JP2014108945A - ヒートショックプロテイン70産生誘導剤 - Google Patents
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Abstract
これまでにない高い安全性を有するヒートショックプロテイン70産生誘導剤を得、医薬品、化粧品に応用することを課題とする。
【解決手段】
亜鉛化合物を今までに無い高濃度に含有する培地で順化させた酵母の培養方法。および亜鉛化合物を高濃度に菌体内に蓄積した酵母菌体抽出液を利用することにより、細胞毒性が低く、且つ十分なヒートショックプロテイン70産生誘導効果を有する組成物を利用することで、胃潰瘍・胃粘膜の修復、予防に有効な組成物として利用できる。さらに、化粧品組成物として利用することで紫外線や環境からのストレスに対して、肌の炎症防止、皮膚バリア機能の保持などの効果が期待できる。
【選択図】なし
Description
さらに、芍薬の根から抽出されたペオニフロリンがHela細胞に対してHSP70を誘導することが報告されている(非特許文献3)。
グリチルレチン酸の誘導体であるカルベノキソロンもHela細胞に対してHSP70を誘導することが知られている(非特許文献4)。
亜鉛化合物を高濃度で含有する酵母菌体をそのまま、あるいは酵母菌体抽出物を飲用することにより、上皮細胞でのヒートショックプロテイン70の産生誘導が可能となり、胃潰瘍、胃粘膜傷害を防止する医薬品に利用が可能である。
本発明で用いる酵母は市販されているパン酵母、または分譲されているSaccharomyces cerevisiae
に属する酵母であれば使用できる。また、酵母は糖類が存在する自然界からも容易に分離することができるため、植物や土などから分離した酵母でSaccharomyces属に属する酵母であればいずれも使用できるが、特にSaccharomyces cerevisiae に属する酵母が望ましい。
リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、ヒスチジン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、セリン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、プロリン、チロシン等の窒素含有化合物を用いることができ、これらから1種以上含有していれば良い。リン源としては、リン酸塩を用いることが出来、リン酸1水素カリウム、リン酸2水素カリウム、リン酸アンモニウムを用いることができ、これらから1種以上含有していれば良い。
Saccharomyces cerevisiae 酵母の採取方法
市販されているパン酵母(日清スパーカメリア・ドライイースト:日清フーズ(株))を購入し、120℃で15分間滅菌したYM培地100mlを添加した三角フラスコに0.1g懸濁し、28℃、150rpmで3日間回転培養を行った。懸濁液を1白金耳取り、YM寒天培地上で引き伸ばして単独コロニーを得、これを以下の実験に使用した。
以下、培地組成においてg/L等とあるのは、各成分を該当g計量し、精製水で1Lにしたという意味である。
<YM培地>
ペプトン5g/L、酵母エキス3g/L、麦芽エキス3g/L、グルコース10g/L
<YM寒天培地>
YM培地に寒天20g/Lを添加し、加熱溶解して作成。
高濃度亜鉛化合物含有培地での酵母菌の順化培養
培地はYNB(Yeast Nitrogen Base) with Ammonium Sulfate 合成培地にグルコースを2.0%添加した(以下、本明細書中では、YNB-SG培地と称す)。
