CN103228298A - 凋亡pet成像剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及凋亡和其它形式的细胞死亡的放射性药物的体内成像。本发明提供经由与在凋亡细胞的表面上暴露的氨基磷脂磷脂酰乙醇胺(PE)选择性结合靶向凋亡细胞的PET成像剂。还提供了药物组合物、试剂盒和体内成像的方法。

Description

凋亡PET成像剂
发明领域
本发明涉及凋亡和其它形式的细胞死亡的放射性药物体内成像。本发明提供经由与在凋亡细胞的表面上暴露的氨基磷脂磷脂酰乙醇胺(PE)选择性结合，靶向凋亡细胞的PET成像剂。还提供了药物组合物、试剂盒和体内成像的方法。
发明背景
凋亡或程序性细胞死亡(PCD)为最普遍的细胞死亡路径，并且经由高度调节的、能量守恒的机制进行。在健康状态下，凋亡在控制细胞生长、调节细胞数量、促进形态发生和除去有害或异常细胞中起关键作用。PCD过程的失调牵涉多种疾病状态，包括与抑制凋亡相关的那些，例如癌症和自身免疫病症，以及与凋亡活动过强相关的那些，包括神经变性疾病、血液疾病、AIDS，局部缺血和同种异体移植排斥。因此，凋亡的显影和定量可用于诊断这样的与凋亡相关的病理生理学。
对于这些疾病治疗性处理目的是通过适当地刺激或抑制PCD过程来恢复平衡的凋亡。因此，在细胞和组织中，凋亡的体内非侵入性成像对于治疗性介入响应的早期评价具有巨大价值，并且对于破坏性病理过程可提供新的深刻了解。特别感兴趣的是早期监测癌症治疗的功效，以确保在病况变为晚期之前控制恶性生长。
因此特别感兴趣开发用于凋亡的成像剂[参见例如Zeng等人，Anti-cancer Agent Med.Chem.，9(9)，986-995 (2009)；Zhao，ibid，9(9)，1018-1023 (2009)和M. De Saint-Hubert等人，Methods，48，178-187 (2009)]。在可用于对细胞死亡成像的探针中，放射性标记的膜联蛋白V最受关注。膜联蛋白V仅与带负电荷的磷脂结合，这使其不能区分凋亡与坏死。
含有羊毛硫氨酸的抗生素肽(“羊毛硫抗生素”)耐久霉素和肉桂霉素为两种具有紧凑四环结构的密切相关的19-聚体肽[Zhao，Amino Acids，DOI 10.1007/s00726-009-0386-9，Springer-Verlag (2009)，以及其中引用的参考文献]。它们经由四个共价、分子内桥交联，并且区别仅在于在2位的单一氨基酸残基。耐久霉素和肉桂霉素的结构在以下示意性显示，其中编号是指在19-聚体序列中连接的氨基酸残基的位置：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
耐久霉素X2 = Lys，
肉桂霉素X2 = Arg。
程序性细胞死亡或凋亡为细胞的胞内、能量-依赖性自身毁灭。磷脂跨过细胞质膜的双层的再分布是凋亡的重要标志。因此，在活细胞中，氨基磷脂磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰丝氨酸(PS)为细胞质膜的内部小叶的主要组分。在凋亡的细胞中，存在PE和PS的同步表面化。
通过形成在PE头部基团周围相适应的疏水性袋，耐久霉素和肉桂霉素二者均以类似的特异性和高亲和力与中性氨基磷脂PE结合。通过β-羟基天冬氨酸残基(HO-Asp15)与乙醇胺基之间的离子相互作用，使结合稳定。已知对该残基的修饰使耐久霉素失活[Zhao等人，J.Nucl.Med，49，1345-1352 (2008)]。Zhao [Amino Acids，DOI 10.1007/s00726-009-0386-9，Springer-Verlag (2009)]引用Wakamatsu等人[Biochemistry，29，113-188 (1990)]的早期研究，其中NMR研究显示，在与PE结合时，肉桂霉素的5个末端氨基酸的1H NMR共振无一偏移，这表明它们不涉及与PE的相互作用。
US 2004/0147440 A1 (University of Texas System)描述了标记的抗-氨基磷脂抗体，其可用于检测预先-凋亡的或凋亡的细胞，或者用于癌症成像。还提供了耐久霉素与用于癌症治疗的生物素、蛋白质或抗病毒药物的缀合物。
WO 2006/055855公开了使用放射性标记的化合物对凋亡成像的方法，所述放射性标记的化合物包含蛋白质的磷脂酰丝氨酸-结合C2结构域。
WO 2009/114549公开了通过以下方法制备的放射性药物，所述方法包括：
(i) 提供与CKQSCSFGPFTFVCDGNTK具有至少70%序列相似性的多肽，
其中多肽在氨基酸残基1-18、4-14和5-11之间包含硫醚键以及在氨基酸残基6-19之间包含酰胺键，并且其中一个或多个具有以下结构的末端部分
Figure 37792DEST_PATH_IMAGE002
在多肽的1位、2位或者1位和2位处与氨基酸共价结合，并且其中R1和R2各自独立地为直链或支链、饱和或不饱和的C1-4烷基；和
(ii) 将一个或多个末端部分与99mTcx、(99mTc=O)3+、(99mTc≡N)2+、(O=99mTc=O)+或[99mTc(CO)3]+或其盐、溶剂合物或水合物螯合，其中x为选自+7、+6、+5、+4、+3、+2、+1、0和-1的氧化还原或氧化态。
WO 2009/114549的‘末端部分’为放射性同位素99mTc的络合剂，其基于肼基烟酰胺(通常简称为“HYNIC”)。HYNIC在文献[参见例如Banerjee等人，Nucl.Med.Biol，32，1-20 (2005)]中众所周知，并且为使用99mTc标记肽和蛋白质的优选方法[R.Alberto，第2章，第19-40页，IAEA Radioisotopes and Radiopharmaceuticals Series 1: “Technetium-99m Radiopharmaceuticals Status and Trends (IAEA放射性同位素和放射性药物系列1：“锝-99m放射性药物状况和趋势)”(2009)]。
WO 2009/114549特别公开了99mTc-HYNIC-耐久霉素，并且提出其中教导的放射性药物可用于对凋亡和/或坏死、动脉粥样硬化斑或急性心肌梗死成像。
Zhao等人[J.Nucl.Med，49，1345-1352 (2008)]公开了99mTc-HYNIC-耐久霉素的制备。Zhao等人注意到耐久霉素具有2个可用于与HYNIC缀合的胺基：在N-末端(Cys1残基)和Lys2残基的ε-胺侧链。它们通过HPLC纯化HYNIC-耐久霉素缀合物，以除去双-HYNIC-官能化的耐久霉素，然后用99mTc进行放射性标记。Zhao等人承认研究的99mTc-标记的单-HYNIC-耐久霉素缀合物可能是异构体的混合物形式。
虽然HYNIC形成稳定的99mTc络合物，但是其需要另外的共同-配体以完成锝金属络合物的配位层。HYNIC可用作单齿配体或二齿螯合剂，这取决于在附近的氨基酸侧链官能团的性质[King等人，Dalton Trans.，4998-5007 (2007)；Meszaros等人[Inorg.Chim.Acta，363，1059-1069 (2010)]。因此，取决于环境，HYNIC形成具有1个或2个金属供体原子的金属络合物。Meszaros等人注意到与HYNIC一起使用的共同-配体的性质可对系统的行为具有显著作用，并且陈述没有一个共同-配体是理想的。
发明内容
本发明提供放射性药物成像剂，特别是用于对其中涉及异常凋亡的哺乳动物身体的疾病状态成像。所述成像剂包含18F-放射性标记的羊毛硫抗菌肽。
本发明提供放射性示踪剂，其以高放射化学纯度(RCP)可再现地形成。本发明人还已证实在本文式II的羊毛硫抗菌肽的N-末端(Cysa残基)处连接放射性标记的络合物是强烈优选的，这是由于在甚至与N-末端(式II的Xaa)相邻的氨基酸处连接对于与磷脂酰乙醇胺结合具有有害作用。该作用先前在现有技术中未认识到，因此，认为对结合亲和力的影响程度是新的。
