JP2013545087A - 脳損傷のバイオマーカー - Google Patents

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Abstract

本発明はバイオマーカーの分野に関する。より具体的には、本発明は脳損傷を診断する際に有用なバイオマーカーに関する。脳損傷は顕性または外傷性脳損傷、さらに無症候性脳損傷（ＳＣＩ）を含むことができる。１つの実施形態においては、患者のＳＣＩを診断するための方法は（ａ）患者からサンプルを採取すること；（ｂ）バイオマーカーパネルがＡＳＴＮ１、ＢＡＩ３、ＣＮＤＰ１、ＥＲＭＩＮ、ＧＦＡＰ、ＧＲＭ３、ＫＬＨ３２、ＭＡＧＥ２、ＮＲＧ３、ＮＲＧＮ、ＯＭＧ、ＳＬＣ３９Ａ１２、ＲＴＮ１およびＭＴ３を含むことを特徴とする、患者から採取したサンプル中のバイオマーカーパネルのレベルを測定すること；および（ｃ）事前に定義したレベルの１つとの相関が診断を提供することを特徴とする、バイオマーカーパネルのレベルを、ＳＣＩを有する患者と相関する同じバイオマーカーパネルの事前に定義したレベルおよびＳＣＩのない患者と相関する同じバイオマーカーパネルの事前に定義したレベルと比較することを含む。
【選択図】図１

Description

（関連出願の相互参照）
本明細書は、いずれもその全文を参照文献として明細書に援用する２０１１年１月２７日に出願された米国特許仮出願第６１／４３６，９５６号明細書、２０１１年１月２７日に出願された米国特許仮出願第６１／４３６，９５５号明細書、および２０１０年１０月１４日に出願された米国特許仮出願第６１／３９３，００９号明細書の利益を主張するものである。
（政府の利害関係の陳述）
本発明は、第ＮＨＬＢＩ １ Ｒ０１ ＨＬ０９１７５９−０２号およびＮＨＬＢＩ ５Ｕ５４ＨＬ０９０５１５−０２号助成金の下で政府の援助によりなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明はバイオマーカーの分野に関する。より具体的には、本発明は脳損傷を診断する際に有用なバイオマーカーに関する。
（電子的に提出された資材の参照文献としての援用）
本明細書は配列表を含む。「Ｐ１０７８４−０８＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ−ＳＴ２５．ｔｘｔ．」という標題のＡＳＣＩＩテキストファイルとしてＥＦＳ−Ｗｅｂを通じて電子的に提出されている。配列表はサイズが１，９４７バイトであり、２０１１年１０月１３日に作製された。その全体を本明細書に参照文献として援用する。
脳損傷は複雑であると共に重度の多発的臨床転帰をとることがある。脳および脊髄の損傷は頭部外傷、脳卒中、分娩時外傷、心臓手術、心停止および患者が心室補助装置または体外膜型酸素供給（ＥＣＭＯ）による循環器系サポートを必要とすることが原因で発生することがある。さらに、無症候性脳損傷の検出は、特に分娩関連損傷を有する小児および新生児においては困難である。鎌形赤血球症を有する小児は無症候性脳損傷のリスクが高い。小児の無症候性脳損傷を治療しないと顕性脳卒中、神経学的損傷、学習障害および記憶喪失に進行することがある。
残念ながら、理学的検査および画像診断（ＣＴスキャンまたはＭＲＩ）などの臨床的手段は、脳損傷を有する乳児、小児または成人を特定するには主観的で、広範に利用できず、敏感度または特異性が不十分で、かつ／または費用が高すぎる。脳損傷、および特に無症候性脳損傷を有する乳児、小児および成人は顕性脳卒中、および認知および運動欠損の発症、および認知症に進行するリスクが有意に高いため、これらの患者を特定する大きな臨床的ニーズがある。
本発明は、少なくとも部分的に、脳および中枢神経系（ＣＮＳ）損傷後に体液を循環するＣＮＳ特異的タンパク質バイオマーカーの発見に基づいている。ＣＮＳ細胞からのタンパク質の放出または分泌は、小児または成人において、患者の生存、回復および新規または再発性ＣＮＳ損傷を安定化または予防するための治療法の効果に対する診断的評価／予後評価に有用となることがある。したがって、血中ＣＮＳタンパク質の検出は、無症候性および顕性脳損傷を有する小児および成人を特定することによりＣＮＳ損傷の診断の正確度を改善し、かつ転帰を改善するための有効性について新規および既存のＣＮＳ損傷の治療を判定および実証する手段を提供する。これは、損傷を軽減するための新規プロトコルまたは医薬品（介入）をスクリーニングする手段も提供するであろう。
したがって、１つの態様においては、本発明は脳損傷を有する小児および成人の診断にとって有用なバイオマーカーを提供する。１つの実施形態においては、脳損傷は無症候性脳損傷（ＳＣＩ）である。他の実施形態においては、脳損傷は顕性脳損傷である。バイオマーカーを用いて患者を診断し、患者の予後を経時的に評価し、または患者の脳損傷の状態を全般的に判定することができる。
具体的な実施形態においては、患者の脳損傷を診断するための方法は（ａ）患者からサンプルを採取すること；（ｂ）患者から採取したサンプル中の１つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベルを測定すること；および（ｃ）事前に定義したレベルの１つとの相関が診断を提供することを特徴とする、１つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベルを、脳損傷を有する患者と相関する同じバイオマーカーの事前に定義したレベルおよび脳損傷のない患者と相関する同じバイオマーカーの事前に定義したレベルと比較することという段階を含む。
より具体的な実施形態においては、患者の無症候性脳損傷（ＳＣＩ）を診断するための方法は（ａ）患者からサンプルを採取すること；（ｂ）患者から採取したサンプル中の１つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベルを測定すること；および（ｃ）事前に定義したレベルの１つとの相関が診断を提供することを特徴とする、１つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベルを、ＳＣＩを有する患者と相関する同じバイオマーカーの事前に定義したレベルおよび脳損傷のない患者と相関する同じバイオマーカーの事前に定義したレベルと比較することという段階を含む。
１つまたはそれ以上のバイオマーカーは、アストロタクチン１（ＡＳＴＮ１）、脳血管新生阻害物質３（ＢＡＩ３）；カルノシンジペプチダーゼ（ＣＮＤＰ１）；ＥＲＭＩＮ；グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）；代謝型グルタミン酸受容体３（ＧＲＭ３）；ケルヒ様タンパク質３２（ＫＬＨ３２）；メラノーマ抗原ファミリーＥ，２（ＭＡＧＥ２）；ニューレグリン３（ＮＲＧ３）；ニューログラニン（ＮＲＧＮ）；乏突起膠細胞ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）；溶質輸送体ファミリー３９（亜鉛輸送体）、メンバー１２（ＳＬＣ３９Ａ１２）；レティキュロン１（ＲＴＮ１）；およびメタロチオネイン（ＭＴ３）からなる群から選択することができる。
具体的な実施形態においては、１つまたはそれ以上のバイオマーカーはＮＲＧＮを含む。他の実施形態においては、１つまたはそれ以上のバイオマーカーはＯＭＧを含む。さらに他の実施形態においては、１つまたはそれ以上のバイオマーカーはＭＴ３を含む。さらなる実施形態においては、１つまたはそれ以上のバイオマーカーはさらにＧＦＡＰを含む。
他の実施形態においては、１つまたはそれ以上のバイオマーカーはＮＲＧＮ、ＯＭＧおよびＭＴ３を含む。バイオマーカーはさらにＧＦＡＰを含むことができる。さらに他の実施形態においては、１つまたはそれ以上のバイオマーカーは表１および表２に列挙されたバイオマーカーをさらに含む。
他の実施形態においては、患者の脳損傷を診断するための方法は（ａ）患者からサンプルを採取すること；（ｂ）バイオマーカーパネルがＡＳＴＮ１、ＢＡＩ３、ＣＮＤＰ１、ＥＲＭＩＮ、ＧＦＡＰ、ＧＲＭ３、ＫＬＨ３２、ＭＡＧＥ２、ＮＲＧ３、ＮＲＧＮ、ＯＭＧ、ＳＬＣ３９Ａ１２、ＲＴＮ１およびＭＴ３を含むことを特徴とする、患者から採取したサンプル中のバイオマーカーパネルのレベルを測定すること；および（ｃ）事前に定義したレベルの１つとの相関が診断を提供することを特徴とする、バイオマーカーパネルのレベルを、脳損傷を有する患者と相関する同じバイオマーカーパネルの事前に定義したレベルおよび脳損傷のない患者と相関する同じバイオマーカーパネルの事前に定義したレベルと比較することという段階を含む。
さらに他の実施形態においては、患者のＳＣＩを診断するための方法は（ａ）患者からサンプルを採取すること；（ｂ）バイオマーカーパネルがＡＳＴＮ１、ＢＡＩ３、ＣＮＤＰ１、ＥＲＭＩＮ、ＧＦＡＰ、ＧＲＭ３、ＫＬＨ３２、ＭＡＧＥ２、ＮＲＧ３、ＮＲＧＮ、ＯＭＧ、ＳＬＣ３９Ａ１２、ＲＴＮ１およびＭＴ３を含むことを特徴とする、患者から採取したサンプル中のバイオマーカーパネルのレベルを測定すること；および（ｃ）事前に定義したレベルの１つとの相関が診断を提供することを特徴とする、バイオマーカーパネルのレベルを、ＳＣＩを有する患者と相関する同じバイオマーカーパネルの事前に定義したレベルおよびＳＣＩのない患者と相関する同じバイオマーカーパネルの事前に定義したレベルと比較することという段階を含む。
