CN113368264A - 放射性标记肉桂霉素，其制备方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及放射性标记肉桂霉素，其制备方法及其用途，具体为一类靶向磷脂酰乙醇胺(PE)的放射性(R)标记三聚乙二醇(PEG3)修饰肉桂霉素(Cinnamycin)多肽化合物(R‑PEG3‑Cinnamycin)，其结构式如式1，其中，R＝[Xn+]‑1,4,7‑三氮杂环九烷基‑N’,N”‑二乙酸基‑N‑乙酰基([Xn+]NOTA‑)或其它[Xn+]螯合剂，如[Xn+]‑1,4,7,10‑四氮杂环十二烷‑N’,N”N”’‑三乙酸基‑N‑乙酰基([Xn+]DOTA‑),标记放射性金属离子Xn+＝68Ga3+,[Al18F]2+，[64Cu]或其它放射性金属离子。
Figure DDA0002404600950000011

Description

放射性标记肉桂霉素，其制备方法及其用途
【技术领域】
本发明涉及放射性标记肉桂霉素，其制备方法及其用途，尤其是靶向磷脂酰乙醇胺(PE)的放射性(R)标记三聚乙二醇(PEG3)修饰肉桂霉素(Cinnamycin，Cinn)多肽化合物，其制备方法及其在制备正电子发射断层(PET)显像剂中的应用。
【背景技术】
活体内细胞凋亡分子显像对于疾病治疗效果评估、治疗进程的监测、以及某些疾病的早期诊断或研究新疗法具有非常重要意义。分子影像学发展的关键技术之一是特异性分子探针的研究开发。目前研制临床用细胞凋亡正电子发射断层(PET)显像探针(显像剂)面临较大挑战[1,2]。
细胞膜内膜外翻是细胞凋亡分子水平的重要特征之一，磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰乙醇胺(PE)位于哺乳动物细胞膜内膜上，是研制细胞凋亡或死亡显像剂(探针)的重要靶标[1-5]。早期主要集中于靶向PS细胞凋亡显像剂的研制，重要显像剂有标记特异性大分子蛋白质Annexin V、以及标记小分子化合物N,N-二甲基吡啶(DPA)类和多胺大环类(Cyclen)分子探针([18F]FB-DPAZn2和[11C]CyclenZn2)等[1]，但这些靶向PS显像剂是高分子量蛋白质探针或靶向PS亲和力低的小分子探针，具有较大局限性，限制其在临床中转化应用。为此，本发明人率先研制出靶向PE新型细胞死亡小分子多肽类PET显像剂2-18F-氟代丙酰基-耐久霉素([18F]FPDuramycin)，用于抗肺癌治疗PET显像，获得满意结果，但它具有不良药代动力学特性的局限性[6]。最近又以PE为靶标，研制出优良药代动力学特性的小分子多肽类PET显像剂[68Ga]三氮杂环九烷基二乙酸基-聚三乙醇基-耐久霉素([68Ga]-NOTA-PEG3-Duramycin)和18F-氟化铝-三氮杂环九烷基二乙酸基-聚三乙醇基-耐久霉素([18F]AlF-NOTA-PEG3-Duramycin)[7]。但是，耐久霉素有两个含游离-NH2标记位点，通常较难实现定位标记。
参考文献：
1.黄婷婷，王红亮，唐刚华.细胞凋亡小分子PET显像剂的研究进展.2011,24(4):240-245.
2.元龚骏,聂大红,唐刚华.临床用肿瘤细胞凋亡核医学显像剂研究进展.国际放射医学核医学杂志,2017,41(4):271-277.
3.黄斌,方纬,田伟,王峰,李少华,付彤,孟庆乐,王自正.68Ga-NOTA-Duramycin实验研究的标记与生物分布.中华核医学与分子影像杂志,2012,32(4):286-290.
4.Zhao M,Li Z,Bugenhagen S.99mTc-Labeled duramycin as a novelphosphatidylethanolamine-binding molecular probe.J Nucl Med,2008,49:1345–1352.
5.Elvas F,·Stroobants S,·Wyffels L.Phosphatidylethanolaminetargeting for cell death imaging in early treatment response evaluation anddisease diagnosis.Apoptosis,2017,22:971–987.
