JP2014048529A - ラマン顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】視野の広いラマン顕微鏡を提供すること。
【解決手段】励起光２を出射する光源１と、励起光２を試料１５に照射する光学系と、試料１５で発生したラマン散乱光を検出する検出器１２とを備えたラマン顕微鏡であって、光学系は、光反射面４ｃを有し励起光２の向きを可変に変更するガルバノミラー４ｂと、対物レンズ５とを有しており、対物レンズ５のビームスポット１６で発生する光により対物レンズ５の後側に形成される光束は、少なくとも一部の光束１８は反射素子の光反射面に入射し、他の一部の光束１７はガルバノミラー４ｂの光反射面４ｃに入射しないラマン顕微鏡を構成する。
【選択図】図２

Description

本発明は、ラマン顕微鏡に関するものであり、特に広視野の観察に適したラマン顕微鏡に関するものである。

ラマン分光法は物質の同定、結晶の評価、応力の測定などに用いられる光学的測定手法である。例えば、測定対象の試料の１μｍ程度（あるいはそれ以下）のサイズの領域を分析するために、顕微鏡用対物レンズを用いて光源からの光をスポット状の領域に集光する顕微ラマン分光法が広く用いられている。

図７は、従来の一般的な顕微ラマン分光装置（以下、「ラマン顕微鏡」と記載する場合もある。）を示す図である。顕微ラマン分光装置においては、レーザ光源から射出された光がビームスプリッタによって反射された後、顕微鏡用対物レンズによって試料（サンプル）上のスポット状の領域に集光される。このとき、サンプルのスポット状領域からはラマン散乱光が発生する。発生したラマン散乱光は、レーザ光源からの光を集光したのと同じ顕微鏡用対物レンズによって平行光として集められ、ビームスプリッタを透過し、レンズによって集光され、分光器の手前に設置された空間フィルタであるスリットを透過する。スリットを透過したラマン散乱光は分光器によってスペクトルに分光され、検出器によって測定される。

このような顕微ラマン分光装置において、レーザ光のスポットをサンプル上で二次元に走査すれば、物質、応力等の分布像を取得することができる。走査方法としては、（１）ガルバノミラーなどによって対物レンズに入射するレーザ光の角度を変化させ、固定されたサンプルに対してスポットを動かすビームスキャン方式と、（２）サンプルを可動ステージ上に置いて、固定されたスポットに対してサンプルを動かす、ステージスキャン方式が知られている。

ビームスキャン方式の顕微ラマン分光装置としては、例えば特許文献１のものが知られている。図８は、特許文献１の図５を示すものである。この図面の説明に限り、特許文献１において付されている符号のまま説明する。図８においてレーザ光源１０から射出された光は、エッジフィルタ１９で反射され、Ｙ走査装置１６、Ｘ走査装置２０で反射されたあと、リレーレンズ２１，２２を介して対物レンズ２３に入射し、対物レンズ２３の下に置かれた試料２４に入射する。この顕微ラマン分光装置では、ガルバノミラー等のＹ走査装置１６、Ｘ走査装置２０の角度をそれぞれ振ることにより、レーザ光のビームスポットが試料２４上で二次元に走査される。

特開２０１０−５４３６８号公報（第５図）

しかしながら、従来の顕微鏡用対物レンズを用いた装置には次の問題があった。ビームスキャン方式においては、測定できる範囲が使用する顕微鏡用対物レンズの視野（１００μｍから数ｍｍ程度）に制限され、視野外においては空間分解能、感度などの性能が大きく低下してしまう。また、顕微鏡用対物レンズの筺体内部には開口絞りが存在しているため、開口絞りによって光が蹴られないようにするために走査装置との間にリレーレンズが必要であり、そのために装置の部品点数が増え、装置が複雑になる。さらにリレーレンズによる光の損失が原因の感度の低下、リレーレンズから発生する蛍光による背景光の増大が問題となる。

ステージスキャン方式においては、対物レンズの視野による測定範囲の制限はないが、例えば、ピントがあっているかなど対物レンズの視野の外の状態を調べるためには、ステージによるサンプルの移動が必要であり、測定範囲全体の状態がわかりにくい。また、ステージを動作させることによって試料に振動が加わってしまうなどの問題、その他、一般的にビームスキャン方式よりも走査に時間がかかるといった問題がある。

本発明は上記の様な事情に着目してなされたものであって、その目的は、対物レンズの性能を活かしつつ広い視野のラマン分光像を形成し得るラマン顕微鏡を提供することにある。

