には、薬物によるヒト又は動物の身体の治療効果をモニターするために繰り返して実施できる。この場合、前記イメージングは前記薬物による治療前及び治療後に実施され、任意には前記薬物による治療中にも実施される。これらの疾患に関する治療学的処置は、場合に応じてPCD過程を促進又は抑制することにより、バランスの取れたアポトーシスを回復することを目指している。特に興味深いのは、癌療法の効力の早期モニタリングにより、状態が末期になる前に悪性増殖を確実に制御することである。
第7の態様では、本発明は、ヒト又は動物の身体の診断方法における、第1の態様のイメージング剤、第4の態様の組成物又は第5の態様のキットの使用を提供する。
第7の態様におけるイメージング剤又は組成物の好ましい態様は、本発明のそれぞれ第1及び第4の態様(上記)に記載した通りである。第7の態様の使用は、好ましくはヒト又は動物の身体の診断が、異常なアポトーシスが関与している疾患状態の診断である場合のものである。かかる「異常なアポトーシス」は、第6の態様(上記)に記載した通りである。
下記に詳述する非限定的な実施例によって本発明を例示する。実施例1及び実施例2はそれぞれ、2種の異なるアミノ保護基で保護された本発明のアミノオキシ官能化LBPペプチドである前駆体1A及び前駆体1Bの合成法を示している。実施例3は、本発明のアミノオキシ官能化LBPペプチドである前駆体2の合成法を示している。実施例4は、フッ素同位体が19Fである本発明の非放射性フッ素化化合物である化合物1の合成法を示している。化合物1は、18F対応物(化合物1A)の生物学的結合性を決定するために有用である。実施例5は、18F−ベンズアルデヒドを用いて前駆体1を18F標識して本発明の18F標識化合物(化合物1A)を得る方法を示している。実施例6はホスファチジルエタノールアミンに対する結合親和性データを示し、化合物1の生成が結合親和性に対して顕著な効果を有しないことを証明している。化合物1Aは、EL4マウスリンパ腫異種移植片モデルにおける体内分布によって評価した。この試験からの結果は実施例7に示されている。
略語
通常の一文字又は三文字アミノ酸略語が使用される。
Ac: アセチル
ACN: アセトニトリル
Boc: tert−ブチルオキシカルボニル
DIPEA: N,N−ジイソプロピルエチルアミン
DMSO: ジメチルスルホキシド
EOS: 合成終了時
Fmoc: 9−フルオレニルメトキシカルボニル
HATU: O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’
−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
HPLC: 高速液体クロマトグラフィー
NMP: 1−メチル−2−ピロリジノン
PBS: リン酸緩衝食塩水
PyBOP: ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘ
キサフルオロホスフェート
RAC: 放射能濃度
RCP: 放射化学純度
tBu: tert−ブチル
TFA トリフルオロ酢酸
TFP: テトラフルオロフェニル
TR: 保持時間
通常の一文字又は三文字アミノ酸略語が使用される。
Ac: アセチル
ACN: アセトニトリル
Boc: tert−ブチルオキシカルボニル
DIPEA: N,N−ジイソプロピルエチルアミン
DMSO: ジメチルスルホキシド
EOS: 合成終了時
Fmoc: 9−フルオレニルメトキシカルボニル
HATU: O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’
−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
HPLC: 高速液体クロマトグラフィー
NMP: 1−メチル−2−ピロリジノン
PBS: リン酸緩衝食塩水
PyBOP: ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘ
キサフルオロホスフェート
RAC: 放射能濃度
RCP: 放射化学純度
tBu: tert−ブチル
TFA トリフルオロ酢酸
TFP: テトラフルオロフェニル