6.Yao S,Hu K,Tang G,Liang X,Du K,Nie D,Jiang S,Zang L.Positronemission tomography imaging of cell death with[18F]FPDuramycin.Apoptosis,2014,19:841-850.
7.Yuan Gongjun,Liu Shaoyu,Ma Hui,Su Shu,Wen Fuhua,Tang Xiaolan,ZhangZhanwen,Zhao Jing,Lin Liping,Xiang Xianghong,Nie Dahong*,Tang Ganhhua*.Targeting phosphatidylethanolamine with 18F-labelled small molecule probe forapoptosis imaging.Mol Imaging Biol,2019,DOI:10.1007/s11307-019-01460-0
【发明内容】
本发明就是为了提供一种优良药代动力学特性、定位标记、制备简单、可实现自动化高产率制备的靶向磷脂酰乙醇胺(PE)的正电子发射断层(PET)显像剂，本发明还提供这种显像剂及其中间体的制备方法，本发明还进一步提供这种化合物作为显像剂的用途。
本发明是这样实现的。本发明的化合物为靶向磷脂酰乙醇胺(PE)的正电子放射性核素标记三聚乙二醇(PEG3)修饰肉桂霉素(Cinnamycin，Cinn)多肽化合物(R-PEG3-Cinnamycin)，
其中放射性金属核素结合螯合基R＝[Xn+]-1,4,7-三氮杂环九烷基-N’,N”-二乙酸基-N-乙酰基([Xn+]NOTA-)或其它[Xn+]螯合基，例如[Xn+]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N’,N”N”’-三乙酸基-N-乙酰基([Xn+]DOTA-)；Xn+＝68Ga3+,[Al18F]2+，[64Cu]或其它放射性金属离子；引入三聚乙二醇(PEG3)为药代动力学基，可赋予R-PEG3-Cinnamycin更优药代动力学特性。
其结构是为式1，
Figure BDA0002404600930000021
本发明还涉及靶向PE的正电子放射性核素标记PEG3修饰Cinnamycin多肽化合物的制备方法。其中68Ga半衰期较短(67.71min)，不适于长距离运输；而18F半衰期较长(109.8min)，适于长距离运输和延迟显像。
放射合成多肽化合物R-PEG3-Cinnamycin的关键是其前体NOTA-PEG3-Cinnamycin的制备。前体原料NOTA-PEG3-Cinnamycin的制备难度大、操作较繁琐，价格也相当昂贵。因而，本发明还涉及其前体NOTA-PEG3-Cinnamycin的制备方法。
本发明还涉及靶向PE多肽化合物R-PEG3-Cinnamycin在制备正电子发射断层(PET)显像剂中的应用。
本发明所述的靶向磷脂酰乙醇胺的R-PEG3-Cinnamycin多肽化合物在制备PET显像剂中的应用，为神经退行性疾病、脑中风、血栓、动脉粥样斑、心肌梗塞以及抗肿瘤治疗疗效监测的PET显像早期鉴别诊断显像剂中的应用。
本发明所述的靶向磷脂酰乙醇胺的R-PEG3-Cinnamycin多肽化合物在制备PET显像剂中的应用，其特征在于所述的应用为与细胞死亡或细胞凋亡过程中与PS有关病变的鉴别诊断与疗效监测PET显像剂中的应用。
本发明涉及的靶向PE多肽化合物R-PEG3-Cinnamycin，如[Xn+]NOTA-PEG3-Cinnamycin，具有以下优势：(1)Cinnamycin的定位标记。耐久霉素有两个含游离-NH2标记位点，通常较难实现定位标记。而耐久霉素的多肽类似物—肉桂霉素(Cinnamycin)只含有一个游离-NH2，可获得定位标记的多肽纯净物R-PEG3-Cinnamycin。(2)Cinnamycin经PEG3修饰后，可赋予其更优良药代动力学特性。(3)Cinnamycin-PEG3-NH2修饰–NOTA，不仅可实现用核素68Ga标记，且可用半衰期更长的核素18F标记，并可进一步用其它核素如64Cu2+等标记。(4)R-PEG3-Cinnamycin可用68Ga3+和[Al18F]2+分别与NOTA-PEG3-Cinnamycin一步反应和小柱分离纯化制得。其制备方法简单，可用简单合成仪实现其高产率和高纯度自动化合成，满足临床PET显像需要。(5)为放化疗治疗引起肝纤维化和肺纤维化监测、炎症诊断和抗炎治疗监测、抗肿瘤治疗疗效监测以及心脑血管疾病诊断提供新型优良的靶向PE细胞死亡PET药物。