対物レンズは、試料から様々な方向へ発する光をできるだけ広い角度範囲で多く集光して、試料の像をより正確に得ようとするものである。しかし、レンズの周縁部を通過する光には歪曲収差などの諸収差が現れ、像品質を落としてしまう。そのため顕微鏡用対物レンズには通常、諸収差の発生要因である周縁光をカットする（蹴る）ための開口絞りが設けられている。この開口絞りを通過した光は、収差の少ない像の形成に寄与する。したがって、開口絞りの後側の光学系で更に蹴られが発生することなくＣＣＤ等の検出器に到達することが望ましいのである。

例えば、前述の図８に示したラマン顕微鏡におけるリレーレンズ２１，２２は、試料２４で発生して対物レンズ２３を透過してきた様々な方向の光がガルバノミラー等のＸ走査装置２０によって蹴られないようにするため、すなわち対物レンズ２３を透過した全光束をＸ走査装置２０の反射面に到達させるために設けられている。このように、対物レンズ２３を透過した光がＸ走査装置２０に蹴られないようにすることは、技術常識として大前提をなしていた。

本発明者は、試料の広い視野を観察するために対物レンズとして実体顕微鏡用対物レンズを用いることを検討したが、対物レンズとして実体顕微鏡用の対物レンズ等を用いる場合には、従来のようにリレーレンズを用いることが困難であることに直面した。その理由は、実体顕微鏡用対物レンズは、焦点距離ｆに対する開口数（ＮＡ）の比（ＮＡ／ｆ）が通常の顕微鏡用対物レンズよりも非常に大きいために、仮にリレーレンズを使用して実用的なリレー性能を得ようとすると、リレーレンズ１つあたりの構成レンズ枚数が実体顕微鏡用対物レンズなみに多くなってしまい、これらのレンズを透過することに伴う光の損失が非常に多くなってしまうためである。

そこで本発明者は、対物レンズを透過した光がガルバノミラー等の走査装置に蹴られないようにするという従来の前提にとらわれず、対物レンズの前側焦点で発生する光により対物レンズの後側に形成される光束のうち少なくとも一部はガルバノミラー等の反射素子に入射させ、光束の他の一部はガルバノミラーに入射させない構成、すなわち対物レンズを透過した光の一部がガルバノミラーによって蹴られるという構成に想到した。対物レンズを透過した光がガルバノミラーによって一部蹴られるということは、ガルバノミラーに対物レンズの開口絞りの役割を持たせるものである。対物レンズの開口絞りの位置においてガルバノミラーの角度が変化することにより、対物レンズの開口数を最大限に活かしたビーム走査が可能となる。

上記目的を達成し得た本発明のラマン顕微鏡は、励起光を出射する光源と、前記励起光を試料に照射する光学系と、前記試料で発生したラマン散乱光を検出する検出器と、を備えたラマン顕微鏡であって、
前記光学系は、光反射面を有し前記励起光の向きを可変に変更する反射素子と、対物レンズとを有しており、前記対物レンズの前側焦点で発生する光により前記対物レンズの後側に形成される光束は、少なくとも一部は前記反射素子の光反射面に入射し、前記光束の他の一部は前記反射素子の光反射面に入射しないものである。
このような構成により、対物レンズの開口数を最大限に活かしたビーム走査が可能となり、試料の広い視野のラマン分光像を得ることができる。

上記ラマン顕微鏡において、前記反射素子の光反射面と前記対物レンズの光軸との交点を、前記対物レンズの後側焦点から、前記対物レンズから離れる方向に距離０．２Ｆ（Ｆ：対物レンズの後側焦点距離）離れた位置よりも前記対物レンズに近い側におくことが好ましい。

上記ラマン顕微鏡において、前記対物レンズに入射する前記励起光のビーム径を、前記対物レンズの前側焦点で発生する光により前記対物レンズの後側に形成される光束であって前記反射素子の光反射面に入射する光束の径の７０％以下とすることが好ましい。

上記ラマン顕微鏡において、前記反射素子の光反射面に入射する前記励起光のビーム径を、前記光反射面の短径の７０％以下とすることが好ましい。

上記ラマン顕微鏡において、前記対物レンズは、１または複数のレンズで構成されるレンズ系と、該レンズ系を保持するための筒状筐体とを有しており、前記対物レンズの前側焦点で発生して前記対物レンズの像面側に透過できる光と光軸とがなす角の最大値が前記筒状筐体によって制限されていることが好ましい。