YNB-SG培地50mlを三角フラスコに加え、120℃、15分間オートクレーブで滅菌処理を行った。本培地を冷却後、別に滅菌しておいた1M硫酸亜鉛7水和物の水溶液を10mM濃度になるように本培地に添加した(10mM硫酸亜鉛含有YNB-SG培地と称す)。この10mM硫酸亜鉛含有YNB-SG培地に、実験1で得た酵母菌を1白金耳植え付け、24℃、150rpm、で14日間培養を行った。始めの3−4日間程度は、酵母菌の増殖はほとんど認められないが、徐々に増殖が確認できるようになる。この培養物500μlを新しい10mM硫酸亜鉛含有YNB-SG培地50mlに添加し、さらに培養を続ける。これを5継代程繰り返すことにより、順化株が得られる。この順化株を用いて、15mM硫酸亜鉛含有YNB-SG培地、20mM、30mM、40mM、50mM、60mMと硫酸亜鉛濃度を高めたYNB-SG培地に順次移行して培養することにより、高硫酸亜鉛含有YNB-SG培地に順化した亜鉛耐性酵母菌株を得た。以下、最終培養状態における亜鉛の添加量に合わせて、20mM亜鉛耐性酵母菌株等と称す。具体的には、培地中の亜鉛濃度を順次高めて順化させていき、亜鉛を60mM添加した培地での培養を最終として採取した菌株を60mM亜鉛耐性酵母菌株と称す。
尚、本願においては、基本培地としてYNB-SG培地を用いたが、酵母菌に亜鉛を含有させることが出来れば所望の効果を奏するので、他の公知の培地を基本培地としても差し支えない。
<YNB-SG培地組成>
硫酸アンモニウム5,000、リン酸二水素カリウム1,000、硫酸マグネシウム500、塩化ナトリウム100、塩化カルシウム100、ビオチン0.002、パントテン酸カルシウム0.4、葉酸0.002、イノシトール2.0、ナイアシン0.4、パラアミノ安息香酸0.2、塩酸ピリドキシン0.4、リボフラビン0.2、塩酸チアミン0.4、ホウ酸0.5、硫酸銅0.04、ヨウ化カリウム0.1、塩化第二鉄0.2、硫酸マンガン0.4、モリブデン酸ナトリウム0.2、硫酸亜鉛0.4、グルコース20,000(単位は全てmg/L)。
培養初期の3日間では、10mM硫酸亜鉛を添加したYNB-SG培地では酵母菌の増殖はほとんど認められなかった。
しかし、[実験2]に記載した方法で継代培養を繰り返すことにより、[表2]に示したように、硫酸亜鉛10mM添加YNB-SG培地においても、高い増殖性を示すようになった。
酵母菌体抽出液の作成1
1Lの培養ボトルに30mM硫酸亜鉛含有YNB-SG培地800mlを用意し、種菌として60mM亜鉛耐性酵母菌株の分散液8mlを添加し、24℃、通気量1L/min.で、5日間培養を行った。培養後、3500rpmで10分間遠心分離を行い、得られた酵母菌体(湿重量)10gに、精製水50gを加え、菌体を分散させた。この懸濁液を50℃にて24時間放置させ、自己消化させた。この懸濁液を、3500rpmで10分間遠心分離し、上清を取り酵母菌体抽出液とした。この抽出液の固形分は2.0w/v%であった。
酵母菌体抽出液の作成2
1Lの培養ボトルに30mM硫酸亜鉛含有YNB-SG培地800mlを用意し、種菌として50mM亜鉛耐性酵母菌株の分散液8mlを添加し、24℃、通気量1L/min.で、5日間培養を行った。培養後、3500rpmで10分間遠心分離を行い、得られた酵母菌体(湿重量)10gに、精製水50gを加え、菌体を分散させる。この懸濁液を2N-塩酸溶液でPH2.0に調製した後、60℃にて24時間放置させ、酸加水分解させる。この懸濁液を、3500rpmで10分間遠心分離し、上清を取り酵母菌体抽出液とした。この抽出液の固形分は2.5w/v%であった。
酵母菌体抽出液の作成3
