JP2014152139A - 癌細胞のアポトーシス促進剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】天然物からの一次処理物を有効成分とし、癌の治療等に有用な、癌細胞のアポトーシス促進剤を提供する。
【解決手段】ラクトバチルス ケフィリ（Lactobacillus kefiri）の加熱死菌処理物を、癌細胞のアポトーシス促進剤の有効成分として用いる。更に胸腺抽出物を有効成分として含有することが好ましい。この癌細胞のアポトーシス促進剤は、癌の治療等のために好適に用いられる。
【選択図】なし
【解決手段】ラクトバチルス ケフィリ（Lactobacillus kefiri）の加熱死菌処理物を、癌細胞のアポトーシス促進剤の有効成分として用いる。更に胸腺抽出物を有効成分として含有することが好ましい。この癌細胞のアポトーシス促進剤は、癌の治療等のために好適に用いられる。
【選択図】なし
Description
本発明は、癌の治療等に有用な、癌細胞のアポトーシス促進剤に関するものである。
アポトーシスは、生物発生の過程で不必要となった細胞や、老化したり傷害を受けた細胞や、異常になった細胞を除去するために、生物的に厳密にプログラムされた細胞死のことをいうが、細胞を化学的、物理的要因、酸化ストレスや成長因子の除去など種々の刺激にさらすことによっても誘発される。最近の研究によって、多くの抗癌剤はアポトーシスを誘発することで、その効果を発揮しており、アポトーシスによる癌の治療は将来、有望であると考えられている。しかし、よく知られているように、化学療法剤は、ガン細胞と同時に多くの正常細胞を無差別に殺傷する。それ故、このような副反応を極力少なくした、癌細胞のアポトーシス誘発物質の検索に特別な関心がもたれている。
例えば、下記非特許文献１には、ブタ胸腺からの水溶性総抽出物が、ミトコンドリア膜蛋白であるＢｃｌ−２蛋白を抑制する経路を介して、ヒト乳癌由来細胞のアポトーシスを誘導することが報告されている。
一方、本出願人は、ラクトバチルス ケフィリ（Lactobacillus kefiri）、とくにラクトバチルス ケフィリP-IF株を含む乳発酵物には、ヒト腸内細菌叢の悪玉菌と言われているクロストリジウム属微生物に対して強い抗菌効果を示す成分が含まれ、腸内環境改善剤の有効成分として優れていることを報告している（下記特許文献１、２）。
Mamdooh Ghoneum et al.「Gross thymic extract, Thymax, induces apoptosis in human breast cancer cells in vitro through the mitochondrial pathway」Anticancer Research 2008 May-Jun;28(3A):1603-9.
癌細胞のアポトーシス促進剤の新たな有効成分を提供できれば治療や処置の選択の幅が広がる。また、有効成分が天然物からの一次処理物であれば、副作用のリスクも少ないと考えられるので、望ましい。
したがって、本発明の目的は、天然物からの一次処理物を有効成分とし、癌の治療等に有用な、癌細胞のアポトーシス促進剤を提供することにある。
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ラクトバチルス ケフィリ（Lactobacillus kefiri）の加熱死菌処理物を有効成分として含有することを特徴とする癌細胞のアポトーシス促進剤。
［２］更に胸腺抽出物を有効成分として含有する上記［１］記載の癌細胞のアポトーシス促進剤。
［３］前記ラクトバチルス ケフィリ（Lactobacillus kefiri）は、ラクトバチルス ケフィリP-IF（Lactobacillus Kefiri P-IF）（受託番号FERM BP-10896）である、上記［１］又は［２］記載の癌細胞のアポトーシス促進剤。
［４］前記胸腺抽出物が、ブタ胸腺から極性溶媒での抽出により得られた水溶性総抽出物である、上記［１］〜［３］のいずれか1つに記載の癌細胞のアポトーシス促進剤。
［５］Ｂｃｌ−２蛋白の発現を抑制するために用いられる、上記［１］〜［４］のいずれか1つに記載の癌細胞のアポトーシス促進剤。