本发明18F-标记的成像剂适用于PET (正电子发射断层扫描)，其与现有技术的成像剂相比具有更容易的图像定量的优点。
发明详述
在第一方面，本发明提供了包含式I化合物的成像剂：
Z1-(L)n-[LBP]-Z2
(I)
其中：
LBP为式II的羊毛硫抗菌肽：
Cysa-Xaa-Gln-Serb-Cysc-Serd-Phe-Gly-Pro-Phe-Thrc-Phe-Val-Cysb-(HO-Asp)-Gly-Asn-Thra-Lysd
(II)
Xaa为Arg或Lys；
Cysa-Thra、Serb-Cysb和Cysc-Thrc经由硫醚键共价连接；
Serd-Lysd经由赖氨酸丙氨酸键共价连接；
HO-Asp为β-羟基天冬氨酸；
Z1-(L)n-与Cysa连接并且当Xaa为Lys时还任选与LBP的Xaa连接，其中Z1为18F或与金属络合物的金属配位的18F；
Z2与LBP的C-末端连接，并且为OH或OBc，
其中Bc为生物相容的阳离子；
L为式-(A)m-的合成的接头基团，其中每个A独立地为-CR2-、-CR=CR-、-C≡C-、-CR2CO2-、-CO2CR2-、-NRCO-、-CONR-、-CR=N-O-、-NR(C=O)NR-、-NR(C=S)NR-、-SO2NR-、-NRSO2-、-CR2OCR2-、-CR2SCR2-、-CR2NRCR2-、C4-8环杂亚烷基、C4-8环亚烷基、-Ar-、-NR-Ar-、-O-Ar-、-Ar-(CO)-、氨基酸、糖或单分散聚乙二醇(PEG)结构单元，其中每个Ar独立地为C5-12亚芳基或C3-12杂亚芳基，并且其中每个R独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基烷基或C1-4羟基烷基；
m为数值1-20的整数；
n为数值0或1的整数。
本发明成像剂为18F-标记的羊毛硫抗菌肽。术语“18F-放射性标记的”或“18F-标记的”意指羊毛硫抗菌肽已经在其中共价缀合了放射性同位素18F。18F经由C-F氟烷基或氟芳基键合适地连接，这是由于这些键在体内相对稳定，因此赋予对18F放射性标记从肽代谢裂解的抗性。
术语“成像剂”意指适用于对哺乳动物身体成像的化合物。优选，哺乳动物为体内完整的哺乳动物身体，并且更优选为人受试者。优选，可将成像剂以最小侵入性方式给予哺乳动物身体，即，当在专业医疗专家下进行时，对哺乳动物受试者不会有显著健康风险。这样的最小侵入性给药优选向所述受试者的外周静脉静脉内给药，无需局部或全身麻醉。第一方面的成像剂特别适用于对凋亡和其它形式的细胞死亡成像，如在(下文)第六方面中所描述。
本文使用的术语“体内成像”意指非侵入性产生哺乳动物受试者的全部或部分内部状况(internal aspect)的图像的那些技术。本发明优选的成像技术为正电子发射断层扫描(PET)。
术语“金属络合物”意指非放射性金属的配位络合物。优选的这样的络合物包含螯合剂。合适的本发明非放射性金属包括铝、镓或铟。
术语“氨基酸”意指L-或D-氨基酸、氨基酸类似物(例如，萘基丙氨酸)或氨基酸模拟物，其可为天然存在的或纯粹合成起源，并且可为光学纯的，即，单一的对映异构体，因此为手性的，或者为对映异构体的混合物。本文中使用氨基酸的常规3-字母或单一字母缩写。优选本发明的氨基酸为光学纯的。
术语“单分散的聚乙二醇(PEG)结构单元”意指式IA或IB的PEG生物修饰剂：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
式IA的17-氨基-5-氧代-6-氮杂-3,9,12,15-四氧杂十七烷酸
其中q为1-15的整数并且p为1-10的整数。或者，可使用基于式IB的丙酸衍生物的PEG-样结构：
(IB)
其中p和q如对于式IA所定义，并且
在式IB中，p优选为1或2，并且q优选为1-12。
术语“肽”意指包含两个或更多个通过肽键(即，连接一个氨基酸的胺与另一个氨基酸的羧基的酰胺键)连接的如上定义的氨基酸的化合物。
术语“羊毛硫抗菌肽”是指含有至少一个羊毛硫氨酸键的肽。“羊毛硫氨酸”具有其常规的含义，并且是指具有所示化学结构的胱氨酸的硫化物类似物：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
术语“经由硫醚键共价连接”意指相关的Cys残基的硫醇官能团与所示的Ser或Thr残基经由Ser或Thr残基的羟基官能团脱水作为硫醚键连接，以得到羊毛硫氨酸或甲基羊毛硫氨酸键。这样的键由Willey等人[Ann.Rev.Microbiol.，61，477-501 (2007)]描述。
术语“赖氨酸丙氨酸键”意指Lys残基的ε胺基与所示的Ser残基经由Ser的羟基官能团脱水作为胺键连接，得到连接氨基酸残基的两个α-碳原子的-(CH2)-NH-(CH2)4-键。
当Z1与Cysa连接时，其与LBP肽的N-末端连接。当Z1也与Xaa连接时，这意味着Xaa为Lys，并且Z1与Lys残基的ε氨基连接。
Z2基团取代LBP的最后的氨基酸残基的羰基，即，羧基末端。因此，当Z2为OH时，LBP的羧基末端终止于最后的氨基酸残基的游离CO2H基团，并且当Z2为OBc时，该末端羧基作为CO2Bc基团电离。
术语“生物相容的阳离子”(Bc)意指与电离的、带负电荷的基团形成盐的带正电荷的反荷离子，其中所述带正电荷的反荷离子也是无毒的，因此适于给予哺乳动物身体，特别是人体。合适的生物相容的阳离子的实例包括：碱金属钠或钾、碱土金属钙和镁以及铵离子。优选的生物相容的阳离子为钠和钾，最优选钠。
优选的实施方案
在第一方面的成像剂中，Z1优选仅与LBP的Cysa连接。当Xaa为Arg时，这意味着在Cysa残基的游离氨基处，Z1与LBP的N-末端连接。当Xaa为Lys时，这意味着采取步骤以：
(i) 优先于Xaa残基的ε胺基，在Cysa残基处选择性官能化LBP肽；或者
(ii) 制备包含在Cysa或Xaa处被Z1官能化的LBP的组合物，随后将Xaa-官能化的物类除去。
在第一方面的成像剂中，Xaa优选为Arg。Z2优选为OH或OBc。
在式I中，n优选为1，即，存在接头基团(L)。当Z1为18F时，优选的放射性氟化的取代基18F-(L)n-具有式X，其中选择-(L)n-为-X1-(A)x-：
18F–X1-(A)x- (X)
其中：x为数值0-5的整数；
X1选自-Ar-、-Ar-NR-、-Ar-O-、–Ar-(CO)-或–Si(Ra)2-；
其中A、Ar和R如(上文)对于L基团所定义，并且每个Ra独立地为C1-9烷基。
Ar1的Ar基团优选为C1-6芳基，其中18F放射标记与所述芳基共价键合。Ar1优选包含苯环或选自三唑、异噁唑或吡啶环的杂环。
当X1为-Si(Ra)2-时，Ra可为直链或支链或其组合。Ra优选为支链的，并且优选为-C(CH3)3。更优选，两个Ra基团均为-C(CH3)3。
在一个实施方案中，最优选的式X取代基由用氟化的活性酯对LBP中Cys残基的Nα-氨基或Lys的Nε-氨基的N-酰化，或Cys或Lys胺残基的氨基氧基衍生物与放射性氟化的苯甲醛的缩合产生，并且含有下列结构元件(structural elements)：
Figure 796987DEST_PATH_IMAGE006
在另一个实施方案中，最优选的式X取代基包含三唑或异噁唑环，其由点击环化(click cyclisation)产生：
Figure DEST_PATH_IMAGE007
其中n = 1-6。
在上述反应流程中，n优选为1-3。
在另一个实施方案中，最优选的式X取代基包括具有18F-Si键的有机硅衍生物：
Figure 192196DEST_PATH_IMAGE008
当Z1为与金属络合物的金属配位的18F时，优选的金属为铝。铝优选为氨基羧化物(aminocarboxylate)配体的金属络合物。术语“氨基羧化物配体”具有其常规的含义，并且是指其中供体原子为胺(N)供体和羧酸(O)供体的混合物的螯合剂。这样的螯合剂可为开链(例如，EDTA、DTPA或HBED)或大环(例如，DOTA或NOTA)。合适的这样的螯合剂包括DOTA、HBED和NOTA，其为本领域众所周知的。对于铝，优选的这样的螯合剂为NOTA。