上記ラマン顕微鏡において、前記対物レンズとして、平行系実体顕微鏡用対物レンズを用いることができる。

上記ラマン顕微鏡において、前記平行系実体顕微鏡用対物レンズの焦点距離を４０ｍｍ以上とすることが好ましい。

上記ラマン顕微鏡において、前記試料を観察する撮像装置をさらに設けることが好ましい。

上記ラマン顕微鏡において、前記反射素子と前記対物レンズとの間にレンズが存在させない態様を好ましく実施することができる。

上記ラマン顕微鏡において、前記検出器の光入射側に分光器、該分光器の光入射側に空間フィルタを更に有しており、前記対物レンズの前側焦点位置から、前記空間フィルタへの結像倍率を２．５倍以下とすることが好ましい。

上記ラマン顕微鏡において、前記反射素子のうちの少なくとも１つを、２軸方向に走査が可能な反射素子とすることが好ましい。

上記ラマン顕微鏡において、前記反射素子のうち、前記対物レンズに最も近いものの光反射面の形状を楕円とすることが好ましい。

本発明のラマン顕微鏡では、対物レンズの前側焦点で発生する光により対物レンズの後側に形成される光束が少なくとも一部は反射素子の光反射面に入射し、光束の他の一部は反射素子の光反射面に入射しない構成とすることにより、対物レンズの性能を活かしつつ、広い視野のラマン分光像を得ることができる。さらに、従来、反射素子と対物レンズの間に使用していたリレーレンズを用いる必要もなくなる。

図１は、本発明の実施の形態におけるラマン顕微鏡の装置構成図である。 図２は、同実施の形態のラマン顕微鏡における光の進路を示す図である。 図３は、同実施の形態のラマン顕微鏡においてガルバノミラーの角度を変えた場合における光の進路を示す図である。 図４は、図３の一部拡大図であり、ガルバノミラーの設置位置を説明するものである。 図５は、図２の一部拡大図であり、対物レンズ付近の光の様子を示すものである。 図６（ａ）は、励起光のビーム径が大きい場合のスポットの様子、図６（ｂ）は、励起光のビーム径が小さい場合のスポットの様子を示すものである。 図７は、従来のラマン顕微鏡の光学系を示すものである。 図８は、他の従来のラマン顕微鏡の光学系を示すものである。

以下、本発明の実施の形態により本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施の形態によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。以下、図面を用いて本発明の実施の形態におけるラマン顕微鏡について説明する。

図１は、本発明の実施の形態におけるラマン顕微鏡の装置構成図である。図１において、レーザである光源１から射出された励起光２は、ビームエキスパンダー３によってビーム径を拡げられた後、エッジフィルタ７、反射素子であるガルバノミラー４により向きを変えられる。その後、励起光２は、対物レンズ５に入射して試料ステージ６上に集光されビームスポットを形成する。

試料において散乱された光は、再び対物レンズ５に入射した後にガルバノミラー４により向きを変えられ、エッジフィルタ７を透過することによりレーザ光（励起光２）が除去され、結像レンズ８（焦点距離２００ｍｍ）によって分光器１０の入口に入射される。なお分光器１０の入口側には、ピンホールやスリットに代表される空間フィルタ９が設けられている。分光器１０の内部に導入された光は、反射型グレーティング１１によって波長ごとに分光され、冷却ＣＣＤ等の検出器１２によって光の強度が測定される。ガルバノミラー４は、角度の変更が可変な光学素子であり、ガルバノミラー４の向きを変えてビームスポットを２次元に走査することにより２次元のラマン分光イメージを取得することができる。

また、ガルバノミラー４と対物レンズ５との間にビームスプリッタを挿入し、分岐された光をビデオカメラ１３の撮像素子上に結像させることで、測定しようとする視野全体のフォーカス等状態を把握することができる。

図１のラマン顕微鏡において、ガルバノミラー４は、励起光２の向きを変更できる反射素子であり、Ｘ軸変更用とＹ軸変更用の二つの反射素子を備えている。Ｘ軸、Ｙ軸は、対物レンズ５の光軸に垂直な面において規定されるものである。後述するが、一つの反射素子を用いてＸ軸、Ｙ軸の２軸の角度を走査することもできる。