［６］ラクトバチルス ケフィリ（Lactobacillus kefiri）の加熱死菌処理物と、胸腺抽出物とを含有し、癌細胞のアポトーシス促進機能を有することを特徴とする組成物。
［１］ラクトバチルス ケフィリ（Lactobacillus kefiri）の加熱死菌処理物を有効成分として含有することを特徴とする癌細胞のアポトーシス促進剤。
［２］更に胸腺抽出物を有効成分として含有する上記［１］記載の癌細胞のアポトーシス促進剤。
［３］前記ラクトバチルス ケフィリ（Lactobacillus kefiri）は、ラクトバチルス ケフィリP-IF（Lactobacillus Kefiri P-IF）（受託番号FERM BP-10896）である、上記［１］又は［２］記載の癌細胞のアポトーシス促進剤。
［４］前記胸腺抽出物が、ブタ胸腺から極性溶媒での抽出により得られた水溶性総抽出物である、上記［１］〜［３］のいずれか1つに記載の癌細胞のアポトーシス促進剤。
［５］Ｂｃｌ−２蛋白の発現を抑制するために用いられる、上記［１］〜［４］のいずれか1つに記載の癌細胞のアポトーシス促進剤。
［６］ラクトバチルス ケフィリ（Lactobacillus kefiri）の加熱死菌処理物と、胸腺抽出物とを含有し、癌細胞のアポトーシス促進機能を有することを特徴とする組成物。
本発明によれば、ラクトバチルス ケフィリ（Lactobacillus kefiri）の加熱死菌処理物を有効成分にするので、生物に本来備わる異物排除の機構を亢進して、安全で副作用少なく癌細胞のアポトーシスを促進することができる。よって、癌の治療等に有用である。
本発明の癌細胞のアポトーシス促進剤は、ラクトバチルス ケフィリ（Lactobacillus kefiri）の加熱死菌処理物を有効成分として含有する。ラクトバチルス ケフィリ（Lactobacillus kefiri）としては、ラクトバチルス ケフィリ（Lactobacillus kefiri）に属する微生物であればよく、特に制限はないが、好ましくは、ラクトバチルス ケフィリP-IF（Lactobacillus Kefiri P-IF）（受託番号FERM BP-10896）である。ラクトバチルス ケフィリ（Lactobacillus kefiri）は、公知の方法により、又はそれに準じて培養を行うことができ、例えば、市販のMRS培地「Lactobacilli MRS Broth」(商品名、Difco社製品)用いて、嫌気静置培養することにより、大量培養が可能である。
本発明においては、ラクトバチルス ケフィリ（Lactobacillus kefiri）は、その菌体に６０〜１２０℃、より好ましくは、９５〜１２０℃の加熱処理が施されて、死菌化したものを用いる。その加熱死菌処理後には凍結乾燥してもよく、噴霧乾燥により粉末化してもよい。なお、噴霧乾燥で付加される熱で死菌化されていてもよい。また、後述の試験例のように、ラクトバチルス ケフィリ（Lactobacillus kefiri）の菌体を加熱死菌処理した後、水又は緩衝液等の極性溶媒を加えて混合し、その総抽出物を調製して用いてもよい。
本発明の癌細胞のアポトーシス促進剤には、有効成分として更に胸腺抽出物を含有せしめてもよい。これによれば、後述する実施例で示すように、ラクトバチルス ケフィリ（Lactobacillus kefiri）との相乗的なアポトーシス促進効果が期待できる。
胸腺抽出物は、例えば次のようにして調製することができる。
病原体を保有していない動物の胸腺を複数に裁断し、８０℃程度に加熱してプロテアーゼ活性を低下させ、水又は緩衝液等の極性溶媒を加えて均質化し、その細胞ホモジネートを再び８０℃程度に加熱した後、３７℃程度まで冷まし、ろ紙（アドバンテック製 No.5A）でろ過して不溶物を除去して、胸腺抽出物を得る。なお、胸腺抽出物には、保存のためにNaClを0.3 w/v%程度、L-アスコルビン酸1.0 w/v%程度となるように加えてもよい。また、フィルター滅菌処理などを施してもよい。更にその調製後には凍結乾燥してもよく、噴霧乾燥により粉末化してもよい。
胸腺抽出物の由来等に特に制限はないが、例えば、ブタ胸腺の抽出物である「サイマックス（ThymaX）」（商品名、ワイ・エス・ナチューレ株式会社）などが好ましく用いられる。