代替的な実施形態においては、患者の脳損傷を診断するための方法は（ａ）患者からサンプルを採取すること；（ｂ）バイオマーカーパネルがＮＲＧＮおよびＧＦＡＰを含むことを特徴とする、患者から採取したサンプル中のバイオマーカーパネルのレベルを測定すること；および（ｃ）事前に定義したレベルの１つとの相関が診断を提供することを特徴とする、バイオマーカーパネルのレベルを、脳損傷を有する患者と相関する同じバイオマーカーパネルの事前に定義したレベルおよび脳損傷のない患者と相関する同じバイオマーカーパネルの事前に定義したレベルと比較することという段階を含む。より具体的な実施形態においては、バイオマーカーパネルはＯＭＧおよびＭＴ３をさらに含む。さらなる実施形態においては、バイオマーカーパネルはＡＳＴＮ１、ＢＡＩ３、ＣＮＤＰ１、ＥＲＭＩＮ、ＧＲＭ３、ＫＬＨ３２、ＭＡＧＥ２、ＮＲＧ３、ＯＭＧ、ＳＬＣ３９Ａ１２、ＲＴＮ１およびＭＴ３をさらに含む。
さらなる実施形態においては、患者のＳＣＩを診断するための方法は（ａ）患者からサンプルを採取すること；（ｂ）バイオマーカーパネルがＮＲＧＮおよびＧＦＡＰを含むことを特徴とする、患者から採取したサンプル中のバイオマーカーパネルのレベルを測定すること；および（ｃ）事前に定義したレベルの１つとの相関が診断を提供することを特徴とする、バイオマーカーパネルのレベルを、ＳＣＩを有する患者と相関する同じバイオマーカーパネルの事前に定義したレベルおよびＳＣＩのない患者と相関する同じバイオマーカーパネルの事前に定義したレベルと比較することという段階を含む。より具体的な実施形態においては、バイオマーカーパネルはＯＭＧおよびＭＴ３をさらに含む。さらなる実施形態においては、バイオマーカーパネルはＡＳＴＮ１、ＢＡＩ３、ＣＮＤＰ１、ＥＲＭＩＮ、ＧＲＭ３、ＫＬＨ３２、ＭＡＧＥ２、ＮＲＧ３、ＯＭＧ、ＳＬＣ３９Ａ１２、ＲＴＮ１およびＭＴ３をさらに含む。
他の実施形態においては、患者の脳損傷を診断するための方法は（ａ）患者から血漿サンプルを採取すること；（ｂ）バイオマーカーパネルがＮＲＧＮおよびＧＦＡＰを含むことを特徴とする、患者から採取した血漿サンプル中のバイオマーカーパネルのレベルを測定すること；および（ｃ）事前に定義したレベルの１つとの相関が診断を提供することを特徴とする、バイオマーカーパネルのレベルを、脳損傷を有する患者と相関する同じバイオマーカーパネルの事前に定義したレベルおよび脳損傷のない患者と相関する同じバイオマーカーパネルの事前に定義したレベルと比較することという段階を含む。より具体的な実施形態においては、バイオマーカーパネルはＯＭＧおよびＭＴ３をさらに含む。代替的に、バイオマーカーパネルはＡＳＴＮ１、ＢＡＩ３、ＣＮＤＰ１、ＥＲＭＩＮ、ＧＲＭ３、ＫＬＨ３２、ＭＡＧＥ２、ＮＲＧ３、ＯＭＧ、ＳＬＣ３９Ａ１２、ＲＴＮ１およびＭＴ３をさらに含む。
さらに他の実施形態においては、患者のＳＣＩを診断するための方法は（ａ）患者から血漿サンプルを採取すること；（ｂ）バイオマーカーパネルがＮＲＧＮおよびＧＦＡＰを含むことを特徴とする、患者から採取した血漿サンプル中のバイオマーカーパネルのレベルを測定すること；および（ｃ）事前に定義したレベルの１つとの相関が診断を提供することを特徴とする、バイオマーカーパネルのレベルを、ＳＣＩを有する患者と相関する同じバイオマーカーパネルの事前に定義したレベルおよびＳＣＩのない患者と相関する同じバイオマーカーパネルの事前に定義したレベルと比較することという段階を含む。より具体的な実施形態においては、バイオマーカーパネルはＯＭＧおよびＭＴ３をさらに含む。代替的に、バイオマーカーパネルはＡＳＴＮ１、ＢＡＩ３、ＣＮＤＰ１、ＥＲＭＩＮ、ＧＲＭ３、ＫＬＨ３２、ＭＡＧＥ２、ＮＲＧ３、ＯＭＧ、ＳＬＣ３９Ａ１２、ＲＴＮ１およびＭＴ３をさらに含む。
本発明の他の実施形態においては、患者の脳損傷の状態を判定するための方法は（ａ）患者からサンプルを採取すること；（ｂ）バイオマーカーパネルがＡＳＴＮ１、ＢＡＩ３、ＣＮＤＰ１、ＥＲＭＩＮ、ＧＦＡＰ、ＧＲＭ３、ＫＬＨ３２、ＭＡＧＥ２、ＮＲＧ３、ＮＲＧＮ、ＯＭＧ、ＳＬＣ３９Ａ１２、ＲＴＮ１およびＭＴ３を含むことを特徴とする、患者から採取したサンプル中のバイオマーカーパネルのレベルを測定すること；および（ｃ）事前に定義したレベルの１つとの相関が患者の脳損傷状態を判定することを特徴とする、バイオマーカーパネルのレベルを、脳損傷を有すること、脳損傷がないこと、脳損傷が進行すること、および脳損傷が後退することからなる群から選択される１つまたはそれ以上の脳損傷状態と相関する同じバイオマーカーパネルの事前に定義したレベルと比較することという段階を含む。
本発明の具体的な実施形態においては、患者のＳＣＩの状態を判定するための方法は（ａ）患者からサンプルを採取すること；（ｂ）バイオマーカーパネルがＡＳＴＮ１、ＢＡＩ３、ＣＮＤＰ１、ＥＲＭＩＮ、ＧＦＡＰ、ＧＲＭ３、ＫＬＨ３２、ＭＡＧＥ２、ＮＲＧ３、ＮＲＧＮ、ＯＭＧ、ＳＬＣ３９Ａ１２、ＲＴＮ１およびＭＴ３を含むことを特徴とする、患者から採取したサンプル中のバイオマーカーパネルのレベルを測定すること；および（ｃ）事前に定義したレベルの１つとの相関が患者のＳＣＩの状態を判定することを特徴とする、バイオマーカーパネルのレベルを、ＳＣＩを有すること、ＳＣＩがないこと、ＳＣＩが進行すること、およびＳＣＩが後退することからなる群から選択される１つまたはそれ以上のＳＣＩ状態と相関する同じバイオマーカーパネルの事前に定義したレベルと比較することという段階を含む。
本発明の具体的な実施形態においては、測定の段階はイムノアッセイ、免疫ブロット法、免疫沈降測定法、免疫染色法、定量測定法、免疫蛍光測定法、または化学発光測定法を含む。一定の実施形態においては、サンプルは血液、血漿血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）または尿サンプルである。具体的な実施形態においては、サンプルは血液サンプルである。より具体的な実施形態においては、サンプルは血清サンプルである。
他の態様においては、本発明は患者の脳損傷状態を判定するためのキットを提供する。具体的な実施形態においては、診断キットは患者から生体サンプルを採取するための基材；およびＡＳＴＮ１、ＢＡＩ３、ＣＮＤＰ１、ＥＲＭＩＮ、ＧＦＡＰ、ＧＲＭ３、ＫＬＨ３２、ＭＡＧＥ２、ＮＲＧ３、ＮＲＧＮ、ＯＭＧ、ＳＬＣ３９Ａ１２、ＲＴＮ１およびＭＴ３からなる群から選択される１つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベルを測定する手段を含む。
血漿除去処理、ＲＰ−ＨＰＬＣ分離およびＭＳ分析の手法の概要である。 ＧＦＡＰペプチドのイオンスペクトル表を示す。ｐｅｐＰ確率は０．７５９８でありＸＣＯＲＲは４．０１６である。このペプチドはＳＣＩ患者６例中４例に認められた。 安定期鎌状赤血球症（ｎ＝２５９、ＨｂＳＳおよびＨｂＳβ０、５〜１４歳）、健康な小児（ｎ＝４７）、およびの非鎌状赤血球急性脳卒中患者（患者１２例よりサンプル２０件）、脳生検実施患者（患者３例よりサンプル６件）、または脳部分切除患者（患者１３例よりサンプル２２件）における血漿ＧＦＡＰ濃度を示す。点線は、ＳＩＴＴコホートと年齢でマッチングした４７例の健康対照の９５パーセンタイルを示す。 ＳＣＩ状態別の安定期鎌状赤血球症における血漿ＧＦＡＰ濃度を示す（ＳＣＩ陽性ｎ＝６６；ＳＣＩ陰性ｎ＝１４５）。点線は、年齢でマッチングした４７例の健康対照の９５パーセンタイルを示す。 ＨｂＳＳでありかつ急性脳卒中を呈した１１歳の患者における連続血漿ＧＦＡＰレベルを示す。臨床診断より５時間後に赤血球交換輸血を実施し、新規神経学的欠損のため４７時間後に再度実施した。患者の血漿ＧＦＡＰは、診断より１１日後には０．５０ｎｇ／ｍＬまで上昇したままであり、２６日後の最初に予定していた赤血球輸血の直前に正常値０．０７４ｎｇ／ｍＬまで戻った。点線は、年齢でマッチングした４７例の健康対照の９５パーセンタイルを示す。 血漿ＧＦＡＰを連続的に追跡したＨｂＳＳ患者の急性脳卒中の脳診断画像を示す。左：右前頭葉にくさび形低減衰を示す脳卒中の臨床診断直後の非造影頭部ＣＴ。右：進展性右前大脳動脈梗塞を示す脳卒中診断より２９時間後のＦＬＡＩＲ ＭＲＩ画像。 体外膜型酸素供給（ＥＣＭＯ）を受けている患者のＧＦＡＰレベルの中央値を示す（ｎ＝２２）。 分娩時神経学的損傷を有する新生児（ｎ＝２７）および分娩時神経学的損傷のない新生児（ｎ＝７６）の生後１日目ＧＦＡＰレベルを示す。数値は平均＋ＳＤである。 分娩時神経学的損傷の予測因子としてのＧＦＡＰと羊水吸引のＲＯＣ曲線を提示する。上：妊娠期間とマッチングした生後１日以内のＧＦＡＰ＞０．０８ｎｇ／ｍＬに関する神経学的損傷のロジスティック回帰。下：神経学的損傷の予測因子としての羊水混濁。 