优选地，成像剂以无菌形式，即如(下文)第四方面所描述的适于哺乳动物给药的形式提供。
第一方面的成像剂可按照(下文)第三方面所描述获得。
在第二方面，本发明提供了式III的前体：
Z3-(L)n-[LBP]-Z2
(III)
其中：
L、n、LBP和Z2如第一方面中所定义；
Z3为选自以下的官能团：
(i) 氨基氧基；
(ii) 叠氮基；
(iii) 炔基；
(iv) 氧化腈；
(v) 氨基羧化物配体的铝、铟或镓金属络合物。
在第二方面中，L、n、LBP、Z2和金属络合物的优选方面如(上文)第一方面中所定义。
术语“氨基氧基”意指式III的LBP肽已经在其中共价缀合氨基氧基官能团。这样的基团具有式-O-NH2，优选-CH2O-NH2，并且具有这样的优点：在与醛形成肟醚的缩合反应中，氨基氧基的胺比Lys胺基更具反应性。这样的氨基氧基在LBP的Cys或Lys残基处合适地连接。
第二方面的前体为非放射性的。优选地，前体以无菌形式提供，以便于制备药物组合物形式的成像剂—如(下文)第四方面所描述。
在式III中，Z3优选与LBP的Cysa并且任选还与Xaa连接，优选，Z3仅与LBP的Cysa连接。
氨基氧基官能化的LBP肽可通过Poethko等人[J.Nucl.Med., 45, 892-902 (2004)]、Schirrmacher等人[Bioconj.Chem., 18, 2085-2089 (2007)]、Solbakken等人[Bioorg.Med.Chem.Lett, 16, 6190-6193 (2006)]或Glaser等人[Bioconj. Chem., 19, 951-957 (2008)]的方法制备。氨基氧基可任选用两步缀合。第一，将N-保护的氨基氧基羧酸或N-保护的氨基氧基活化酯与LBP肽缀合。第二，将中间体N-保护的氨基氧基官能化的LBP肽脱保护以产生期需产物[参见上文引用的Solbakken和Glaser的论文]。N-保护的氨基氧基羧酸例如Boc-NH-O-CH2(C=O)OH和Eei-N-O-CH2(C=O)OH可例如从Novabiochem和IRIS市售获得。术语“保护的”是指保护基的使用。术语“保护基”意指这样的基团，其抑制或遏抑不期望的化学反应，但是经设计具有足够的反应性，使其可在不改变分子的其余部分的足够温和的条件下从目标官能团裂解。在脱保护后，得到期需的产物。胺保护基为本领域技术人员众所周知的，并且适宜地选自：Boc (其中Boc为叔丁氧基羰基)、Eei (其中Eei为乙氧基亚乙基)、Fmoc (其中Fmoc为芴基甲氧基羰基)、三氟乙酰基、烯丙氧基羰基、Dde [即，1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环亚己基)乙基]或Npys (即，3-硝基-2-吡啶氧硫基(3-nitro-2-pyridine sulfenyl))。进一步的保护基的使用描述于‘Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基)’，第4版，Theorodora W. Greene和Peter G. M. Wuts，[Wiley Blackwell，(2006)]。优选的胺保护基为Boc和Eei，最优选Eei。
用叠氮基官能化肽的方法由Nwe等人[Cancer Biother.Radiopharm., 24(3), 289-302 (2009)]描述。Li等人提供了N3-L1-CO2H型 (其中L1为-(CH2)4-)化合物的合成及其与包含胺的生物分子缀合的用途[Bioconj.Chem., 18(6), 1987-1994 (2007)]。Hausner等人描述了用于N3-L1-CO2H (其中L1为-(CH2)2-)的相关方法[J.Med.Chem., 51(19), 5901-5904 (2008)]。De Graaf等人[Bioconj.Chem., 20(7), 1281-1295 (2009)]描述了具有叠氮化物侧链的非天然氨基酸及其在肽或蛋白中的位点特异性掺入，用于随后的点击缀合。
用炔基官能化肽的方法由Nwe等人[Cancer Biother.Radiopharm., 24(3), 289-302 (2009)]描述。Smith等人提供了炔官能化的靛红前体的合成[J.Med.Chem., 51(24), 8057-8067 (2008)]，其中靛红化合物为胱天蛋白酶-3或胱天蛋白酶-7特异性的。De Graaf等人[Bioconj.Chem., 20(7), 1281-1295 (2009)]描述了具有炔侧链的非天然氨基酸及其在肽或蛋白中的位点特异性掺入，用于随后的点击缀合。
术语“氧化腈”是指式-C≡N+-O-的取代基。在上述条件下，用18F-标记的炔的点击环加成导致异噁唑环。氧化腈可通过Ku等人[Org.Lett., 3(26), 4185-4187 (2001)]及其中的参考文献中描述的方法获得。因此，其通常通过用有机碱例如三乙胺处理α-卤代醛肟原位产生。优选的产生方法以及用于随后点击环化为所需异噁唑的条件由Hansen等人[J.Org.Chem., 70(19), 7761-7764 (2005)]描述。Hansen等人通过相应醛与三水合氯胺-T的反应原位产生了期需的α-卤代醛肟。还参见K.B.G.Torsell “Nitrile Oxides, Nitrones and Nitronates in Organic Synthesis (有机合成中的氧化腈、硝酮和氮酸酯)” [VCH, New York (1988)]。
制备官能化的NOTA螯合剂、其与肽的缀合以及用18F放射性标记螯合剂缀合物的方法由McBride等人[J.Nucl.Med., 51(3), 454-461 (2009); Bioconj.Chem., 21(7), 1331-1340 (2010)]和Laverman等人[J.Nucl.Med., 51(3), 454-461 (2010)]描述。
在第三方面，本发明提供了制备第一方面的成像剂的方法，所述方法包括使第二方面的前体或如第一方面所描述的LBP肽与合适化学形式的18F供应在合适的溶剂中反应。
在第三方面中，前体和LBP肽的优选方面各自如(上文)本发明第一方面和第二方面中所描述。
“合适的溶剂”通常为水性的，并且优选为如(下文)第四方面中所定义的生物相容的载体溶剂。
“合适化学形式的18F供应”根据前体或LBP肽的官能团进行选择。当使用LBP肽的Lys残基的胺基或Cysa的氨基时，则18F的化学形式合适地为活性酯或在活化剂存在下的18F-标记的羧酸。术语“活化剂”意指用于促进胺与羧酸之间的偶联以产生酰胺的试剂。合适的这样的活化剂是本领域众所周知的，并且包括碳二亚胺例如EDC [N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺和N,N′-二烷基碳二亚胺例如二环己基碳二亚胺或二异丙基碳二亚胺，以及三唑例如HBTU [O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲
Figure DEST_PATH_IMAGE009
六氟磷酸盐]、HATU [O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐]和PyBOP [苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷子基磷
Figure 891348DEST_PATH_IMAGE010
(tripyrrolidinophosphonium)六氟磷酸盐]。这样的活化剂可市售获得。进一步的细节在“March’s Advanced Organic Chemistry (March’s高级有机化学)”，第五版，508-510页，Wiley Interscience (2001)中给出。优选的这样的活化剂为EDC。