本発明の癌細胞のアポトーシス促進剤においては、上記有効成分以外に、他の素材を配合することに特に制限はなく、必要に応じて、薬学的に許容される基材や担体を添加して、公知の製剤方法によって、例えば錠剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、散剤、液剤、粉末剤、ゼリー状剤、飴状剤、注射剤、吸引剤、塗布剤等の形態にして利用することができる。
本発明の癌細胞のアポトーシス促進剤においては、その投与形態に特に制限はなく、例えば経口投与、静脈内投与、脳内局所投与、腹腔内投与、吸引、経鼻投与などが挙げられる。なかでも、摂取者の負担の軽減や服用のし易さの観点からは、経口投与の形態が好ましい。
本発明の癌細胞のアポトーシス促進剤を経口的に摂取する場合、その１日当りの摂取量としては、ラクトバチルス ケフィリ（Lactobacillus kefiri）の加熱死菌処理物の乾燥物換算で０．０１（ｇ／ｋｇ体重）〜１０（ｇ／ｋｇ体重）であることが好ましく、０．０５（ｇ／ｋｇ体重）〜１（ｇ／ｋｇ体重）であることがより好ましい。また、胸腺抽出物の１日当りの摂取量としては、液状物換算で０．０１（ｇ／ｋｇ体重）〜１０（ｇ／ｋｇ体重）であることが好ましく、０．０５（ｇ／ｋｇ体重）〜１（ｇ／ｋｇ体重）であることがより好ましい。各有効成分について、摂取量がそれらの範囲よりも少ないと、十分な効果が得られにくく、摂取量がその範囲よりも多いと、何らかの副作用を生じるリスクが高まる。
一方、本発明のもう１つは、ラクトバチルス ケフィリ（Lactobacillus kefiri）の加熱死菌処理物と、胸腺抽出物とを含有し、癌細胞のアポトーシス促進機能を有する組成物を提供する。この組成物は、健康食品、健康飲料、飲食品添加剤、サプリメント、化粧料など、適宜それらに適した形態とすることができ、それを食したり、体に塗布したりして、癌細胞のアポトーシス促進の作用効果を享受できる。
上記組成物中のラクトバチルス ケフィリ（Lactobacillus kefiri）の加熱死菌処理物の含有量は、乾燥物換算で１質量％〜１００質量％であることが好ましく、５０質量％〜１００質量％であることがより好ましい。また、上記組成物中の胸腺抽出物の含有量は、ラクトバチルス ケフィリ（Lactobacillus kefiri）の加熱死菌処理物に対する含有量比として、液状物換算で２５質量％〜７５質量％であることが好ましく、２５質量％〜４５質量％であることがより好ましい。例えば、ラクトバチルス ケフィリ（Lactobacillus kefiri）の加熱死菌処理物：胸腺抽出物＝８：２（例えば１．６ｇ：０．４ｇ）のものを１包２ｇとし、成人で包／２ｇ〜１０ｇ／日で摂取することが好ましい。
以下に例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの例は本発明の範囲を限定するものではない。
［実験材料及び方法］
（１）細胞と培養条件
実験には、多剤耐性（MDR: muitidrug resistant）のヒト骨髄性白血病由来細胞（HL60/AR）（以下、「HL60/AR細胞」という。）を用いた。HL60/AR細胞は、特に言及のない限り、10v/v%のウシ胎児血清（FCS: fetal calf serum）、2mMのグルタミン、100μg/mLのストレプトマイシン、100units/mLのペニシリンで補ったRPMI-1640からなる完全培地で培養した。
（１）細胞と培養条件
実験には、多剤耐性（MDR: muitidrug resistant）のヒト骨髄性白血病由来細胞（HL60/AR）（以下、「HL60/AR細胞」という。）を用いた。HL60/AR細胞は、特に言及のない限り、10v/v%のウシ胎児血清（FCS: fetal calf serum）、2mMのグルタミン、100μg/mLのストレプトマイシン、100units/mLのペニシリンで補ったRPMI-1640からなる完全培地で培養した。
（２）被検物
・ラクトバチルス ケフィリ（L. kefiri P-IF）
ラクトバチルス ケフィリP-IF（Lactobacillus kefiri P-IF）（受託番号FERM BP-10896）を液体培養した後、菌を回収して、加熱殺菌処理後、凍結乾燥した。これを1mg/mLの濃度で蒸留水に懸濁後、1200Ｇで5分間遠心分離して、その上澄みをフィルター滅菌して以下の試験に用いた。
・胸腺抽出物（Thymax）