TR: 保持時間
実施例1:(Boc−アミノオキシ)アセチル−ジュラマイシン(前駆体1A)の合成
分取HPLC(以下の条件、即ち溶媒A=H2O/0.1%TFA及び溶媒B=ACN/0.1%TFA、勾配:40分で20〜50%B、流量:10mL/分、カラム:Phenomenex Luna 5μm C18(2)250×21.2mm、検出:UV214nmを用いるBeckman System Goldクロマトグラフィーシステム)によって精製することで、3.8mgの純粋な前駆体1A(収率44%)を得た。精製物質を分析LC−MSによって分析した(勾配:5分で20〜70%B、tR:1.93分、実測m/z:1093.7、予測MH2 2+:1093.5)。
前駆体1の位置異性体の分離は、上記の分析又は分取HPLC条件下で達成することはできなかった。各々の場合において、2種の位置異性体は単一のピークてして溶出した。
しかし、前駆体1Aの位置異性体の分離は、一層穏やかな溶出条件(即ち、勾配:5分で25〜35%)下での分析HPLCによって達成できる。LC−MSは、tR:2.0分、実測m/z:1093.7及びtR:2.3分、実測m/z:1093.7、予測MH2 2+:1093.5である。同様な条件は、分取HPLCによって各位置異性体を単離するためにも使用できる。
実施例2:(Eei−アミノオキシ)アセチル−ジュラマイシン(前駆体1B)の合成
分取HPLC(溶媒A=H2O/0.1%TFA及び溶媒B=ACNを用いて、勾配:40分で14〜45%Bとした点を除き、実施例1と同様)によって精製することで、14mgの純粋な前駆体1B(収率26%)を得た。精製物質をLC−MSによって分析した(勾配:5分で20〜50%B、tR:2.5分及び2.7分、実測m/z:1078.8、予測MH2 2+:1078.5)。
(Eei−アミノオキシ)アセチル−ジュラマイシンの位置異性体のクロマトグラフィー分割は、0.1%TFAを用いる分析HPLCによって達成できた。しかし、Eei保護基は0.1%TFA中で不安定であるので、分取分離は実行できなかった。位置異性体は、0.1%酢酸を用いては分割されなかった。
実施例3:アミノオキシアセチル−ジュラマイシン(前駆体2)の合成
前駆体2の位置異性体のクロマトグラフィー分割は、0.1%TFAを用いる分析HPLCによって達成できた。しかし、遊離アミノオキシ基が溶媒及び雰囲気中の微量のケトン及びアルデヒドに対して高い反応性を有するため、この段階で位置異性体を分離する試みは行わなかった。
実施例4:N−(4−フルオロベンジリデン)−アミノオキシアセチル−ジュラマイシン(化合物1)の合成
分取HPLC(勾配:40分で20〜50%Bとした点を除き、実施例1と同様)によって精製することで、0.6mgの純粋な化合物1(収率60%)を得た。精製物質を分析LC−MSによって分析した(勾配:5分で20〜70%B、tR:2.09分、実測m/z:1096.5、予測MH2 2+:1096.5)。化合物1の位置異性体の分離は、分析又は分取HPLCを用いて達成することはできなかった。各々の場合において、2種の位置異性体は単一のピークてして溶出した。
実施例5:前駆体2からの化合物1Aの放射合成
化合物1Aは、自動化合成装置及びカセット(FASTlab(商標)、GE Healthcare社)を用いる2段階操作で製造される。
化合物1Aは、自動化合成装置及びカセット(FASTlab(商標)、GE Healthcare社)を用いる2段階操作で製造される。
段階(a): 18 F−ベンズアルデヒドの合成及び精製
銀ターゲットを有するGEMS PETトレースサイクロトロンを用いて、[18F]フッ化物イオンを[18O](p,n)[18F]核反応により生成した。1.5〜3.5mLの総ターゲット体積を使用した。放射性フッ化物イオンを(炭酸塩でプレコンディショニングした)Waters QMAカートリッジ上に捕捉し、水(80μL)及びアセトニトリル(320μL)中のKryptofix2.2.2(4mg、10.7μM)及び炭酸カリウム(0.56mg、4.1μM)の溶液でフッ化物イオンを溶出した。窒素を用いて溶液をQMAカートリッジから反応器に排出した。窒素の定常流及び真空下において、[18F]フッ化物イオンを120℃で9分間乾燥した。ジメチルスルホキシド(1.1mL)中のトリメチルアンモニウムベンズアルデヒドトリフレート[Haka et al,J.Lab.Comp.Radiopharm.,27,823−833(1989)](3.3mg、10.5μM)を乾燥した[18F]フッ化物イオンに添加し、混合物を105℃で7分間加熱して4−[18F]フルオロベンズアルデヒドを生成した。