初步试验表明，本发明公开的[Xn+]DOTA-PEG3-Cinnamycin化合物也具有类似的化学和生物学特性。
本发明制备方法详述。
本发明以NOTA-PEG3-Cinnamycin为前体，通过调节反应溶液pH，达到与68Ga3+、[Al18F]2+或其他离子发生螯合反应的目的，并经小柱分离纯化，即可制成多肽PET药物R-PEG3-Cinnamycin，其中放射性金属核素结合螯合基R＝[Xn+]NOTA-或其它[Xn+]螯合基；Xn+＝68Ga3+,[Al18F]2+或其它放射性金属离子。
本发明涉及多肽药物R-PEG3-Cinnamycin前体NOTA-PEG3-Cinnamycin的制备。Cinnamycin在碱性二甲亚砜中与PEG3-NH2反应生成Cinnamycin-PEG3-NH2。1,4,7-三氮杂环九烷基-N’,N”-二乙酸基-N-乙酰基丁二酰亚胺酯(NOTA-NHS)和Cinnamycin-PEG3-NH2在含二异丙基乙胺的二甲亚砜微碱性溶液中混匀，室温下反应1-2小时。用制备型HPLC分离纯化收集产品峰，经冷冻干燥后获得前体多肽NOTA-PEG3-Cinnamycin。
反应式示于合成路线1。
Figure BDA0002404600930000041
合成路线1.前体多肽NOTA-PEG3-Cinnamycin的合成。
NOTA-PEG3-Cinnamycin化学产率较高，纯度大于95％。本发明专利的实施解决了多肽前体NOTA-PEG3-Cinnamycin制备难题，也进一步解决了一步法自动化合成放射性多肽PET药物R-PEG3-Cinnamycin的难题。
本发明还涉及多肽PET药物R-PEG3-Cinnamycin的放射合成。R-PEG3-Cinnamycin即
[Xn+]NOTA-PEG3-Cinnamycin，其中放射性金属核素结合螯合基R＝[Xn+]NOTA-或其它[Xn+]螯合基；Xn+＝68Ga3+，[Al18F]2+或其它放射性金属离子。由于肉桂霉素(Cinnamycin)只含有一个游离-NH2，因而可获得定位标记的多肽纯净物R-PEG3-Cinnamycin。以
NOTA-PEG3-Cinnamycin为前体，弱酸性条件下，在pH 3.5-5.0和90-100℃时，优选在pH4.0和100℃时与Al18F发生螯合反应后，经Sep-Pak plus C18小柱或HLB小柱分离纯化，可获得[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin注射液，反应式示于合成路线2A；以
NOTA-PEG3-Cinnamycin为前体，弱酸性条件下，例如在pH4.0-4.5和100-110℃时，优选条件在pH 4.0和100℃时，与68GaCl3发生螯合反应后，经Sep-Pak plus C18小柱或HLB小柱分离纯化，可制备[68Ga]NOTA-PEG3-Cinnamycin注射液，反应式示于合成路线2B；以NOTA-PEG3-Cinnamycin为前体，也可制备其它[Xn+]NOTA-PEG3-Dur注射液。
Figure BDA0002404600930000042
合成路线2.[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin(A)和[68Ga]NOTA-PEG3-Cinnamycin(B)的放射合成路线。
本发明公开的[Xn+]DOTA-PEG3-Cinnamycin化合物的制备方法与[Xn+]NOTA-PEG3-Cinnamycin化合物类似。对此将在实施例中详述。
【附图说明】
图1为[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin注射液的HPLC图谱(A)以及体内(B)、体外(C)稳定性HPLC检测色谱图。
图2为[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin体内生物分布以及心梗组织/心脏摄取比值图。
图3为心肌细胞摄取[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin实验结果。
图4心梗模型[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin PET-CT显像及其定量结果。
为经治疗处理动物模型注射[18F]AlF-NOTA-PEG3-Dur(A和B)和[18F]FDG(C)后60min时，肿瘤/肌肉放射性摄取比值。A.荷S180肿瘤小鼠组；荷A549肺癌裸鼠模型组(B和C)(n＝3)。