胸腺抽出物としては、「サイマックス（ThymaX）」（商品名、ワイエスナチューレ株式会社）を用いた。これは、病原体を保有していないブタの胸腺を複数に切り、急速に加熱してプロテアーゼ活性を低下させ、水を加えて均質化し、その細胞ホモジネートを再び80℃で30分間加熱した後、37℃まで冷まし、ろ紙（アドバンテック製 No.5A）でろ過して不溶物を除去して、最後にNaClを0.3 w/v%、L-アスコルビン酸1.0 w/v%となるように加えて、得られた、ブタ胸腺の抽出物である。以下の試験には、これをフィルター滅菌して用いた。
・ラクトバチルス ケフィリ（L. kefiri P-IF）
ラクトバチルス ケフィリP-IF（Lactobacillus kefiri P-IF）（受託番号FERM BP-10896）を液体培養した後、菌を回収して、加熱殺菌処理後、凍結乾燥した。これを1mg/mLの濃度で蒸留水に懸濁後、1200Ｇで5分間遠心分離して、その上澄みをフィルター滅菌して以下の試験に用いた。
・胸腺抽出物（Thymax）
胸腺抽出物としては、「サイマックス（ThymaX）」（商品名、ワイエスナチューレ株式会社）を用いた。これは、病原体を保有していないブタの胸腺を複数に切り、急速に加熱してプロテアーゼ活性を低下させ、水を加えて均質化し、その細胞ホモジネートを再び80℃で30分間加熱した後、37℃まで冷まし、ろ紙（アドバンテック製 No.5A）でろ過して不溶物を除去して、最後にNaClを0.3 w/v%、L-アスコルビン酸1.0 w/v%となるように加えて、得られた、ブタ胸腺の抽出物である。以下の試験には、これをフィルター滅菌して用いた。
（３）プロピジウムイオダイドを用いた癌細胞の細胞死の検出
細胞死の割合を、プロピジウムイオダイド（PI）法によって調べた。この手法では、死んだ細胞はPIに反応して蛍光を発する。具体的には、最終濃度が50μg/mLになるようPIを細胞（1 x 106/mL）に加え、室温の暗い場所で細胞を30分間染色し、フローサイトメトリー装置FACScan（Becton Dickinson社, Sall Jose, CA, USA）で、PIに反応して蛍光を発する細胞死の割合を分析した。
細胞死の割合を、プロピジウムイオダイド（PI）法によって調べた。この手法では、死んだ細胞はPIに反応して蛍光を発する。具体的には、最終濃度が50μg/mLになるようPIを細胞（1 x 106/mL）に加え、室温の暗い場所で細胞を30分間染色し、フローサイトメトリー装置FACScan（Becton Dickinson社, Sall Jose, CA, USA）で、PIに反応して蛍光を発する細胞死の割合を分析した。
（４）Bcl-2蛋白の発現量
細胞内のBcl-2蛋白の発現量の測定のために、細胞をまず氷冷した70%メタノールで固定、透過処理した。これをFITC標識抗Bcl-2蛋白抗体又はそのアイソタイプコントロール抗体（Dako Corp、Carpintaria、CA）で染色し、洗浄後、フローサイトメトリー装置FACScan（Becton Dickinson社, Sall Jose, CA, USA）で、Bcl-2蛋白由来の細胞当たりの平均蛍光強度を分析した。
細胞内のBcl-2蛋白の発現量の測定のために、細胞をまず氷冷した70%メタノールで固定、透過処理した。これをFITC標識抗Bcl-2蛋白抗体又はそのアイソタイプコントロール抗体（Dako Corp、Carpintaria、CA）で染色し、洗浄後、フローサイトメトリー装置FACScan（Becton Dickinson社, Sall Jose, CA, USA）で、Bcl-2蛋白由来の細胞当たりの平均蛍光強度を分析した。
（５）カスパーゼ3の細胞内活性
カスパーゼ3の細胞内活性の測定は、カルボキシフルオレセインで標識したフルオロメチルケトン(FMK)−カスパーゼ阻害性ペプチドを用いて行った。この阻害剤は細胞透過性であり非毒性で、一旦細胞内に入ると、活性化カスパーゼと共有結合する。フローサイトメトリーによって、カスパーゼ陽性(+)細胞とカスパーゼ陰性(-)細胞を区別できる。具体的には、蛍光標識されたFAM-DEVD-FMK(FAM-Asp-Glu-Val-Asp-FMK)（Intergen社, NY, USA）を培地に添加して細胞を1時間培養し、洗浄後、フローサイトメトリー装置FACScan（Becton Dickinson社, Sall Jose, CA, USA）で、カスパーゼ阻害剤が結合しアポトーシスが起こっている細胞を分析した。