ＮＩＣＵ入院時点での新生児血清ＧＲＡＰ（０日目）のロジスティック回帰を示す。 先天性心疾患の修復を目的とした心肺バイパス中の血清ＧＦＡＰレベルを示すグラフである、ｎ＝２０。 先天性心疾患の修復を目的とした心肺バイパス中の連続血清ＧＦＡＰレベルを示すグラフである、ｎ＝２０。 先天性心疾患の修復を目的とした心肺バイパス中のＧＦＡＰレベルを示すグラフである。 評価した２２例の患者の人口統計学的および臨床的特性を示す表である。 個々の患者の特性および転帰を示す表である。 個々の患者の特性および転帰を示す表である。 ＥＣＭＯを受けている急性神経学的損傷を有する小児および急性神経学的損傷のない小児におけるピーク血漿ＧＦＡＰ濃度を示す（ｎ＝２２）。ｙ軸は対数目盛であることに留意されたい。 Ａは、ＥＣＭＯを受けている急性神経学的損傷を有する小児における連続血漿ＧＦＡＰ濃度を示す（ｎ＝７）。Ｘは小児集中治療室における死亡を表し；塗りつぶしのない四角は最終ＧＦＡＰ測定と時間的に最も近い（２４時間以内）急性神経学的損傷の診断時間を示し；点線は正常対照の９５パーセンタイルを示す。塗りつぶしのない四角が６個だけであることに留意されたい；１例はＧＦＡＰ測定を１回のみ実施した後４８時間後に頭部超音波検査で診断した（診断２４時間前のＧＦＡＰ測定は行わなかった）。図１７Ｂは、ＥＣＭＯを受けている急性神経学的損傷のない小児における連続血漿ＧＦＡＰ濃度を示す（ｎ＝１５）。Ｘは小児集中治療室における死亡を表し；点線は正常対照の９５パーセンタイルを示す。ＡとＢの目盛が異なることに留意されたい。 被験集団の母親および新生児特性を要約した表である。 対照と冷却療法を受けた新生児のＧＦＡＰレベル（ｎｇ／ｍＬ）の箱形図を示す。各箱形図の下の数字は分析に用いることのできたサンプル数である。＊は対照と比較したときｐ＜０．０５であることを示す。 冷却療法を実施した新生児の特性を示す表である。 脳ＭＲＩの結果別に比較した、冷却療法を受けた新生児のＧＦＡＰレベル（ｎｇ／ｍＬ）の箱形図を示す。各箱形図の下の数字は分析に用いることのできたサンプル数である。＊はＭＲＩ正常新生児と比較したときｐ＜０．０５であることを示す。 ＧＦＡＰレベルおよび神経学的転帰を示す表である。 同定された１６種類の特異なＴＳＰ−１ペプチドのうち１つのイオンスペクトル表を示す。Ｌｏｇ（ｅ）確率は１０−８．６であった。このペプチドはＳＩＴＴ患者１５例中１０例に認められた。 同定された３種類の特異なＳＥＬＬペプチドのうち１つのイオンスペクトル表を示す。Ｌｏｇ（ｅ）確率は１０−４．３であった。このペプチドはＳＩＴＴ患者１５例中１３例に認められた。 年齢でマッチングした（５〜１４歳）正常およびＳＣＤ小児におけるＴＳＰ−１濃度を提示する。 安定期鎌状赤血球症（５〜１４歳）における血漿ＴＳＰ−１濃度を示す。ＴＳＰ−１含有量はＴＳＰ−１濃度／１×１０６血小板である。＊＝ＳＣＩと非ＳＣＩ間でｐ＜０．０１３または０．０３９。 ＳＣＩおよび非ＳＣＩ ＳＣＤ小児と、年齢および人種でマッチングした対照におけるＥＬＩＳＡで測定したＳＥＬＬ濃度（平均）を示す（上）。同じデータを棒グラフ形式（中）および平均値を表示した点グラフ形式（下）で示す。 ニューログラニンタンパク質の検出に必要な最小量のニューログラニンアプタマーを示すゲルである。 ニューログラニンアプタマーを用いたプルダウン測定の結果を示す。 ＡＢＩ Ｓｃｉｅｘ Ｑｔｒａｐ ４０００トリプルクアドラポール質量分析器を用いたニューログラニンシグネチャーペプチドおよび標識標準ペプチドのシグナルを示す。 クマシー染色したＰＡＧＥゲル上のＨｉｓ−ＮＲＧＮを示す。Ｈｉｓ−ＮＲＧＮの予想分子量は８．５Ｋｄである。 マウスモノクローナル抗体３０．５．２を用いた組換えＮＲＧＮの直接ＥＬＩＳＡの標準曲線を示す。濃度範囲は０．００２〜１０ｎｇ／ｍＬである。 ニューログラニンに対する抗ヒトモノクローナル抗体を用いた組換えＮＲＧＮの直接ＥＬＩＳＡの標準曲線を示す。濃度範囲は７５ｎｇ／ｍＬである。 先天性心疾患の外科的修復を目的とした心肺バイパスを受けた患者からのニューログラニンおよびＧＦＡＰレベルを示すグラフである。
本明細書に記載された具体的な方法および成分等は変更しうるので、本発明はこれらに限定されないことが理解される。本明細書で用いる用語は具体的な実施形態を記載することのみを目的として使用され、本発明の範囲を限定することを意図していないことも理解すべきである。本明細書および付属の請求項に用いられる単数形「１つの」、「１つの」および「その」は、文脈がそうでないことを明確に指示しない限り、複数形の内容を含むことに留意しなければならない。したがって、たとえば１つの「タンパク質」への言及は１つまたはそれ以上のタンパク質への言及であり、かつ当業者に既知の同等物その他を含む。
本明細書で用いられる全ての技術用語および学術用語は、特に定義しない限り、本発明が属する技術に精通する当業者に共通して理解されるものと同じ意味を有する。具体的な方法、機器、および材料が記載されるが、本明細書に記載されたものと同様または同等の任意の方法および材料を本発明の実践または試験に用いることができる。
本明細書に引用された全ての公表文献は、全ての雑誌記事、書籍、マニュアル、公開特許明細書、および発行された特許を含めて、その全文を本明細書に参照文献として援用する。さらに、明細書、実施例および付属の請求項に使用された一定の語句の意味が提供される。定義は性質上限定的であることを意図せず、かつ本発明の一定の態様のより明確な理解を提供するのに役立つ。
（Ｉ．定義）
用語「脳損傷」は、ある事象によって引き起こされた損傷によって脳が障害される状態を意味する。本明細書で用いる「損傷」は、細胞的または分子的完全性、活性、レベル、堅牢性、状態の変質、またはある事象に起因するその他の変質である。たとえば、損傷は物理的性質、機械的性質、化学的性質、生物学的性質、機能的性質、感染的性質、または他の細胞または分子モジュレーターの性質を含む。事象は、衝突（衝撃による）などの物理的な外傷、または血管の遮断または漏出のいずれかの結果起こる脳卒中などの生物学的異常を含みうる。事象は感染因子による感染であってもよい。当業者は、用語損傷または事象によって包含される数多くの同等の事象を認識する。
より具体的には、用語「脳損傷」は、その病態生理学的基盤とは無関係に、中枢神経障害を引き起こす状態を意味する。「脳損傷」の最も頻度の高い原因には脳卒中および外傷性脳損傷（ＴＢＩ）がある。「脳卒中」は出血性および非出血性に分類される。出血性脳卒中の例は脳出血、くも膜下出血および大脳動脈奇形に続発する頭蓋内出血である一方、非出血性脳卒中の例は脳梗塞を含む。
用語「外傷性脳損傷」または「ＴＢＩ」は、物理的な外傷が脳障害を引き起こす際に発生する脳に対する外傷性の損傷を意味する。ＴＢＩは、たとえば非開放性頭部損傷または穿通性頭部損傷によって発生する。「非外傷性脳損傷」は、虚血または機械的外力の関与しない脳損傷を指す（例：特に脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脳出血、脳感染症、脳腫瘍）。
用語「脳損傷」は無症候性脳損傷、脊髄損傷および無酸素性虚血性脳損傷も意味する。用語「無症候性脳損傷」（ＳＣＩ）は脳損傷の顕在的臨床的エビデンスを伴わない脳損傷を意味する。実際には脳損傷が存在する時に臨床的エビデンスがない理由は、損傷の程度、損傷の種類、意識レベル、薬物、特に鎮静剤および麻酔剤などである可能性もある。
「脊髄損傷」は、脊髄が脊椎骨折または脱臼による圧迫／挫滅を受けて機能障害を引き起こす状態である。本明細書で用いる用語「無酸素性虚血性脳損傷」は、脳機能の損傷を引き起こす脳組織への酸素供給の遮断を意味し、かつ脳低酸素症を含む。たとえば、無酸素性虚血性脳損傷は巣状脳虚血、全脳虚血、低酸素性低酸素症（すなわち、いずれもこの種の脳低酸素症のリスクの高いダイバー、パイロット、登山家および消防士の場合のように、環境中の酸素が限られているために脳の機能が低下する）、肺の閉塞（例：窒息、絞扼、気管の圧挫による低酸素など）を含む。
本明細書で用いる用語「比較する」は、患者から採取したサンプル中の１つまたはそれ以上のバイオマーカーの割合、レベルまたは細胞内局在が、標準または対照サンプル中の対応する１つまたはそれ以上のバイオマーカーの割合、レベルまたは細胞内局在とどのように関係するか評価することを意味する。たとえば、「比較する」は、患者から採取したサンプル中の１つまたはそれ以上のバイオマーカーの割合、レベルまたは細胞内局在が、標準または対照サンプル中の対応する１つまたはそれ以上のバイオマーカーの割合、レベルまたは細胞内局在と同じであるか、またはこれより多いかまたは少ないか、または異なるか評価することを意味しうる。より具体的には、当該用語は、患者から採取したサンプル中の１つまたはそれ以上のバイオマーカーの割合、レベルまたは細胞内局在が、たとえば無症候性脳損傷（ＳＣＩ）を有する患者、ＳＣＩのない患者と対応する事前に定義したバイオマーカーレベルの割合、レベルまたは細胞内局在と同じであるか、またはこれより多いかまたは少ないか、これと異なるか、またはこれと異なる対応をするか（否か）、またはＳＣＩに対する治療に反応しているか、ＳＣＩに対する治療に反応していないか、特定のＳＣＩ治療に反応する可能性がある／ないか、または他の疾患または状態を有している／いないか評価することを意味する。具体的な実施形態においては、用語「比較する」は、患者から採取したサンプル中の本発明の１つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベルが、対照サンプル中の同じバイオマーカーのレベル（例：未感染者（unaffected）、標準ＳＣＩレベルなどと相関する事前に定義したレベル）と同じであるか、これより多いかまたは少ないか、他と異なるかこれと異なる対応をするか（否か）評価することを意味する。