18F-标记的活化酯，例如[18F]SFB可通过Glaser等人及其中的参考文献[J.Lab.Comp.Radiopharm., 52, 327-330 (2009)]中的方法或Marik等人的自动化方法[Appl.Rad.Isot., 65(2), 199-203 (2007)]制备：
Figure DEST_PATH_IMAGE011
Olberg等人[J.Med.Chem., 53(4), 1732-1740 (2010)]已经报道，对于肽的18F-标记，18F-Py-TFP (氟烟酸的四氟苯酯)比起18F-SFB具有优势。
18F-标记的羧酸可通过上文引用的Marik等人的方法获得。
当前体包含氨基氧基时，合适的化学形式为18F-氟化醛，优选18F-氟苯甲醛或对-(二叔丁基-18F-氟甲硅烷基)苯甲醛(18F-SiFA-A)，更优选18F-氟苯甲醛。
式18F(CH2)2O[CH2CH2O]qCH2CHO (其中q为3)的18F-标记的脂族醛可通过Glaser等人[Bioconj.Chem., 19(4), 951-957 (2008)]的方法获得。18F-氟苯甲醛可通过Glaser等人[J.Lab.Comp.Radiopharm., 52, 327-330 (2009)]的方法获得。18F-氟苯甲醛的前体，即Me3N+-C6H4-CHO. CF3SO3 -通过Haka等人[J.Lab.Comp.Radiopharm., 27, 823-833 (1989)]的方法获得。
18F-SiFA-A，即18F-Si(But)2-C6H4-CHO可通过Schirrmacher等人[Ang.Chem.Int.Ed.Engl., 45(36), 6047-6050 (2006); Bioconj.Chem., 18(6), 2085-2089 (2007)和Bioconj.Chem., 20(2), 317-321 (2009)]的方法获得。Schirrmacher等人也公开了使用18F-SiFA-A对氨基氧基官能化的肽前体进行18F-放射性标记的方法。
当前体包含叠氮化物-官能化的LBP肽时，合适的化学形式为18F-标记的末端炔。这样的放射性氟化的炔可通过Kim等人[Appl.Rad.Isotop., 68(2), 329-333 (2010)]或Marik等人[Tet.Lett., 47, 6681-6684 (2006)]的方法获得。
当前体包含炔-官能化的LBP肽时，合适的化学形式为18F-标记的末端叠氮化物。优选的这样的化合物为Gaeta等人[Bioorg.Med.Chem.Lett., 20(15), 4649-4652 (2010)]和Glaser等人[Bioconj.Chem., 18(3), 989-993 (2007)]所描述的18F-氟乙基叠氮化物。
当前体包含炔-官能化的或叠氮化物-官能化的LBP肽时，放射性氟化反应涉及点击化学。用于这样的点击反应的合适溶剂为，例如乙腈、C1-4烷基醇、二甲基甲酰胺、四氢呋喃或二甲基亚砜，或其任何的水性混合物，或水。可使用pH范围4-8，更优选5-7的水性缓冲液。反应温度优选为5-100℃，更优选75-85℃，最优选环境温度(通常为15-37℃)。点击环加成可任选在有机碱存在下进行，如Meldal和Tornoe [Chem. Rev. 108, (2008) 2952, 表1 (2008)]所描述。
点击反应在点击环加成催化剂存在下进行。术语“点击环加成催化剂”意指已知催化点击(炔加叠氮化物)或点击(炔加氧化异腈)环加成反应，分别产生三唑和异噁唑环的催化剂。合适的这样的催化剂在本领域已知用于点击环加成反应。优选的这样的催化剂包括Cu(I)，并在下文中描述。合适催化剂的进一步细节由Wu和Fokin [Aldrichim.Acta, 40(1), 7-17 (2007)]以及Meldal和Tornoe [Chem. Rev., 108, 2952-3015 (2008)]描述。
优选的点击环加成催化剂包括Cu(I)。Cu(I)催化剂以足以使反应进行的量存在，通常以催化量或过量，例如相对于叠氮化物或氧化异腈反应物0.02-1.5摩尔当量存在。合适的Cu(I)催化剂包括Cu(I)盐例如CuI或[Cu(NCCH3)4][PF6]，但有利地，可在还原剂存在时使用Cu(II)盐例如硫酸铜(II)原位产生Cu(I)。合适的还原剂包括：抗坏血酸或其盐例如抗坏血酸钠、氢醌、金属铜、谷胱甘肽、半胱氨酸、Fe2+或Co2+。Cu(I)还固有地存在于元素铜颗粒的表面，因此元素铜，例如粉末或颗粒形式，也可用作催化剂。具有控制的粒度的元素铜为优选的Cu(I)催化剂来源。更优选的这样的催化剂为作为铜粉的元素铜，其具有介于0.001-1 mm范围、优选0.1 mm-0.7 mm、更优选约0.4 mm的粒度。或者，可使用直径在0.01-1.0 mm范围、优选0.05-0.5 mm并且更优选直径0.1 mm的卷曲铜线。可任选在红菲咯啉存在下使用Cu(I)催化剂，红菲咯啉在点击化学中用于稳定Cu(I)。
使用点击、活性酯和金属络合物方法对肽进行18F-标记的进一步的细节由Olberg等人[J.Med.Chem., 53(4), 1732-1740 (2010)和Curr.Top.Med.Chem., 10(16), 1669-1679 (2010)]提供。
某些LBP肽可市售获得。因此，肉桂霉素和耐久霉素可自Sigma-Aldrich获得。耐久霉素由菌株：来自肉桂链轮丝菌(Streptoverticillium cinnamoneus)的D3168耐久霉素(D3168 Duramycin)产生。肉桂霉素可由若干菌株通过生物化学方法产生，例如，来自肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamoneus)或来自灰轮丝链轮丝菌(Streptoverticillium griseoverticillatum)。参见C. Chatterjee等人[Chem. Rev., 105, 633-683 (2005)]的综述。
其它肽可通过固相肽合成获得，如P. Lloyd-Williams, F. Albericio和E. Girald; Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (肽和蛋白合成的化学方法), CRC Press, 1997中描述的。
在第四方面，本发明提供了放射性药物组合物，所述放射性药物组合物包含第一方面的成像剂以及生物相容的载体，所述组合物呈适用于哺乳动物给药的形式。
在第四方面中，成像剂的优选方面如(上文)本发明第一方面中所描述。
短语“适用于哺乳动物给药的形式”意指无菌、无热原的组合物，其缺乏产生毒性或有害作用的化合物，并且在生物相容的pH (约pH 4.0-10.5)下配制。这样的组合物缺乏可能具有体内引起栓塞的风险的颗粒，并且经配制使得在与生物学流体(例如，血液)接触时不发生沉淀。这样的组合物还含有仅生物学上相容的赋形剂，并且优选为等渗的。
“生物相容的载体”为流体，特别是液体，其中成像剂可悬浮或优选溶解，使得组合物在生理学上可耐受，即，可给予哺乳动物身体，而没有毒性或过度不适。生物相容的载体适宜地为注射用载体液体，例如用于注射的无菌无热原的水、水溶液例如盐水(其可有利地平衡，使得用于注射的最终产品为等渗的)、包含生物相容缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)的水性缓冲溶液、一种或多种张度-调节物质(例如等离子体阳离子与生物相容的反荷离子的盐)的水溶液、糖(例如葡萄糖或蔗糖)、糖醇(例如山梨糖醇或甘露糖醇)、二醇(例如甘油)或其它非离子多元醇物质(例如聚乙二醇、丙二醇等)。优选生物相容的载体为用于注射的无热原的水、等渗盐水或磷酸盐缓冲液。
