CN102014970A - 99mTc标记的含19个氨基酸的多肽作为磷脂酰乙醇胺结合分子探针和放射性药物的用途 - Google Patents

Abstract

只有19个氨基酸的耐久霉素是已知的具有明确三维结合结构的最小多肽。耐久霉素与磷脂酰乙醇胺(PtdE)以1∶1的比例发生高亲和力和专一特异性的结合。作为一种含量丰富的结合靶标，PtdE是一种主要的磷脂，占哺乳动物细胞膜中磷脂含量的约20％。PtdE被外化到凋亡细胞的表面，由于质膜完整性受损，坏死细胞的PtdE也可及。考虑到耐久霉素的独特理化性质和急性细胞死亡的PtdE可及性，本研究的目标是研制开发和评价作为新的PtdE成像分子探针的^99mTc-HYNIC-耐久霉素。^99mTc-HYNIC-耐久霉素是一种低分子量快速清除的放射性药物，通过结合PtdE检测凋亡/坏死。目标是定量检测心肌缺血和再灌注后危险区的^99mTc-HYNIC-耐久霉素摄取，并确定检测窗口。

Description

99mTc标记的含19个氨基酸的多肽作为磷脂酰乙醇胺结合分子探针和放射性药物的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2008年3月10日提交的美国专利临时申请第61/068,764号的优先权。

关于政府关注的声明

无。

发明背景

对包括凋亡和坏死的急性细胞死亡的非侵入性成像术在评估退变性疾病和监测肿瘤治疗中具有重要意义。要获得更好更早的图像，必须不断努力去发现和开发能提供改进结合、药代动力学和生物分布性质的摄取机制和分子探针。

锝(technetium)-99m(^99mTc)是一种用于放射性同位素医学检测的发射γ射线的同位素，例如，作为医疗设备可在体内检测到的放射性示踪物。^99mTc非常适合该作用，因为其易发射可检测的140keVγ射线。^99mTc发射的γ射线半衰期为6.1小时，表示其中约15/16(93.7％)在24小时内衰减为⁹⁹Tc。该同位素的短半衰期允许进行迅速收集数据的扫描方法，而患者暴露于辐射可保持在低水平。

^99mTc通过核内的核子重排衰减为锝-99(Tc-99，同一同位素的较低激发态)。锝-99发射柔和的β射线，但不发射γ射线。

由于^99mTc半衰期短，对于核医学目的而言，通常从含Mo-99的锝-99m发生器中提取^99mTc，Mo-99是该同位素通常的母核素。为Tc-99m医学应用生产的大多数Mo-99来自HEU裂变，全世界仅有四个反应堆：加拿大的NRU、比利时的BR2、南非的SAFARI-1和荷兰的HFR。由LEU生产是可能的，并提议在澳大利亚的新OPAL反应堆以及其它地点生产。激发Mo-98是现今规模较小的另一种生产途径(CRP从LEU或IAEA中子激发产生Mo-99)

每年有两千万个核医学诊断方法采用^99mTc。核医学中约85％的成像诊断方法采用该同位素。根据核医学方法的类型，用Tc-99m标记(或与之结合)的药物可将Tc-99m运输到所需部位。例如，Tc-99m与依沙美肟化学结合时，该药物能透过血脑屏障流入脑血管，可观察脑血流(也用于标记白细胞观察感染部位)。Tc-99m甲氧基异丁基异腈用于心肌灌注成像，可显示血流流过心脏的良好程度。进行肾功能测定和成像时采用用Tc-99m标记的巯基乙酰基三甘氨酸，称为MAG3扫描。

^99mTc由合成物质核裂变的副产物钼-99制得。因为其母核素是钼-99，^99mTc适合于现代医学。钼-99的半衰期为约66小时，衰减为^99mTc、负β粒子和反中微子：

99Mo(负β衰减)→99mTc+β-+v

其中β-＝负β粒子(电子)，v＝反中微子；

⁹⁹Mo(负β衰减)→99mTc+β-+v

其中β-＝负β粒子(电子)，v＝反中微子，然后经历同质异能跃迁产生⁹⁹Tc和单能γ射线：

99mTc→99Tc+γ。

称为SPECT的单光子发射计算机断层摄影术是一种采用γ射线的核医学成像技术。在锝-99的使用中，将该放射性同位素给予患者，逃逸的γ射线入射在计算图像的γ相机上。为了获得SPECT图像，γ相机围绕患者转动。转动期间通常每3-6度，获得确定点的投影。在大多数情况下，采用全360度转动可获得最佳重建。获得每个投影的耗时也可不同，但通常为15-20秒。这使得总扫描时间需要15-20分钟。锝-99放射性同位素主要用于扫描骨和脑，以检查任何异常。虽然Tc-99可用于核医学成像诊断方法，但不用于任何治疗方法。

发明内容

本发明的一个方面是一种放射性药物化合物或其盐、溶剂化物或水合物，通过包括以下步骤或行动的方法制成：提供SEQ.ID.No.1所示的多肽序列或与SEQ.ID.No.1序列具有至少70％序列相似性的序列，其中所述多肽在第1-18、4-14和5-11位氨基酸之间包含硫醚键，所述多肽在第6-19位氨基酸之间包含酰胺键，其中一个或多个如以下结构所示的远端部分

与所述多肽的第1位、第2位，或第1位和第2位的氨基酸共价结合，且其中R¹和R²各自独立地是直链或支链、饱和或不饱和的C_1-4烷基，所述一个或多个远端部分与^99mTc^x、(^99mTc＝O)⁺³、(^99mTc≡N)⁺²、O＝^99mTc＝O)⁺或(^99mTc(CO)₃)⁺螯合，其中x是选自+7、+6、+5、+4、+3、+2、+1、0和-1的氧化还原态或氧化态。

在所述放射性药物化合物的一个示范性实施方式中，R¹是CH₃，R²是CH₃。

在所述放射性药物化合物的另一个示范性实施方式中，SEQ.ID.No.1所示的化合物在第1位被远端部分取代。

在所述放射性药物化合物的另一个示范性实施方式中，SEQ.ID.No.1所示的化合物在第2位被远端部分取代。

在所述放射性药物化合物的另一个示范性实施方式中，SEQ.ID.No.1所示的化合物在第1位和第2位被远端部分取代。

在上述放射性药物化合物任何一种的另一个示范性实施方式中，其第7、10、12位或其组合的氨基酸被选自Val、Leu、Ile、Met、Trp或其组合的疏水性氨基酸取代。

在上述放射性药物化合物任何一种的另一个示范性实施方式中，其第8、13位或其组合的氨基酸被选自Val、Leu、Ile、Met、Phe或其组合的疏水性氨基酸取代。

在上述放射性药物化合物任何一种的另一个示范性实施方式中，所述多肽第1-4位和第16-19位的至少一个氨基酸残基被选自功能基团、聚合物、肽、蛋白质、复合物、颗粒和脂质体的至少一种修饰物所修饰。

在上述放射性药物化合物任何一种的另一个示范性实施方式中，所述被修饰的多肽基本上保留对磷脂酰乙醇胺的结合亲和力和特异性。

在上述放射性药物化合物任何一种的另一个示范性实施方式中，SEQ.ID.No.1所示的化合物被截短或延长，但基本上保留对磷脂酰乙醇胺的结合亲和力和特异性。

本发明的另一个方面是一种药物的可注射剂型，其包含上述放射性药物化合物以及可注射的载体系统。

本发明的另一个方面是一种对心脏凋亡和/或坏死、动脉粥样硬化斑块或急性心肌梗死成像的方法，包括给予患者上述剂型的药物并对^99mTc发射的γ射线成像的步骤或行动。

本发明的另一个方面是一种放射性药物化合物或其盐、溶剂化物或水合物，通过包括以下步骤或行动的方法制成：提供SEQ.ID.No.1所示的多肽序列或与SEQ.ID.No.1序列具有至少70％序列相似性的序列，其中所述多肽在第1-18、4-14和5-11位氨基酸之间包含硫醚键，所述多肽在第6-19位氨基酸之间包含酰胺键，其中一个或多个如以下结构所示的远端部分

与所述多肽的第1位、第2位，或第1位和第2位的氨基酸共价结合，且其中R¹和R²各自独立地为直链或支链、饱和或不饱和的C_1-4烷基，所述一个或多个远端部分与选自¹¹¹In⁺³、¹¹¹In⁰、¹¹¹In^-5、¹²⁵I^-1、¹²⁵I⁰、¹²⁵I⁺⁷、¹³¹I^-1、¹³¹I⁰、¹³¹I⁺⁷、¹⁸F^-1、¹⁸F⁰、⁶⁴Cu⁰、⁶⁴Cu⁺¹、⁶⁴Cu⁺²或⁶⁴Cu⁺³的同位素螯合。

本发明的另一个方面是一种药物的可注射剂型，包含上述放射性药物化合物和可注射的载体系统。

本发明的另一个方面是一种心脏凋亡和/或坏死、动脉粥样硬化斑块或急性心肌梗死成像的方法，包含给予患者上述剂型的药物并对该同位素发射的γ射线成像的步骤或行动。包含¹⁸F^-1、¹⁸F⁰、⁶⁴Cu⁰、⁶⁴Cu⁺¹、⁶⁴Cu⁺²或⁶⁴Cu⁺³同位素的放射性化合物采用正电子发射成像术(PET)进行成像。本文所用的经6-肼基吡啶-3-羧酸(HYNIC)修饰、用^99mTc标记的耐久霉素及其螯合物称为^99mTc-HYNIC-耐久霉素或类似名称，

远端部分与2-Lys共价结合。

本发明的另一个方面是一种放射性药物化合物，通过在放射化学中可变化但用^99mTc标记耐久霉素结果稳定的方法，将^99mTc^x原子掺入耐久霉素中。这些^99mTc放射化学的变化包括氧化还原态((+7、+6、+5、+4、+3、+2、+1、0和-1氧化态)不同的放射性同位素和/或与螯合核心和辅配体螯合和不螯合。所得的放射性药物化合物用作预定成像装置中的成像剂足够稳定。所述^99mTc-耐久霉素复合物(含或不含螯合核心和/或辅配体)可通过耐久霉素的结合活性将放射性靶向递送给组织和器官。对于放射性标记而言，锝核心可以是“裸露”的锝原子、^99mTc(III)核心、^99mTc(IV)核心、[^99mTc＝O]³⁺核心、[^99mTc≡N]²⁺核心、[O＝^99mTc＝O]⁺核心、[^99mTc(CO)₃]⁺核心或[^99mTc]HYNIC核心。该螯合分子可包含一个或多个与耐久霉素共价或非共价结合的单功能-、双功能-或多功能物质，包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、生物素、谷胱甘肽、抗体、抗原等。^99mTc螯合构象可包含N₂S₄、N₂S₃、N₂S₂或N₃S。螯合基团的变化可包含天然和/或修饰氨基酸，如不同长度和组合的Gly-Ser-Cys、Gly-Gly-Cys、Cys-Gly-Cys、Lys-Gly-Cys、Gly-Ala-Gly、His-His-His、MAG₃、MAG₂-NH₂、苯甲酰-MAG₃、甲基-MAG₂-NH₂等(MAG是巯基乙酰基三甘氨酸，一种与放射性元素螯合的化合物)。除^99mTc的核心放射化学外，辅配体可以不同，其中常见的辅配体包括N-(羟甲基)甲基甘氨酸、膦化合物、dicine、N-二(羟乙基)甘氨酸、葡庚糖酸盐、EDDA(乙二胺-N，N’-二乙酸酯)、亚胺-N-杂环、PADA(吡啶-2-偶氮-p-二甲苯胺)等。本发明的另一个方面是一种药物的可注射剂型，其包含这些放射性药物化合物的任何一种以及可注射的载体系统。另一个方面是一种心脏凋亡和/或坏死、动脉粥样硬化斑块或急性心肌梗死成像的方法，包括给予患者这些药物剂型的任何一种并对该同位素发射的γ射线成像的步骤或行动。^99mTc的放射化学性质的发现可参见：Liu S等，“可作为诊断放射药物的^99mTc标记的小肽”(^99mTc-labeled small peptides as diagnostic radiopharmaceuticals)，Chem Rev.1999；99：2235-2268，将其全文纳入本文。