图5心梗模型的病理和细胞凋亡检测结果。
图6为经治疗处理动物模型注射[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin后60min时PET-CT显像图。
【具体实施方式】
实施例1前体NOTA-PEG3-Cinnamycin的制备。
肉桂霉素(Cinnamycin)修饰PEG3后形成Cinnamycin-PEG3-NH2。1,4,7-三氮杂环九烷基-N’,N”-二乙酸基-N-乙酰基丁二酰亚胺酯(NOTA-NHS)溶于二甲亚砜后，室温下在二异丙基乙胺中与三聚乙醇氨基修饰耐久霉素(Dur-PEG3-NH2)反应1-2小时，用制备型HPLC分离纯化收集产品峰，经冷冻干燥后获得最终产品NOTA-PEG3-Cinnamycin。
终产品经HPLC分析其化学纯度大于95％(保留时间tR＝12.45)；ESI-MS:[M+2H]2+＝1258.9(m/z),即分子量(Mr.)2515.80，计算:2516.29即NOTA-PEG3-Cinnamycin分子量(Mr.2485)＝-Cinnamycin分子量(Mr.2041.29)+-PEG3分子量(Mr.189)+-NOTA分子量(Mr.286)。
前体DOTA-PEG3-Cinnamycin按上述类似方法由Cinnamycin-PEG3-NH2与1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N’,N”N”’-三乙酸基-N-乙酰基(DOTA-)丁二酰亚胺酯(NHS-)(DOTA-NHS)反应制备。DOTA-PEG3-Dur的ESI-MS:[MH]+＝2586.40(m/z),计算:2617.00。
实施例2[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin的放射合成
由回旋加速器通过18O(p,n)18F核反应生产的18F-，在N2气载带下，捕集在Sep-PakQMA阴离子小柱中，18O-水被收集在回收瓶中。用0.4mL生理盐水将QMA小柱中18F-洗脱入小瓶中，取50-100μL加入反应瓶中。取NOTA-PEG3-Cinnamycin(50μg/μL)50μL,加入2mM AlCl3溶液6μL、4μL冰醋酸以及乙腈300μL，混匀后，转移到反应瓶中。搅拌后，100℃加热反应10min左右。冷却，加入生理盐水8mL到反应瓶中，混匀，转移至HLB小柱或SEP-PAK C18小柱中。反应瓶中溶液全部转移完后，用10mL注射用水冲洗小柱，吹干小柱。最后，用乙醇1.5mL洗脱产品并经无菌滤膜后收集在接收瓶中，用生理盐水将其稀释成含5％乙醇的产品溶液，得到符合要求的[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin注射液。[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin未校正放射化学产率为20-40％，总放射合成时间为35min。
实施例3[68Ga]NOTA-PEG3-Cinnamycin和[64Cu]NOTA-PEG3-Cinnamycin的放射合成
在反应管中依次加入NOTA-PEG3-Cinnamycin(50μg/μL)50μL和1.25M乙酸钠溶液200μL。从68Ge/68Ga发生器中用0.05M盐酸4mL洗脱68Ga3+至该反应管中，混匀，调溶液pH至4.0，100℃加热反应10min左右。冷却，加入生理盐水4mL到反应瓶中，混匀，转移至HLB小柱或SEP-PAK C18小柱中。待反应瓶中溶液全部转移完后，用10mL注射用水冲洗小柱，吹干小柱。然后，用乙醇1.5mL洗脱产品并经无菌滤膜后收集到接收瓶中，用生理盐水将其稀释成含5％乙醇的产品溶液，得到符合要求的[68Ga]NOTA-PEG3-Cinnamycin注射液。[68Ga]NOTA-PEG3-Cinnamycin未校正放射化学产率大于为50％，总放射合成时间为30min。
在反应管中依次加入NOTA-PEG3-Cinnamycin(50μg/μL)100μL和64CuCl2溶液0.100-1.0mL，用乙酸钠溶液调至pH 4.0-5.6，室温反应15min左右。最后用生理盐水稀释并经无菌滤膜过滤后收集到接收瓶中，得到符合要求的[64Cu]NOTA-PEG3-Cinnamycin注射液。[64Cu]NOTA-PEG-Cinnamycin未校正放射化学产率大于为70％。