本明細書で用いる、たとえば患者から採取したサンプル中のモジュレートされた割合、レベル、または細胞内局在などのパラメーターについての用語「示す」または「相関する」（または文脈によっては「示すこと」または「相関すること」または「指示」または「相関」）は、患者がＳＣＩを有することを示しうる。具体的な実施形態においては、パラメーターは本発明の１つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベルを含むことがある。具体的な１つまたはそれ以上のバイオマーカー群またはその量のパターンは、患者がＳＣＩを有することを示しうる（すなわちＳＣＩを有する患者と相関する）。他の実施形態においては、具体的な１つまたはそれ以上のバイオマーカー群またはその量のパターンは、非罹患患者と相関しうる（すなわち患者がＳＣＩでないことを示す）。他の実施形態においては、本発明にしたがって用いる「示すこと」または「相関すること」は、診断の評価、ＳＣＩまたはＳＣＩの進行の予測、臨床治療の効果の評価、特定の投与法または医薬品に応答しうる患者の特定、治療の経過のモニタリング、およびスクリーニング測定の状況においては抗ＳＣＩ治療の特定を目的とした標準、対照または比較対象数値とのバイオマーカーレベル間の関係を定量する任意の線形的または非線形的方法によることもある。
用語「患者」、「個人」または「被験者」は、本明細書では互換的に用いられ、かつ哺乳類、具体的にはヒトを意味する。患者は軽度の疾患を有することも、中等度、または重度の疾患を有することもある。患者は治療未経験であることも、あらゆる形態の治療に反応することも、または難治性であることもある。患者は治療を必要とする個人であることも、または具体的な症状または家族歴による診断を必要とする個人であることもある。一部の症例においては、当該用語は、マウス、ラットおよびハムスターを含むげっ歯類および霊長類を含むがこれに限定されない実験動物、獣医学的用途、および疾患についての動物モデルの開発における治療を意味することもある。
用語「測定すること」および「判定すること」は全体を通して互換的に用いられ、かつ患者サンプルを採取することおよび／またはサンプル中のバイオマーカーのレベルを検出することを含む方法を意味する。１つの実施形態においては、当該用語は患者サンプルを採取することおよびサンプル中の１つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベルを検出することを意味する。１つの実施形態においては、用語「測定すること」および「判定すること」は患者サンプル中の１つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベルを検出することを意味する。測定することは技術上既知の方法および本明細書においてさらに記載する方法によって遂行することができる。用語「測定すること」は、全体を通じて「検出すること」とも互換的に用いられる。
用語「サンプル」、「患者サンプル」、「生物学的サンプル」などは、患者、個人または被験者から採取された多様なサンプルの種類を包含し、かつ診断またはモニタリング測定法において用いることができる。患者サンプルは健康被験者から採取されることもあれば、疾患患者またはＳＣＩ関連症状を有する患者から採取されることもある。さらに、患者から採取されたサンプルは分割することが可能であり、また一部のみを診断に用いてもよい。さらに、サンプルまたはその一部は、後で分析するためにサンプルを維持する条件下で保存することができる。当該の定義は、具体的には、血液および他の生物学的由来の液状サンプル（末梢血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、唾液、糞便および滑液を含むがこれに限定されない）、生検検体または組織培養などの固形組織サンプル、またはこれに由来する細胞およびその子孫を包含する。具体的な実施形態においては、サンプルは血液サンプルを含む。他の実施形態においては、血清サンプルを使用する。当該の定義は、その取得後に、遠心分離、濾過、沈殿、透析、クロマトグラフィー、試薬による処理、洗浄または一定の細胞集団の濃縮といった任意の方法で操作されたサンプルを含む。当該用語はさらに臨床サンプルを包含し、かつ培養細胞、細胞上清、組織サンプル、器官なども含む。サンプルは、臨床または病理生検より調製した、病理分析または免疫組織化学分析による試験のために調製したブロックなどの新鮮凍結および／またはホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロックも含みうる。
本発明の多様な方法論は、数値、レベル、性質、特徴、特性等を、本明細書において「適切な対照」または「対照サンプル」と互換的に呼ばれる「適当な対照」と比較することを包含する段階を含む。「適当な対照」、「適切な対照」または「対照サンプル」は、比較の目的にとって有用な当業者に周知の任意の対照または標準である。１つの実施形態においては、「適当な対照」または「適切な対照」は、たとえば、正常な形質などを示す対照または正常細胞、器官または患者などの、細胞、器官、または患者において判定される数値、レベル、性質、特徴、特性などである。たとえば、本発明のバイオマーカーは非罹患者（ＵＩ）または正常対象者（ＮＣ）（本明細書では両用語を互換的に用いる）から採取したサンプル中のレベルを測定しうる。他の実施形態においては、「適当な対照」または「適切な対照」は、患者に対して治療法（例：ＳＣＩ治療）を実施する前に判定される数値、レベル、性質、特徴、特性などである。さらに他の実施形態においては、転写速度、ｍＲＮＡレベル、翻訳速度、タンパク質レベル、生物学的活性、細胞の特徴または特性、遺伝型、表現型などは、治療法を細胞、器官または患者に施行する前、施行中、または施行後に判定することができる。さらなる実施形態においては、「適当な対照」または「適切な対照」は、事前に定義される数値、レベル、性質、特徴、特性などである。「適当な対照」は、患者サンプルをこれと比較することのできるＳＣＩと相関する本発明の１つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベルのプロフィールまたはパターンとすることができる。患者サンプルは陰性対照、すなわちＳＣＩがないことと相関するプロフィールと比較することもできる。
（ＩＩ．脳損傷バイオマーカーの検出）
（Ａ．質量分析法による検出）
１つの実施形態においては、本発明のバイオマーカーは、気相イオンを検出する質量分析器を用いる方法である質量分析法によって検出しうる。質量分析法の例は、飛行時間型、磁気セクター、四極子フィルター、イオントラップ、イオンサイクロトロン共鳴、静電セクター分析器、前記のハイブリッドまたは複合等である。具体的な実施形態においては、質量分析法はマトリクス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を含む。他の実施形態においては、方法はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦタンデム質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳ）を含む。さらに他の実施形態においては、質量分析法は当業者が考慮することのできる他の適切な方法と組み合わせることができる。たとえば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは本明細書に記載するようにトリプシン消化およびタンデム質量分析法と共に利用することができる。他の実施形態においては、質量分析法は多重反応モニタリング（ＭＲＭ）または定量的ＭＲＭである。
代替的実施形態においては、質量分析法はたとえば米国特許第６，２２５，０４７号および第５，７１９，０６０号に記載された表面増強レーザー脱離イオン化すなわち「ＳＥＬＤＩ」を含む。簡単に説明すると、ＳＥＬＤＩは、分析物（本明細書においては１つまたはそれ以上のバイオマーカー）がＳＥＬＤＩ質量分析計プローブの表面に捕捉される脱離／イオン化気相イオンスペクトル分析（例：質量分析）の方法を意味する。親和性捕捉質量分析法（表面増強親和性捕捉（ＳＥＡＣ）とも呼ばれる）、およびプローブの表面に化学結合したエネルギー吸収分子を含むプローブ（ＳＥＮＤプローブ）の使用を包含する表面増強ニート脱離（ＳＥＮＤ）を含むがこれに限定されない、利用しうるＳＥＬＤＩのいくつかのバージョンがある。他のＳＥＬＤＩ法は表面増強感光性付着および放出（ＳＥＰＡＲ）と呼ばれ、これは分析物と共有結合し、その後たとえばレーザー光などに露光した後にその部分にある感光性結合が回裂して分析物を放出することのできる表面と結合する部分を有するプローブの使用を包含する（米国特許第５，７１９，０６０号を参照）。ＳＥＰＡＲおよび他の形態のＳＥＬＤＩは、本発明に準拠して、バイオマーカーおよびバイオマーカーパネルを検出するよう容易に適合化することができる。