本发明的另一个方面是一种放射性药物化合物或其盐、溶剂化物或水合物，通过包括以下步骤或行动的方法制成：提供SEQ.ID.No.1所示的多肽序列或与SEQ.ID.No.1序列具有至少70％序列相似性的序列，其中所述多肽在第1-18、4-14和5-11位氨基酸之间包含硫醚键，所述多肽在第6-19位氨基酸之间包含酰胺键，其中一个或多个如以下结构所示的远端部分

与所述多肽的第1位、第2位，或第1位和第2位氨基酸共价结合，其中x是选自+7、+6、+5、+4、+3、+2、+1、0和-1的氧化还原态或氧化态。

在上述放射性药物化合物的一个示范性实施方式中，SEQ.ID.No.1所示的化合物在第1位被所述远端部分取代。

在上述放射性药物化合物的另一个示范性实施方式中，SEQ.ID.No.1所示的化合物在第2位被所述远端部分取代。

在上述放射性药物化合物的另一个示范性实施方式中，SEQ.ID.No.1所示的化合物在第1位和第2位被所述远端部分取代。

在上述放射性药物化合物中任何一种的另一个示范性实施方式中，其第7、10、12位或其组合的氨基酸被选自Val、Leu、Ile、Met、Trp或其组合的疏水性氨基酸取代。

在上述放射性药物化合物中任何一种的另一个示范性实施方式中，其第8、13位或其组合的氨基酸被选自Val、Leu、Ile、Met、Phe或其组合的疏水性氨基酸取代。

在上述放射性药物化合物任何一种的另一个示范性实施方式中，所述多肽第1-4位和第16-19位的至少一个氨基酸残基被选自功能基团、聚合物、肽、蛋白质、复合物、颗粒和脂质体的至少一种修饰物所修饰。

在上述放射性药物化合物任何一种的另一个示范性实施方式中，所述被修饰的多肽基本上保留对磷脂酰乙醇胺的结合亲和力和特异性。

本发明的另一个方面是一种药物的可注射剂型，其包含上述放射性药物化合物的任何一种和可注射的载体系统。

本发明的另一个方面是一种心脏凋亡和/或坏死、动脉粥样硬化斑块或急性心肌梗死成像的方法，包含给予患者任何一种上述剂型的药物并对^99mTc^x发射的γ射线成像的步骤或行动。

示范实施例的附图说明

图1：图A包括说明带交联桥的耐久霉素的一级结构图，^99mTc-HYNIC-耐久霉素在纯化前后的放射性HPLC色谱图分别见图B和图C，其中纯化前存在低(但显著)水平的高锝酸锝，滞留时间2分钟，图D显示三个独立实验的代表性竞争曲线，^99mTc-HYNIC-耐久霉素与凋亡细胞的结合因存在含PtdE的脂质体()而并非其它种类的磷脂而竞争性减少，其它种类的磷脂包括PtdC(■)、PtdG(□)或PtdS(○)。

图2：图A显示健康大鼠中^99mTc-HYNIC-耐久霉素的血液清除率(n＝3)，图B显示^99mTc-HYNIC-耐久霉素标准品的放射性HPLC色谱图，图C显示注射1分钟后的血清，图D显示注射5分钟后的血清，图E显示注射60分钟后的尿液。

图3：图A显示健康大鼠中^99mTc-HYNIC-耐久霉素分布的动态平面图像，其中显示了该放射性示踪物的快速肾脏清除和肝脏低摄取，图B显示急性心肌梗死大鼠^99mTc-HYNIC-耐久霉素摄取的全身动态平面图像，图C显示假手术后(左)和梗死后(右)大鼠静脉注射^99mTc-HYNIC-耐久霉素120分钟后获得的非色彩增强原始计数静态平面图像，其中梗死部位用箭头标出，在放射自显影中，心肌膜的放射性摄取部位与梗死部位相同，梗死-非梗死的比率极佳(小图)，肾脏和膀胱的位置分别用“K”和“B”标出。

图4：图A显示注射^99mTc-HYNIC-耐久霉素后相同时间点获得的典型前部平面图像，图B显示心肌缺血和再灌注大鼠模型的梗死(条纹)、缺血非梗死(点)和正常(实心)心肌膜的^99mTc-HYNIC-耐久霉素摄取动力学，其中在注射2小时后注射^99mTc-HYNIC-耐久霉素，注射后3、10、20、60和180分钟采集放射性摄取样品，各数据点表示为4只大鼠测量的平均值和标准偏差。

图5显示心肌缺血和再灌注大鼠模型应用^99mTc-HYNIC-耐久霉素的AMI检测窗口的表征，其中图A显示梗死2小时、1天、2天、3天、5天和7天后注射^99mTc-HYNIC-耐久霉素1小时后获得的大鼠典型前部全身平面图像，梗死部位用箭头标出，图B包括大鼠心脏短轴中段的放射自显影，从该放射自显影测量到的梗死-非梗死比率的变化为梗死年龄的函数，显示于图C中。

图6显示HYNIC修饰的耐久霉素的合成和结构图。

图7显示用^99mTc-HYNIC-耐久霉素的动脉粥样硬化斑块荧光成像。

图8显示^99mTc-HYNIC-耐久霉素的一种可能的结构，其它螯合结构也有可能。本发明的^99mTc-HYNIC-耐久霉素不限于图8所示的结构。图8所示的结构在本文中也称为^99mTc-HYNIC-耐久霉素。

示范性实施方式详述

耐久霉素的修饰形式如SEQ ID.NO.1所定义，其中耐久霉素在赖氨酸-2和/或丙氨酸-1经6-肼基吡啶-3-羧酸(HYNIC)共价修饰，为^99mTc提供螯合位点(见图1A-C)。

耐久霉素的同源物包含在第1和/或2位的氨基酸经HYNIC共价修饰的多肽序列中至少一个氨基酸的保守取代。

锝-99m是锝-99的亚稳态核异构体，表示为^99mTc。“m”表示其为亚稳态核异构体，意为其衰减时不会变为另一种元素(即嬗变)。它是一种用于放射性同位素医学检测的发射γ射线的同位素，例如，作为医学设备可以在体内检测到的放射性示踪物。它非常适合这种作用，因为它易于发射可检测的140keVγ射线(这些射线与常规X光诊断设备发射的波长相同)，其γ射线的半衰期为6.01小时(意为其中约15/16(93.7％)在24小时内衰变为⁹⁹Tc)。该同位素的短半衰期允许进行迅速收集数据的扫描方法，而患者暴露于辐射可保持在低水平。

螯合是两个-或多个配体的结合或络合。这些配体常为有机化合物，称为螯合剂、螯合物或多价螯合剂。根据ASTM-A-380，螯合剂是“能与某些金属离子形成可溶性复合分子，使离子失活而不能与其它元素或离子正常反应产生沉淀或结垢的化学物质”。配体与底物形成螯合复合物。该术语对金属离子与螯合剂的两个或多个原子结合(形成)的复合物有保留。

本文使用的所有技术和科学术语的含义与本领域普通技术人员通常所理解的相同。

“活化的”和/或“活性”指保留天然耐久霉素生物活性的一种或多种多肽形式，活性保持指能够表现与SEQ ID.NO.1编码的耐久霉素多肽基本上相似的体内活性的化合物。

生物“活性”指具有天然产生分子的结构、调节或生化功能的蛋白质。

“氨基酸”包括包含氨基功能和羧基功能二者的所有(天然或合成)化合物，包括氨基酸类似物和衍生物。本发明的氨基酸可为在蛋白质中发现的天然产生的氨基酸，或天然产生的包含氨基和羧基的这些氨基酸合成代谢或分解代谢的产物。特别适合的氨基酸侧链包括选自以下氨基酸侧链的侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。

“氨基酸残基”指缺乏羧基中-OH的氨基酸或肽分子。本文所用表示氨基酸和保护基团的术语与IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Commission on Biochemical Nomenclature)推荐的术语一致(Biochemistry(1972)11：1726-1732)。例如，Met、Ile、Leu、Ala和Gly分别表示甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸和甘氨酸残基，其中残基是相应的α-氨基酸去除了羧基的OH和α-氨基的H衍生得到的基团。

“凋亡”指程序性细胞死亡，是一种导致细胞死亡的内源性细胞死亡程序。

“结合亲和力”指一个结合位点与一个决定簇之间相互作用(及二者之间立体化学相容性)强度的热力学表达。

“结合位点”指分子或分子复合物(根据其形状)与另一个分子有益地缔合(或结合)的区域。这样的其它分子是结合位点的配体。如耐久霉素第5-15位氨基酸所确定的结合位点类似于一面墙壁围成称为“口袋”的空间。结合位点的配体处于口袋内。

“结合特异性”、“特异性结合”和“特异地结合”指蛋白质/肽与激动剂、抗体、拮抗剂、小分子或任何天然或合成结合组合物之间的相互作用。该相互作用取决于结合分子所识别的蛋白质是否存在特定结构，例如，抗原决定簇或表位。例如，耐久霉素的结合口袋类似于手套形状的表面，以明确的理化相互作用恰好围绕着PtdE的头部基团。该疏水结合口袋包含来自Gly-8、Pro-9和Val-13的亲脂性侧链。头部乙醇胺基团的结合通过PtdE的铵基与Asp-15羧酸根之间的离子对相互作用而稳定。耐久霉素结合口袋与乙醇胺头部基团之间的整体紧密适配赋予热力学稳定性和对PtdE的专一特异性。

各种语法形式的“结合”指分子、化学化合物或化学实体之间的接近状态。这种缔合可为非共价(即未形成键或可逆)，其中能量并置优选通过氢键、范德华力或静电相互作用，或可为共价(即形成键或不可逆)。

“螯合剂”指具有两个或多个可贡献给金属离子的未共用电子对的分子，常为有机分子，这种包含结合金属离子的复合物含有螯合剂的两个或多个原子。

“复合物”指由一个或多个富含电子或缺乏电子的分子或原子联合形成的化合物，所述分子或原子能与一个或多个缺乏电子的分子或原子独立存在，各自也能独立存在。

“保守序列”指与多个其它种类的生物或同一生物产生的不同分子相似或相同的核酸或氨基酸序列。

“保守性氨基酸取代”指预测最少干扰原始蛋白质性质的取代，即蛋白质的结构和特别是功能是保留的，没有因为这种取代而发生显著变化。保守性氨基酸取代通常维持(a)取代区域内的多肽主链结构，(b)取代位点的分子电荷或疏水性，和/或(c)侧链的大部分。本发明包括的氨基酸取代基于氨基酸取代导致功能保留的可能性。

“延长的”指加长肽或蛋白质，常通过在N-或C-末端依次添加而加长。

“功能基团”指分子内的特定原子团，负责这些分子的特征性化学反应。相同的功能基团不论所属分子的大小，均经历相同或相似的化学反应。然而，其相对反应性可受到邻近功能基团的修饰。

“同源的”或“同源物”指具有至少30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％或95+％同源性和共同功能活性的氨基酸序列。例如，肉桂霉素是耐久霉素的一种同源物，其在第2位有一个氨基酸取代，Arg取代了Lys。耐久霉素与肉桂霉素的19个氨基酸中有18个序列相同，使它们的序列相似性达到95％。

“疏水”指分子受大量水排斥的物理性质。疏水分子倾向于是非极性的，因此优选其它中性分子和非极性溶剂。

“同位素”指同一化学元素的任何不同类型的原子，各自由于中子数目不同而具有不同的原子质量。

“脂质体”指由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小囊泡，可用于向哺乳动物递送药物(或化合物，如本文所述的化合物)。脂质体的组分通常排列成双层形式，与生物膜的脂质排列相似。

“修饰”指可在多肽中任何地方，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端发生的改变。一个给定的多肽可包含许多类型的修饰。例如，在本发明中，通过共价连接HYNIC修饰耐久霉素。