カスパーゼ3の細胞内活性の測定は、カルボキシフルオレセインで標識したフルオロメチルケトン(FMK)−カスパーゼ阻害性ペプチドを用いて行った。この阻害剤は細胞透過性であり非毒性で、一旦細胞内に入ると、活性化カスパーゼと共有結合する。フローサイトメトリーによって、カスパーゼ陽性(+)細胞とカスパーゼ陰性(-)細胞を区別できる。具体的には、蛍光標識されたFAM-DEVD-FMK(FAM-Asp-Glu-Val-Asp-FMK)（Intergen社, NY, USA）を培地に添加して細胞を1時間培養し、洗浄後、フローサイトメトリー装置FACScan（Becton Dickinson社, Sall Jose, CA, USA）で、カスパーゼ阻害剤が結合しアポトーシスが起こっている細胞を分析した。
（６）ミトコンドリア膜電位(MMP)の検出
細胞内のミトコンドリア膜電位(MMP)を、テトラメチルローダミンエチルエステル（Molecular Probes社, Eugene, OR, USA）を用いて調べた。この色素はミトコンドリア膜にその膜電位に応じて蓄積して、その蛍光検出によりミトコンドリアの膜電位の程度を分析できる。具体的には、テトラメチルローダミンエチルエステルを培地に添加して細胞を37℃で30分間培養し、洗浄後、フローサイトメトリー装置FACScan（Becton Dickinson社, Sall Jose, CA, USA）を用いて、壊死細胞片を遮断して取り除き、488nmで励起させて生じる細胞当たりの平均蛍光強度を分析した。
細胞内のミトコンドリア膜電位(MMP)を、テトラメチルローダミンエチルエステル（Molecular Probes社, Eugene, OR, USA）を用いて調べた。この色素はミトコンドリア膜にその膜電位に応じて蓄積して、その蛍光検出によりミトコンドリアの膜電位の程度を分析できる。具体的には、テトラメチルローダミンエチルエステルを培地に添加して細胞を37℃で30分間培養し、洗浄後、フローサイトメトリー装置FACScan（Becton Dickinson社, Sall Jose, CA, USA）を用いて、壊死細胞片を遮断して取り除き、488nmで励起させて生じる細胞当たりの平均蛍光強度を分析した。
（７）原子間力顕微鏡(AFM)イメージング
被検物を含む培地で24時間培養した後のHL60/AR細胞について、原子間力顕微鏡(AFM)イメージングを行なった。具体的には、培養後の細胞（細胞数：0.3 x 105）を、集細胞遠心装置cytospin cytocentrifuge（Shandon Southern Inst., Sewickley, PA, USA）にて、スライド上で200gで5分間遠心分離し、これを空気乾燥してスライドサンプルとした。AFMイメージングは、Dimension 5000 AFM（Veeco社）にて接触モード下、OTESPシリコンプローブ（Veeco社）を使用し、表面形状の高さイメージを0.8Hzの走査率で、512x512ピクセルで記録した。画像処理には、SPIP SPMイメージ解析ソフトウェアを使用した。
被検物を含む培地で24時間培養した後のHL60/AR細胞について、原子間力顕微鏡(AFM)イメージングを行なった。具体的には、培養後の細胞（細胞数：0.3 x 105）を、集細胞遠心装置cytospin cytocentrifuge（Shandon Southern Inst., Sewickley, PA, USA）にて、スライド上で200gで5分間遠心分離し、これを空気乾燥してスライドサンプルとした。AFMイメージングは、Dimension 5000 AFM（Veeco社）にて接触モード下、OTESPシリコンプローブ（Veeco社）を使用し、表面形状の高さイメージを0.8Hzの走査率で、512x512ピクセルで記録した。画像処理には、SPIP SPMイメージ解析ソフトウェアを使用した。
（８）ギムザ染色した細胞の顕微鏡観察による液胞(Vacoules)/孔分析