他の質量分析法においては、バイオマーカーはバイオマーカーと結合するクロマトグラフィー的性質を有するクロマトグラフィー樹脂上にまず捕捉することができる。たとえば、ＣＭ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｆ樹脂などの陽イオン交換樹脂上にバイオマーカーを捕捉し、樹脂を洗浄し、バイオマーカーを溶離し、ＭＡＬＤＩによって検出することも可能である。代替的に、この方法に先立ち、陽イオン交換樹脂への適用の前に陰イオン交換樹脂上でサンプルを分画化することも可能である。他の代替法においては、陰イオン交換樹脂上で分画化してＭＡＬＤＩで直接検出することも可能である。さらに他の方法においては、バイオマーカーを、バイオマーカーと結合する抗体を含む免疫クロマトグラフィー樹脂上で捕捉し、樹脂を洗浄して未結合の材料を除去し、樹脂よりバイオマーカーを溶離し、さらに溶離したバイオマーカーをＭＡＬＤＩまたはＳＥＬＤＩで検出することも可能である。
（Ｂ．イムノアッセイによる検出）
他の実施形態においては、本発明のバイオマーカーはイムノアッセイによって検出および／または測定することができる。イムノアッセイは、バイオマーカーを捕捉するために抗体などの生体特異的捕捉試薬を必要とする。多くの抗体が市販されている。抗体は、たとえば動物をバイオマーカーによって免疫することなどの、技術上周知の方法によっても生成することができる。バイオマーカーは、その結合特性に基づいてサンプルより分離することができる。代替的に、ポリペプチドバイオマーカーのアミノ酸配列が既知の場合は、ポリペプチドを合成し、さらに技術上周知の方法によって抗体を生成するために用いることができる。
本発明は、たとえばＥＬＩＳＡを含むサンドイッチイムノアッセイまたは蛍光イムノアッセイ、イムノブロット、ウェスタンブロット（ＷＢ）、さらには他の酵素免疫測定法などを含む、従来のイムノアッセイを考慮している。比濁法は、抗体が溶液となっている液相において実施する測定法である。抗原の抗体との結合によって吸光度が変化し、これを測定する。ＳＥＬＤＩイムノアッセイでは、バイオマーカーの生体特異的捕捉試薬を、事前に活性化させたプロテインチップアレイなどのＭＳプローブの表面に結合させる。その後、この試薬によってバイオマーカーをバイオチップ上に特異的に捕捉し、さらに捕捉したバイオマーカーを質量分析法で検出する。
抗体はその多彩な特性より有用であるものの、上記のイムノアッセイの抗体の代わりに任意に用いられる本発明のバイオマーカーと特異的に結合する他の任意の適当な試薬（例：ペプチド、アプタマー、または低分子量有機分子など）が任意に用いられる。たとえば、全てのニューログラニンおよび／または１つまたはそれ以上のその分解生成物と特異的に結合するアプタマーを用いることもあるかもしれない。アプタマーは特定のリガンドと結合する核酸ベースの分子である。具体的な結合特異性を有するアプタマーを作成する方法は、米国特許第５，４７５，０９６号；第５，６７０，６３７号；第５，６９６，２４９号；第５，２７０，１６３号；第５，７０７，７９６号；第５，５９５，８７７号；第５，６６０，９８５号；第５，５６７，５８８号；第５，６８３，８６７号；第５，６３７，４５９号；および第６，０１１，０２０号に詳述されたように既知である。
（Ｃ．電気化学発光分析による検出）
いくつかの実施形態においては、本発明のバイオマーカーはメソスケールディスカバリー（メリーランド州ゲッサーズバーグ）によって開発された電気化学発光測定法によって検出しうる。電気化学発光検出は、電気化学的に刺激されたときに発光する標識を用いる。刺激メカニズム（電気）はシグナル（光）からデカプリングするため、バックグラウンドシグナルは最小である。標識は安定で、非放射性でありかつ簡便な結合化学特性の選択を提供する。約６２０ｎｍの光を発し、カラークエンチングの問題を解消する。米国特許第７，４９７，９９７号；第７，４９１，５４０号；第７，２８８，４１０号；第７，０３６，９４６号；第７，０５２，８６１号；第６，９７７，７２２号；第６，９１９，１７３号；第６，６７３，５３３号；第６，４１３，７８３号；第６，３６２，０１１号；第６，３１９，６７０号；第６，２０７，３６９号；第６，１４０，０４５号；第６，０９０，５４５号；および第５，８６６，４３４号を参照されたい。米国特許出願公開第２００９／０１７０１２１号；第２００９／００６３３９号；第２００９／００６５３５７号；第２００６／０１７２３４０号；第２００６／００１９３１９号；第２００５／０１４２０３３号；第２００５／００５２６４６号；第２００４／００２２６７７号；第２００３／０１２４５７２号；第２００３／０１１３７１３号；第２００３／０００３４６０号；第２００２／０１３７２３４号；第２００２／００８６３３５号；および第２００１／００２１５３４号を参照されたい。
（Ｄ．バイオマーカーを検出するその他の方法）
本発明のバイオマーカーは、他の適当な方法で検出することができる。この目的のために用いることのできる検出パラダイムは、光学的方法、電気化学的方法（ボルタメトリー法および電流滴定法）、原子間力顕微鏡、およびたとえば多極共鳴分光法などの高周波法を含む。光学的方法の例示は、共焦点および非共焦点顕微鏡に加えて、蛍光、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、および複屈折または屈折率（例：表面プラスモン共鳴法、偏光解析法、共鳴ミラー法、回折格子結合器導波管法または干渉法）である。
さらに、サンプルはバイオチップの手段によって分析しうる。バイオチップは一般に固形基材を含みかつ一般に平面状の表面を有し、その表面に捕捉試薬（吸着剤またはアフィニティ試薬とも呼ばれる）が結合する。バイオチップの表面は、それぞれがそこに結合する捕捉試薬を有するアドレスを指定できる位置を多数含むことが多い。プロテインバイオチップはポリペプチドの捕捉に適合化されたバイオチップである。当技術分野では多くのプロテインバイオチップが記載されている。これらは、たとえばサイファージェンバイオシステムズ社（カリフォルニア州フリーモント）、インビトロジェン社（カリフォルニア州カールズバッド）、アフィメトリクス社（カリフォルニア州フレモング）、Ｚｙｏｍｙｘ（カリフォルニア州ヘイワード）、Ｒ＆Ｄシステムズ社（ミネソタ州ミネアポリス）、Ｂｉａｃｏｒｅ（スウェーデン、ウプサラ）およびＰｒｏｃｏｇｎｉａ（英国、バークシャー）によって製造されるプロテインバイオチップを含む。このようなプロテインバイオチップの例は、以下の特許または公開特許明細書に記載されている：米国特許第６，５３７，７４９号、米国特許第６，３２９，２０９号、米国特許第６，２２５，０４７号、米国特許第５，２４２，８２８号、ＰＣＴ国際公開第００／５６９３４号、およびＰＣＴ国際公開第０３／０４８７６８号。
（ＩＩＩ．患者の脳損傷状態の判定）
本発明は、脳損傷を診断するためのバイオマーカーの使用に関する。より具体的には、本発明のバイオマーカーは、たとえば個人、被験者または患者の脳損傷を診断するためなどに、脳損傷状態を判定、認定、および／または評価するための診断検査において使用することができる。具体的な実施形態においては、脳損傷状態は、たとえば個人、被験者または患者のＳＣＩを診断するためなどに、患者の無症候性脳損傷状態すなわちＳＣＩ状態を判定することを含むことができる。より具体的には、脳損傷（例：ＳＣＩまたは顕性脳損傷）を診断する際に検出しようとするバイオマーカーはＡＳＴＮ１、ＢＡＩ３、ＣＮＤＰ１、ＥＲＭＩＮ、ＧＦＡＰ、ＧＲＭ３、ＫＬＨ３２、ＭＡＧＥ２、ＮＲＧ３、ＮＲＧＮ、ＯＭＧ、ＳＬＣ３９Ａ１２、ＲＴＮ１およびＭＴ３を含むが、これに限定されない。ＳＢＤＰ１５０、ＳＢＤＰ１５０ｉ、ＮＳＥ、ＳｌＯＯβ、ＭＡＰ２、ＭＡＰＩ、ＭＡＰ３、ＭＡＰ４、ＭＡＰ５、ＭＢＰ、Ｔａｕ、ＮＦ−Ｌ、ＮＦ−Ｍ、ＮＦ−Ｈ、ＵＣＨ−Ｌｌ、ＮＳＥ、ＮｅｕＮ、ＣＮＰａｓｅ、α−インターネキシン、ＣＢ−Ｉ、ＣＢ−２；ＩＣＡＭ、ＶＡＭ、ＮＣＡＭ、ＮＬ−ＣＡＭ、ＡＬ−ＣＡＭ、Ｃ−ＣＡＭ；シナプトタグニン、シナプトフィジン、シナプシン、ＳＮＡＰ；ＣＲＭＰ−２、ＣＲＭＰ−Ｉ、ＣＲＭＰ−３、ＣＲＭＰ−４ ｉＮＯＳ、およびβｌｌｌ−チューブリンを含むがこれに限定されない関連技術において既知である他のバイオマーカーを、本明細書に記載するバイオマーカーと組み合わせて用いてもよい。
（Ａ．バイオマーカーパネル）