銀ターゲットを有するGEMS PETトレースサイクロトロンを用いて、[18F]フッ化物イオンを[18O](p,n)[18F]核反応により生成した。1.5〜3.5mLの総ターゲット体積を使用した。放射性フッ化物イオンを(炭酸塩でプレコンディショニングした)Waters QMAカートリッジ上に捕捉し、水(80μL)及びアセトニトリル(320μL)中のKryptofix2.2.2(4mg、10.7μM)及び炭酸カリウム(0.56mg、4.1μM)の溶液でフッ化物イオンを溶出した。窒素を用いて溶液をQMAカートリッジから反応器に排出した。窒素の定常流及び真空下において、[18F]フッ化物イオンを120℃で9分間乾燥した。ジメチルスルホキシド(1.1mL)中のトリメチルアンモニウムベンズアルデヒドトリフレート[Haka et al,J.Lab.Comp.Radiopharm.,27,823−833(1989)](3.3mg、10.5μM)を乾燥した[18F]フッ化物イオンに添加し、混合物を105℃で7分間加熱して4−[18F]フルオロベンズアルデヒドを生成した。
次いで、粗標識混合物を水酸化アンモニウム溶液で希釈し、(FASTlabシーケンスの一部として水でプレコンディショニングした)MCX+ SPEカートリッジ上に装填した。カートリッジを水で洗浄し、窒素ガスで乾燥した後、4−[18F]フルオロベンズアルデヒドをエタノール(1mL)で反応器に戻し溶出した。4〜7%(崩壊補正値)の[18F]フルオロベンズアルデヒドがカートリッジ上に捕捉されたままに残った。
段階(b):アミノオキシ誘導体(前駆体2)とのアルデヒド縮合
前駆体2(5mg)をFASTlab反応器に移した後、4−[18F]フルオロベンズアルデヒドをMCX+カートリッジから溶出した。次いで、混合物を60℃で5分間加熱した。次いで、粗反応材料を水で希釈し、tC2 SPEカートリッジ上に装填した。次いで、これを窒素及び真空で乾燥し、エタノール溶液で洗浄し、再び乾燥した。次いで、化合物1Aをエタノール、続いて水(全部で6mL)で収集バイアル中に溶出した。EOS収率は16〜34%(非崩壊補正値)であった。分析HPLCにより、化合物1Aは97%のRCPで製造され、少なくとも180分間にわたって安定である(RCP 94%、RAC 150MBq/mL)ことが確認された。
前駆体2(5mg)をFASTlab反応器に移した後、4−[18F]フルオロベンズアルデヒドをMCX+カートリッジから溶出した。次いで、混合物を60℃で5分間加熱した。次いで、粗反応材料を水で希釈し、tC2 SPEカートリッジ上に装填した。次いで、これを窒素及び真空で乾燥し、エタノール溶液で洗浄し、再び乾燥した。次いで、化合物1Aをエタノール、続いて水(全部で6mL)で収集バイアル中に溶出した。EOS収率は16〜34%(非崩壊補正値)であった。分析HPLCにより、化合物1Aは97%のRCPで製造され、少なくとも180分間にわたって安定である(RCP 94%、RAC 150MBq/mL)ことが確認された。
HPLC条件
カラム:Phenomenex,Jupiter 4u,Proteo 90A,250× 4.6mm。
勾配:0分 50%B
5分 50%B
20分 90%B
25分 90%B
流量:1mL/分。
UV検出:254nm。
移動相A:50mM酢酸アンモニウム。
移動相B:メタノール。
化合物1A(TR)=22.6分。
カラム:Phenomenex,Jupiter 4u,Proteo 90A,250× 4.6mm。
勾配:0分 50%B
5分 50%B
20分 90%B
25分 90%B
流量:1mL/分。
UV検出:254nm。
移動相A:50mM酢酸アンモニウム。
移動相B:メタノール。
化合物1A(TR)=22.6分。