被検物を含む培地で24時間培養した後のHL60/AR細胞について、ギムザ染色後、顕微鏡観察を行なった。具体的には、培養後の細胞（細胞数：0.3 x 105）を、集細胞遠心装置cytospin cytocentrifuge（Shandon Southern Inst., Sewickley, PA, USA）にて、スライド上で200gで5分間遠心分離し、これを空気乾燥してスライドサンプルとした。そして、100% MeOHで5分間固定し、4% ギムザ溶液で15分間染色した。顕微鏡にて200個以上の細胞を観察して、細胞が液胞(Vacoules)/孔様の構造を呈するかを調べた。
被検物を含む培地で24時間培養した後のHL60/AR細胞について、ギムザ染色後、顕微鏡観察を行なった。具体的には、培養後の細胞（細胞数：0.3 x 105）を、集細胞遠心装置cytospin cytocentrifuge（Shandon Southern Inst., Sewickley, PA, USA）にて、スライド上で200gで5分間遠心分離し、これを空気乾燥してスライドサンプルとした。そして、100% MeOHで5分間固定し、4% ギムザ溶液で15分間染色した。顕微鏡にて200個以上の細胞を観察して、細胞が液胞(Vacoules)/孔様の構造を呈するかを調べた。
＜試験例１＞
HL60/AR細胞（細胞数：0.5 x 106）を、異なる濃度のL. kefiri P-IF（1.25, 2.5, 5 mg/mL）の存在下で、3日間培養して、その培養後の細胞死の割合をプロピジウムイオダイド（PI）法によって調べ、無処置の細胞（対照）と比較した。なお、L. kefiri P-IFの濃度は、菌体からの総抽出物換算での濃度である（以下、同様）。
HL60/AR細胞（細胞数：0.5 x 106）を、異なる濃度のL. kefiri P-IF（1.25, 2.5, 5 mg/mL）の存在下で、3日間培養して、その培養後の細胞死の割合をプロピジウムイオダイド（PI）法によって調べ、無処置の細胞（対照）と比較した。なお、L. kefiri P-IFの濃度は、菌体からの総抽出物換算での濃度である（以下、同様）。
図１に示すように、無処置の対照（7%の細胞死）と比べて、L. kefiri P-IFの添加による影響が、1.25 mg/mLの濃度で検出され（17%の細胞死）、2.5 mg/mLの濃度でかなり強化されて（52%の細胞死）、5 mg/mLの濃度でも高水準に維持された（60%の細胞死）。よって、L. kefiri P-IFがその濃度に応じてHL60/AR細胞のアポトーシスを促進することが明らかとなった。
＜試験例２＞
HL60/AR細胞（細胞数：0.5 x 106）を、1.25 mg/mL濃度のL. kefiri P-IFの存在下、1.25 mg/mL濃度の胸腺抽出物（Thymax）の存在下、又はそれらの併存下（各同濃度）で、3日間培養して、その培養後の細胞死の割合をプロピジウムイオダイド（PI）法によって調べ、無処置の細胞（対照）と比較した。なお、胸腺抽出物（Thymax）の濃度は、その総抽出物換算での濃度である（以下、同様）。
HL60/AR細胞（細胞数：0.5 x 106）を、1.25 mg/mL濃度のL. kefiri P-IFの存在下、1.25 mg/mL濃度の胸腺抽出物（Thymax）の存在下、又はそれらの併存下（各同濃度）で、3日間培養して、その培養後の細胞死の割合をプロピジウムイオダイド（PI）法によって調べ、無処置の細胞（対照）と比較した。なお、胸腺抽出物（Thymax）の濃度は、その総抽出物換算での濃度である（以下、同様）。
図２に示すように、無処置の対照（7%の細胞死）と比べて、L. kefiri P-IFは17%の細胞死を引き起こし（試験例１参照）、胸腺抽出物（Thymax）は37%の細胞死を引き起こした。一方、L. kefiri P-IFと胸腺抽出物（Thymax）とを併用した場合、その影響は顕著に増加した（60%の細胞死）。よって、HL60/AR細胞のアポトーシスは、L.kefiri P-IF又は胸腺抽出物（Thymax）により促進され、これらを併用することにより、相乗的に更に促進されることが明らかとなった。
＜試験例３＞
HL60/AR細胞（細胞数：0.5 x 106）を、1.25 mg/mL濃度のL. kefiri P-IFの存在下、1.25 mg/mL濃度の胸腺抽出物（Thymax）の存在下、又はそれらの併存下（各同濃度）で、3日間培養して、その培養後の細胞内のBcl-2蛋白の発現量を、Bcl-2蛋白に対する特異抗体を用いて調べ、無処置の細胞（対照）と比較した。結果は、フローサイトメトリー装置で測定したBcl-2蛋白由来の細胞当たりの平均蛍光強度で表わした。