“部分”指分子的特定区段或功能基团。化学部分通常认为是嵌入分子中或附着于分子的化学实体。

“坏死”指由外部因素，如感染、毒素或外伤造成的未成熟或非自然的细胞和活组织死亡。

“核素”指含有特定数量质子和中子的原子核。总体来说，所有元素的所有同位素均可形成核素组。

“肽”和“多肽”可互换使用，指氨基酸聚合物。“多肽”是氨基酸残基通过肽键连接而成的聚合物，可天然或合成产生。少于约10个氨基酸残基的多肽通常称为“肽”。

“磷脂”指形成所有细胞膜主要组分的一类脂质，其可形成脂质双层。磷脂可包含甘油二酯、磷酸基团和简单的有机分子。

“聚合物”指包含通常由共价化学键连接的重复结构单元的大分子。

“蛋白质”指包含一个或多个多肽链的大分子。蛋白质也可包含非肽组分，如糖基。可通过产生蛋白质的细胞将糖和其它非肽取代基加入到蛋白质中，糖和其它非肽取代基随细胞类型而不同。蛋白质包括氨基酸主链结构以及通常不说明但仍然存在的取代基如糖基团。

“放射性同位素”或“放射性核素”指具有不稳定核(特征是能量过强)的原子，可将其给予核内新产生的辐射粒子。放射性同位素经历放射性衰变而发射γ射线。

氨基酸序列比较中的“序列基本相似”指对该区段(或其互补链)进行比较时，在带有适当的氨基酸插入、缺失或取代的最优比对时，有至少约50％的氨基酸相同，至少56％、至少59％、至少62％、至少65％、至少68％、至少71％、至少74％、至少77％、至少80％、至少约85％、至少约90％、至少约95-98％、或高达约99％或更多的氨基酸相同。

“取代”或“被取代”暗指这种取代所产生的化合物稳定，不会自发转化。例如，一些动力学形式是稳定的。“截短”指缩短肽或多肽，常通过将多肽的天然N-或C-末端切除。本发明考虑的截短蛋白质包括：去除多肽羧基末端一个或多个氨基酸残基，或去除多肽氨基末端一个或多个氨基酸残基，或去除多肽内部区域(即不从两端)的一个或多个氨基酸残基的那些蛋白质。

在急性冠状动脉综合征(ACS)病例中，具有非典型症状的患者向急诊医学提出了重大挑战(Pope JH等，HP.“急诊部门对急性心脏缺血的误诊”(Missed diagnoses of acute cardiac ischemia in the emergency department)，N Engl J Med  2000；342：1163-70；Braunwald E等，美国心脏病学会(American College of Cardiology)，美国心脏协会(American Heart Association)，不稳定型心绞痛患者管理委员会(Committee on the Management of Patients With Unstable Angina)，“ACC/AHA 2002不稳定型心绞痛和非ST段抬高心肌梗死患者管理准则——摘要文章：美国心脏病学会/美国心脏协会专门小组关于实施准则的报告，不稳定型心绞痛患者管理委员会”(ACC/AHA 2002guideline update for the management of patients with unstable angina and non-ST-segment elevation myocardial infarction--summary article：a report of the American College of Cardiology/American Heart Association task force on practice guidelines，Committee on the Management of Patients With Unstable Angina)，J Am Coll Cardiol 2002；40：1366-74)。能特异性加快可疑ACS病例诊断的成像技术也有可能促进对胸痛患者的管理，提供对了解心脏病的进一步认识。初步研究已证明^99mTc-HYNIC-耐久霉素的独特成像性质，可潜在地满足诊断心脏成像诊断的标准(Zhao M等，“作为新的结合磷脂酰乙醇胺的分子探针的^99mTc标记的耐久霉素”(^99mTc-labeled Duramycin as a novel hosphatidylethanolamine-binding molecular probe)，J Nucl Med2008；49：1345-52)。

作为凋亡成像的靶分子，磷脂酰乙醇胺(PtdE)是含量第二丰富的磷脂，占哺乳动物细胞膜中所有磷脂的约20％(Alberts B等，《细胞分子生物学》，第四版(Molecular biology of the cell，Fourth edition)，Garland Science，New York，2002；Spector AA，Yorek MA，“膜脂质的组成和细胞功能”(Membrane lipid composition and cellular function)，J Lipid Res，1985，26(9)：1015-1035)。与磷脂酰丝氨酸(PtdS)相同，PtdE是一种质膜内层组分，很少存在于正常活细胞的表面(Bevers等，1999年8月，Biochim Biophys Acta.，18；1439(3)：317-330)。凋亡时，由于双层中磷脂的重分配受到促进，PtdE暴露于细胞表面上(Emoto等，1997年5月，Exp Cell Res1；232(2)：430-434)。坏死时，由于质膜完整性受损，PtdE接触到胞外环境。

与PtdS(外化时负责频死细胞清除的信号机制)不同，存在于凋亡细胞表面的PtdE似乎发挥调节作用。发泡和形成凋亡小体是必需步骤，此时胞内组分分别被包装，按照指令被清道夫细胞吞噬而不会引起炎症。作为凋亡的形态学标志之一，发泡是复杂膜结构重塑的结果。已证明PtdE的跨双层膜移动在凋亡细胞的小泡中特别强，其形态学变化部分归因于PtdE介导的肌动蛋白丝重组(Umeda M等，“胞质分裂期间的膜磷脂动力学：通过膜表面磷脂重分配调控肌动蛋白丝装配”(Membrane phospholipid dynamics during cytokinesis：regulation of actin filament assembly by redistribution of membrane surface phospholipid)，Chem Phys Lipids，1999，101(1)：81-91；MillsJC等，“凋亡膜发泡受肌球蛋白轻链磷酸化作用的调控”，J Cell Biol，1998，140(3)：627-636)。

PtdE的一种候选分子探针是耐久霉素，其为肉桂色链轮丝菌(Streptoverticillium cinnamoneus)产生的19个氨基酸肽(Hayashi F等，“PA48009的结构：耐久霉素的修改结构”(The structure of PA48009：the revised structure of Duramycin)，J Antiboiot(Tokyo)，1990，43(11)：1421-1430；Zimmermann N等，“羊毛硫抗生素耐久霉素B和C的溶液结构”(Solution structures of the lantibiotics Duramycin B and C)，Eur JBiochem，1993，216(2)：419-428)。在1∶1摩尔比时，耐久霉素与PtdE的头部基团发生高亲和力结合(Marki F等，“含羊毛硫氨酸肽的抗生素耐久霉素、耐久霉素B和C以及作为磷脂酶A2间接抑制剂的肉桂霉素的作用模式”(Mode of action of the lanthionine-containing peptide antibiotics Duramycin，Duramycin B and C，and Cinnamycin as indirect inhibitors of phospholipase A2)，Biochem Pharmacol.，1991，42(10)：2027-2035；Iwamoto K等，“耐久霉素和肉桂霉素对乙醇胺磷脂的曲率依赖性识别”(Curvature-dependent recognition of ethanolamine phospholipids  by Duramycin and Cinnamycin)，Biophys J.2007，93(5)：1608-1619；Seelig J，“脂质-肽相互作用的热力学”(Thermodynamics of lipid-peptide interactions)，Biochim Biophys Acta.，2004，1666(1-2)：40-50)。

耐久霉素的整体结构采取一种紧凑的环状构象，含有能与PtdE发生特异性相互作用的一个结合口袋(Hayashi 1990；Zimmerman 1993)。耐久霉素受三个内部硫醚连接的稳定作用，是已知的具有明确三维结合位点的最小多肽(Hayashi 1990；Zimmerman 1993)。耐久霉素的结合口袋类似于手套形状的表面，通过明确的理化相互作用恰好围绕着PtdE的头部基团。该疏水结合口袋包含来自Gly-8、Pro-9和Val-13的亲脂性侧链。PtdE的铵基与Asp-15羧酸根之间的离子相互作用对使乙醇胺头部基团的结合稳定。耐久霉素结合口袋与乙醇胺头部基团之间的整体紧密适配赋予稳定的热力学稳定性和对PtdE的专一特异性。此外，上部环中突出的两个Phe侧链通过锚定在膜双层的疏水核心使耐久霉素-膜结合稳定。

耐久霉素和其近邻类似物肉桂霉素的生物活性已得到了良好的表征，为体外生物学研究对它们的PtdE结合活性进行了探索(Aoki Y等，“研究磷脂酰乙醇胺跨双层运动的一种新的肽探针”(A novel peptide probe for studying the transbilayer movement of phosphatidylethanolamine)，J Biochem(Tokyo)，1994，116(2)：291-297；Machaidze G等，“Ro 09-0198(肉桂霉素)对磷脂酰乙醇胺的特异性结合：热力学分析”(Specific binding of Ro 09-0198(cinnamycin)to phosphatidylethanolamine：a thermodynamic analysis)，Biochemistry，2002，41(6)：1965-1971；Guder A等，“经过翻译后修饰的细菌素——羊毛硫抗生素”(Posttranslationally modified bacteriocins--the lantibiotics)，Biopolymers，2000，55(1)：62-73；Hosoda K等，“通过1H-NMR1与溶血磷脂酰乙醇胺复合的免疫增强剂肽肉桂霉素的结构测定”(Structure determination of an immunopotentiator peptide，cinnamycin，complexed with lysophosphatidylethanolamine by 1H-NMR1)，J Biochem(Tokyo)，1996，119(2)：226-230；Kaletta C等，“肉桂霉素(Ro 09-0198)的前肽序列：首个耐久霉素类羊毛硫抗生素结构基因”(Prepeptide sequence ofcinnamycin(Ro09-0198)：the first structural gene of a Duramycin-type lantibiotic)，Eur JBiochem，1991，199(2)：411-415)。

耐久霉素和肉桂霉素具有相似的PtdE结合活性，两个肽在远离结合口袋的远端有一个氨基酸差别。用脂质体证明，这两个肽以等摩尔比率结合PtdE的解离常数为纳摩尔范围(Guder 2000；Hosoda 1996；Kaletta 1991)。通过荧光标记证明肉桂霉素与凋亡细胞外化的PtdE结合(Emoto 1997)。本发明提供利用耐久霉素和肉桂霉素肽或其同源肽，研制体内应用的分子探针，至少部分归因于它们的分子量低、稳定性高、对PtdE结合的亲和力和特异性高。耐久霉素与肉桂霉素的氨基酸序列也反映了它们之间的相似性(表1)。

表1

多肽	氨基酸序列	SEQID NO.
			耐久霉素	CKQSCSFGPFTFVCDGNTK	1
肉桂霉素	CRQSCSFGPFTFVCDGNTK	2
			耐久霉素	CRQSCSFGPLTFVCDGNTK	3
耐久霉素	CANSCSYGPLTWSCDGNTK	4

应考虑到，保留肽功能活性的耐久霉素同源物也可用于本发明。表2中列出了预计允许耐久霉素同源物保持实质活性的结合口袋中保守性氨基酸取代的例子。此外，耐久霉素、肉桂霉素和耐久霉素同源物可用各种功能基团、聚合物、肽、蛋白质、复合物、粒子或脂质体进行修饰，基本上不影响该多肽对PtdE的结合亲和力和特异性。

表2

氨基酸位置	氨基酸残基	允许的取代
			1	Cys
2	Lys
			3	Gln
4	Ser
			5	Cys
6	Ser
			7	Phe	疏水性残基
8	Gly	疏水性残基(非Trp)
			9	Pro
10	Phe	疏水性残基
			11	Thr
12	Phe	疏水性残基
			13	Val	疏水性残基
14	Cys
			15	Asp
16	Gly
			17	Asn

18	Thr
			19	Lys

本发明包括用于PtdE非侵入性成像的锝-99m标记的耐久霉素的合成和表征，以及耐久霉素的HYNIC修饰和放射性标记。本发明还包括对作为PtdE的特异性快速清除分子探针的^99mTc-HYNIC-耐久霉素的表征。本文显示的急性细胞死亡的即时清晰成像采用了心肌缺血和再灌注的体内大鼠模型。