成像剂和生物相容的载体各自提供在包括密封容器加上任选惰性顶空气体(例如氮气或氩气)的合适的小瓶或器皿中，所述密封容器使得可保持无菌完整性和/或放射性安全，所述惰性顶空气体同时使得可通过注射器或插管加入及取出溶液。优选这样的容器为隔膜密封小瓶，其中用顶封(通常为铝)压紧气密封盖。所述封盖适于用皮下注射器针头一次或多次穿刺同时保持无菌完整性(例如压紧的隔膜封封盖(crimped-on septum seal closure))。这样的容器具有以下另外的优点：需要时封盖可承受真空(例如以改换顶空气体或除去溶液中的气体)以及承受压力变化，例如降低压力而不使外部大气气体例如氧气或水蒸气进入。
优选的多剂量容器包含单一的大包装(bulk)瓶(例如，10-50 cm3体积)，其含有多个患者剂量，由此在制剂的可用期限期间，在不同的时间间隔，可将单一的患者剂量取出至临床级别注射器中，以适于临床状况。设计预先填充的注射器以含有单人剂量或“单位剂量”，因此优选为一次性注射器或其它适用于临床使用的注射器。本发明的药物组合物优选具有适用于单个患者的剂量，并且在合适的注射器或容器中提供，如上文描述的。
药物组合物可含有另外的任选的赋形剂，例如：抗微生物防腐剂、pH-调节剂、填充剂、辐射防护剂、增溶剂或重量克分子渗透压浓度调节剂。术语“辐射防护剂”意指通过捕获高度-反应性自由基，例如由水的辐射分解引起的含氧自由基抑制降解反应，例如氧化还原过程的化合物。本发明的辐射防护剂适宜地选自：抗坏血酸、对氨基苯甲酸(即，4-氨基苯甲酸)、龙胆酸(即，2,5-二羟基苯甲酸)及其与上述生物相容的阳离子的盐。术语“增溶剂”意指提高成像剂在溶剂中的溶解性的存在于组合物中的添加剂。优选的这样的溶剂为水性介质，因此，增溶剂优选改进在水中的溶解性。合适的这样的增溶剂包括：C1-4醇、甘油、聚乙二醇(PEG)、丙二醇、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、脱水山梨醇单油酸酯(monooloeate)、聚山梨醇酯、聚(氧乙烯)聚(氧丙烯)聚(氧乙烯)嵌段共聚物(PluronicsTM)、环糊精(例如，α、β或γ环糊精、羟丙基-β-环糊精或羟丙基-γ-环糊精)和卵磷脂。
术语“抗微生物防腐剂”意指抑制可能有害的微生物(例如细菌、酵母或霉菌)的生长的试剂。抗微生物防腐剂还可呈现一些杀菌性质，取决于采用的剂量。本发明的抗微生物防腐剂的主要作用是抑制任何这样的微生物在药物组合物中的生长。然而，在给药之前，抗微生物防腐剂还可任选用于抑制用于制备所述组合物的试剂盒的一种或多种组分中的可能有害的微生物的生长。合适的抗微生物防腐剂包括：对羟基苯甲酸酯(即，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯或对羟基苯甲酸丁酯或它们的混合物)、苄醇、苯酚、甲酚、溴化十六烷基三甲铵和硫柳汞。优选的抗微生物防腐剂为对羟基苯甲酸酯。
术语“pH-调节剂”意指可用于确保组合物的pH在用于人或哺乳动物给药的可接受的限度(约pH 4.0-10.5)内的化合物或多种化合物的混合物。合适的这样的pH-调节剂包括药学上可接受的缓冲剂，例如曲辛(tricine)、磷酸盐或TRIS [即，三(羟甲基)氨基甲烷]，以及药学上可接受的碱例如碳酸钠、碳酸氢钠或它们的混合物。当组合物以试剂盒形式使用时，pH调节剂可任选在单独的小瓶或容器中提供，因此试剂盒的使用者可调节pH作为多步程序的一部分。
术语“填充剂”意指在生产和冻干期间可促进材料处理的药学上可接受的膨胀剂。合适的填充剂包括无机盐例如氯化钠，和水溶性糖或糖醇例如蔗糖、麦芽糖、甘露醇或海藻糖。
第四方面的放射性药物组合物可在无菌制造(即，净化室)条件下制备，以得到期望的无菌、无热原产物。优选关键组分，尤其是相关试剂加上与成像剂接触的装置的那些部件(例如，小瓶)无菌。组分和试剂可通过本领域已知的方法灭菌，包括：无菌过滤、使用例如γ-照射的最终灭菌、高压灭菌、干热或化学处理(例如使用环氧乙烷)。优选事先灭菌一些组分，使得需要进行最少数量的操作。然而，作为预防，优选包括至少无菌过滤步骤作为制备药物组合物的最终步骤。
本发明的放射性药物组合物可通过各种方法制备：
(i) 无菌制造技术，其中在净化室环境中进行18F-放射性标记步骤；
(ii) 最终灭菌，其中不使用无菌制造进行18F-放射性标记，随后在最后的步骤灭菌[例如，通过γ照射、高压灭菌、干热或化学处理(例如使用环氧乙烷)]；
(iii) 试剂盒方法，其中包含式III的合适前体和任选的赋形剂的无菌、非放射性试剂盒制剂与合适的18F供应反应；
(iv) 无菌制造技术，其中使用自动合成仪装置进行18F-放射性标记步骤。
优选方法(iv)。用于该方法的试剂盒描述于(以下)第五实施方案。
术语“自动合成仪”意指基于Satyamurthy等人[Clin.Positr.Imag., 2(5), 233-253 (1999)]所述单元操作原理的自动模块。术语“单元操作”意指复杂的过程被简化为一系列简单操作或反应，其可应用于一系列材料。这样的自动合成仪对于本发明方法是优选的，特别是当期需放射性药物组合物时。其可从多个供应商[Satyamurthy等, 上文]，包括GE Healthcare、CTI Inc、Ion Beam Applications S.A. (Chemin du Cyclotron 3, B-1348 Louvain-La-Neuve, 比利时)、Raytest (德国)和Bioscan (USA)市售获得。
市售的自动合成仪还提供用于由于放射性药物制备而产生的放射性废液(liquid radioactive waste)的合适容器。自动合成仪通常不提供辐射屏蔽，这是因为其设计为在适当配置的放射性工作单元中使用。放射性工作单元提供适当的辐射屏蔽以保护操作者免受潜在的辐射剂量，并提供通风以除去化学和/或放射性蒸气。自动合成仪优选包含盒(cassette)。术语“盒”意指可移去以及可互换地安装在自动合成仪装置上的一件装置(如上文定义)，其以这样的方式使得合成仪活动部件的机械运动从盒外面即外部控制盒的操作。合适的盒包含线性阵列的阀，每个阀连接到端口，在此可通过针刺倒置的隔膜密封小瓶或通过气密性连接接头而连接试剂或小瓶。各阀具有与自动合成仪相应移动臂对接的凸-凹接头(male-female joint)。因此当盒与自动合成仪连接时臂的外部旋转控制阀的打开或关闭。额外的自动合成仪活动部件设计为夹在注射器柱塞顶端，因此升高或压低注射器桶状体。
盒为通用的，通常具有一些可连接试剂的位点，以及一些适于连接试剂的注射器小瓶或色谱柱(例如固相萃取或SPE)的位点。盒总是包含反应器皿。这样的反应器皿体积优选1-10 cm3，最优选2-5 cm3，并经配置使得其上连接3个或更多盒端口，以允许试剂或溶剂从盒的不同端口转移。盒优选具有线性阵列的15-40个，最优选20-30个，特别优选25个阀。盒的阀优选各自相同的，且最优选为三通阀。盒设计为适于放射性药物制造，因此由药物级并且理想地还抗辐射分解的材料制造。
优选的本发明自动合成仪包含一次性或单次使用的盒，所述盒包含进行给定批次放射性氟化放射性药物制备所需的所有试剂、反应器皿和装置。盒意指自动合成仪具有能够通过简单地改变盒而制造多种不同的放射性药物并且交叉污染风险最低的灵活性。盒方法还具有下列优点：简化的设置因此减少操作人员错误的风险、改善的GMP (药品生产质量管理规范)顺应性、多示踪能力、生产运行之间的快速更换、盒和试剂的预运行自动诊断检查、化学试剂与待进行合成的自动条码交叉检查、试剂示踪能力、单次使用因此无交叉污染风险、抗干扰和滥用。
本发明该方面包括使用自动合成仪装置制备第二方面的放射性药物组合物。
在第五方面，本发明提供了用于制备第四方面的放射性药物组合物的试剂盒，所述放射性药物组合物包含无菌、固体形式的第二方面的前体或第一方面定义的LBP肽，使得当与合适化学形式的18F的无菌供应重构时，发生溶解，以得到期需的放射性药物组合物。
术语“合适的化学形式”如(上文)第三方面中所定义。
在第五方面中，前体的优选方面如(上文)本发明第二方面中所描述。