实施例4[68Ga]DOTA-PEG3-Cinnamycin和[64Cu]DOTA-PEG3-Cinnamycin的放射合成
在反应管中依次加入DOTA-PEG3-Cinnamycin(50μg/μL)50μL和1.25M乙酸钠溶液200μL。从68Ge/68Ga发生器中用0.05M盐酸4mL洗脱68Ga3+至该反应管中，混匀，调溶液pH至4.0，100℃加热反应10min。冷却，加入生理盐水4mL到反应瓶中，混匀，转移至HLB小柱中。待反应瓶中溶液全部转移完后，用15mL注射用水冲洗小柱，吹干小柱。然后，用乙醇1.5洗脱产品并经无菌滤膜后收集到接收瓶中，用生理盐水将其稀释成含5％乙醇的产品溶液，得到符合要求的[68Ga]DOTA-PEG3-Cinnamycin注射液。[68Ga]DOTA-PEG3-Cinnamycin未校正放射化学产率大于为60％，总放射合成时间约30min。
在反应管中依次加入DOTA-PEG3-Cinnamycin(50μg/μL)100μL和64CuCl2溶液0.100-1.0mL，用乙酸钠溶液调至pH 4.0-5.6，室温反应15min。最后用生理盐水稀释并经无菌滤膜过滤后收集到接收瓶中，得到符合要求的[64Cu]DOTA-PEG3-Cinnamycin注射液。[64Cu]DOTA-PEG3-Cinnamycin未校正放射化学产率大于为70％。
实施例5产品纯度和稳定性的测定
用放射性高效液相色谱(HPLC)和薄层色谱法(TLC)测定多肽PET药物注射液的放射化学纯度。用确定结构的非放射性标准品[Xn+]NOTA-PEG3-Cinnamycin和[Xn+]DOTA-PEG3-Cinnamycin，分别与相应的放射性多肽[Xn+]NOTA-PEG3-Cinnamycin和[Xn+]DOTA-PEG3-Cinnamycin注射液一同注射到HPLC中，或一同点样行TLC，以确定其保留时间或比移值Rf是否一致，并证实制备注射液的真实性，测定其放射化学纯度均大于95％。代表性[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin注射液放射性HPLC分析结果示于图1A(Rt＝15.81min)，放射化学纯度大于99％。
HPLC分析条件：分析柱为Zorbax eclipse xdb-c18柱。流动相为0.1％三氟乙酸(TFA)的乙腈溶液：0.1％TFA的水溶液，行梯度洗脱：0min时，含0.1％TFA的乙腈溶液/0.1％TFA的水溶液：2/98；逐渐升到8min时，0.1％TFA的乙腈溶液/0.1％TFA的水溶液：10/90；再升到20min时，0.1％TFA的乙腈溶液/0.1％TFA的水溶液：80/20。流速为1mL/min，紫外检测波长210nm和254nm。
TLC法检测放射性[Xn+]NOTA-PEG3-Cinnamycin和[Xn+]DOTA-PEG3-Cinnamycin注射液的放射化学纯度。取一条硅胶板，放到屏蔽铅玻璃后面，用毛细管吸取少许放射性样品及其标准品(浓度0.5mg/mL)，一同轻轻点在硅胶板上距离一头1.5cm处，用电吹风吹干。在层析缸内进行层析，展开剂为甲醇：1.0M乙酸铵＝50:50(V/V)，层析后用热空气吹干，采用放射性TLC扫描仪行薄层扫描。扫描后，用碘染色TLC板，检测放射性样品和标准品的比移值Rf。代表性[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin注射液Rf＝0.45。
检测[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin在动物体内血浆稳定性，HPLC检测显示在15min时出现单一高峰，没有检测到其它峰，提示[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin在体内的2h中没有脱氟和分解现象(图1B)。同样，检测[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin体外稳定性，与大鼠血清2小时37℃孵育2h，HPLC显示在15min时只出现单一高峰，而未观察到其它峰(图1C)。结果表明，[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin在内外血浆中较稳定。
以下针对[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin实施例1-5，进行体内生物分布、体外生物活性实验及其体内模型动物PET显像研究。
实验例1体内生物分布的测定