^99mTc-HYNIC-耐久霉素是检测凋亡/坏死的PtdE结合放射性药物。其在若干主要方面不同于现有的成像示踪物。只有19个氨基酸的耐久霉素是具有明确三维结合结构可能最小的多肽之一(Hayashi 1990；Zimmerman1993；Seelig 2004)耐久霉素也具有抗体样结合活性以及小分子样药物动力学性质。耐久霉素也提供快速肾脏清除和总体(包括肝脏)低背景(Zhao2008)。耐久霉素也通过高亲和力和特异性识别暴露的PtdE结合死亡和频死细胞(Zhao 2008)，这与磷脂酰丝氨酸(PS)结合示踪物，包括膜联蛋白V和突触结合蛋白I(Synaptotagmin I)的C2A结构域不同(Zhao M等，“用磁共振成像和靶向造影剂非侵入性检测凋亡”(Non-invasive detection of apoptosis using magnetic resonance imaging and a targeted contrast agent)，Nat Med，2001，7：1241-44；Jung HI等，“用突触结合蛋白I的C2A结构域检测凋亡”(Detection of apoptosis using the C2A domain of synaptotagmin I)，Bioconjugate Chem，2004，15：983-7；Blankenberg FG等，“程序性细胞死亡中磷脂酰丝氨酸表达的体内检测和成像”(In vivo detection and imaging of phosphatidylserine expression during programmed cell death)，Proc Natl Acad Sci USA，1998，95：6349-54；Ohtsuki K等，“锝-99m HYNIC-膜联蛋白V：体内检测凋亡的一种潜在放射性药物”(Technetium-99m HYNIC-Annexin V：a potential radiopharmaceutical for the in-vivo detection of apoptosis)，Eur JNucl Med，1999，26：1251-58；Petrovsky A等，“肿瘤凋亡的近红外荧光成像”(Near-infrared fluorescent imaging of tumor apoptosis)，Cancer Res，2003，63：1936-42；Lahorte CM等，“检测凋亡的放射性配体：技术现状和未来前景”(Apoptosis-detecting radioligands：current state of the art and future perspectives)，Eur J Nucl Med，2004，31：887-919；Taki J等，“用99mTc标记的膜联蛋白V检测缺血和再灌注大鼠模型的心肌细胞死亡”(Detection of cardiomyocyte death in a rat model of ischemia and reperfusion using 99mTc-labeled annexin V)，J Nucl Med，2004，45：1536-41；Zhu X等，“急性心脏细胞死亡成像：99mTc标记的C2A在心肌缺血和再灌注后的危险区域中的时空分布”(Imaging acute cardiac cell death：temporal and spatial distribution of 99mTc-labeled C2A in the area at risk after myocardial ischemia and reperfusion)，J Nucl Med，2007，48：1031-6；Hofstra L等，“对急性心肌梗死患者体内细胞死亡的显示”(Visualisation of cell death in vivo in patients with acute myocardial infarction)，Lancet，2000，356：209-12；Thimister PW等，“体内检测急性心肌梗死危险区域的细胞死亡”(In vivo detection of cell death in the area at risk in acute myocardial infarction)，J Nucl Med，2003，44：391-6)。

重要的是，本发明的^99mTc-HYNIC-耐久霉素提供肾脏清除而无肝滞留。天然耐久霉素在肝脏中不能完全清洗因而滞留时间延长(例如很多天)。因此，用天然耐久霉素作为成像剂非常不利，因为无法清除和高肝脏背景会干扰对胸腹区的诊断(McNulty MJ等，Xenobiotica 2003；33(2)：197-210)。

本发明的^99mTc-HYNIC-耐久霉素是一种出人意料的优质诊断成像剂。

Tc-99m耐久霉素制品和组合物也可用于动脉粥样硬化斑块和急性心肌梗死病症以及成像方法。常规的背景信息如USPN 4,952,393中所述，其中描述了由^99mTc和葡糖二酸制成的用于梗死组织成像的成像剂。

PtdE在细胞膜中的显著丰度可引起更高的摄取(Spector 1985；Bevers1999；Emoto 1997)。耐久霉素也通过分子内共价桥发生广泛交联，显示出优异的体内稳定性(Zhao 2008；Hayashi 1990；Zimmerman 1993)。

本发明还包括对心肌缺血和再灌注后危险区的^99mTc-HYNIC-耐久霉素摄取动力学表征，以及在心肌缺血和再灌注大鼠模型中急性冠状病症后的检测窗口的确定。本发明提供对于^99mTc-HYNIC-耐久霉素与靶组织之间相互作用的重要认识，并提供^99mTc-HYNIC-耐久霉素作为PtdE非侵入性成像分子探针的诊断用途。

^99mTc-HYNIC-耐久霉素的体内稳定性可至少归因于以下几点。就放射化学而言，为了保持HYNIC放射化学的方便性，提供一种膦化合物用作第三辅配体(Edwards DS等，“锝放射性药物的新的通用三重配体系统：水溶性膦和N-(羟甲基)甲基甘氨酸作为用^99mTc标记肼基烟酰胺修饰的环状糖蛋白IIb/IIIa受体拮抗剂的辅配体”(New and versatile ternary ligand system for technetium radiopharmaceuticals：water soluble phosphines and tricine as coligands in labeling a hydrazinonicotinamide-modified cyclic glycoprotein IIb/IIIa receptor antagonist with ^99mTc.)，Bioconjug Chem.，1997，8(2)：146-154；Liu S等，“^99mTc标记的强效小分子肽”(^99mTc labeling of highly potent small peptides)，Bioconjug Chem.，1997，8(5)：621-636)。N-(羟甲基)甲基甘氨酸被广泛单独用作HYNIC放射化学的辅配体，其中两个N-(羟甲基)甲基甘氨酸分子与^99mTc和HYNIC的肼基形成十分明确的配位化合物。然而，已知N-(羟甲基)甲基甘氨酸螯合核心在稀释条件下稳定性较低(Edwards 1997；Liu 1997；Liu S等，“采用氨基羧酸盐作为辅配体用^99mTc标记肼基烟酰胺修饰的环状IIb/IIIa受体拮抗剂”(Labeling a hydrazino nicotinamide-modified cyclic IIb/IIIa receptor antagonist with^99mTc using aminocarboxylates as coligands)，Bioconjug Chem，1996，7(1)：63-71；Babich JW等，“用于细菌感染病灶部位成像的锝-99m标记的肼基烟酰胺衍生趋化肽类似物”(Technetium-99m-labeled hydrazino nicotinamide derivatized chemotactic peptide analogs for imaging focal sites of bacterial infection)，J Nucl Med，1993，34(11)：1964-1974；Babich JW，Fischman AJ，“‘辅配体’对^99mTc标记的肼基烟酸衍生趋化肽生物分布的作用”(Effect of″co-ligand″on the biodistribution of ^99mTc-labeled hydrazino nicotinic acid derivatized chemotactic peptides)，Nucl Med Biol，1995，22(1)：25-30)。

通过将三苯膦-3，3′，3″三钠-三磺酸酯(TPPTS)包含在配位化学分子中使^99mTc-HYNIC-耐久霉素在溶液中和体内均保持稳定，这与先前的发现相一致(Edwards1997；Liu 1997)。另一个有助于使^99mTc-HYNIC-耐久霉素稳定的关键因素包括耐久霉素的结构构象，其中三个内部硫醚桥使该多肽稳定(Hayashi 1990；Zimmerman 1993)(多肽环化导致的)自由肽能末端的缺失也使血液传送的蛋白酶和肽酶对其蛋白水解降解的可能性降至最小(Hayashi 1990；Zimmerman 1993)。稳定的放射化学药物和对蛋白水解/代谢降解的耐受性的结合协同促进^99mTc-HYNIC-耐久霉素在溶液中和体内的全面稳定性。这些特征通过静脉注射后在尿样中回收到完整的该放射性药物，而没有发现^99mTc-HYNIC-耐久霉素理化降解得到证明。

耐久霉素与含PtdE膜的结合亲和力为4.8-25.0nM，浓度与成像注射剂量相关(Iwamoto 2007)。HYNIC的结合位点和放射性标记在耐久霉素的远端，远离PtdE的结合位点，因此放射性标记过程对耐久霉素与PtdE之间相互作用的干扰很小。

^99mTc-HYNIC-耐久霉素在梗死区域的高度积累理论上是由于凋亡和坏死导致大量细胞死亡产生高水平的可及PtdE所致。对缺血和再灌注后各种方式细胞死亡的确切作用和百分比还存在争议。梗死心肌膜对^99mTc-HYNIC-耐久霉素的摄取可能反映了细胞损伤的整体程度，其中PtdE在凋亡细胞中由于外化可用于结合，在坏死细胞中质膜完整性受损时可用于结合(Kostin S等，“衰竭人心脏中多种机制的肌细胞死亡”(Myocytes die by multiple mechanisms in failing human hearts)，Circ Res，2003，92：715-724；Freude B等，“急性和慢性疾病中的心肌细胞凋亡”(Cardiomyocyte apoptosis in acute and chronic conditions)，Basic Res Cardiol，1998；93：85-89)。

梗死区域热点摄取的早期显著出现也得益于快速血液清除所致的即时背景消退。这种显著梗死检测归因于肝脏区域的低摄取低，而肝脏区域非常靠近心脏。虽然血管的高通透性是急性心肌梗死众所周知的结果，但摄取后没能清除的事实表明被动摄取在^99mTc-HYNIC-耐久霉素与梗死组织的结合中仅发挥了次要(如果不是可忽略不计的话)作用。从耐久霉素如^99mTc-HYNIC-耐久霉素被灭活时梗死组织中缺乏滞留可以明显看出，^99mTc-HYNIC-耐久霉素的摄取依赖PtdE，先前的成像和组织学研究中梗死组织的其它非特异性造影剂被清洗支持了这点(Kim RJ等，“心肌Gd-DTPA动力学决定MRI对比增强并反映急性再灌注梗死后心肌损伤的程度和严重性”(Myocardial Gd-DTPA kinetics determine MRI contrast enhancement and reflect the extent and severity of myocardial injury after acute reperfused infarction)，Circulation，1996，94：3318-3326；Zhu X等，“用延迟增强磁共振成像评估超急性期再灌注心肌梗死”(Assessment of reperfused myocardial infarction in the hyper-acute phase with delayed enhancement magnetic resonance imaging)，J Cardiovasc Magn Reson，2006，8(3)：461-467；Zhao M等，“^99mTc标记的突触结合蛋白I的C2A结构域作为急性心肌梗死非侵入性成像术的靶特异性分子探针”(^99mTc-labeled C2A domain of synaptotagmin I as a target-specific molecular probe for noninvasive imaging of acute myocardial infarction)，J Nucl Med.2006，47(8)：1367-1374)。

利用质膜双层之间明确种类磷脂的不对称分布，结合磷脂的分子探针在对急性细胞死亡的非侵入性检测和定量测定方面具有良好应用前景。其中已报道了在各种应用中膜联蛋白V和突触结合蛋白I的C2A结构域的表征和利用(Zhao 2006；Zhu 2007；Liu Z等，“缺血和再灌注大鼠模型中用^99mTc标记的突触结合蛋白I的C2A结构域的心肌细胞死亡体内动态成像”(In vivo dynamic imaging of myocardial cell death using ^99mTc-labeled C2Adomain of Synaptotagmin I in a rat model of ischemia and reperfusion)，Nucl Med Biol，2007，34(8)：907-15；Audi S等，“用房室模型定量分析心肌缺血和再灌注后危险区域中的^99mTc-C2A-GST分布”(Quantitative Analysis Of ^99mTc-C2A-GST Distribution In The Area-At-Risk After Myocardial Ischemia And Reperfusion Using A Compartmental Model)，Nucl Med Biol，2007，34(8)：897-905；Zhao 2001；Fang W等，“猪缺血再灌注模型中用^99mTc标记的突触结合蛋白I的C2A结构域的心肌梗死SPECT成像”(SPECT Imaging of Myocardial Infarction Using ^99mTc Labeled C2A Domain of Synaptotagmin I in a Porcine Ischemia Reperfusion Model)，Nucl Med Biol，2007，34(8)：917-23；Jung 2004；Krishnan AS等，“采用MR成像和基于钆的靶向造影剂检测肿瘤细胞死亡”(Detection of cell death in tumors by using MR imaging and a gadolinium-based targeted contrast agent)，Radiology，2008Mar，246(3)：854-62，Epub 2008 Jan 9；Tait JF等，“对采用^99mTc-膜联蛋白V体内检测细胞死亡的结构要求”(Structural requirements for in vivo detection of cell death with ^99mTc-Annexin V)，J Nucl Med，2005，46(5)：807-815；Hofstra2000；Blankenberg 1998；Ohtsuki 1999；Petrovsky 2003；Lahorte 2004；Sosnovik DE，Schellenberger EA，NahrendorfM等，“用新的磁光纳米颗粒的心肌细胞凋亡磁共振成像”(Magnetic resonance imaging of cardiomyocyte apoptosis with a novel magneto-optical nanoparticle)，Magn Reson Med，2005Sept，54(3)：718-24)。