1Lの培養ボトルに30mM硫酸亜鉛含有YNB-SG培地800mlを用意し、種菌として40mM亜鉛耐性酵母菌株の分散液8mlを添加し、24℃、通気量1L/min.で、5日間培養を行った。培養後、培養後、3500rpmで10分間遠心分離を行い、得られた酵母菌体(湿重量)10gに、精製水50gを加え菌体を分散させる。この懸濁液を2N-水酸化ナトリウム溶液でPH7.0に調製した後、プロテアーゼであるYL-NL「アマノ」(天野エンザイム株式会社)を1.2%(乾燥菌体量当り)、およびペプチダーゼであるプロテアックス(天野エンザイム株式会社)を2%(乾燥菌体量当り)添加し、50℃で24hr放置し、酵素加水分解を行う。この懸濁液を、3500rpmで10分間遠心分離し、上清を取り酵母菌体抽出液とした。この抽出液の固形分は3.5w/v%であった。
酵母菌体抽出液の作成4
1Lの培養ボトルに40mM硫酸亜鉛含有YNB-SG培地800mlを用意し、種菌として50mM亜鉛耐性酵母菌株の分散液8mlを添加し、24℃、通気量1L/min.で、5日間培養を行った。培養後、3500rpmで10分間遠心分離を行い、得られた酵母菌体(湿重量)10gに、精製水50gを加え、菌体を分散させる。この懸濁液を2N-塩酸溶液でPH2.0に調製した後、60℃にて24時間放置させ、酸加水分解させる。この懸濁液を、3500rpmで10分間遠心分離し、上清を取り酵母菌体抽出液とした。この抽出液の固形分は2.2w/v%であった。
<YNB-SBS培地組成>
YNB(Yeast Nitrogen Base) with Ammonium Sulfate 合成培地に黒砂糖を添加した培地を、YNB-SBS培地と称す。組成は、以下の通り。
硫酸アンモニウム5,000、リン酸二水素カリウム1,000、硫酸マグネシウム500、塩化ナトリウム100、塩化カルシウム100、ビオチン0.002、パントテン酸カルシウム0.4、葉酸0.002、イノシトール2.0、ナイアシン0.4、パラアミノ安息香酸0.2、塩酸ピリドキシン0.4、リボフラビン0.2、塩酸チアミン0.4、ホウ酸0.5、黒砂糖20,000(単位は全てmg/L)。
酵母菌体抽出液の作成4
60mM亜鉛耐性酵母菌株を種菌として、30mM硫酸亜鉛含有YNB-SBS培地で培養した。1Lの培養ボトルに30mM硫酸亜鉛含有YNB-SBS培地800mlを用意し、種菌として60mM亜鉛耐性酵母菌株の分散液8mlを添加し、24℃、通気量1L/min.で、5日間培養を行った。培養後、3500rpmで10分間遠心分離を行い、得られた酵母菌体(湿重量)10gに、精製水50gを加え、菌体を分散させた。この懸濁液を50℃にて24時間放置させ、自己消化させた。この懸濁液を、3500rpmで10分間遠心分離し、上清を取り酵母菌体抽出液とした。この抽出液の固形分は2.3w/v%であった。
硫酸亜鉛の定量
[実施例1]にて調製した酵母菌体抽出液10mlに、蒸留水100mlおよびPH10.7のアンモニア・塩化アンモニウム緩衝液2mlを添加する。これに、指示薬としてエリオクロムブラックT・塩化Na 50mgを加え、0.01mol/Lエデト酸二Na液で滴定した。
滴定により測定した酵母菌体抽出液中の硫酸亜鉛濃度を[表3]に示した。
YNB-SG培地中に硫酸亜鉛を30mM添加して培養した酵母菌体抽出物中には3.5mMの硫酸亜鉛が、YNB-SG培地中に20mM添加して培養した酵母菌体抽出物中には、2.8mMの硫酸亜鉛が含有されていることが確認された。
酵母菌体抽出液の上皮細胞に対する細胞毒性
A)細胞の培養
B)細胞:NHEK-Neo-Epidermal Kera(CAMBREX)
C)培地:EpiLife KG2 (Ca濃度:0.06mM)
D)添加試料:硫酸亜鉛・7水和物(和光純薬工業)、[実施例1]に記載した酵母菌体抽出物
上皮細胞としては、正常ヒト表皮細胞であるNHEK-Neo-Epidermal Kera(CAMBREX)を用い、EpiLife KG2(クラボウ)培地で培養した。細胞を24 well plateに50%コンフルーエント程度に植え付けた。翌日上記の試料を添加し、48時間後に細胞を回収して細胞数を計測した。