本発明のバイオマーカーは、患者の脳損傷状態を評価、判定、および／または認定（本明細書では互換的に使用される）するための診断検査において用いることができる。語句「脳損傷状態」は、脳損傷を有していないことを含めた状態の任意の判別可能な発現を含む。たとえば、脳損傷状態は、患者の脳損傷の有無、脳損傷を発症するリスク、脳損傷の病期または重症度、脳損傷の進行（例：経時的な脳損傷の進行）および脳損傷の治療の有効性またはこれに対する反応（例：治療後の脳損傷の臨床的経過観察および監視など）を制限なく含む。この状態に基づき、追加的な診断検査または治療手技または治療法を含むさらなる手順を指示しうる。
状態を正しく予測する診断検査の検出力は、一般に測定法の敏感度、測定法の特異度または受信者動作特性（「ＲＯＣ」）曲線下面積として測定される。敏感度は、検査が陽性であることで予測された真陽性の百分率である一方、特異性は検査が陰性であることで予測された真陰性の百分率である。ＲＯＣ曲線は、検査の敏感度を１−特異度の関数として表す。ＲＯＣ曲線下面積が大きければ、検査的中度がより強力になる。検査の有用性のその他の有用な指標は陽性的中度および陰性的中度である。陽性的中度は、検査が陽性で実際に陽性である者の百分率である。陰性的中度は、検査が陰性で実際に陰性である者の百分率である。
具体的な実施形態においては、本発明のバイオマーカーパネルは種々のＳＣＩ状態に少なくともｐ＜０．０５、ｐ＜１０−２、ｐ＜１０−３、ｐ＜１０−４またはｐ＜１０−５の統計的差を示しうる。これらのバイオマーカーを用いる診断検査は、少なくとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．８または少なくとも０．９のＲＯＣを示しうる。
バイオマーカーは、ＵＩ（ＮＣまたは非脳損傷）と脳損傷で存在の仕方が異なり、したがって、脳損傷状態の判定を支援する際に有用である。一定の実施形態においては、本明細書に記載の方法を用いて患者サンプル中のバイオマーカーを測定し、かつたとえば事前に定義したバイオマーカーレベルなどと比較し、かつ脳損傷状態と相関させる。具体的な実施形態においては、測定値は、次に、脳損傷陽性状態を脳損傷陰性状態と識別する関連する診断的量、カットオフ値、または多変量モデルスコアと比較されることがある。診断的量は、その値を上回るかまたは下回るとき患者が特定の脳損傷状態を有すると分類されるバイオマーカーの測定量を表す。たとえば、バイオマーカーが脳損傷時に正常値と比較してアップレギュレートされるとき、診断的カットオフ値を上回る測定量は脳損傷の診断を提供する。代替的に、バイオマーカーが脳損傷時にダウンレギュレートされるとき、診断的カットオフ値にあるかまたはこれ以下の測定量は非脳損傷の診断を提供する。技術上十分に理解されているように、測定法で用いられる特定の診断カットオフ値を調節することにより、診断医の選好に応じて診断測定法の敏感度または特異度を高めることができる。具体的な実施形態においては、具体的な診断カットオフ値は、たとえば種々の脳損傷状態を有する患者から採取した統計的に有意な数のサンプルにおいてバイオマーカーの量を測定し、さらに所望のレベルの敏感度および特異度に適合させるためにカットオフ値を選択することなどによって決定することができる。
実際に、当業者が認識するように、検討中の診断的な問題を改善するために２つまたはそれ以上のバイオマーカーの測定値を用いる多くの方法がある。きわめて単純であるもののしばしば有効な手法においては、サンプルが測定したマーカーのうち少なくとも１つについて陽性である場合、結果は陽性であると推測される。
さらに、一定の実施形態においては、バイオマーカーパネルのマーカーについて測定した数値を数学的に複合し、さらに複合した数値を背景にある診断的問題と相関させる。バイオマーカーの数値は任意の適切な最新の数学的方法によって複合しうる。マーカーの複合値を疾患状態と相関させる周知の数学的方法は、判別分析（ＤＡ）（例：線形、二次、正規化ＤＡ）、判別関数分析（ＤＦＡ）、カーネル法（例：ＳＶＭ）、多次元尺度構成法（ＭＤＳ）、ノンパラメトリック法（例：ｋ近傍分類法）、ＰＬＳ（部分最小二乗法）、決定木法（例：論理回帰、ＣＡＲＴ、ランダムフォレスト法、ブースティング／バッギング法）、一般化線型モデル（例：ロジスティック回帰）、主成分法（例：ＳＩＭＣＡ）、一般化加法モデル、ファジー論理法、ニューラルネットワークおよび遺伝的アルゴリズム法のような方法を用いる。当業者は、本発明のバイオマーカー複合値を評価する適切な方法を問題なく選択するであろう。１つの実施形態においては、たとえば脳損傷を診断するためなどに本発明のバイオマーカー複合値を相関させる際に用いられる方法は、ＤＡ（例：線形、二次、正規化判別分析）、ＤＦＡ、カーネル法（例：ＳＶＭ）、ＭＤＳ、ノンパラメトリック法（例：ｋ近傍分類法）、ＰＬＳ（部分最小二乗法）、決定木法（例：論理回帰、ＣＡＲＴ、ランダムフォレスト法、ブースティング法）、または一般化線型モデル（例：ロジスティック回帰）、および主成分法から選択される。これらの統計学的方法に関する詳細は以下の参照文献で確認される：Ruczinski他、12 J. OF COMPUTATIONAL AND GRAPHICAL STATISTICS 475-511（2003）；Friedman, J. H., 84 J. OF THE AMERICAN STATISTICAL ASSOCIATION 165-75（1989）；Hastie, Trevor, Tibshirani, Robert, Friedman, Jerome『統計的学習の要素―Springer統計学シリーズ』（2001）；Breiman, L., Friedman, J. H., Olshen, R. A., Stone, C. J. 『分類および回帰木』California: Wadsworth（1984）；Breiman, L., 45 MACHINE LEARNING 5-32（2001）； Pepe, M. S.,『分類および評価を目的とした医学的検査の統計学的評価、オックスフォード統計科学シリーズ28』（2003）；およびDuda, R. O., Hart, P. E., Stork, D. G.,『パターン分類』（第２版）Wiley Interscience（2001）。
（Ｂ．脳損傷発症リスクの判定）
具体的な実施形態においては、本発明は患者が脳損傷を発症するリスクを判定するための方法を提供する。バイオマーカーの百分率、量またはパターンは、たとえば高、中、低などの多様なリスク状態の特徴である。脳損傷を発症するリスクは、関連バイオマーカーを測定し、その後それらを分類アルゴリズムに投入するか、または参照値、すなわち具体的なリスクレベルと関連する事前に定義したバイオマーカーのレベルまたはパターンと比較することによって判定する。
（Ｃ．脳損傷の重症度の判定）
他の実施形態においては、本発明は患者の脳損傷の重症度を判定するための方法を提供する。脳損傷の各等級または病期は、特徴的なバイオマーカーのレベルまたはバイオマーカー群の相対的レベル（パターン）を有する可能性がある。脳損傷の重症度は、関連バイオマーカーを測定し、その後それらを分類アルゴリズムに投入するか、または参照値、すなわち具体的な病期と関連する事前に定義したバイオマーカーのレベルまたはパターンと比較することによって判定する。
（Ｄ．脳損傷の予後の判定）
１つの実施形態においては、本発明は患者の脳損傷の経過を判定するための方法を提供する。脳損傷の経過は、脳損傷の進行（悪化）および脳損傷の後退（改善）を含む、脳損傷状態の経時的変化を意味する。バイオマーカーの量または相対的な量（例：パターン）は経時的に変化する。たとえば、バイオマーカー「Ｘ」が脳損傷に伴って増加することがある一方で、バイオマーカー「Ｙ」が脳損傷に伴って減少することもある。したがって、脳損傷または非脳損傷に向かうこれらのバイオマーカーの経時的な増加または減少の傾向は、状態の経過を示す。このため、本方法は、患者の１つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベルを、たとえば１回目および２回目などの少なくとも２つの測定時に測定し、かつ変化があれば比較することを包含する。脳損傷の経過はこれらの比較に基づいて判定する。
（Ｅ．患者の管理）
脳損傷状態を認定する方法の一定の実施形態においては、方法は状態に基づく患者の治療を管理することをさらに含む。そのような管理は、脳損傷状態を判定することに続く医師または臨床家の措置を含む。たとえば、医師が脳損傷の診断を下す場合、その後に一定のモニタリング法を実施するであろう。本発明の方法を用いた脳損傷の経過の評価は、その後一定の脳損傷治療法を必要とすることもある。代替的に、非脳損傷の診断の後で、患者が罹患していることもありうる具体的な疾患を判定するためにさらなる検査を行うこともありうる。また、診断検査の結果が脳損傷に関する結論に至らない場合はさらなる検査を要請することもある。
（Ｆ．医薬品の治療効果の判定）