HL60/AR細胞（細胞数：0.5 x 106）を、1.25 mg/mL濃度のL. kefiri P-IFの存在下、1.25 mg/mL濃度の胸腺抽出物（Thymax）の存在下、又はそれらの併存下（各同濃度）で、3日間培養して、その培養後の細胞内のBcl-2蛋白の発現量を、Bcl-2蛋白に対する特異抗体を用いて調べ、無処置の細胞（対照）と比較した。結果は、フローサイトメトリー装置で測定したBcl-2蛋白由来の細胞当たりの平均蛍光強度で表わした。
表１に示すように、Bcl-2蛋白由来の細胞当たりの平均蛍光強度は、無処置の対照（平均蛍光強度74）と比べて、L. kefiri P-IFの添加により抑制され（平均蛍光強度61）、胸腺抽出物（Thymax）の添加によっても抑制された（平均蛍光強度68）。一方、L. kefiri P-IFと胸腺抽出物（Thymax）とを併用した場合、Bcl-2蛋白由来の細胞当たりの平均蛍光強度は顕著に低下した（平均蛍光強度50）。よって、HL60/AR細胞のBcl-2蛋白の発現は、L.kefiri P-IF又は胸腺抽出物（Thymax）により抑制され、これらを併用することにより、相乗的に更に抑制されることが明らかとなった。
＜試験例４＞
HL60/AR細胞（細胞数：0.5 x 106）を、異なる濃度のL. kefiri P-IF（0.6, 1.2, 2.5 mg/mL）の存在下で、24時間培養して、その培養後のカスパーゼ3の細胞内活性を、蛍光標識したカスパーゼ阻害剤を用いて調べ、無処置の細胞（対照）と比較した。結果は、フローサイトメトリー装置で測定した活性化カスパーゼ3由来の細胞当たりの蛍光強度の頻度分布チャートで表わした。
HL60/AR細胞（細胞数：0.5 x 106）を、異なる濃度のL. kefiri P-IF（0.6, 1.2, 2.5 mg/mL）の存在下で、24時間培養して、その培養後のカスパーゼ3の細胞内活性を、蛍光標識したカスパーゼ阻害剤を用いて調べ、無処置の細胞（対照）と比較した。結果は、フローサイトメトリー装置で測定した活性化カスパーゼ3由来の細胞当たりの蛍光強度の頻度分布チャートで表わした。
図３に示すように、活性化カスパーゼ3由来の細胞当たりの蛍光強度は、無処置の対照と比べて、L. kefiri P-IFの添加により明らかに増加した。よって、L. kefiri P-IFによるHL60/AR細胞のアポトーシスが、カスパーゼの活性化を介して起こっていることが確認された。
＜試験例５＞
HL60/AR細胞（細胞数：0.5 x 106）を、異なる濃度のL. kefiri P-IF（0.6, 1.2, 2.5 mg/mL）の存在下で、3日間培養して、その培養後のミトコンドリア膜電位を、ミトコンドリア膜電位検出用色素であるテトラメチルローダミンエチルエステルを用いて調べ、無処置の細胞（対照）と比較した。結果は、フローサイトメトリー装置で測定したミトコンドリア膜電位由来の細胞当たりの平均蛍光強度で表わした。
HL60/AR細胞（細胞数：0.5 x 106）を、異なる濃度のL. kefiri P-IF（0.6, 1.2, 2.5 mg/mL）の存在下で、3日間培養して、その培養後のミトコンドリア膜電位を、ミトコンドリア膜電位検出用色素であるテトラメチルローダミンエチルエステルを用いて調べ、無処置の細胞（対照）と比較した。結果は、フローサイトメトリー装置で測定したミトコンドリア膜電位由来の細胞当たりの平均蛍光強度で表わした。
表２に示すように、ミトコンドリア膜電位由来の細胞当たりの平均蛍光強度は、無処置の対照と比べて、L. kefiri P-IFの添加によりその濃度に応じて明らかに低下した。よって、L. kefiri P-IFによるHL60/AR細胞のアポトーシスが、ミトコンドリア膜の透過性の亢進を介して起こっていることが確認された。
＜試験例６＞
HL60/AR細胞（細胞数：0.5 x 106）を、L. kefiri P-IF（1.25又は2.5 mg/mL）の存在下で、24時間培養して、その培養後の原子間力顕微鏡(AFM)イメージングを、蒸留水を添加した細胞（対照）と比較した。図４Ａには、対照として蒸留水を添加した細胞のAFMイメージの典型例を示し、図４Ｂ〜図４Ｈには、L. kefiri P-IFを添加して培養した細胞のAFMイメージの典型例を複数示す。