ヒートショックプロテイン70の産生誘導の確認
1.細胞の培養
正常ヒト表皮細胞であるNHEK-Neo-Epidermal Kera(CAMBREX)を、Epilife KG2 (Ca濃度:0.06mM)
培地にて50cm2 plate で培養する。
2.試料の調製
コンフルーエントになったヒト正常表皮細胞に[実施例1]にて調製した酵母菌体抽出物をそれぞれの濃度になるように培地に添加した。添加後、37℃にて4時間インキュベートした後、細胞を回収しRIPA bufferにて細胞タンパクを抽出した。
RIPA buffer:Tris-塩酸緩衝液(PH8.0) 50mM、塩化ナトリウム 150mM、EDTA(PH8.0)1mM、Triton X-100 1%、SDS 0.1%、デオキシコール酸ナトリウム0.1%
3.ウエスタン・ブロッティング
12%のアクリルアミドのゲルを作成し、上記で抽出した細胞タンパク質30μgをゲルLaneに添加して電気泳動を行った。PVDF膜に転写後、一次抗体Hsp70(Mouse monoclonal:Stress gene社)、二次抗体としてECLTM Anti-Mouse IgG、Horseradish
Peroxidase linked whole antibody(from sheep)NA931(Amersham Bioscience UK Limited)を用いてウェスタン・ブロッティングを行い、分子量70KDaのヒートショックプロテイン70を確認した。
4.ヒートショックプロテイン70タンパク量の確認
ウエスタン・ブロッティングで得られたバンド強度を[図1]に示した。試薬の硫酸亜鉛・7水和物、および実施例1で得られた[実施例1]で得られた酵母菌体抽出液を添加した細胞において、培地に添加した硫酸亜鉛濃度が100μMでは産生誘導が確認できなかったが、培地に添加した硫酸亜鉛濃度が200μMにおいてはいずれも強いヒートショックプロテイン70の産生誘導が確認できた。
紫外線傷害抑制効果の確認
1.細胞の培養
正常ヒト線維芽細胞であるNB1-RGBを、10%FBS含有D-MEM 培地にて24 well plate で培養する。
2.試料の調製
50%程度コンフルーエントになった細胞に[実施例1]にて調製した酵母菌体抽出物をそれぞれの濃度になるように添加した。添加後、37℃にて4時間インキュベートした後、培地を捨て、紫外線UV-Bを20mJ/cm2照射した。照射後、無血清D-MEMを添加し、37℃にて24時間培養し、細胞数をCELL Counting Kit(同仁化学研究所)
による415nmにおける吸光度値で測定した。
3.紫外線傷害抑制効果
[表5]に示したように、酵母抽出液中の硫酸亜鉛濃度が、0μM、100μM、150μM、200μMと高まるにつれ、細胞数が0.706、0.769、0.775、0.828と増加し、紫外線照射を行う前に、あらかじめ酵母抽出液を細胞に添加することにより、紫外線傷害を抑制できることが明らかになった。また、硫酸亜鉛濃度0μM、と 200μMの細胞数を統計処理すると、5%の危険率で有意差があることがわかった。
下記に示した酵母菌体抽出物の配合料は、抽出液としての量である。カッコ内に蒸発残分としての量を併記した。
(処方例1)化粧用クリーム(質量%)
a)ミツロウ・・・2.0
b)ステアリルアルコール・・・5.0
c)ステアリン酸・・・8.0
d)スクワラン・・・10.0
e)自己乳化型グリセリルモノステアレート・・・3.0
f)ポリオキシエチレンセチルエーテル(20E.O.)・・・1.0
g)[実施例1]で調製した酵母菌体抽出物・・・10.0(0.2)
h)1,3−ブチレングリコール・・・5.0
i)水酸化カリウム・・・0.3
j)防腐剤・酸化防止剤・・・適量
k)精製水・・・残部
製法