他の実施形態においては、本発明は医薬品の治療効果を判定するための方法を提供する。これらの方法は医薬品の臨床試験を実施する際、および医薬品を使用している患者の進行をモニタリングする際に有用である。治療法または臨床試験は、医薬品を特定の投与法で投与することを包含する。投与法は、医薬品の１回投与または医薬品の経時的複数回投与を包含しうる。医師または臨床研究者は、患者または被験者に対する医薬品の効果を投与の過程に渡ってモニタリングする。医薬品が病状に対して薬理学的影響を有する場合、本発明の１つまたはそれ以上のバイオマーカーの量または相対量（例：パターンまたはプロフィール）は、非脳損傷プロフィールに変化しうる。したがって、投与クール中、患者における１つまたはそれ以上のバイオマーカーの経過を追跡することができる。これにより、本方法は薬物療法を受ける患者の１つまたはそれ以上のバイオマーカーを測定すること、およびバイオマーカーレベルを（例：種々の脳損傷状態に対応する事前に定義したバイオマーカーレベルとの比較により）患者の脳損傷状態と相関させることを包含する。本方法の１つの実施形態は、たとえば１回目および２回目など、薬物療法クール中の少なくとも２つの測定時に１つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベルを判定し、かつバイオマーカーのレベルに変化があれば比較することを包含する。たとえば、１つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベルは医薬品の投与の前後、または医薬品の投与中の異なる２つの測定時に測定することができる。治療法の効果はこれらの比較に基づいて判定する。治療が有効である場合は１つまたはそれ以上のバイオマーカーは正常に向かう傾向である一方、治療が無効である場合は１つまたはそれ以上のバイオマーカーは脳損傷を示す傾向であろう。
（Ｇ．脳損傷状態を認定するための分類アルゴリズムの生成）
一部の実施形態においては、「既知のサンプル」などのサンプルを用いて生成したデータはその後分類モデルを「トレーニング」するために用いることができる。「既知のサンプル」とは事前に分類されたサンプルである。分類モデルを形成するために用いるデータは「トレーニングデータセット」と呼ぶことができる。分類モデルを形成するために用いる「トレーニングデータセット」は生データを含むこともあれば、または事前に処理したデータを含むこともある。分類モデルは、一旦トレーニングすれば未知のサンプルを用いて生成したデータにおけるパターンを認識することができる。分類モデルはその後未知のサンプルを分類に分類するために用いることができる。これは、たとえば特定の生物学的サンプルが一定の生物学的状態と関連するか否か予測する際など（例：疾患対非疾患）に有用となることがある。
分類モデルは、データ中に存在する客観的パラメーターに基づいてデータの本体を分類に区分することを試みる任意の適当な統計学的分類または学習法を用いて形成することができる。分類法は教師付きであることも、または教師なしであることもある。教師付き分類および教師なし分類のプロセスの例は、その教示を参照文献として本明細書に援用するJain、“Statistical Pattern Recognition: A Review”, IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence, Vol. 22, No. 1, January 2000に記載されている。
教師付き分類においては、既知のカテゴリーの例を含むトレーニングデータが学習メカニズムに提示され、この学習メカニズムが各既知の分類を定義する１つまたはそれ以上の関係群を学習する。その後新規データを学習メカニズムに適用し、学習メカニズムは次に学習した関係を用いて新規データを分類する。教師付き分類プロセスの例は、線形回帰プロセス（例：多重線形回帰（ＭＬＲ）、部分最小二乗（ＰＳＬ）回帰および主成分回帰（ＰＣＲ））、二分決定木（例：ＣＡＲＴなどの帰納的分配プロセス）、バックプロパゲーションネットワークなどのアーティフィシャルニューラルネットワーク、判別分析（例：ベイズ分類またはフィッシャー分析）、ロジスティック分類、およびサポートベクター分類（サポートベクターマシン）を含む。
他の教師付き分類法は帰納的分配プロセスである。機能的分配プロセスは、未知のサンプルから派生したデータを分類するために帰納的分配木を用いる。帰納的分配プロセスについてのさらなる詳細はＰａｕｌｓｅ他の米国特許出願公開第２００２ ０１３８２０８（Ａ１）号「質量スペクトルを分析するための方法」に提供される。
他の実施形態においては、作製される分類モデルは教師なし学習法によって形成することができる。教師なし分類では、トレーニングデータセットが派生したスペクトルを事前に分類することなく、トレーニングデータセット中の類似性に基づいて分類の学習を試みる。教師なし学習モデルはクラスター分析を含む。クラスター分析は、そのメンバーが理想的には互いに非常に類似し、かつ他のクラスターのメンバーとは非常に異なっていなければならない「クラスター」または群へのデータの分割を試みる。次に、データ項目間の距離を測定し、かつ互いにより近いデータ項目と共にクラスター間の距離を測定する何らかの距離測定法を用いて類似性を測定する。クラスター化法はＭａｃＱｕｅｅｎのＫ−平均アルゴリズムおよびＫｏｈｏｎｅｎの自己組織化マップアルゴリズムを含む。
生物学的情報を分類する際の使用を目的として仮定された学習アルゴリズムは、たとえばＰＣＴ国際出願公開第０１／３１５８０号（Ｂａｒｎｈｉｌｌ他、「生物学的システムにおけるパターンを特定するための方法および装置およびその使用方法」）、米国特許出願公開第２００２／０１９３９５０号（Ｇａｖｉｎ他、「方法または質量スペクトルを分析すること」）、米国特許出願公開第２００３／０００４４０２号（Ｈｉｔｔ他、「生物学的データからの隠れたパターンに基づく生物学的状態間を識別するためのプロセス」）、および米国特許出願公開第２００３／００５５６１５号（ＺｈａｎｇおよびＺｈａｎｇ、「生物学的発現データを処理するためのシステムおよび方法」）などに記載されている。
分類モデルは、任意の適当なデジタルコンピュータ上で形成し、かつ使用することができる。適当なデジタルコンピュータは、Ｕｎｉｘ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）またはＬｉｎｕｘ（登録商標）ベースのオペレーティングシステムなどの任意の標準的なまたは専用のオペレーティングシステムを用いたマイクロ、ミニまたは大型コンピュータを含む。質量分析計を利用する実施形態においては、使用するデジタルコンピュータは、目的のスペクトルを作製するために用いる質量分析計と物理的に分離していることもあれば、または質量分析計と接続していることもある。
本発明の実施形態によるトレーニングデータセットおよび分類モデルは、デジタルコンピュータによって実行または使用されるコンピュータコードによって具現することができる。コンピュータコードは、光学または磁気ディスク、スティック、テープなどの任意の適当なコンピュータ読み取り可能メディアに保存することができ、かつＲ、Ｃ、Ｃ＋＋、ｖｉｓｕａｌ ｂａｓｉｃなどを含む任意の適当なコンピュータプログラミング言語で書くことができる。
上記の学習アルゴリズムは、すでに発見されたバイオマーカーのための分類アルゴリズムを開発するため、および新規バイオマーカーバイオマーカーを確認するためのいずれにも有用である。一方、分類アルゴリズムの方は、単独でまたは組み合わせて用いられるバイオマーカーのための診断値（例：カットオフポイント）を提供することにより、診断検査のための基盤を形成する。
（Ｈ．脳損傷バイオマーカーの検出のためのキット）
他の態様においては、本発明は脳損傷状態を認定するためのキットであって、当該キットが本明細書に記載するバイオマーカーを検出するために用いられるキットを提供する。具体的な実施形態においては、キットはＡＳＴＮ１、ＢＡＩ３、ＣＮＤＰ１、ＥＲＭＩＮ、ＧＦＡＰ、ＧＲＭ３、ＫＬＨ３２、ＭＡＧＥ２、ＮＲＧ３、ＮＲＧＮ、ＯＭＧ、ＳＬＣ３９Ａ１２、ＲＴＮ１、およびＭＴ３を含むがこれに限定されない本発明のバイオマーカーに対する抗体を含むＥＬＩＳＡキットとして提供される。
ＥＬＩＳＡキットは、その上にバイオマーカー捕捉試薬が結合しているチップ、マイクロプレート（例：９６ウェルプレート）、ビーズ、または樹脂などの固形支持体を含みうる。キットは、抗体などのバイオマーカーを検出するための手段、およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ウサギヤギＩｇＧ抗体などの二次抗体−シグナル複合体およびＨＲＰの基質としてテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をさらに含みうる。
脳損傷状態を認定するためのキットは、膜が、ＮＣ膜およびＰＶＤＦ膜を含む、その上に抗体が固定されている膜、およびたとえば金粒子結合抗体などのような検出するための手段を含む免疫クロマトグラフィストリップとして提供されうる。キットは、サンプルアプリケーションパッド、グラスファイバーフィルター上に一時的に固定された金粒子結合抗体、その上に抗体バンドおよび二次抗体バンドが固定されたニトロセルロース膜および吸着剤パッドが、血清の連続的毛管流を維持するよう、その上に連続的な様式で配置されたプラスチックプレートを含みうる。