检测5-120min 6个时间点[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin在心梗(MI)模型鼠内主要脏器、组织的生物分布(％ID/g)(图2A)和心梗区/心脏放射性比值(图2B)。[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin(图2A)在肝脏、肾脏和心梗区中有明显的放射性浓集，在所选取的脏器中具有较高的摄取率，且滞留时间较长,其中15～120min时间段内肾脏摄取值高于其它组织器官，60min时心梗区/心脏放射性比值达3.4；大脑、心脏、胃、小肠、胰腺、肌肉、骨骼始终处于较低水平，血液、肺和脾脏也有一定放射性摄取，血液放射性清除较快；放射性主要经肾脏排泄，30min时肾中放射性积聚高达(5.4±0.14)％ID/g。
实验例2心肌细胞摄取实验
大鼠H9C2心肌细胞由上海中科院细胞库提供，37℃和5％CO2恒温箱中培养。采用杜贝克改良鹰氏培养基(DMEM)、10％胎牛血清和100μg/mL链霉素和100IU/mL青霉素。在对数生长期收获细胞，接种于12孔板，密度为1×107细胞/深夜孵育，分为五组：对照组、缺氧组、治疗组、质粒干预组。采用乙酰半胱氨酸(Acetylcysteine,NAC)干预治疗组氯化钴(CoCl2)诱导的低氧，质粒转染组通过质粒转染获得H9C2细胞中整合素β3的过表达(O-EXP)和低表达(L-EXP)。在不同浓度(300、600、900μM)和不同缺氧时间(6、12、24h)测定H9C2细胞凋亡中[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin的摄取。每孔细胞加入0.22mBq的[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin，用磷酸缓冲液(PBS)洗涤两个周期，37℃培养60min后用氢氧化钠(NaOH,0.2uM)消化，分别收集于离心管中。用γ放射免疫计数器测定细胞摄取活性，以每105个细胞的放射性表示。
通过CoCl2诱导H9C2细胞缺氧凋亡，检测[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin在缺氧H9C2细胞中的放射性摄取。H9C2细胞(接种在24孔板，每组n＝4)缺氧处理后，对[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin的摄取增加，氯化钴900μM/6h，[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin的摄取比值高达2.2(图3A)；CoCl2 600μM/12h，[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin的摄取比值达0.46cpm/10×5cell(图3B)。氯化钴600μM/6h在乙酰半胱氨酸(NAC，1μM)干预下，[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin摄取低于正常组(图3C)，证实NAC对缺氧细胞具有抗凋亡细胞摄取作用。
为验证在缺氧条件下凋亡蛋白的表达，通过Western blot证实缺氧环境下H9C2细胞Caspase3表达上调(图3D)。为检测Caspase 3在心肌梗塞(MI)模型中的表达，Westernblot检测发现心梗区Caspase 3表达升高(图3E)。H9C2细胞缺氧处理后，通过流式细胞术分析证实细胞凋亡，600μM/6h凋亡率48.43％(图3F)。这些结果表明[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin可被凋亡细胞摄取。
实验例3心梗模型[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin PET-CT显像
9周龄雄性Sprague-Dawley大鼠，体重200～220g，被放置在无特定病原体(SPF)动物实验室，允许自由获取食物和水。如前所述，永久性冠状动脉前降支(LAD)结扎可诱发跨壁心肌梗死，在心电图仪上通过观察心肌白化和ST段抬高，确认闭塞成功。假手术动物接受类似的外科手术，包括打开心包，在LAD下缝合。动物分为3组：心肌梗死组(n＝36)、对照组(n＝12)和治疗组(n＝24)。治疗组大鼠术前腹腔注射乙酰半胱氨酸(NAC，0.1g/kg)。这项研究是按照机构动物护理和使用委员会批准的方案进行的。