术语“试剂盒”是指一个或多个非放射性药物级别容器，包含制备期需的放射性药物组合物所必需的化学品，以及操作说明。将试剂盒设计为与18F重构，以用最少的操作得到适用于人给药的溶液。
无菌、固体形式优选为冻干的固体。
非放射性试剂盒可任选进一步包含另外的组分，例如转移螯合剂(transchelator)、辐射防护剂、抗微生物防腐剂、pH-调节剂或填充剂，如上所定义。
本发明该方面包括使用包含第五方面的试剂盒连同自动合成仪装置的盒制备第二方面的放射性药物组合物。
在第六方面，本发明提供了对人或动物身体成像的方法，所述方法包括使用PET产生已分布第一方面的成像剂或第四方面的组合物的所述身体的至少部分的图像，其中所述成像剂或组合物已预先给予所述身体。
在第六方面中，成像剂或组合物的优选方面分别如在(上文)本发明的第一和第四方面中所描述。当一部分身体为其中涉及异常凋亡的疾病状态时，优选进行第六方面的方法。术语“异常凋亡”意指程序性细胞死亡过程的失调。这样的失调已经牵涉多种疾病状态，包括与抑制凋亡相关的那些，例如癌症和自身免疫病症，以及与凋亡活动过强相关的那些，包括：神经变性疾病；血液疾病；AIDS；局部缺血和同种异体移植排斥。
也有新出现的证据表明凋亡有助于动脉粥样硬化病变的不稳定性。易经受破裂的斑块通常具有大的坏死核心和变薄的纤维帽(attenuated fibrous cap)，其被巨噬细胞和淋巴细胞大量浸润。尽管发展病变内的细胞死亡的后果未精确定义，但形态学数据提示巨噬细胞的凋亡显著有助于坏死核心的大小，而平滑肌细胞(SMC)的凋亡导致纤维帽的变薄。认为巨噬细胞的广泛凋亡在斑块破裂的位点发生，并且可能有助于破裂过程。因此，检测凋亡可有助于鉴别有破裂倾向的动脉粥样硬化病变。
因此，凋亡的显影和定量可用于诊断这样的凋亡-相关的病理生理学。
第六方面的成像方法可任选重复进行，以监测用药物治疗人或动物身体的作用，所述成像在用所述药物治疗之前和之后，以及任选还在用所述药物治疗期间实现。用于这些疾病的治疗性处理目的是通过适当地刺激或抑制PCD过程恢复平衡的凋亡。特别感兴趣的是早期监测癌症治疗的功效以确保在病况变为晚期之前控制恶性生长。
在第七方面，本发明提供第一方面的成像剂、第四方面的组合物或第五方面的试剂盒在诊断人或动物身体的方法中的用途。
在第七方面中，成像剂或组合物的优选方面分别如在(上文)本发明第一和第四方面中所描述。当人或动物身体的诊断为其中涉及异常凋亡的疾病状态的诊断时，优选第七方面的用途。这样的“异常凋亡”如在(上文)第六方面中所描述。
通过下文详述的非限制性实施例来说明本发明。实施例1和实施例2分别提供前体1A和前体1B (用两个不同的氨基保护基保护的本发明氨基氧基官能化的LBP肽)的合成。实施3提供前体2 (本发明氨基氧基官能化的LBP肽)的合成。实施例4提供化合物1 (本发明非放射性氟化的化合物)的合成，其中氟同位素为19F。化合物1可用于测定18F对应物(化合物1A)的生物结合性质。实施例5提供使用18F-苯甲醛对前体1进行18F-标记以得到本发明18F-标记化合物(化合物1A)的方法。实施例6提供对于磷脂酰乙醇胺的结合亲和力数据，证明化合物1的产生对结合亲和力无显著作用。通过在EL4小鼠淋巴瘤异种移植模型中的生物分布评价化合物1A。该研究的结果在实施例7中提供。
缩写
使用常规的单字母或3-字母氨基酸缩写。
Ac：乙酰基。
ACN：乙腈。
Boc：叔丁氧基羰基。
DIPEA：N,N-二异丙基乙胺。
DMSO：二甲基亚砜。
EOS：合成终点
Fmoc：9-芴基甲氧基羰基。
HATU：O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲
Figure 220698DEST_PATH_IMAGE010
六氟磷酸盐。
HPLC：高效液相色谱法。
NMP：1-甲基-2-吡咯烷酮。
PBS：磷酸盐缓冲盐水。
PyBOP：苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷子基(pyrrolidino)磷
Figure 419598DEST_PATH_IMAGE010
六氟磷酸盐。
RAC：放射性浓度。
RCP：放射化学纯度。
tBu：叔丁基。
TFA：三氟乙酸。
TFP：四氟苯基。
TR：保留时间。
表1：本发明化合物
式II (具有在第一方面中指定的桥)：
Cysa-Xaa-Gln-Serb-Cysc-Serd-Phe-Gly-Pro-Phe-Thrc-Phe-Val-Cysb-(HO-Asp)-Gly-Asn-Thra-Lysd
Figure 88477DEST_PATH_IMAGE012
实施例1：(Boc-氨基氧基)乙酰基-耐久霉素(前体1A)的合成。
Figure DEST_PATH_IMAGE013
将耐久霉素(Sigma-Aldrich；8.0 mg，4.0 μmol)、(Boc-氨基氧基)乙酸TFP酯(Invitrogen；1.3 mg，3.8 μmol)和DIPEA (2.1 μL，12.5 μmol)溶解在NMP (1 mL)中。将反应混合物振摇30分钟。然后用水/0.1% TFA (6 mL)稀释该混合物，并使用制备型HPLC纯化产物。
通过制备型HPLC (Beckman System Gold 色谱系统，使用下列条件：溶剂A = H2O/0.1% TFA且溶剂B = ACN/0.1% TFA，梯度：40分钟内20-50% B；流速：10 mL/分钟；柱：Phenomenex Luna 5 μm C18 (2) 250 x 21.2 mm；检测：UV 214 nm)纯化，得到3.8 mg纯的前体1A (收率44%)。纯化的物质通过分析型LC-MS (梯度：5分钟内20-70% B，t R：1.93分钟，实测值m/z：1093.7，预期为MH2 2+：1093.5)分析。
在上述分析型或制备型HPLC条件下不能实现前体1区域异构体的分离。在各自的情况下两种区域异构体作为单峰被洗脱。
然而，前体1A区域异构体的分离可通过分析性HPLC在更温和的洗脱条件下实现：LC-MS梯度5分钟内25-35% B，t R：2.0分钟，实测值m/z：1093.7和t R：2.3分钟，实测值m/z：1093.7，预期为MH2 2+：1093.5。可使用类似的条件通过制备型HPLC分离各个区域异构体。
实施例2：(Eei-氨基氧基)乙酰基-耐久霉素(前体1B)的合成。
Figure 144158DEST_PATH_IMAGE014
将耐久霉素(Sigma-Aldrich；50 mg，25 μmol)、(Eei-氨基氧基)乙酸NHS酯(Iris Biotech.，5.1 mg，20 μmol)和DIPEA(17 μL，100 μmol)溶解在NMP (1 mL)中。将反应混合物振摇45分钟。然后用水/0.1%乙酸(8 mL)稀释该混合物，并使用制备型HPLC纯化产物。
通过制备型HPLC (如对于实施例1，用梯度40分钟内14-45% B，其中A = 水/0.1%乙酸且B = ACN)纯化，得到14 mg纯的前体1B (收率26%)。纯化的物质通过LC-MS (梯度：5分钟内20-50% B，t R：2.5和2.7分钟，实测值m/z: 1078.8，预期为MH2 2+：1078.5)分析。
(Eei-氨基氧基)乙酰基-耐久霉素区域异构体的色谱拆分可在分析型HPLC上使用0.1% TFA实现。然而，Eei保护基在0.1% TFA中不稳定，因此制备型分离不可行。使用0.1%乙酸，区域异构体未得到拆分。
实施例3：氨基氧基乙酰基-耐久霉素(前体2)的合成。
Figure DEST_PATH_IMAGE015
前体1B (14 mg)用2.5% TFA/水(2.8 mL)在氩气下处理40分钟。用水(31 mL)稀释反应混合物，并将产物冻干(氩气下使用异丙醇/干冰冷冻)，得到18 mg前体2。冻干产物通过LC-MS (梯度：5分钟内20-50% B，t R：2.5和2.1分钟，实测值m/z：1043.8，预期为MH2 2+: 1043.5)分析。