図１のラマン顕微鏡において、エッジフィルタ７は、波長に応じて光を反射又は透過する。すなわち、エッジフィルタ７は、波長に応じた透過率、及び反射率を有している。具体的には、エッジフィルタ７は、レーザ波長の光を反射して、レーザ波長よりも波長の長い光を透過する。これにより、効率よく、ラマン散乱光を測定することができる。すなわち、励起光２となるレーザ光のほとんどは、エッジフィルタ７で反射して、試料の方向に向かう。一方、レーザ光よりも長い波長を有するラマン散乱光のほとんどは、エッジフィルタ７を透過して、分光器１０の方向に向かう。エッジフィルタ７には、例えばＳｅｍｒｏｃｋ社製のラマン分光用フィルタ「ＲａｚｏｒＥｄｇｅ」を用いることができる。

対物レンズ５には、例えば、オリンパス社製の「ＳＤＦ ＰＬＡＰＯ １ＸＰＦ」（ＮＡ：０．１５）等の実体顕微鏡用対物レンズを用いることができる。実体顕微鏡用対物レンズは、顕微鏡用の対物レンズに比べて、焦点距離が長い、視野が広い、無限系（平行系）の光学系であるといった特徴がある。実体顕微鏡用対物レンズの焦点距離の下限については、例えば、４０ｍｍ、６０ｍｍ、８０ｍｍとすることができる。焦点距離の上限については特にはないが、例えば、３００ｍｍ、２５０ｍｍ、２００ｍｍとすることもできる。また、実体顕微鏡用対物レンズは、１または複数のレンズで構成されるレンズ系と、このレンズ系を保持するための筒状筐体とを有しており、対物レンズの前側焦点で発生して対物レンズの像面側に透過できる光と光軸とがなす角の最大値が筒状筐体によって制限されているという特徴も有している。すなわち、筒状筐体の内部には、視野を制限するための開口絞りを有していない。

図２も、基本的には図１のラマン顕微鏡を示す図であるが、図１がラマン顕微鏡の主に装置構成を示しているのに対して、図２は、同ラマン顕微鏡における光の進路をより詳細に示すものである。図２において、光源１から射出された励起光２は、ビームエキスパンダー３によってビーム径を拡げられた後、エッジフィルタ１４で反射され、さらに反射素子であるＸ軸用のガルバノミラー４ａおよびＹ軸用のガルバノミラー４ｂにより向きを変えられる。なお、実際には、ガルバノミラー４ａは光線を紙面の奥行き方向に反射させるものであるが、図面の理解のため便宜上、同一平面内の光学系として表している。その後、励起光２は、対物レンズ５に入射して前側焦点であるビームスポット１６に集光され、試料ステージ６上の試料１５を照射する。試料１５は、励起光２により基底状態から、ラマン散乱光を放出し得る励起状態となる。

励起された試料１５から発生するラマン散乱光は、再び対物レンズ５に入射した後にガルバノミラー４ｂ、４ａにより向きを変えられ、エッジフィルタ１４を透過することにより励起光２が除去され、結像レンズ８によって分光器１０の入口に入射される。分光器１０の入口側には、図１において説明した通り、ピンホールやスリットに代表される空間フィルタ９が設けられている。分光器１０の内部に導入された光は、反射型グレーティング１１によって波長ごとに分光され、冷却ＣＣＤ等の検出器１２によって光の強度が測定される。

試料１５から散乱された光の振る舞いについてもう少し詳しく説明すると、対物レンズ５の前側焦点１６で発生する光により対物レンズ５の後側に形成される光束の一部である光束１８は最初に到達するガルバノミラー４ｂの光反射面４ｃに入射して分光器１０に到達している。一方、光束の他の一部である光束１７はガルバノミラー４ｂの光反射面４ｃに入射せず、分光器１０には到達しない。すなわち、対物レンズ５の後側に形成される光束の中でも、最初に到達するガルバノミラー４ｂによって蹴られる部分があり、ガルバノミラー４ｂの光反射面４ｃが実質的に対物レンズ５の開口絞りの役割を果たしている。

図３は、図２のラマン顕微鏡においてガルバノミラー４ｂの角度を変えた場合における光の進路を示す図である。図３では、ガルバノミラー４ｂの角度を変えた場合に形成されるビームスポット１９と、ビームスポット１９で発生した光であって最初に到達するガルバノミラー４ｂの光反射面４ｃに入射する光束２０を示している。なお、図面の複雑化を避けるために、ビームスポット１６，１９で発生した光のうちガルバノミラー４ｂの光反射面４ｃに入射しない光束は図示していない。図３にも示すように、ガルバノミラー４ｂの光反射面４ｃは対物レンズ５の開口絞りとして働いている。