膜联蛋白V和C2A均为钙依赖性磷脂结合蛋白，结合口袋中的钙离子以钙桥的形式介导蛋白质与脂质膜之间的结合(Huber R等，“一种结合钙和膜的抗凝蛋白——人膜联蛋白V的晶体和分子结构”(The crystal and molecular structure of human annexin V，an anticoagulant protein that binds to calcium and membranes)，EMBO J，1990，9：3867-3874；Sutton RB等，“突触结合蛋白I第一个C2结构域的结构：一种新的Ca2+/磷脂结合折叠”(Structure of the first C2domain of synaptotagmin I：a novel Ca2+/phospholipid-binding fold)，Cell，1995，80：929-938)。相比之下，耐久霉素与PtdE的结合是钙非依赖性的，包括带有乙醇胺头部基团和疏水脂肪酸尾部的肽侧链的多种相互作用(Hayashi 1990；Zimmerman 1993)。

耐久霉素的另一个重要特征是分子量低。耐久霉素的分子量为2kDa，远小于膜联蛋白V(32-36kDa)和C2A(12kDa)。^99mTc-HYNIC-耐久霉素的血液清除率之高出人意料，与其低分子量相一致，这点从尿液收集到的其大部分注射剂量可以明显看出。

虽然PtdE结合可能伴有非特异性摄取，但本发明并未观察到。根据即时的生物分布数据，^99mTc-HYNIC-耐久霉素的摄取在组织中处于低水平，包括在肝脏。这与体内全身成像相一致，其中^99mTc-HYNIC-耐久霉素通过肾脏-泌尿系统清除，体内无明显滞留。

耐久霉素由肉桂色链轮丝菌产生，其免疫原性可能受到关注。然而，耐久霉素是一种用于治疗某些类型细菌感染的抗生素，包括囊性纤维化患者中发现的细菌感染。从包括耐久霉素的临床实际应用中可以明显看出其没有明显的毒性和免疫原性。

HPLC纯化对为体内成像获得具有令人满意放射化学质量的放射性示踪物所必需的。为解决这种要求，通过提供无需进一步纯化的一步标记方案优化放射性标记条件。HYNIC衍生的耐久霉素(即放射性标记化合物)不是异构同源物，因为耐久霉素表面有两个伯胺(基)。可去除其中一个胺(基)。

与HYNIC-(N-(羟甲基)甲基甘氨酸)-膦螯合核心结合的^99mTc标记的耐久霉素在溶液中和体内高度稳定。^99mTc-HYNIC-耐久霉素的PtdE结合活性和特异性在放射性标记后受到良好保护。该放射性药物在体内具有良好的药代动力学和生物分布特性。再加上快速血液清除和低肝脏摄取，^99mTc-HYNIC-耐久霉素可迅速结合于急性心肌梗死部位，从而允许在注射后不久进行快速和清晰成像。^99mTc-HYNIC-耐久霉素为PtdE非侵入性成像提供优质的分子探针，具有重要和显著的临床意义。

本发明提供了若干重要发现。^99mTc-HYNIC-耐久霉素可被梗死的和缺血非梗死的心肌膜快速摄取达到高水平。本发明的放射性示踪物以PtdE依赖性方式在受损组织发生螯合。一旦结合，在延长的时间段内极少被清洗。该即时成像技术对急性心肌梗死(AMI)后的检测窗口宽度合理，因此可对梗死组织检测约2天。作为放射性药物，^99mTc-HYNIC-耐久霉素满足心脏成像应用的许多重要标准，下面对此作进一步讨论。

与大分子试剂如^99mTc-C2A-GST相比，^99mTc-HYNIC-耐久霉素在危险区的动力学具有出人意料的优势，表现为以更快速率进行更高摄取(Zhao2006；Liu Z.2007；Audi S等，“用房室模型定量分析心肌缺血和再灌注后危险区域^99mTc-C2A-GST的分布”(Quantitative Analysis Of ^99mTc-C2A-GSTDistribution In The Area-At-Risk After Myocardial Ischemia And ReperfusionUsing A Compartmental Model)，Nucl Med Biol，2007，34：897-905)。具体而言，危险区域^99mTc-HYNIC-耐久霉素的水平在注射后10分钟内达到～4.0％ID/g的平台。在相同的动物模型中，^99mTc-C2A-GST的摄取在30分钟内仅达到约2.5％ID/g的平台(Liu 2007；Audi 2007)。

不受任何理论的束缚，该差异可归因于至少两种控制成像剂体内行为的潜在因素。先前研究中的定量分析表明，扩散速率可能是大分子探针摄取的主要限制性因素(Audi 2007)。探针与结合靶点之间的关联相互作用依赖于探针导向靶组织的能力。较小的探针扩散速率较大，更易穿过内皮屏障，导致更有效的靶结合。C2A-GST和耐久霉素的分子量分别为37kDa和2kDa。分子大小的显著差异与靶组织对^99mTc-HYNIC-耐久霉素的摄取更高更快相一致。

另一个可能有利于^99mTc-HYNIC-耐久霉素更高摄取的因素是，在典型的哺乳动物细胞中，PtdE含量比PS含量高若干倍(Spector 1985)。耐久霉素和C2A分别结合PtdE和PtdS。尽管这两种磷脂的外化在频死细胞中同步发生，但更丰富的结合靶点可增加探针摄取(Bevers 1999；Emoto1997)。因此，危险区对^99mTc-HYNIC-耐久霉素的更快更高的摄取可能是靶组织中PtdE丰度更高和^99mTc-HYNIC-耐久霉素扩散更好相结合的反映。

^99mTc-HYNIC-耐久霉素成像剂识别急性期心脏细胞死亡，并有一个延长的成像检测窗口。平面成像的数据证明如此。在梗死后约48小时对检测窗口进行估计。数据表明，作为细胞死亡分子标记的PtdE在初始缺血刺激后持续存在一段时间，这一现象源自连续的细胞死亡，或尚待清除的细胞碎片。由于PtdE在凋亡和坏死细胞中均可及，使用^99mTc-HYNIC-耐久霉素成像可检测到以整体组织损伤表示的细胞死亡的两种形式。示踪物摄取的水平随时间下降，在梗死后7天或之后向基线水平减小。^99mTc-HYNIC-耐久霉素成像剂可检测急性期的AMI，其检测窗口足够宽可捕获晚期病例。随着其前景看好，延长的成像窗口有助于诊断无法寻求即刻医疗照料的急性冠状病例患者。

血液池和肝脏背景是现有和潜在心脏成像剂的两个最重要的障碍。这两个部位非常靠近心肌膜，其中任何一个出现高背景都可能损害图像质量。抗肌球蛋白抗体(相对较大的大分子)清除慢肝脏滞留高，不可用于静脉注射后即时成像(Khaw BA，“梗死快速成像的当前应用”(The current role of infarct avid imaging)，Semin Nucl Med，1999，29：259-70；Khaw BA等，“闪烁照相定量测定静脉注射肌球蛋白特异性抗体后患者的心肌坏死”(Scintigraphic quantification of myocardial necrosis in patients after intravenous injection of myosin-specific antibody)，Circulation，1986，74：501-8；Khaw BA等，“用铟-111标记的单克隆抗肌球蛋白进行急性心肌梗死成像”(Acute myocardial infarct imaging with indium-111-labeled monoclonal antimyosin)，Fab.J Nucl Med，1987，28：1671-8)。

采用中等大小的基于蛋白质的试剂，包括膜联蛋白V和突触结合蛋白I的C2A结构域试剂减少血液池和肝背景。然而，要在人体和大AMI动物模型注射后几小时获得高质量成像仍然非常困难，这是由高心血管血液池和/或肝脏背景造成的(Hofstra 2000；Thimister 2003；Fang 2007)。

与抗肌球蛋白抗体、膜联蛋白V和C2A相比，^99mTc-HYNIC-耐久霉素的药代动力学和生物分布模式明显更有利，如快速血液清除和非常低的肝脏背景所证明的那样(Zhao 2008)。^99mTc-HYNIC-耐久霉素与PtdE之间的关联相互作用类似于抗体-抗原相互作用(Hayashi 1990；Zimmerman 1993；Seelig 2004)。^99mTc-HYNIC-耐久霉素的体内动力学也表现为小亲水分子的体内动力学(Zhao 2008)。这些性质提供由伴随着快速背景清除的快速靶摄取造成的对胸部梗死的清晰成像有利的协同优势。

本文的数据提供了关于再灌注AMI大鼠模型危险区中^99mTc-HYNIC-耐久霉素摄取的动力学的定量测定说明。^99mTc-HYNIC-耐久霉素与受损心肌膜的结合快速，可持续一段时间而无显著清洗。^99mTc-HYNIC-耐久霉素成像剂可检测急性期梗死，允许延长成像窗口至梗死后约2天。

^99mTc-HYNIC-耐久霉素成像剂也可用于心脏成像。考虑到合理的外推和高靶组织-背景比率，^99mTc-HYNIC-耐久霉素成像剂可用于评估组织移植排斥、监测癌症治疗和其它涉及急性细胞死亡的退行性病变。

本文所用的本发明化合物的“盐”可为药学上合适(即药学上可接受)的盐，包括但不限于通过将本发明化合物的溶液与药学上可接受的酸溶液混合形成的酸加成盐。该药学上可接受的酸可为盐酸、甲磺酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸。各种药学上可接受的盐是本领域熟知的，可与本发明化合物一起使用，如Berge SM等“药学盐”(″Pharmaceutical Salts.″)J.Pharm.Sci.66：1-19(1977)和Haynes DA等，“剑桥结构数据库中出现的药学上可接受的阴离子和阳离子”(″Occurrence of pharmaceutically acceptable anions and cations in the Cambridge Structural Database，″)J.Pharm.Sci.94：2111-2120(2005)所述的那些，此二文通过引用纳入本文。例如，FDA批准的市售盐包括乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、乙二胺四乙酸钙、樟磺酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、二盐酸化物、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、对α-羟乙酰氨基苯砷酸铋、己基间苯二酚盐(hexylresorcinate)、海巴明(hydrabamine)、氢溴化物、盐酸化物、羟萘酸盐、碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、黏酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、双羟萘酸盐、泛酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、单宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐和三乙基碘化物。

本文所用的本发明化合物的“水合物”可为药学上合适(即药学上可接受)的水合物，该化合物通过向宿主分子(例如，该化合物的游离形式)加入水或其元素形成，包括但不限于一水合物、二水合物等。

本文所用的本发明化合物的“溶剂化物”可为药学上合适(即药学上可接受)的溶剂化物，溶剂化是溶质与溶剂相互作用导致溶质在溶液中稳定，溶剂化状态是溶液中的离子与溶剂分子络合。溶剂化物和水合物也可称为“类似物”。