前体2区域异构体的色谱拆分可在分析型HPLC上使用0.1% TFA实现。然而，由于游离氨基氧基对溶剂和大气中的痕量酮和醛的高度反应性，在此阶段未尝试分离区域异构体。
实施例4： N -(4-氟苯亚甲基)-氨基氧基乙酰基-耐久霉素(化合物1)的合成。
Figure 898487DEST_PATH_IMAGE016
前体1A (实施例1；1.0 mg，0.46 μmol)用TFA (1 mL)处理30分钟。真空除去TFA，残余物重新溶解在40% ACN/水(1 mL)中。加入4-氟苯甲醛(1.0 μl，9.2 μmol)，并将反应混合物振摇30分钟。然后用20% ACN/水/0.1% TFA (6 mL)稀释反应混合物，并通过制备型HPLC纯化产物。
通过制备型HPLC (如对于实施例1，用梯度：40分钟内20-50% B)纯化得到0.6 mg纯的化合物1 (收率60%)。纯化的物质通过分析型LC-MS (梯度：5分钟内20-70% B，t R：2.09分钟，实测值m/z：1096.5，预期为MH2 2+：1096.5)分析。使用分析型或制备型HPLC不能实现化合物1区域异构体的分离。在各自的情况下，两种区域异构体作为单峰被洗脱。
实施例5：从前体2放射性合成化合物1A。
化合物1A使用自动合成仪和盒(FASTlab TM , GE Healthcare)在两步程序中产生。
步骤(a)  18 F-苯甲醛的合成和纯化。
[18F]氟化物使用带有银靶的GEMS PETtrace回旋加速器经由[18O](p,n) [18F]核反应产生。使用1.5-3.5 ml的总靶体积。放射性氟化物捕获在Waters QMA柱(用碳酸盐预处理)上，并用Kryptofix2.2.2. (4 mg，10.7 μM)和碳酸钾(0.56 mg，4.1 μM)在水(80 μL)和乙腈(320 μL)中的溶液洗脱氟化物。使用氮气驱使溶液离开QMA柱进入反应器皿。[18F]氟化物在稳定的氮气流和真空下在120℃干燥9分钟。将三甲基铵苯甲醛三氟甲磺酸盐[Haka等, J.Lab.Comp.Radiopharm., 27, 823-833 (1989)] (3.3mg，10.5 μM)/二甲基亚砜(1.1mL)加入到干燥的[18F]氟化物中，并将混合物在105℃加热7分钟以产生4-[18F]氟苯甲醛。
粗标记混合物接着用氢氧化铵溶液稀释，并装载到MCX+ SPE柱(用水预调节作为FASTlab顺序的一部分)。用水洗涤该柱并用氮气干燥，然后将4-[18F]氟苯甲醛洗脱回乙醇(1 ml)中的反应器皿。4-7% (衰变校正)的[18F]氟苯甲醛仍捕获在柱上。
步骤(b)：与氨基氧基衍生物(前体2)的醛缩合。
将前体2 (5 mg)转移至FASTlab反应器皿中，然后从MCX+柱洗脱4-[18F]氟苯甲醛。混合物接着在60℃加热5分钟。粗反应物质用水(10 ml)稀释，并装载到tC2 SPE柱。其接着用氮气和真空干燥，用乙醇溶液洗涤并再次干燥。然后用乙醇接着用水(总共6 mL)将化合物1A洗脱入收集小瓶中。EOS收率为16-34% (无衰变校正)。分析型HPLC证实化合物1A以97%的RCP制备，并稳定至少180分钟(RCP 94%，RAC 150 MBq/mL)。
HPLC条件
柱：Phenomenex, Jupiter 4u, Proteo 90A, 250 x 4.6 mm。
梯度：0分钟 50%B
5分钟 50% B
20分钟 90% B
25分钟 90% B
流速：1 mL/分钟。
UV检测：254 nm。
流动相A：50 mM乙酸铵。
流动相B：甲醇。
化合物1A (TR) = 22.6 分钟。
实施例6：对磷脂酰乙醇胺的亲和力。
Biacore 3000 (GE Healthcare，Uppsala)配备有L1芯片。使用制造商推荐的捕获技术，将由POPE/POPC (20% PE)制成的脂质体应用于亲和力研究。每次运行由芯片表面的激活、脂质体的固定化、肽的结合以及脂质体和肽二者的洗掉(再生)组成。相似的应用可参见Frostell-Karlsson等人[Pharm. Sciences, V.94 (1), (2005)]。每个循环后用运行缓冲剂对针、管和液体处理系统进行彻底洗涤。
BIACORE软件：应用包含所有方法指令的BIACORE控制软件。 带有命令的方法亦用BIACORE方法定义语言(Method Definition Language, MDL)编写，以对预编程的指令具有完全的控制。应用BIACORE评估软件分析传感图。
发现化合物1为良好的磷脂酰乙醇胺结合剂。耐久霉素和化合物1二者的KD均小于100 nM。结果在表2中给出：
表2：
  耐久霉素 化合物1
kd (1/s) 约8·10-5 约12·10-4
ka (1/Ms) 约2·104 约2.8·104
KD (nM) 约5 约43
实施例7：肿瘤摄取研究。
在EL4小鼠淋巴瘤异种移植模型中，通过生物分布评价化合物1A。简要地，在C57/Bl6小鼠中建立肿瘤生长之后，将动物用如下之一处理：
(i) 盐水/DMSO溶液；或
(ii) 化疗(67 mg/kg依托泊苷和100 mg/kg环磷酰胺在50%盐水50% DMSO中)。
在治疗或溶媒处理24小时后，评价动物的化合物1A的生物分布。此外，提取肿瘤，并且通过测量胱天蛋白酶活性(胱天蛋白酶(capase)-Glo测定)评价凋亡水平。观察到化合物1A的肿瘤保留增加，这在肿瘤凋亡增加之后。
Figure IDA00003281083500011
Figure IDA00003281083500021
Figure IDA00003281083500031
Figure IDA00003281083500041
Figure IDA00003281083500051

Claims (16)

1. 一种成像剂，所述成像剂包含式I的化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
其中：
LBP为式II的羊毛硫抗菌肽：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
Xaa为Arg或Lys；
Cysa-Thra、Serb-Cysb和Cysc-Thrc经由硫醚键共价连接；
Serd-Lysd经由赖氨酸丙氨酸键共价连接；
HO-Asp为β-羟基天冬氨酸；
Z1-(L)n-与LBP的Cysa连接并且任选还与LBP的Xaa连接，其中Z1为18F或与金属络合物的金属配位的18F；
Z2与LBP的C-末端连接，并且为OH或OBc，
其中Bc为生物相容的阳离子；和
L为式-(A)m-的合成的接头基团，其中每个A独立地为-CR2-、-CR=CR-、-C≡C-、-CR2CO2-、-CO2CR2-、-NRCO-、-CONR-、-CR=N-O-、-NR(C=O)NR-、-NR(C=S)NR-、-SO2NR-、-NRSO2-、-CR2OCR2-、-CR2SCR2-、-CR2NRCR2-、C4-8环杂亚烷基、C4-8环亚烷基、-Ar-、-NR-Ar-、-O-Ar-、-Ar-(CO)-、氨基酸、糖或单分散聚乙二醇(PEG)结构单元，其中每个Ar独立地为C5-12亚芳基或C3-12杂亚芳基；
每个R独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基烷基或C1-4羟基烷基；
m为数值1-20的整数；
n为数值0或1的整数。
2. 权利要求1的成像剂，其中Z1仅与LBP的Cysa连接。
3. 权利要求1或权利要求2的成像剂，其中Xaa为Arg。
4. 权利要求1-3中任一项的成像剂，其中Z1–(L)n-包含式X的基团：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
其中：x为数值0-5的整数；
X1选自-Ar-、-Ar-NR-、-Ar-O-、-Ar-(CO)-或-Si(Ra)2-；