a)〜f)までを加熱溶解し、80℃に保つ。h)〜k)までを加熱溶解し、80℃に保ち、a)〜f)に加えて乳化し、40℃まで撹拌しながら冷却する。その後、g)を加え、攪拌し均一に溶解する。
a)ミツロウ・・・0.5
b)ワセリン・・・2.0
c)スクワラン・・・8.0
d)ソルビタンセスキオレエート・・・0.8
e)ポリオキシエチレンオレイルエーテル(20E.O.)・・・1.2
f)[実施例1]で調製した酵母菌体抽出物・・・0.1(0.002)
g)1,3−ブチレングリコール・・・7.0
h)カルボキシビニルポリマー・・・0.2
i)水酸化カリウム・・・0.1
j)精製水・・・残部
k)防腐剤・酸化防止剤・・・適量
l)エタノール・・・7.0
製法
a)〜e)までを加熱溶解し、80℃に保つ。g)〜k)までを加熱溶解し、80℃に保ち、a)〜e)に加えて乳化し、50℃まで撹拌しながら冷却する。50℃でf)、l)を添加し、40℃まで攪拌、冷却する。
a)[実施例2]で調製した酵母菌体抽出物・・・5.0(0.125)
b)グリセリン・・・5.0
c)ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(20E.O.)・・・1.0
d)エタノール・・・6.0
e)香料・・・適量
f)防腐剤・酸化防止剤・・・適量
g)精製水・・・残部
製法
a)〜g)までを混合し、均一に溶解する。
a)ステアリン酸・・・12.0
b)ミリスチン酸・・・14.0
c)ラウリン酸・・・5.0
d)ホホバ油・・・3.0
e)グリセリン・・・10.0
f)ソルビトール・・・15.0
g)1,3−ブチレングリコール・・・10.0
h)POE(20)グリセロールモノステアリン酸・・・2.0
i)水酸化カリウム・・・5.0
j)水・・・残部
k)キレート剤・・・適量
l)香料・・・適量
m)[実施例1]で調製した酵母菌体抽出物・・・1.0(0.02)
製法
a)〜h)までを加熱溶解し70℃に保つ。j)にi)を溶解後a)〜h)に加えケン化する。その後k)、l)を入れ攪拌しながら冷却する。50℃でm)を添加し、40℃まで攪拌、冷却する。
a)[実施例3]で調製した酵母菌体抽出物・・・5.0(0.175)
b)グリセリン・・・5.0
c)ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(20E.O.)・・・1.0
d)エタノール・・・6.0
e)香料・・・適量
f)防腐剤・酸化防止剤・・・適量
g)精製水・・・残部
製法
a)〜g)までを混合し、均一に溶解する。
(処方例5)錠剤(質量%)
1.30mM硫酸亜鉛を含有するYNB-SG培地で培養して得られた乾燥酵母菌体・・・30.0
2.乳糖・・・30.0
3.トウモロコシデンプン・・・32.0
4.ヒドロキシプロピルセルロース・・・6.0
5.ステアリン酸マグネシウム・・・2.0
さらに、化粧品組成物としては紫外線などによるストレスによる表皮細胞障害を防御し、その結果、皮膚を炎症から守ることが可能となる。
Claims (4)
- 亜鉛化合物を10mM以上含有する培地で培養した酵母の菌体抽出物を有効成分とするヒートショックプロテイン70産生誘導剤。
- 亜鉛化合物を10mM以上含有する培地で培養した酵母の菌体抽出物を有効成分とする紫外線傷害抑制剤。
- ヒートショックプロテイン70産生誘導剤又は紫外線傷害抑制剤の製造方法であって、(1)亜鉛化合物を10mM以上含有する培地にて酵母を培養する工程と、
(2)(1)の工程で得られた酵母培養物の抽出物を作製し、
(3)(2)でえられた抽出物を含有させる工程を有する製造方法。 - 亜鉛化合物を10mM以上含有する培地で酵母を培養する方法。
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