本文所用的可注射和输注剂型(即胃肠道外剂型)包括但不限于含有包封活性药物的磷脂的脂质体注射剂或脂质双层囊泡。注射剂包括胃肠道外使用的无菌制品。

已存在USP定义的五个不同种类的注射剂：乳液、脂质、粉末、溶液或悬浮液。乳液注射剂包括包含胃肠道外给药的无菌无热源制品的乳液。用于溶液注射剂的脂质复合物和粉末是无菌制品，用于重建形成胃肠道外使用的溶液。用于悬浮液注射剂的粉末是无菌制品，用于重建形成胃肠道外使用的悬浮液。用于脂质体悬浮液注射剂的冻干粉末是无菌冷冻干燥制品，用于重建后胃肠道外使用，其制备方式允许掺入脂质体，如脂质双层囊泡，其含有用于将活性药物物质包封在脂质双层或水性空间中的磷脂，该制剂可在重建时形成。用于溶液注射剂的冻干粉末是用于通过冻干(“冷冻干燥”)制备的溶液的剂型，过程包括以极低压力去除冷冻状态产物中的水分，随后加入液体产生在所有方面均符合注射要求的溶液。用于悬浮液注射剂的冻干粉末是胃肠道外使用的液体制品，包含悬浮于合适液态介质中的固体，所有方面均符合无菌悬浮液的要求，通过冻干制备用于悬浮液的药用试剂。溶液注射剂包括液体制品，包含一种或多种溶于适合注射的合适溶剂或相互混溶的溶剂混合物中的药物物质。溶液浓缩注射剂包括胃肠道外使用的无菌制品，加入合适的溶剂时产生所有方面均符合注射要求的溶液。悬浮液注射剂包括(适合注射的)液体制品，包含分散于整个液相中的固体颗粒，这种颗粒是不溶性的，油相分散于整个水相或反之。悬浮液脂质体注射剂是(适合注射的)液体制品，具有分散于整个水相的油相而形成脂质体(通常在脂质双层或水性空间内包含用于包封活性药物物质的磷脂的脂质双层囊泡)。悬浮液超声注射剂是(适合注射的)液体制品，包含分散于整个液相中的固体颗粒，这种颗粒是不溶性的。此外，由于悬浮液产生的气泡可导致固体颗粒形成微球，可对该产物进行超声处理。

胃肠道外载体系统包含一种或多种药学上合适的赋形剂，如溶剂和助溶剂、增溶剂、湿润剂、悬浮剂、增稠剂、乳化剂、螯合剂、缓冲剂、pH调节剂、抗氧化剂、还原剂、抗微生物防腐剂、膨胀剂、保护剂、张力调节剂和特殊添加剂。

实施例

HPLC方法1。在室温和1.0ml/min的流速下，连同由乙腈和水组成流动相系统采用Jupiter C₁₈柱(

孔径，250×4.6mm，Phenomenex)。以90％缓冲液A(水与0.1％三氟乙酸，v/v)和10％缓冲液B(乙腈与0.1％三氟乙酸，v/v)运行5分钟形成基线，然后运行35分钟到10％缓冲液A和90％缓冲液B的线性梯度。

HPLC方法2。在室温和1.0ml/min的流速下，连同由磷酸缓冲液(10mM磷酸钠，pH6.7)和乙腈组成的经缓冲的流动相系统采用Jupiter C₁₈柱(

孔径，250×4.6mm)。以90％缓冲液A(磷酸缓冲液，pH6.7)和10％缓冲液B(乙腈)运行5分钟形成基线，然后运行30分钟内到10％缓冲液A和90％缓冲液B的线性梯度。通过γ计数在140±15keV的能量窗口监测HPLC洗脱液中的放射性水平。

耐久霉素的放射性标记。在HYNIC修饰后用^99mTc标记耐久霉素。具体地说，在4当量三乙胺存在下，使琥珀酰亚胺基6-肼基烟酸丙酮腙与耐久霉素以8∶1的摩尔比反应，合成HYNIC偶联的耐久霉素。在二甲基甲酰胺(DMF)中室温温和搅拌反应18小时。用HPLC方法1纯化HYNIC-耐久霉素。合并含HYNIC-耐久霉素的组分，分装为15μg等份，冻干储存在-80℃氩下直至使用。用基质辅助激光解吸/电离(MALDI)质谱证实终产物的分子量。已报道了采用HYNIC制备^99mTc标记的多肽(Ono M等，“(99m)Tc-HYNIC-衍生的体内蛋白质结合低的(99m)Tc标记多肽的三元配体复合物”((99m)Tc-HYNIC-derivatized ternary ligand complexes for (99m)Tc-labeled polypeptides with low in vivo protein binding)，Nucl Med Biol.Apr 2001，28(3)：215-24；Zhao M等，“作为新的磷脂酰乙醇胺结合分子探针的^99mTc标记的耐久霉素”(^99mTc-Labeled Duramycin as a Novel Phosphatidylethanolamine-Binding Molecular Probe)，J Nucl Med 2008，49：1345-1352)。

为合成不能结合PtdE但具有改变最小的耐久霉素结构和分子量的对照肽，通过对耐久霉素结合口袋中Asp-15的羧基修饰制备灭活的耐久霉素。室温在DMF中进行封闭反应，耐久霉素、乙醇胺和盐酸N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺的摩尔比为1∶10∶40。用C₁₈反相HPLC纯化灭活的化合物耐久霉素^I，用作本文的对照。对于放射性标记，用HYNIC衍生耐久霉素^I，再用C₁₈反相HPLC纯化后如本文所述等份分装。

用N-(羟甲基)甲基甘氨酸-膦辅配体系统以^99mTc标记HYNIC-耐久霉素。具体地说，将15μg HYNIC-耐久霉素与40mg N-(羟甲基)甲基甘氨酸、1mg TPPTS和20μg SnCl₂在pH5.3于0.8ml中进行混合。加入约1mCi的^99mTc启动标记。室温培育40分钟。用HPLC方法2分析和纯化最终的放射性药物^99mTc-HYNIC-耐久霉素。纯化后，氮气下蒸发去除乙腈，在盐水中重建^99mTc-HYNIC-耐久霉素以供使用。以相同方式合成^99mTc-HYNIC-耐久霉素。对于稳定性测试，室温在0.01mM磷酸缓冲液(pH6.8)中以100∶1的半胱氨酸-^99mTc-HYNIC-耐久霉素比率进行半胱氨酸刺激。用放射性HPLC(方法2)分析样品。

脂质体的制备。制备具有以下化学组成的脂质体：PtdC(100％)、PtdC/PtdE(50/50，w/w)、PtdC/PtdS(50/50，w/w)、PtdC/PtdG(50/50，w/w)。称取固体磷脂放在不同的玻璃试管(10×140mm)中，每种脂质2mg。用1ml氯仿完全溶解各管中的磷脂。在氮气流下蒸发氯仿，干燥磷脂在试管壁上形成残留物薄膜。抽真空过夜彻底干燥样品。第二天早上用45℃的2mlHEPES缓冲液(15mM HEPES，120mM NaCl，pH 7.4)重悬各样品。超声处理各悬浮液2-5分钟，每轮15秒直至混合物呈不透明外观，表明形成了多层脂质体。将样品置于冰上直至使用。

体外结合试验。用体外结合试验检测^99mTc-HYNIC-耐久霉素的PtdE结合活性。一种暴露PtdE的良好来源是在37℃、5％CO₂湿润环境下将凋亡的Jurkat淋巴细胞与终浓度5μM的喜树碱一起培养。800g离心5分钟收获未经处理的对照或经处理的细胞，将其重悬至2×10⁶/ml。将放射性标记的耐久霉素或耐久霉素^I(灭活耐久霉素)加入到每毫升细胞中，终浓度100nM，室温结合5分钟。然后将混合物加到Histopaque层上。800g离心5分钟后，收集试管底Histopaque层下的细胞沉淀，而含非结合放射性的培养液留在Histopaque层上。温和吸除水性上清液。用热解剖刀切去含沉淀的试管尖端。通过直接γ计数在140±15keV的能量窗口测定结合的放射性。

竞争试验。用竞争试验测定存在含PtdE的脂质体时结合活性的滞留。如本文所述制备PtdC/PtdE脂质体。在量不断增加的PtdC/PtdE脂质体存在时一式三份地进行结合试验，终浓度以4倍的增长量从1nM到10μM。如之前段落所述，通过γ计数测定细胞沉淀结合的放射性。用含有紧密相关的其它种类磷脂，包括PtdC、PtdG和PtdS制备的脂质体重复该试验。

血液半衰期和药代动力学研究。所用动物方案按照NIH指南得到动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)的批准。通过尾静脉给健康Sprague Dawley大鼠注射放射性标记的耐久霉素(2.3nmol)。在各指定的时间点，包括0、1、5、15、30和60分钟，从预先安置的股动脉导管抽取50μl血液，收集在肝素化试管中。5000g离心血液样品，140±15keV能量窗口直接γ计数分别测定细胞和血浆组分的放射性。输出的数据分别包括随时间推移的血液总放射活性，以及与血细胞和血浆相关的活性。一式三份地测定血液半衰期。为分析该放射性药物的药代动力学，用包括根据基质-溶剂相互作用对分子进行物理分离的HPLC方法2分析10μl血浆或尿液样品。

生物分布研究。给健康的Sprague Dawley大鼠注射放射性标记的耐久霉素(2.3nmol)。用内置γ相机(GE XRT)获得全身动态生物分布曲线。在140±15keV的能量窗口对麻醉的动物进行连续成像，视野22.5×22.5cm，矩阵128×128，每分钟拍摄一次直至注射后60分钟。

对于定量检测生物分布，在静脉注射放射性标记耐久霉素后的各指定时间点，包括0、1、5、15、30和60分钟，分别处死4只大鼠。解剖各组织，用盐水漂洗，称重，直接γ计数(140±15keV)测定放射性水平。

利用缺血和再灌注大鼠模型作急性心脏细胞死亡体内成像。腹膜内注射戊巴比妥钠(50mg/kg体重)麻醉Sprague Dawley大鼠。切开气管插管后，用啮齿动物呼吸机维持呼吸。用6.0缝合线结扎左心耳下1mm处的近端冠状动脉左前降支(LAD)。对于假操作，仅将缝合线穿过LAD而不结扎。危险区的灰白色外观和ECG曲线变化，包括ST段立即上升、QRS复合物振幅和宽度显著增加，证实存在急性缺血/再灌注。冠脉结扎进行30分钟。再灌注后缝合诸层闭合胸壁，维持呼吸直至大鼠恢复自发呼吸。

再灌注2小时后，通过尾静脉注射^99mTc-HYNIC-耐久霉素或^99mTc-HYNIC-耐久霉素^I(2.3nmol，～200μCi)。用γ相机拍摄140±15keV能量窗口的体内动态平面图像，矩阵大小128×128，视野22.5×22.5cm，每5分钟拍摄一次图像共60分钟。动态成像后获得500k计数的静态图像。

在成像研究结束时，处死动物。切下心脏迅速在盐水中漂洗。将2ml溶于HEPES缓冲液的0.5％三苯基氯化四唑(TTC)(w/v)逆向灌注入主动脉中，以对整个心肌膜进行染色。37℃培育15分钟后，用4％甲醛固定心脏。切取厚度～500μm的心脏短轴部分切片，-80℃曝光Kodak BMX MS胶片过夜。胶片显影后，将各相应切片置于溶于PBS的1％甲醛(v/v)中过夜进行区分。肉眼观察数字放射自显影和组织学部分图像。对于测定梗死组织的放射性摄取，收获心脏如上所述用TTC染色。从活组织解剖分离梗死心肌膜。称重后，进行γ计数测定标本140±15keV能量窗口的放射性。将数据转换为％ID/g。

生物偶联和放射性标记。偶联后，用质谱证实HYNIC-耐久霉素的分子量(预计MW＝2188.4g/mole，实际MW＝2188.4g/mole)。在该分子量时，一个HYNIC与一个耐久霉素分子共价结合。耐久霉素的一级序列有19个氨基酸，顺序为CKQSCSFGPFTFVCDGNTK(表1)。N末端Cys-1和侧链Lys-2有两个伯胺可供偶联(图1A)。HYNIC偶联的耐久霉素可为异构体形式，其中HYNIC部分存在于Cys-1或Lys-2。通过HPLC纯化去除与两份HYNIC偶联的耐久霉素，并通过质谱证实。

图1B显示典型的放射性色谱，其中洗脱^99mTc-HYNIC-耐久霉素时的滞留时间为24分钟。在现有的标记条件下，标记效率为80-85％，HPLC纯化前的放射化学纯度为78％-89％，比活性为2×10⁵Ci/mol。虽然用色谱柱纯化(图1B和图1C)是获得用于进一步实验的最终放射性药物所必需的，但现有的放射性标记方案已足够适合进行我们的初步研究。一旦被纯化，^99mTc-HYNIC-耐久霉素即稳定，在水溶液中至少24小时未检测到显著水平脱落的^99mTc。该结果与先前与单用N-(羟甲基)甲基甘氨酸相比，膦辅配体可充分改善^99mTc的配位稳定性的报道相一致(Edwards 1997；Liu 1997)。