其中A、Ar和R如权利要求1中对于L基团所定义，并且每个Ra独立地为C1-9烷基。
5. 权利要求4的成像剂，其中Ar1包含苯环或选自三唑、异噁唑或吡啶环的杂环。
6. 权利要求1-3中任一项的成像剂，其中Z1包含氨基羧化物配体的铝络合物，其中18F放射性标记与所述络合物的所述铝配位。
7. 式III的前体：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
其中：
L、n、LBP和Z2如权利要求1-3中任一项所定义；
Z3为官能团，其选自：
(i) 氨基氧基；
(ii) 叠氮基；
(iii) 炔基；
(iv) 氧化腈；
(v) 氨基羧化物配体的铝、铟或镓金属络合物。
8. 一种制备权利要求1-6中任一项的成像剂的方法，所述方法包括使权利要求8的前体或权利要求1-3任一项中所定义的LBP肽与合适化学形式的18F供应在合适的溶剂中反应。
9. 一种放射性药物组合物，所述组合物包含权利要求1-6中任一项的成像剂以及生物相容的载体，所述组合物呈适用于哺乳动物给药的形式。
10. 一种用于制备权利要求9的放射性药物组合物的试剂盒，所述试剂盒包含无菌、固体形式的权利要求7的前体或权利要求1-3任一项中所定义的LBP肽，使得与合适化学形式的18F的无菌供应重构时发生溶解，以得到期需的放射性药物组合物。
11. 权利要求10的试剂盒，其中所述无菌、固体形式为冻干的固体。
12. 一种对人或动物身体成像的方法，所述方法包括使用PET产生已分布权利要求1-6中任一项的成像剂或权利要求9的组合物的所述身体的至少部分的图像，其中所述成像剂或组合物已预先给予所述身体。
13. 权利要求12的方法，其中所述部分身体为其中涉及异常凋亡的疾病状态。
14. 权利要求12或权利要求13的方法，将所述方法重复进行，以监测用药物治疗人或动物身体的作用，所述成像在用所述药物治疗之前和之后并且任选还在用所述药物治疗期间实现。
15. 权利要求1-6中任一项的成像剂、权利要求9的组合物，或权利要求10的试剂盒在诊断人或动物身体的方法中的用途。
16. 权利要求15的用途，其中所述诊断为其中涉及异常凋亡或其它形式的细胞死亡的疾病状态的诊断。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105582556A (zh) * 2016-01-25 2016-05-18 中南大学湘雅医院 一种锝标耐久霉素分子探针
CN108144073A (zh) * 2017-12-28 2018-06-12 中山大学附属第医院 靶向磷脂酰乙醇胺的放射性标记三聚乙二醇修饰耐久霉素多肽药物
CN113368264A (zh) * 2020-03-09 2021-09-10 南方医科大学南方医院 放射性标记肉桂霉素，其制备方法及其用途

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201221266D0 (en) * 2012-11-27 2013-01-09 Ge Healthcare Ltd Aldehyde compositions
GB201314936D0 (en) * 2013-08-21 2013-10-02 Ge Healthcare Ltd Radiolabelling method
GB201322451D0 (en) * 2013-12-18 2014-02-05 Ge Healthcare Ltd Purification method and compositions
GB201322456D0 (en) 2013-12-18 2014-02-05 Ge Healthcare Ltd Radiotracer compositions and methods
AU2016333334B2 (en) 2015-09-30 2019-07-25 Deutsches Krebsforschungszentrum 18F-tagged inhibitors of prostate specific membrane antigen (PSMA) and their use as imaging agents for prostate cancer
GB201804835D0 (en) * 2018-03-26 2018-05-09 Ge Healthcare As Formulation and method of preparation

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004080492A1 (en) * 2003-03-13 2004-09-23 Amersham Health As Methods of radiofluorination of biologically active vectors
WO2009114549A2 (en) * 2008-03-10 2009-09-17 Mcw Research Foundation, Inc. 99mtc-labeled 19 amino acid containing peptide for use as phosphatidylethanolamine binding molecular probe and radiopharmaceutical

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7879801B2 (en) 2002-07-15 2011-02-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions comprising cell-impermeant duramycin derivatives
WO2006055855A2 (en) 2004-11-19 2006-05-26 Mcw Research Foundation, Inc. Method of imaging cell death in vivo
CN101854957B (zh) * 2007-09-10 2013-05-22 通用电气健康护理有限公司 放射性氟化方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004080492A1 (en) * 2003-03-13 2004-09-23 Amersham Health As Methods of radiofluorination of biologically active vectors
WO2009114549A2 (en) * 2008-03-10 2009-09-17 Mcw Research Foundation, Inc. 99mtc-labeled 19 amino acid containing peptide for use as phosphatidylethanolamine binding molecular probe and radiopharmaceutical

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105582556A (zh) * 2016-01-25 2016-05-18 中南大学湘雅医院 一种锝标耐久霉素分子探针
CN108144073A (zh) * 2017-12-28 2018-06-12 中山大学附属第医院 靶向磷脂酰乙醇胺的放射性标记三聚乙二醇修饰耐久霉素多肽药物
CN113368264A (zh) * 2020-03-09 2021-09-10 南方医科大学南方医院 放射性标记肉桂霉素，其制备方法及其用途
CN113368264B (zh) * 2020-03-09 2022-09-30 南方医科大学南方医院 放射性标记肉桂霉素，其制备方法及其用途

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