以上説明したように、本発明は、励起光２を出射する光源１と、励起光２を試料１５に照射する光学系と、試料１５で発生したラマン散乱光を検出する検出器１２とを備えたラマン顕微鏡であって、光学系は、光反射面４ｃを有し励起光２の向きを可変に変更する反射素子４ｂと、対物レンズ５とを有しており、対物レンズ５の前側焦点１６で発生する光により対物レンズ５の後側に形成される光束は、少なくとも一部の光束１８は反射素子の光反射面に入射し、他の一部の光束１７は反射素子４ｂの光反射面４ｃに入射しないものである。このように対物レンズ５の開口絞りとなるガルバノミラー４ｂの角度を変化させるために、リレーレンズを用いずとも対物レンズ５の開口数（ＮＡ）を最大限に活かしたビーム走査が可能となる。

本発明では、反射素子であるガルバノミラー４ｂと対物レンズとの間のリレーレンズをなくすこともできるため、リレーレンズによる信号光（ラマン散乱光）の損失が起こらない、リレーレンズにおいて励起光２に起因して発生する蛍光をなくせるため、ラマン散乱光のＳＮ比が向上する、といった効果が得られる。リレーレンズをなくすことにより、その他の効果もある。リレーレンズの間ではレーザ光のパワーの空間密度が高いため、空気中の分子によるラマン散乱光が発生する。例えば、酸素、又は窒素にレーザ光が照射されると、ラマン散乱光が出射される。したがって、空気からのラマン散乱光が光学系を伝播して、検出器１２によって検出されてノイズとなってしまう。したがって、リレーレンズをなくせば、より精度の高いラマン顕微が可能となる。

以下、本発明のより好ましい実施態様について説明する。
（１）ガルバノミラー４ｂの設置位置
図４は、図３の一部拡大図であり、ガルバノミラー４ｂの好ましい設置位置を説明するものである。図４では、光線の屈折を理解しやすくするために、対物レンズ５は１枚のレンズで示している。図４に示すように、ガルバノミラー４ｂの光反射面４ｃと対物レンズ５の光軸との交点を、対物レンズ５の後側焦点２１から、対物レンズ５から離れる方向に距離０．２Ｆ（Ｆ：対物レンズの後側焦点距離）離れた位置（遠点２２）よりも対物レンズ５に近い側におくことが好ましい。対物レンズ５の筐体に蹴られることなく、励起光２を走査できる範囲を広げるという観点、或いは、試料１５からの光束を検出器１２に導くという観点から、ガルバノミラー４ｂは、できるだけ対物レンズ５に近い位置に置くことが好ましいからである。

さらに、ガルバノミラー４ｂの光反射面４ｃと対物レンズ５の光軸との交点を、対物レンズ５の後側焦点２１付近に置けば、後側焦点面の同じ点から発した光は対物レンズ５と試料１５との間では平行光となる物体側テレセントリック光学系となり、試料１５をフォーカスの合った位置から光軸方向に多少動かしたり、傾斜させたりしても、ラマン分光像の形が変化せず、試料の形状を正確に調べられる。このような効果を実効的に得るためには、ガルバノミラー４ｂの光反射面４ｃと対物レンズ５の光軸との交点を、対物レンズ５の後側焦点２１の位置から、後側焦点距離（Ｆ）の±２０％以内でずれた位置、すなわちガルバノミラー４ｂの光反射面４ｃと対物レンズ５の光軸との交点と、対物レンズの後側焦点との距離を０．２Ｆ以下の範囲とすることが好ましい。より好ましくは０．１５Ｆ以下、さらに好ましくは０．１Ｆ以下である。

（２）励起光２のビーム径Ｄｉ
図５は、図２の一部拡大図であり、対物レンズ５付近の光路を示すものである。
対物レンズ５に入射する励起光２のビーム径の大きさＤｉは、対物レンズ５の前側焦点で発生する光により対物レンズ５の後側に形成される光束であって反射素子であるガルバノミラー４ｂの光反射面４ｃに入射する光束１８の径の大きさＤｄの７０％以下であることが好ましい。より好ましくは６０％以下、さらに好ましくは５０％以下、いっそう好ましくは４０％以下である。以下、励起光２のビーム径の大きさＤｉを、光束１８の径の大きさＤｄよりも小さくすることが望ましい理由について詳しく説明する。

図７に示した従来の顕微ラマン分光イメージング装置には、焦点深度が浅く、試料の僅かな凹凸でもデフォーカスしてしまう問題点があった。これは、図７の光学系が共焦点光学系となっており、分光器の入り口に設置された空間フィルタ（例えばスリット、ピンホール等）によって対物レンズの前側焦点から光軸方向に外れた点からの光が遮られてしまい、分光器に入射しないためである。