PET-CT检测分子示踪剂和FDG在心梗区的摄取情况。如图4A所示，MI鼠在尾静脉注射[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin 30分钟后，心梗区开始出现放射性聚集，随着时间的推移，在60min时达到峰值，随后摄取降低。假手术组图4B，正常心肌在60min时对示踪剂的摄取无显著差异。计算术后各时间点的示踪剂在心梗区相对于左室正常区的平均摄取率(I/L)和相对于骨骼肌的平均摄取率(I/M)，I/L和I/M峰值分别出现在75min和60min(图4D和图4E)。心肌梗死大鼠在术后4个时间点对[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin摄取有显著差异。术后第1天摄取最高，而第3和第7天示踪剂摄取逐渐减退，第28天无明显摄取。计算术后各时间点的示踪剂的I/L值，图4F显示，第1和第3天MI组的I/L平均摄取率高于NAC治疗组(n＝6，P<0.05)；第7天后I/L摄取率无显著性差异。术后各时间点[18F]FDG的I/L摄取逐渐升高(图4F)，其图像可与心肌梗死大鼠[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin图像适当融合，显示[18F]FDG的“负”摄取与梗死心肌[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin的“正”摄取匹配。
实验例4心梗模型病理和细胞凋亡评估
组织学检测心梗区细胞凋亡和凋亡蛋白的表达。如图5所示；MI组和假手术(Sham)组心脏解剖，石蜡包埋切片(n＝3×2，每样本连续切2张)，TUNEL染色(比例尺＝50μm)，第一天凋亡率最高，随后降低；Caspase-3表达(比例尺＝50μm)在第一天和第三天最高。MI组和Sham组，术后不同时间TUNEL检测细胞凋亡的变化以及caspase-3蛋白和integrinβ3表达，示于图5。
实验例5抗肿瘤治疗动物模型PET显像
第4周龄裸鼠每笼圈养5只小鼠，于动物实验中心执行统一管理，标准条件为室温25℃，湿度50％。裸鼠右前肢腋下位置，皮下注射细胞浓度为5×106/ml的培养基，分别接种肺癌HCC827细胞株，继续培养以备用。当裸鼠肿瘤长至直径0.5-1.0cm时，将裸鼠分为两组：肿瘤治疗模型组，厄洛替尼治疗剂量为50mg/kg，治疗1天后显像；对照组，向裸鼠尾静脉注射生理盐水以作空白对照。
经过厄洛替尼治疗处理的肿瘤模型，注射[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin后60min时显像后处死动物，解剖取感兴趣组织，测定组织器官质量和放射性计数，计算肿瘤/肌肉放射性比值，结果示于下表。结果表明，[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin在未经治疗处理的肿瘤组织无摄取，而经治疗处理的肿瘤组织有高摄取；与未经治疗处理的肿瘤模型比较，经治疗处理后[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin的肿瘤/肌肉放射性摄取比值明显增高(示于图6)。结果表明，经治疗后肿瘤/非靶组织摄取比值增高，说明治疗监测PET显像有效，[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin可用于抗肿瘤治疗监测。
抗肿瘤治疗动物模型PET显像肿瘤/非靶组织摄取比值
Figure BDA0002404600930000101
心肌细胞凋亡和修复是心血管疾病主要病变表现。通过结合心肌细胞表达的特异性受体进行PET显像，具有预示性和靶向性。本发明发现，凋亡示踪剂[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin可被凋亡的H9C2心肌细胞高摄取，能在活体的缺血心肌组织中高积聚，这与受损心肌中TUNEL和Caspase3高表达相符，反映凋亡示踪PET显像的良好效果。另外，经靶向治疗的肺癌组织摄取[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin明显增加，说明[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin可用于抗肿瘤治疗监测。[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin是一种很有前景的细胞凋亡PET药物，可用于心肌梗死、抗肿瘤治疗监测以及与细胞凋亡有关疾病的无创评估和干预治疗PET显像。