実施例6:ホスファチジルエタノールアミンに対する親和性
Biacore 3000(GE Healthcare社、ウプサラ))にL1チップを取り付けた。POPE/POPC(20%PE)から作製したリポソームを、製造者によって推奨される捕獲技法を用いた親和性試験のために適用した。各ランは、チップ表面の活性化、リポソームの固定化、ペプチドの結合、並びにリポソーム及びペプチドの洗浄除去(再生)からなっていた。同様な適用例は、Frostell−Karlsson et al[Pharm.Sciences,V.94(1),(2005)])に見出すことができる。各サイクル後には、流れる緩衝液による針、チューブ及び液体取扱いシステムの完全な洗浄を実施した。
Biacore 3000(GE Healthcare社、ウプサラ))にL1チップを取り付けた。POPE/POPC(20%PE)から作製したリポソームを、製造者によって推奨される捕獲技法を用いた親和性試験のために適用した。各ランは、チップ表面の活性化、リポソームの固定化、ペプチドの結合、並びにリポソーム及びペプチドの洗浄除去(再生)からなっていた。同様な適用例は、Frostell−Karlsson et al[Pharm.Sciences,V.94(1),(2005)])に見出すことができる。各サイクル後には、流れる緩衝液による針、チューブ及び液体取扱いシステムの完全な洗浄を実施した。
BIACOREソフトウェア:すべての方法指示を含むBIACORE制御ソフトウェアを適用した。予めプログラムされた指示に対する完全な制御を得るため、コマンド付きの方法がBIACORE Method Definition Language(MDL)でも書かれていた。センサーグラムを分析するためには、BIACORE評価ソフトウェアを適用した。
化合物1は、ホスファチジルエタノールアミンに対する良好な結合剤であることが判明した。ジュラマイシン及び化合物1に関するKDは、共に100nM未満であった。結果を下記表2に示す。
実施例7:腫瘍取込み試験
化合物1Aを、EL4マウスリンパ腫異種移植片モデルにおける体内分布によって評価した。簡単に述べれば、C57/B16マウスにおける腫瘍増殖の確立後、動物を
(i)食塩水/DMSO溶液、又は
(ii)化学療法剤(50%食塩水/50%DMSO中の67mg/kgエトポシド及び100mg/kgシクロホスファミド)
で処置した。
化合物1Aを、EL4マウスリンパ腫異種移植片モデルにおける体内分布によって評価した。簡単に述べれば、C57/B16マウスにおける腫瘍増殖の確立後、動物を
(i)食塩水/DMSO溶液、又は
(ii)化学療法剤(50%食塩水/50%DMSO中の67mg/kgエトポシド及び100mg/kgシクロホスファミド)
で処置した。
療法剤又はビヒクルでの処置から24時間後、動物を化合物1Aの体内分布に関して評価した。加えて、腫瘍を摘出し、カスパーゼ活性の測定(カスパーゼ−Gloアッセイ)によってアポトーシスのレベルを評価した。化合物1Aの腫瘍保持の増加が認められたが、これにはアポトーシスの増加が伴っていた。
Claims (16)
- 次の式Iの化合物を含んでなるイメージング剤。
Z1−(L)n−[LBP]−Z2
(I)
(式中、
LBPは次の式IIのランチビオチックペプチドであり、
Cysa−Xaa−Gln−Serb−Cysc−Serd−Phe−Gly−Pro−Phe−Thrc−Phe−Val−Cysb−(HO−Asp)−Gly−Asn−Thra−Lysd
(II)
(式中、
XaaはArg又はLysであり、
Cysa−Thra、Serb−Cysb及びCysc−Thrcはチオエーテル結合を介して共有結合しており、
Serd−Lysdはリシノアラニン結合を介して共有結合しており、
HO−Aspはβ−ヒドロキシアスパラギン酸である。)
Z1−(L)n−はLBPのCysa及び任意にはXaaにも結合しており、ここでZ1は18F又は金属錯体の金属に配位した18Fであり、
Z2はLBPのC末端に結合していて、OH又はOBc(式中、Bcは生体適合性陽イオンである。)であり、