共焦点光学系においては、対物レンズの焦点と共役な位置に空間フィルタが置かれるため、対物レンズの前側焦点面以外から発生した光はカットされ検出器に到達しない。図１の光学系は空間フィルタ９が対物レンズ５の焦点と共役な位置に置かれた共焦点光学系である。

このような共焦点光学系においては、対物レンズ５によって光が集光、収集される角度、すなわちＮＡを小さくすることで、焦点深度が深くなる。しかしながら、対物レンズ５のＮＡを小さくした場合には、試料１５から発生する光を収集できる量がＮＡの２乗に比例して小さくなってしまう。ラマン分光測定においては、試料１５で発生するラマン散乱光が微弱であるため、試料１５から発生したラマン散乱光はできる限り広い角度で集光する必要があり、ＮＡはできるだけ大きくしたいところである。

共焦点光学系の焦点深度を大きくする別の方法として、空間フィルタ９の開口（ピンホールの開口径、あるいはスリット幅）を大きくすることも考えられる。しかしながら、顕微ラマン分光イメージング装置においては、空間フィルタ９は分光器１０の入り口に設置されているため、そのサイズを大きくすると、分光分解能が低下してしまうという技術常識がある。

そこで、本発明者は、ラマン散乱光の集光効率や分光分解能を維持しつつ、焦点深度を深めるため、以下の検討を行った。

図５に示したように、試料１５と対物レンズ５の間において、励起光２と光軸とがなす最大角度をθｉ、試料１５から発生してガルバノミラー４ｂに蹴られない光束１８と光軸とがなす最大角度をθｄとする。ここで、ｓｉｎ（θｉ）の値を「照明側ＮＡ」あるいは「ＮＡｉ」、ｓｉｎ（θｄ）の値を「検出側ＮＡ」あるいは「ＮＡｄ」ということにする。

図６は、対物レンズ５付近から試料１５にかけての光の様子を示すものであり、図６（ａ）は、励起光２のビーム径Ｄｉが大きい場合（照明側ＮＡが大きい場合）のスポットの様子、図６（ｂ）は、励起光２のビーム径Ｄｉが小さい場合（照明側ＮＡが小さい場合）のスポットの様子を示すものである。当然のことながら、照明側ＮＡが小さい場合のスポットは大きくなる。

共焦点光学系の焦点深度は、光源１からの励起光２が試料１５に集光される角度（θｉ）およびサンプルから発生した光が集光される角度（θｄ）の両方によって決まる。すなわち、照明側ＮＡ、検出側ＮＡの両方によって決まる。

焦点深度を深くするために、検出側ＮＡを小さくすると、試料１５から発生する光の集光量が低下してしまう。一方で細い励起光２を使用することで照明側のＮＡのみを小さくする場合には、試料１５から発生する光の収集効率を下げることなく、焦点深度を深くすることができる。

上記のようにＤｉの小さい励起光２を用いる場合には、試料１５におけるビームスポットのサイズは大きくなり、面内の空間分解能は低下する。通常の顕微鏡においてはこのような空間分解能の低下は好ましくない。しかしながら、広い視野を測定することが目的である場合には、ビームスポットを大きくすることは、より少ない測定点数で視野全体を測定できるため、むしろ好ましいものである。

次に、Ｄｉの小さい励起光２を用いる場合に好ましい空間フィルタ９の開口サイズ（ピンホールにおいては開口直径、スリットにおいては開口幅）について説明する。図６の光学系において、励起光２が試料１５に形成するビームスポットのサイズは、照明側ＮＡ（ＮＡｉ）を用いて１．２２λ／ＮＡｉと表される。λは、励起光２の波長である。ここで、１．２２λ／ＮＡｉのサイズのスポット状の領域から発生したラマン散乱光は、空間フィルタ９の位置に１．２２Ｍλ／ＮＡｉのスポットサイズで結像される（但し対物レンズ５から空間フィルタ９までの検出光学系での回折の効果は、Ｄｉ＜Ｄｄの場合には微小であるため考慮していない）。ここでＭは試料１５（対物レンズの前側焦点面の位置）から空間フィルタ９までの結像の倍率である。空間フィルタ９の開口のサイズを、１．２２Ｍλ／ＮＡｉとすることで、試料１５上のビームスポットからの光のほとんどを分光器１０側に通すことができる。