采用^99mTc标记的不含HYNIC的天然形式耐久霉素时，该放射化学药物的产量为约10％。在半胱氨酸刺激实验中，半胱氨酸-耐久霉素比率为100∶1时，天然耐久霉素结合的放射性又减少了90％。相比之下，在相同条件下，HYNIC-耐久霉素结合的放射性降低了不到3％。这些结果表明，天然形式的耐久霉素吸收的^99mTc量确实有限，但仅在不能形成十分明确的配合复合物时才可能松散地结合^99mTc。HYNIC或另一种形式螯合核心的存在是用^99mTc稳定标记耐久霉素所必需的。

体外结合试验。与活细胞对照相比，^99mTc-HYNIC-耐久霉素对细胞的结合在凋亡细胞中显著增强，存在含PtdE的脂质体时，该结合被竞争性消除。

将^99mTc-HYNIC-耐久霉素分别与2×10⁶个对照活Jurkat淋巴细胞或喜树碱处理诱导的凋亡细胞一起培育。活细胞的放射性摄取保持接近背景，而^99mTc-HYNIC-耐久霉素与凋亡细胞的结合上升了32±6倍(n＝3)。根据图1D，这种与凋亡细胞的结合具有排他性，在含PtdE脂质体的浓度不断增加时发生竞争性减少。含PtdC、PtdG或PtdS的脂质体也不能竞争性降低凋亡细胞^99mTc-HYNIC-耐久霉素的放射性摄取。^99mTc-HYNIC-耐久霉素^I仅与凋亡细胞发生背景水平的结合，该结合在含PtdE的脂质体存在时不会竞争性减少(数据未显示)。

大鼠中^99mTc-HYNIC-耐久霉素的药代动力学和生物分布。静脉注射后，如图2A所示^99mTc-HYNIC-耐久霉素显示被快速清除，其血液半衰期小于4分钟。血液的放射性在所有时间点95％以上与血浆组分有关，证实^99mTc-HYNIC-耐久霉素与正常血细胞仅发生了最小的相互作用。根据血浆样品的放射性HPLC分析，大部分注入放射性仍是亲代^99mTc-HYNIC-耐久霉素的。(见图2C和图2D)。滞留时间较长(27分钟)的小峰，似乎与未知血液组分之间存在平衡(见图2C和图2D)。该小峰的化学物质并未通过肾脏功能排出，因为尿液中未检出该物质。大鼠血清白蛋白存在时^99mTc-HYNIC-耐久霉素的放射性HPLC分析没有得出该示踪物与白蛋白之间形成任何复合物形成的结果。静脉注射后，^99mTc-HYNIC-耐久霉素可与脂蛋白一定程度上结合，已知后者包含PtdE。重要的是，静脉注射的^99mTc-HYNIC-耐久霉素没有表现出被代谢降解的迹象，从尿液样品回收到的^99mTc-HYNIC-耐久霉素保持完整，没有检测到其它放射性衍生物或^99mTc-高锝酸盐(见图2E)。

对于生物分布而言，^99mTc-HYNIC-耐久霉素的肾脏排出是其主要清除途径，如表1数据所示，肝脏和胃肠区摄取低。这种即时成像剂似乎没有穿过血脑屏障，因为脑摄取低(见表3，注射后60分钟，健康大鼠中静脉注入的^99mTc-HYNIC-耐久霉素的生物分布(n＝4))。肺和正常心肌膜存在的放射性由于快速血液清除而随时间推移迅速达到背景水平。因此，如本文所讨论的那样，实现了对急性心脏细胞死亡的早期和清晰检测。如图3A所示，用动态前部平面闪烁成像体内动态研究证实了所述的生物分布模式。用目前的测试剂量，没有观察到毒性或其它不良作用的迹象。

表3

器官/组织/体液	摄取((％ID/g)
		脑	0.01±0.01
甲状腺	0.08±0.03
		肺	0.12±0.05
心脏	0.21±0.16
		肝脏	0.28±0.01
胰腺	0.05±0.01
		脾脏	0.10±0.02
肾脏	2.32±0.48
		胃	0.11±0.01
小肠	0.37±0.07
		结肠	0.11±0.01
骨	0.04±0.01
		肌肉	0.03±0.01

脂肪	0.06±0.06
		皮肤	0.01±0.01
血液	0.33±0.11
		胸腺	0.06±0.02
尿液	22.1±13.25

急性心脏细胞死亡的体内成像。在动态成像中，早至注射后10分钟可见梗死处的病灶摄取(图3B)。血液清除快和肝脏摄取低促进了梗死区的早期清晰外观。注射后2小时，梗死区-肺部比率为4.8±0.4(n＝3)，梗死区-肌肉比率为12.2±1.3(n＝3)。放射自显影的放射性分布与心肌膜组织学中的梗死区部位相同(图3C，小图)。放射性水平不清洗在一段时间内保持稳定。相比之下，梗死心脏中^99mTc-HYNIC-耐久霉素^I的存在伴随着清洗，这与其缺乏PtdE结合活性相一致。注射后1小时，梗死部位^99mTc-HYNIC-耐久霉素的平均放射性为4.0％ID/g以上，而^99mTc-HYNIC-耐久霉素^I低于1.0％ID/g。

耐久霉素和耐久霉素^I的合成。HYNIC修饰后用文献所述的放射化学法以^99mTc标记耐久霉素(见Zhao 2008；Edwards 1997；Liu 1997)。通过使琥珀酰亚胺基6-肼基烟酸丙酮腙与耐久霉素在二甲基甲酰胺中反应合成HYNIC-偶联耐久霉素。用C18反相HPLC(Jupiter C₁₈柱，孔径

250×4.6mm，Phenomenex)纯化HYNIC-耐久霉素。为显示该放射性示踪物的靶特异性PE依赖性摄取，如文献所述用化学方法使结合口袋处的羧基转变为乙醇基序，合成灭活形式的耐久霉素(耐久霉素^I)(Zhao 2008)。所述修饰通过破坏离子桥和部分封闭耐久霉素结合口袋破坏了耐久霉素与PtdE之间的相互作用。将耐久霉素^I偶联于HYNIC，用HPLC纯化。用基质辅助激光解吸/电离(MALDI)质谱证实HYNIC修饰的耐久霉素和耐久霉素^I的分子量。

放射性标记。如Edwards 1997和Liu 1997所报道，采用N-(羟甲基)甲基甘氨酸-膦联合配体系统以^99mTc标记HYNIC-耐久霉素。将10μgHYNIC-耐久霉素与40mg N-(羟甲基)甲基甘氨酸、1mg TPPTS和20μgSnCl₂在pH5.3于0.8ml中进行混合。加入约1mCi^99mTc启动标记。用HPLC纯化所得放射性药物^99mTc-HYNIC-耐久霉素。通过140±15keV能量窗口的γ计数监测HPLC洗脱液的放射性水平。纯化后，在氮气下蒸发去除乙腈，在盐水中重建^99mTc-HYNIC-耐久霉素以供使用。以相同方式对耐久霉素^I进行放射性标记。

急性心肌梗死模型。所用动物方案按照NIH指南得到动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)的批准。腹膜内注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉雄性Sprague Dawley大鼠。气管插管后用啮齿动物呼吸机维持呼吸。在第4肋骨间作切口暴露心脏。打开心包膜后，用6.0缝合线结扎左心耳下约1mm处的近端LAD封堵30分钟。对于假操作，仅将缝合线穿过LAD但不结扎。危险区的灰白色外观和心电图曲线变化，包括ST段立即上升、QRS复合物振幅和宽度显著增加，证实存在急性缺血/再灌注。再灌注后闭合胸壁，维持呼吸直至大鼠恢复自发呼吸。将松散的缝合线留在原处用于危险区染色。

危险区^99mTc-HYNIC-耐久霉素的时空摄取。为研究危险区^99mTc-HYNIC-耐久霉素的时间摄取动力学，编入20只大鼠，如上所述封堵冠状动脉30分钟激发急性心肌梗死。再灌注后2小时，静脉注射放射性示踪物(0.1mCi)。在以下时间点：注射后3、10、20、60和180分钟分别处死一组4只大鼠用于检测。临处死前，实施第二次胸廓切开术暴露心脏。在相同的位置通过拉紧原位的缝合线再次封堵LAD。尾静脉注入2ml伊文思蓝染料(2％w/v溶于PBS，pH7.4)。蓝色染料摄取的缺乏描出了危险区的轮廓，正常灌注的心肌膜被染为深蓝色。迅速切下心脏，解剖危险区的心脏组织，将其浸没在37℃的0.5％TTC中15分钟。在该染色方案下，缺血非梗死心肌膜被TTC染为砖红色，而梗死组织为灰白色。分别称重解剖的组织，将其收集在样品试管中用于以下的γ计数：正常心肌膜(蓝色)，缺血但存活的心肌膜(红色)，梗死心肌膜(灰白色)。取三等分各5μl的^99mTc-HYNIC-耐久霉素溶液，测定其放射性作为计算总注射剂量(ID)的标准。注射后各时间点的^99mTc-HYNIC-耐久霉素放射性摄取以每克注射剂量的百分比((％ID/g)和标准偏差表示。

检测窗口。为测定采用^99mTc-HYNIC-耐久霉素的AMI检测窗口，检测再灌注后不同时间点摄取的放射性示踪物的摄取。具体地说，编入24只大鼠，冠脉封堵30分钟后刺激不同持续时间的再灌注。在再灌注后0.1、1、2、3、5和7天静脉注射^99mTc-HYNIC-耐久霉素(0.1mCi)。获得每个时间点4只大鼠的平面成像。注射放射性示踪物后60分钟，用配有高分辨率平行孔准直仪的GE XRT γ相机(GE Healthcare，Waukesha，WI)集中在140keV的15％能量窗口获得各只大鼠的前部平面图像(卧姿)。视野22.5×22.5mm，矩阵512×512。

为证实成像结果，成像后处死各只大鼠。迅速切下心脏，在盐水中漂洗。将2ml预热TTC溶液(0.5％溶于PBS，w/v，pH7.4)通过主动脉逆向灌注入整个心肌膜。37℃，TTC染色持续15分钟，然后逆向灌注10ml甲醛(4％v/v溶于PBS，pH7.4)。15分钟后将固定的心脏切成0.5mm的连续切片，曝光储磷屏(GE Healthcare)。用Storm 9200磷成像仪(GEHealthcare)捕获放射自显影。在甲醛中过夜脱色后，以与相应放射自显影相同的方向上对组织切片拍照。

数据处理。采用放射自显影数据，用Storm 9200磷成像仪内置分析软件测定危险区与存活心肌膜之间的放射性摄取比率。具体地说，将感兴趣区域(ROI)置于危险区域与存活心肌膜上。测定各ROI中的平均信号强度。用危险区的信号强度除以正常心肌膜的信号强度计算出靶-背景比率。输出的数据表示为标准偏差的比率。

危险区域^99mTc-HYNIC-耐久霉素的时空摄取。通过检测注射后不同时间点的放射性水平对危险区的^99mTc-HYNIC-耐久霉素摄取动力学进行表征，小结于图4中。图1A显示注射示踪物后3、10、20、60和180分钟时，解剖的梗死心脏组织、缺血非梗死和正常心肌膜的定量摄取数据。图1B显示在以上时间点获得的全身前部平面图像的典型例子。注射后梗死心肌膜的放射性摄取在3分钟内快速上升至1.8±0.4％ID/g，10分钟时达到4.3±0.7％ID/g的平台。梗死组织的放射性摄取注射后不显著清洗可保持稳定至少3小时。同时，缺血非梗死心肌膜中的示踪物摄取也很显著，注射后约10分钟达到2.7±0.6％ID/g的峰值。随后在60分钟时降低至最小值1.6±0.6％ID/g，然后又逐渐升高，在180分钟时达到2.1±0.3％ID。正常心肌膜的放射性摄取低，反映出残余的血液池信号。根据对解剖心脏组织的测定，注射后60分钟时，梗死-正常和缺血-正常的平均比率分别为31.9和11.1。采用灭活的示踪物^99mTc-HYNIC-耐久霉素^I证实了^99mTc-HYNIC-耐久霉素的PE依赖性摄取，其摄取动力学显著不同。由于摄取速率显著较低，梗死组织中注射^99mTc-HYNIC-耐久霉素^I后存在的放射性减少了～60％，在约30分钟时达到大为延迟的最大值。总之，^99mTc-HYNIC-耐久霉素的摄取表现为强烈快速的动力学，在注射后10分钟内达到平台。更强的摄取与危险区中更严重的组织损伤相关。该放射性示踪物可在遭受不可逆损伤的心肌膜中发生螯合，这与耐久霉素-PE相互作用的高结合亲和力和特异性相一致。