Lは式−(A)m−(式中、各Aは独立に−CR2−、−CR=CR−、−C≡C−、−CR2CO2−、−CO2CR2−、−NRCO−、−CONR−、−CR=N−O−、−NR(C=O)NR−、−NR(C=S)NR−、−SO2NR−、−NRSO2−、−CR2OCR2−、−CR2SCR2−、−CR2NRCR2−、C4-8シクロヘテロアルキレン基、C4-8シクロアルキレン基、−Ar−、−NR−Ar−、−O−Ar−、−Ar−(CO)−、アミノ酸、糖又は単分散ポリエチレングリコール(PEG)構成単位であり、ここで各Arは独立にC5-12アリーレン基又はC3-12ヘテロアリーレン基であり、各Rは独立にH、C1-4アルキル、C2-4アルケニル、C2-4アルキニル、C1-4アルコキシアルキル及びC1-4ヒドロキシアルキルから選択され、mは1〜20の値を有する整数である。)の合成リンカー基であり、
nは0又は1の値を有する整数である。) - Z1がLBPのCysaのみに結合している、請求項1記載のイメージング剤。
- XaaがArgである、請求項1又は請求項2記載のイメージング剤。
- Z1−(L)n−が次の式Xの基を含む、請求項1乃至請求項3のいずれか1項記載のイメージング剤。
18F−X1−(A)x− (X)
(式中、
xは0〜5の値を有する整数であり、
X1は−Ar−、−Ar−NR−、−Ar−O−、−Ar−(CO)−及び−Si(Ra)2−から選択され、
A、Ar及びRは請求項1でL基について定義した通りであり、
各Raは独立にC1-9アルキルである。) - X1がフェニル環或いはトリアゾール、イソキサゾール及びピリジン環から選択される複素環を含む、請求項1記載のイメージング剤。
- Z1がアミノカルボキシレートリガンドのアルミニウム錯体を含み、18F放射性ラベルが前記錯体の前記アルミニウムに配位している、請求項1乃至請求項3のいずれか1項記載のイメージング剤。
- 次の式IIIの前駆体。
Z3−(L)n−[LBP]−Z2
(III)
(式中、
L、n、LBP及びZ2は請求項1乃至請求項3のいずれか1項で定義した通りであり、
Z3は
(i)アミノオキシ基、
(ii)アジド基、
(iii)アルキン基、
(iv)ニトリルオキシド、及び
(v)アミノカルボキシレートリガンドのアルミニウム、インジウム又はガリウム金属錯体
から選択される官能基である。) - 請求項1乃至請求項6のいずれか1項記載のイメージング剤の製造方法であって、請求項7記載の前駆体又は請求項1乃至請求項3のいずれか1項で定義されたLBPペプチドを適当な溶媒中で適当な化学形態の18F供給物と反応させることを含んでなる方法。
- 請求項1乃至請求項6のいずれか1項記載のイメージング剤を、哺乳動物への投与に適した形態で生体適合性キャリヤーと共に含んでなる放射性医薬組成物。
- 請求項9記載の放射性医薬組成物を製造するためのキットであって、請求項7記載の前駆体又は請求項1乃至請求項3のいずれか1項で定義されたLBPペプチドを無菌固体形態で含んでいる結果、請求項8で定義された適当な化学形態の無菌18F供給物で再構成すれば溶解が起こって所望の放射性医薬組成物を与える、キット。
- 無菌固体形態が凍結乾燥固体である、請求項10記載のキット。
- ヒト又は動物の身体をイメージングする方法であって、当該方法はPETを用いて請求項1乃至請求項6のいずれか1項記載のイメージング剤又は請求項9記載の組成物が分布した前記身体の少なくとも一部の画像を生成する段階を含み、前記イメージング剤又は前記組成物は前記身体に予め投与されている、方法。
- 前記身体の一部が、異常なアポトーシスが関与している疾患状態である、請求項12記載の方法。
- 薬物によるヒト又は動物の身体の治療効果をモニターするために繰り返して実施される、請求項12又は請求項13記載の方法であって、前記イメージングは前記薬物による治療前及び治療後に実施され、任意には前記薬物による治療中にも実施される、方法。
- ヒト又は動物の身体の診断方法における、請求項1乃至請求項6のいずれか1項記載のイメージング剤、請求項9記載の組成物又は請求項10記載のキットの使用。
- 診断が、異常なアポトーシス又は他の形態の細胞死が関与している疾患状態の診断である、請求項15記載の使用。
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