ある開口サイズの空間フィルタ９による共焦点作用（焦点深度を浅くさせる作用）の大きさは、検出側ＮＡ（ＮＡｄ）および結像倍率Ｍによって決まる。空間フィルタ９の開口サイズが１．２２Ｍλ／ＮＡｄの半分の大きさの場合、焦点深度はほぼ最小となり、これを超える開口サイズの場合には、焦点深度は空間フィルタ９の開口サイズと１．２２Ｍλ／ＮＡｄの大きさの比にほぼ比例することが知られている。

したがって、Ｄｉの小さい励起光２によって試料１５に形成される大きめのビームスポットのサイズに合わせて、空間フィルタ９の開口サイズを１．２２Ｍλ／ＮＡｉとすると、ＮＡｉ＜ＮＡｄであることから、１．２２Ｍλ／ＮＡｉ＞１．２２Ｍλ／ＮＡｄであるため、従来のラマン顕微鏡（ＮＡｉ＝ＮＡｄ）に比べて、空間フィルタ９の開口サイズが大きいため、空間フィルタ９の共焦点作用が小さくなり、より深い焦点深度が得られる。すなわち、本実施の形態における空間フィルタ９の開口サイズは、試料１５のビームスポット１６からの光のほとんどを通すことができるだけでなく、従来よりも共焦点作用が小さく抑えられている。

次に、分光分解能の観点から、開口フィルタ９の好ましい開口サイズについて考える。分光分解能はより小さなピンホールを用いることで向上するが、冷却ＣＣＤカメラのような、アレイ型の検出器１２を用いる場合には、検出器１２の画素のサイズより小さくしても（モノクロメータの場合には出口スリットの大きさよりも小さくしても）、ほとんど分光分解能は向上しない。したがって、検出器１２の画素サイズ程度が、より高い分光分解能を得るために好ましい空間フィルタ９の開口サイズである。

以上の条件を満たすために、１．２２Ｍλ／ＮＡｉが検出器１２の画素サイズ程度となる結像倍率Ｍを特定することが好ましい。これによって、ラマン散乱光の集光効率、分光分解能を維持しつつ、焦点深度の深いラマン顕微鏡が実現される。与えられた対物レンズに対して、結像倍率Ｍは、空間フィルタ９への結像レンズ８の焦点距離によって調整することができる。

結像倍率Ｍの上限は、例えば、２．５倍、２．０倍、或いは、１．５倍とすることができる。倍率の下限は、例えば、０．２倍、０．４倍、或いは、０．６倍とすることができる。

一例として、表１に従来のラマン顕微鏡と、本発明の実施の形態におけるラマン顕微鏡の設計パラメータを示す。

他方、ビーム径Ｄｉの好ましい大きさを他の方法で特定することもできる。例えば、反射素子の光反射面に入射する励起光のビーム径Ｄｉは、光反射面の短径の７０％以下とすることが好ましい。より好ましくは６０％以下、さらに好ましくは５０％以下、いっそう好ましくは４０％以下である。

（３）反射素子（ガルバノミラー）
（３−１）反射素子が複数ある場合
図２を用いて説明したように、反射素子が複数ある場合は、対物レンズ５の前側焦点で発生する光により対物レンズ５の後側に形成される光束１７は、対物レンズ５に最も近いガルバノミラー４ｂによって蹴られる構成にする必要があるが、ガルバノミラー４ｂによって蹴られずに反射された光束１８は、対物レンズ５に対して遠い位置にあるガルバノミラー４ａによっては蹴られない構成とすることが望ましい。対物レンズ５の瞳はガルバノミラー４ｂによって規定されているため、光束１８が瞳以外のガルバノミラー４ａによって蹴られると、分光器１０に入射する光の量が不必要に低下し、分光イメージング特性を一定に保てないからである。

（３−２）反射素子が一つの場合
先にも少し触れたが、一つの反射素子を用いてＸ軸、Ｙ軸の２軸の角度を走査することもできる。２軸可変の反射素子としては、例えば、ＴＨＯＲＬＡＢＳ社製の「高速ステアリングミラー」を使用することができる。このような１枚で２軸可変の反射素子を用いることにより、対物レンズ５に対する開口絞りが１つの反射素子の光反射面で定まるため、分光イメージング特性を一定に保つことができる。