检测窗口。采用^99mTc-HYNIC-耐久霉素进行平面成像AMI的检测窗口为再灌注后约48小时。十分明确的放射性示踪物病灶摄取在2和24小时的梗死区中清晰可见，平面成像在48小时仍然可见。图2A显示再灌注后不同时间点获得的典型平面图像。

采用半定量储磷放射自显影半体内测定证实了体内平面成像的结果(见图2B)。再灌注后几个小时内缺血区的放射性摄取更为均匀。梗死后24小时梗死区的周边倾向于信号强度更高。该摄取模式与缺血区放射性标记的膜联蛋白V和C2A的分布相似，推测是由坏死核心中的微血管堵塞和细胞死亡从梗死中心向外传播导致的连续波所致(Machaidze G等，“Ro09-0198(肉桂霉素)与磷脂酰乙醇胺的特异性结合：热力学分析”(Specific binding of Ro 09-0198(cinnamycin)to phosphatidylethanolamine：a thermodynamic analysis)，Biochemistry 2002；41(6)：1965-1971；Guder等，“翻译后修饰的细菌素——羊毛硫抗生素”(Posttranslationally modified bacteriocins--the lantibiotics)，Biopolymers 2000；55(1)：62-73)。再灌注48小时后，梗死区的放射性摄取大为减少和分散，在平面图像中不再可辨别。

通过测定缺血区与正常心肌膜的平均信号强度，测定了放射自显影中的信号-背景比率。所述比率小结于图2C。与梗死后2小时相比，信号-背景比率在24小时下降了32％，在48小时下降了43％。随后几天中信号-背景比率下降更显著。

只有19个氨基酸的耐久霉素是已知的具有明确三维结合结构的最小多肽。耐久霉素与磷脂酰乙醇胺(PtdE)以1∶1的比例发生高亲和力和专有特异性的结合。作为一种含量丰富的结合靶标，PtdE是一种主要的磷脂，占哺乳动物细胞膜磷脂含量的约20％。PtdE被外化到凋亡细胞的表面。由于质膜完整性受损，坏死细胞的PtdE也可及。考虑到耐久霉素的独特理化性质和急性细胞死亡的PtdE可及性，^99mTc-HYNIC-耐久霉素是一种优质的PtdE成像分子探针。

方法。用琥珀酰亚胺基6-肼基烟酸丙酮腙(HYNIC)共价修饰耐久霉素，并采用包含N-(羟甲基)甲基甘氨酸-膦辅配体的配位化学物质以^99mTc标记。用含PtdE的脂质体的竞争试验证实保留了PtdE结合活性。测定大鼠的^99mTc-HYNIC-耐久霉素的血液清除、药代动力学和生物分布。用缺血和再灌注诱导急性心肌梗死的大鼠模型也证明^99mTc-HYNIC-耐久霉素与急性死亡的细胞死亡的体内结合，用放射自显影和组织学证实了这一点。

结果。合成1∶1化学计量的HYNIC衍生耐久霉素，用质谱证实。放射性标记效率为80-85％，放射化学纯度为78-89％，比活性为2×10⁵Ci/mol。使用前用放射性HPLC纯化该放射性示踪物。凋亡细胞的^99mTc-HYNIC-耐久霉素特异性摄取比对照活细胞增强了30多倍。该结合在含PtdE的脂质体存在时竞争性减少，但其它种类磷脂组成的脂质体存在时不减少。在大鼠中，静脉注射的^99mTc-HYNIC-耐久霉素显示有利的药代动力学和生物分布特征，通过肾脏系统从循环中迅速清除，血液半衰期小于4分钟。肝脏和胃肠摄取非常低。^99mTc-HYNIC-耐久霉素在体内完全不发生代谢，可从尿液中回收到其完整试剂。清除快速和肝脏背景低相结合，使^99mTc-HYNIC-耐久霉素与梗死心肌膜的快速结合在注射后不久就迅速达到显著水平。放射自显影和组织学证实了梗死组织的放射性摄取。

^99mTc-HYNIC-耐久霉素是一种稳定的低分子量PtdE结合放射性药物，具有有利的体内成像特征。其为一种优质的PtdE成像分子探针。

^99mTc-HYNIC-耐久霉素是一种低分子量快速清除的放射性药物，通过结合PtdE检测凋亡/坏死。

方法。诱导大鼠急性心肌梗死。测定注射后3、10、20、60和180分钟危险区的摄取动力学。为估计检测窗口，在梗死后0.1、1、2、3、5和7天注射^99mTc-HYNIC-耐久霉素。进行平面成像和放射自显影。

结果。危险区的^99mTc-HYNIC-耐久霉素摄取不清洗时迅速上升至～4％ID/g。梗死区在24小时清晰可见，在48小时仍可检测到。

利用宽度合理的检测窗口，^99mTc-HYNIC-耐久霉素以PE依赖性方式在梗死组织中快速积累。

Claims (24)

1.一种放射性药物化合物或其盐、溶剂化物或水合物，由包括以下步骤的方法制备：

提供SEQ.ID.No.1所示的多肽序列或与SEQ.ID.No.1序列具有至少70％序列相似性的序列，

其中所述多肽在第1-18、4-14和5-11位氨基酸之间包含硫醚键，

所述多肽在第6-19位氨基酸之间包含酰胺键，且

其中一个或多个如以下结构所示的远端部分

与所述多肽的第1位、第2位，或第1位和第2位的氨基酸共价结合，和

其中R¹和R²各自独立地为直链或支链、饱和或不饱和的C_1-4烷基，和

一个或多个远端部分与^99mTc^x、(^99mTc＝O)⁺³、(^99mTc≡N)⁺²、O＝^99mTc＝O)⁺或(^99mTc(CO)₃)⁺螯合，

其中x是选自+7、+6、+5、+4、+3、+2、+1、0或-1的氧化还原态或氧化态。

2.如权利要求1所述的放射性药物，其特征在于，R¹是CH₃，R²是CH₃。

3.如权利要求1所述的放射性药物化合物，其特征在于，SEQ.ID.No.1所示化合物在第1位被所述远端部分取代。

4.如权利要求1所述的放射性药物化合物，其特征在于，SEQ.ID.No.1所示化合物在第2位被所述远端部分取代。

5.如权利要求1所述的放射性药物化合物，其特征在于，SEQ.ID.No.1所示化合物在第1位和第2位被所述远端部分取代。

6.如权利要求1所述的放射性药物化合物，其特征在于，第7、10、12位或其组合的氨基酸被选自Val、Leu、Ile、Met、Trp或其组合的疏水性氨基酸取代。

7.如权利要求1所述的放射性药物化合物，其特征在于，第8、13位或其组合的氨基酸被选自Val、Leu、Ile、Met、Phe或其组合的疏水性氨基酸取代。

8.如权利要求1所述的放射性药物化合物，其特征在于，所述多肽第1-4位和第16-19位的至少一个氨基酸残基被选自功能基团、聚合物、肽、蛋白质、复合物、颗粒或脂质体的至少一种修饰物所修饰。

9.如权利要求1所述的放射性药物化合物，其特征在于，所述被修饰的多肽基本上保留对磷脂酰乙醇胺的结合亲和力和特异性。

10.一种药物的可注射剂型，其包含：

权利要求1-9中任一项所述的放射性药物化合物，和

可注射的载体系统。

11.一种心脏凋亡和/或坏死、动脉粥样硬化斑或急性心肌梗死的成像方法，该方法包括：

给予患者权利要求10所述的药物剂型，和

使^99mTc^x发射的γ射线成像。

12.一种放射性药物化合物或其盐、溶剂化物或水合物，由包括以下步骤的方法制备：

提供SEQ.ID.No.1所示的多肽序列或与SEQ.ID.No.1序列具有至少70％序列相似性的序列，

其中所述多肽在第1-18、4-14和5-11位氨基酸之间包含硫醚键，

所述多肽在第6-19位氨基酸之间包含酰胺键，且

其中一个或多个如以下结构所示的远端部分

与所述多肽的第1位、第2位，或第1位和第2位的氨基酸共价结合，和

其中R¹和R²各自独立地为直链或支链、饱和或不饱和的C_1-4烷基，和

所述一个或多个远端部分与选自¹¹¹In⁺³、¹¹¹In⁰、¹¹¹In^-5、¹²⁵I^-1、¹²⁵I⁰、¹²⁵I⁺⁷、¹³¹I^-1、¹³¹I⁰、¹³¹I⁺⁷、¹⁸F^-1、¹⁸F⁰、⁶⁴Cu⁰、⁶⁴Cu⁺¹、⁶⁴Cu⁺²或⁶⁴Cu⁺³的同位素螯合。

13.一种药物的可注射剂型，其包含：

权利要求12所述的放射性药物化合物，和

可注射的载体系统。

14.一种心脏凋亡和/或坏死、动脉粥样硬化斑或急性心肌梗死的成像方法，包括：

给予患者权利要求12所述的药物剂型，和

使所述同位素发射的γ射线成像。

15.一种放射性药物化合物或其盐、溶剂化物或水合物，由包括以下步骤的方法制备：

提供SEQ.ID.No.1所示的多肽序列或与SEQ.ID.No.1序列具有至少70％序列相似性的序列，

其中所述多肽在第1-18、4-14和5-11位氨基酸之间包含硫醚键，

所述多肽在第6-19位氨基酸之间包含酰胺键，且

其中一个或多个如以下结构所示的远端部分

与所述多肽的第1位、第2位，或第1位和第2位的氨基酸共价结合，

其中x是选自+7、+6、+5、+4、+3、+2、+1、0或-1的氧化还原态或氧化态。

16.如权利要求15所述的放射性药物化合物，其特征在于，SEQ.ID.No.1所示化合物在第1位被所述远端部分取代。

17.如权利要求15所述的放射性药物化合物，其特征在于，SEQ.ID.No.1所示化合物在第2位被所述远端部分取代。

18.如权利要求15所述的放射性药物化合物，其特征在于，SEQ.ID.No.1所示化合物在第1位和第2位被所述远端部分取代。

19.如权利要求15-18中任一项所述的放射性药物化合物，其特征在于，第7、10、12位或其组合的氨基酸被选自Val、Leu、Ile、Met、Trp或其组合的疏水性氨基酸取代。

20.如权利要求15-19中任一项所述的放射性药物化合物，其特征在于，第8、13位或其组合的氨基酸被选自Val、Leu、Ile、Met、Phe或其组合的疏水性氨基酸取代。

21.如权利要求15-20中任一项所述的放射性药物化合物，其特征在于，所述多肽第1-4位和第16-19位的至少一个氨基酸残基被选自功能基团、聚合物、肽、蛋白质、复合物、颗粒或脂质体的至少一种修饰物所修饰。

22.如权利要求15-21中任一项所述的放射性药物化合物，其特征在于，所述被修饰的多肽基本保留对磷脂酰乙醇胺的结合亲和力和特异性。

23.一种药物的可注射剂型，其包含：

权利要求15-22中任一项所述的放射性药物化合物，和

可注射的载体系统。

24.一种心脏凋亡和/或坏死、动脉粥样硬化斑或急性心肌梗死的成像方法，该方法包括：

给予患者权利要求23所述的药物剂型，和

使^99mTc^x发射的γ射线成像。

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