预实验表明，本发明的其他实施例，包括实施例1-5的[68Ga]NOTA-PEG3-Cinnamycin、[64Cu]NOTA-PEG3-Cinnamycin、[68Ga]DOTA-PEG3-Cinnamycin和[64Cu]DOTA-PEG3-Cinnamycin与本发明的[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin试验例1-5具有相类似的结果。

Claims (10)

1.靶向磷脂酰乙醇胺的放射性标记三聚乙二醇修饰肉桂霉素Cinnamycin的多肽化合物R-PEG3-Cinnamycin，由药效基团-Cinnamycin、药代动力学基三聚乙二醇基-PEG3和结合放射性金属核素螯合基-R构成，其结构式为式1，其中，R＝[Xn+]-1,4,7-三氮杂环九烷基-N’,N”-二乙酸基-N-乙酰基[Xn+]NOTA-，[Xn+]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N’,N”N”’-三乙酸基-N-乙酰基[Xn+]DOTA-或其它[Xn+]螯合基；Xn+＝68Ga3+,[Al18F]2+，[64Cu]或其它放射性金属离子；PEG3为药代动力学基三聚乙二醇基；
Figure FDA0002404600920000011
2.根据权利要求1所述的多肽化合物R-PEG3-Cinnamycin，其特征在于：R＝[Xn+]-1,4,7-三氮杂环九烷基-N’,N”-二乙酸基-N-乙酰基，[Xn+]NOTA-。
3.根据权利要求1所述的多肽化合物R-PEG3-Cinnamycin，其特征在于：R＝[Xn+]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N’,N”N”’-三乙酸基-N-乙酰基，[Xn+]DOTA-。
4.权利要求1或2所述的多肽化合物R-PEG3-Cinnamycin的制备方法，其特征在于用以下方法制备：以NOTA-PEG3-Cinnamycin为前体原料，分别与[Xn+]发生螯合反应并经小柱分离纯化，制成多肽PET药物R-PEG3-Cinnamycin。
5.权利要求4所述多肽化合物R-PEG3-Cinnamycin的制备方法，其特征在于所说的前体原料NOTA-PEG3-Cinnamycin用以下方法制备：Cinnamycin修饰PEG3后形成Cinnamycin-PEG3-NH2，与1,4,7-三氮杂环九烷基-N’,N’-二乙酸基-N-乙酰基丁二酰亚胺酯NOTA-NHS在微碱性溶液中室温下反应1-2小时，用制备型HPLC分离纯化收集产品峰，即可获得。
6.权利要求1或2所述的多肽化合物R-PEG3-Cinnamycin的制备方法，其特征在于所说的[68Ga]NOTA-PEG3-Cinnamycin用以下方法制备：所述的前体原料NOTA-PEG3-Cinnamycin与弱酸性68GaCl3溶液在100-110℃加热下反应，用HLB小柱或SEP-PAK C18小柱分离纯化，即得到[68Ga]NOTA-PEG3-Cinnamycin注射液。
7.权利要求1或2所述放射性多肽化合物R-PEG3-Cinnamycin的制备方法，其特征在于所说的[18F]AlF-NOTA-PEG3-Cinnamycin，用以下方法制备：所述的前体原料NOTA-PEG3-Cinnamycin在AlCl3、冰醋酸和乙腈存在下与[Al18F]2+反应，经HLB小柱或SEP-PAK C18小柱分离纯化，即得到[18F]AlF-NOTA-PEG3--Cinnamycin注射液。
8.权利要求1-3之一的多肽化合物R-PEG3-Cinnamycin在制备PET显像剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的多肽化合物R-PEG3-Cinnamycin在制备PET显像剂中的应用，其特征在于所述的应用为神经退行性疾病、脑中风、血栓、动脉粥样斑、心肌梗塞以及抗肿瘤治疗疗效监测的PET显像早期鉴别诊断显像剂中的应用。
10.根据权利要求8所述的多肽化合物R-PEG3-Cinnamycin在制备PET显像剂中的应用，其特征在于所述的应用为与细胞死亡或细胞凋亡过程中与PS有关病变的鉴别诊断与疗效监测PET显像剂中的应用。
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