（３−３）反射素子の光反射面の形状
対物レンズ５に最も近いガルバノミラー４ｂの光反射面４ｃの形状を楕円とすることが望ましい。光反射面４ｃは、上述の通り対物レンズ５の開口絞りの役割を果たしているが、検出器１２から見て開口絞りである光反射面４ｃが円形となるためには、光反射面４ｃの実際の形状を楕円とすればよいからである。上記の高速ステアリングミラーを使用する場合も同様に、光反射面４ｃの形状を楕円とすることが望ましい。

以上のように、本実施の形態におけるラマン顕微鏡によれば、対物レンズの前側焦点で発生する光により対物レンズの後側に形成される光束のうち少なくとも一部はガルバノミラー等の反射素子に入射させ、光束の他の一部はガルバノミラーに入射させない構成とすることにより、対物レンズの開口数を最大限に活かしたビーム走査が可能となり、試料の広い視野のラマン分光像を得ることができる。また、対物レンズに入射する励起光のビーム径を小さくすることにより、ラマン散乱光の集光効率や分光分解能を維持しつつも、焦点深度の深いラマン顕微鏡を提供することができるものである。

１ 光源
２ 励起光
３ ビームエキスパンダー
４ａ ガルバノミラー
４ｂ ガルバノミラー
４ｃ 光反射面
５ 対物レンズ
６ 試料ステージ
７ エッジフィルタ
８ 結像レンズ
９ 空間フィルタ
１０ 分光器
１１ 反射型グレーティング
１２ 検出器
１３ ビデオカメラ
１４ エッジフィルタ
１５ 試料
１６ ビームスポット
１７ 光束
１８ 光束
１９ ビームスポット
２０ 光束
２１ 後側焦点
２２ 遠点

Claims (12)

1. 励起光を出射する光源と、
   前記励起光を試料に照射する光学系と、
   前記試料で発生したラマン散乱光を検出する検出器と、を備えたラマン顕微鏡であって、
   前記光学系は、光反射面を有し前記励起光の向きを可変に変更する反射素子と、対物レンズとを有しており、
   前記対物レンズの前側焦点で発生する光により前記対物レンズの後側に形成される光束は、少なくとも一部は前記反射素子の光反射面に入射し、前記光束の他の一部は前記反射素子の光反射面に入射しないことを特徴とするラマン顕微鏡。
2. 前記反射素子の光反射面と前記対物レンズの光軸との交点は、前記対物レンズの後側焦点から、前記対物レンズから離れる方向に距離０．２Ｆ（Ｆ：対物レンズの後側焦点距離）離れた位置よりも前記対物レンズに近い側にある請求項１に記載のラマン顕微鏡。
3. 前記対物レンズに入射する前記励起光のビーム径が、前記対物レンズの前側焦点で発生する光により前記対物レンズの後側に形成される光束であって前記反射素子の光反射面に入射する光束の径の７０％以下である請求項１または２に記載のラマン顕微鏡。
4. 前記反射素子の光反射面に入射する前記励起光のビーム径が、前記光反射面の短径の７０％以下である請求項１〜３のいずれかに記載のラマン顕微鏡。
5. 前記対物レンズは、１または複数のレンズで構成されるレンズ系と、該レンズ系を保持するための筒状筐体とを有しており、前記対物レンズの前側焦点で発生して前記対物レンズの像面側に透過できる光と光軸とがなす角の最大値が前記筒状筐体によって制限されている請求項１〜４のいずれかに記載のラマン顕微鏡。
6. 前記対物レンズが、平行系実体顕微鏡用対物レンズである請求項１〜５のいずれかに記載のラマン顕微鏡。
7. 前記平行系実体顕微鏡用対物レンズの焦点距離が４０ｍｍ以上である請求項６に記載のラマン顕微鏡。
8. 前記試料を観察する撮像装置をさらに設けた請求項１〜７のいずれかに記載のラマン顕微鏡。
9. 前記反射素子と前記対物レンズとの間にレンズが存在しない請求項１〜８のいずれかに記載のラマン顕微鏡。
10. 前記検出器の光入射側に分光器、該分光器の光入射側に空間フィルタを更に有しており、前記対物レンズの前側焦点位置から、前記空間フィルタへの結像倍率が２．５倍以下である請求項１〜９のいずれかに記載のラマン顕微鏡。
11. 前記反射素子のうちの少なくとも１つは、２軸方向に走査が可能な反射素子である請求項１〜１０のいずれかに記載のラマン顕微鏡。
12. 前記反射素子のうち、前記対物レンズに最も近いものの光反射面の形状が楕円である請求項１〜１１のいずれかに記載のラマン顕微鏡。