HL60/AR細胞（細胞数：0.5 x 106）を、L. kefiri P-IF（1.25又は2.5 mg/mL）の存在下で、24時間培養して、その培養後の原子間力顕微鏡(AFM)イメージングを、蒸留水を添加した細胞（対照）と比較した。図４Ａには、対照として蒸留水を添加した細胞のAFMイメージの典型例を示し、図４Ｂ〜図４Ｈには、L. kefiri P-IFを添加して培養した細胞のAFMイメージの典型例を複数示す。
L. kefiri P-IFを添加して培養した細胞の多くでは、図４Ｄ〜図４Ｇにみられるように、細胞孔を形成しているのが観察できた（例えば、図４Ｆ及び図４Ｇ中の矢印下示す箇所のように観察できた。）。また、L. kefiri P-IFを添加して培養した細胞のかなりのものについては、図４Ｈにみられるように、細胞膜がちぎれた構造が観察できた(blebbing)。これらは、アポトーシスに典型的な細胞の形態変化であった。
＜試験例７＞
HL60/AR細胞（細胞数：0.5 x 106）を、L. kefiri P-IF（1.25又は2.5 mg/mL）の存在下で、24時間培養して、その培養後にギムザ染色して行なった顕微鏡観察像を、蒸留水を添加した細胞（対照）と比較した。
HL60/AR細胞（細胞数：0.5 x 106）を、L. kefiri P-IF（1.25又は2.5 mg/mL）の存在下で、24時間培養して、その培養後にギムザ染色して行なった顕微鏡観察像を、蒸留水を添加した細胞（対照）と比較した。
それぞれ200個以上の細胞について観察した結果、対照として蒸留水を添加した細胞では、0〜3個程度の液胞(Vacoules)/孔様の構造を呈する細胞がほとんどであり、その構造を4個以上呈する細胞はほとんどなかった。他方、L. kefiri P-IFを添加して培養した細胞は、4個以上の液胞(Vacoules)/孔様の構造を呈する細胞が顕著に増加し、対照に比べ3倍以上に増加した。これらは、アポトーシスに典型的な細胞の形態変化であると考えられた。
Claims (6)
- ラクトバチルス ケフィリ（Lactobacillus kefiri）の加熱死菌処理物を有効成分として含有することを特徴とする癌細胞のアポトーシス促進剤。
- 更に胸腺抽出物を有効成分として含有する請求項１記載の癌細胞のアポトーシス促進剤。
- 前記ラクトバチルス ケフィリ（Lactobacillus kefiri）は、ラクトバチルス ケフィリP-IF（Lactobacillus Kefiri P-IF）（受託番号FERM BP-10896）である、請求項１又は２記載の癌細胞のアポトーシス促進剤。
- 前記胸腺抽出物が、ブタ胸腺から極性溶媒での抽出により得られた水溶性総抽出物である、請求項１〜３のいずれか1つに記載の癌細胞のアポトーシス促進剤。
- Ｂｃｌ−２蛋白の発現を抑制するために用いられる、請求項１〜４のいずれか1つに記載の癌細胞のアポトーシス促進剤。
- ラクトバチルス ケフィリ（Lactobacillus kefiri）の加熱死菌処理物と、胸腺抽出物とを含有し、癌細胞のアポトーシス促進機能を有することを特徴とする組成物。
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| JP2014152139A true JP2014152139A (ja) | 2014-08-25 |
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|---|---|---|---|---|
| JP2009232702A (ja) * | 2008-03-26 | 2009-10-15 | Fisu:Kk | 新規乳酸菌株及びその利用 |
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2013
- 2013-02-08 JP JP2013023493A patent/JP2014152139A/ja active Pending
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