一定の実施形態においては、患者は、患者から採取した血液または血清をキットに加えること、および抗体とコンジュゲートした関連バイオマーカーを検出すること、具体的には（ｉ）患者から血液または血清を採取すること；（ｉｉ）患者の血液から血清を分離すること；（ｉｉｉ）患者由来の血清を診断キットに適用すること；および、（ｉｖ）抗体とコンジュゲートしたバイオマーカーを検出することという段階を含む方法によって診断することができる。この方法においては、抗体は患者の血液と接触させられる。サンプル中にバイオマーカーがあれば、抗体はサンプル、またはその一部分と結合するであろう。他のキットまたは診断の実施形態においては、患者より血液または血清を採取する必要はない（すなわち、それはすでに採取されている）。さらに他の実施形態においては、サンプルは組織サンプルまたは臨床サンプルを含んでもよい。
キットは、捕捉試薬と洗浄液の組み合わせにより、固形支持体上にバイオマーカーを捕捉し、後でたとえば抗体または質量分析計などにより検出することが可能となる、洗浄液または洗浄液を作製するための指示を含むことができる。さらなる実施形態においては、キットは適切な操作パラメーターについての指示をラベルまたは別にした説明書の形態で含むことができる。指示書は、たとえばサンプルの捕集方法、プローブの洗浄方法または具体的な検出すべきバイオマーカーなどについての情報を消費者に与えうる。さらに他の実施形態においては、キットは、較正用標準物質として使用するために、バイオマーカーサンプルの入った１つまたはそれ以上の容器を含むことができる。
当業者は、さらに手を加えることなく、前述の記載を用いて本発明を最も完全な程度まで利用できると考えられる。以下の実施例は例示的でのみあって、いかなる様式であっても残る開示を制限していない。
以下の実施例は、当業者に対し、本明細書に記載および主張される化合物、組成物、物品、機器、および／または方法をどのように作製および評価するかについて完全な開示および記載を提供するために提示され、かつ純粋に例示的であることを意図し、かつ発明者がその発明と見なすものの範囲を限定することを意図していない。数値（例：量、温度など）については正確さを確保するよう努力しているが、本明細書では一部の誤りまたは逸脱を説明すべきである。特に指示しない場合、部は重量部であり、温度はセルシウス温度または環境温度であり、かつ圧力は大気圧付近である。数多くの変法、および所望のプロセスより得られる生成物の純度および収率を最適化するために用いることのできる、たとえば成分濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力およびその他の反応範囲および条件などのような反応条件の組み合わせがある。このようなプロセス条件を最適化するためには、合理的かつ常用的な実験法のみが必要であろう。
（鎌状赤血球症（ＳＣＤ）小児における無症候性脳損傷（ＳＣＩ）の血中バイオマーカーの発見）
ＳＣＤおよびＳＣＩを有する小児は重大な学習欠損を有しかつ脳卒中のリスクが高い。ＳＣＩの早期検出により、ＩＱの低下を含むさらなる脳損傷および認知神経科学的欠損を予防するための治療法の実施が可能となるであろう。定義によれば、ＳＣＩ患者は微小梗塞と一致する脳損傷のＭＲＩおよび病理学エビデンスを有する。したがって、顕性脳卒中を有する非ＳＣＤ患者で示されているように、ＳＣＩ患者を特定する特異な血中バイオマーカーが存在する可能性が高い。本実施例の目標は、ＳＣＩの血中バイオマーカーとしての実証のためのリードプロテインを特定するために、ＳＣＩ患者血漿サンプルと非ＳＣＩ患者血漿サンプルの臨床的ペア群を探索するバイアスのないプロテオミクス技法を用いることである。
（被験集団）
被験集団は、ＭＲＩによりＳＣＩを有する（ＳＣＩ群）またはＳＣＩがない（非ＳＣＩ群）と宣告された、ＳＩＴ治験（２４施設）に参加しているＳＣＤを有する６〜１２歳の男児および女児を含んだ。ＳＩＴ治験の一環として、ＭＲＩおよび神経学的検査の他に、患者はＣＢＣ、Ｈｂ／Ｈｃｔ、ヘモグロビン電気泳動およびその他の臨床的検査の判定を受ける。治験に組み入れる際、クエン酸処理血漿を調製し、凍結し、ジョンズ・ホプキンズ大学のＢｉｏｌｏｇｉｃ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙに−７０℃で保存する。ＨｂはＳＣＩの独立リスク因子であることが示されているので、本実施例の初期探索コホートは、表１に示すように、そのいずれもがＨｂ＜８．１ｇ／ｄＬのＳＣＩを有する患者５０例およびＳＣＩのない患者５０例を含む。
（大量タンパク質の除去処理）
ＳＣＩを有する小児における血漿発現の変化に伴うタンパク質を同定するため、ＳＣＩ小児および非ＳＣＩ小児の個々の血漿サンプル２５０μＬを、事前に入手することのできた新世代のＬＣ１０ポリクローナル抗体アフィニティカラム（ＩｇＹ高容量ＬＣ１０カラム、ベックマン・コールター）を用いてアフィニティ除去処理した。この新世代カラムは除去処理できる血漿の量が２倍となっているので（１２５μＬから２５０μＬ）、下流の敏感度が上昇する。この新規カラムをＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＰＰＳ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ベックマン・コールター）と組み合わせて、フロースルーおよび結合タンパク質を採取する。除去処理した血漿各２５０μＬにつきフロースルータンパク質を７ｍＬ採取する。５ｍＬループを用いて除去処理したタンパク質４００μｇを、線形アセトニトリル勾配を用いるＣ１８非多孔性カラムと接続したＲＰ ＨＰＬＣ（ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＰＰＳ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）で分画化し、３０分間で６０分画を捕集した。
（ＳＣＩにおける小分子かつ少量の血漿タンパク質の同定および定量）
上述のＲＰ ＨＰＬＣ分画に含有されるタンパク質を同定するために、各ＲＰ ＨＰＬＣ分画のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ）分析を用いて非ＳＣＩ／ＳＣＩ血漿タンパク質データベースを策定した。簡単に述べると、１例の患者に由来するＲＰ ＨＰＬＣ分画プールをＳｐｅｅｄＶａｃを用いて完全に乾燥し、中和緩衝液に再懸濁し、一晩トリプシン消化した。トリプシン消化後、ＲＰ ＨＰＬＣ分画をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ）で分析した。トリプシン消化前の未処理タンパク質のＲＰ ＨＰＬＣ分画より、それぞれ５０〜１００種類のタンパク質を含有する分画を生成した。タンパク質同定の信頼性を高めるために、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ、ＯＭＳＳＡ、およびＳａｇｅＮ ＳＥＱＵＥＳＴを用いて、ＩＰＩタンパク質データベース（完全トリプシン消化した最新版と３．６）と照合して各タンデムＭＳスペクトルＲＡＷファイルを検索し、さらにタンパク質およびペプチド同定結果を、ＭａｓｐｅｃｔｒａｓおよびＳｃａｆｆｏｌｄで各患者別に編集した。ＳＣＩおよび非ＳＣＩサンプル中のペプチドカウントスペクトルが存在するか／しないかまたは１．５倍を上回るその変化（上昇または減少）に基づいて、初期リードタンパク質を同定した。
（脳損傷タンパク質の同定）
半定量的スペクトルカウントの１．５倍変化というカットオフ値を用いて、ＳＣＩ小児の血中タンパク質を以下の表１に列挙する。これらのペプチドの同定は期待値＜１０−１を有する。
（表１．脳損傷タンパク質バイオマーカー）
（鎌状赤血球症（ＳＣＤ）小児における無症候性脳損傷（ＳＣＩ）の血中バイオマーカーの探索）
ＳＣＤおよびＳＣＩを有する小児は重大な学習欠損を有しかつ脳卒中のリスクが高い。ＳＣＩの早期検出により、ＩＱの低下を含むさらなる脳損傷および認知神経科学的欠損を予防するための治療法の実施が可能となるであろう。定義によれば、ＳＣＩ患者は微小梗塞と一致する脳損傷のＭＲＩおよび病理学エビデンスを有する。したがって、顕性脳卒中を有する非ＳＣＤ患者で示されているように、ＳＣＩ患者を特定する特異な血中バイオマーカーが存在する可能性が高い。本実施例の目標は、ＳＣＩの血中バイオマーカーとしての実証のためのリードプロテインを特定するために、ＳＣＩ患者血漿サンプルと非ＳＣＩ患者血漿サンプルの臨床的ペア群を探索するバイアスのないプロテオミクス技法を用いることである。
（被験集団）
被験集団は、ＭＲＩによりＳＣＩを有する（ＳＣＩ群）またはＳＣＩがない（非ＳＣＩ群）と宣告された、ＳＩＴ治験（２４施設）に参加しているＳＣＤを有する６〜１２歳の男児および女児を含んだ。ＳＩＴ治験の一環として、ＭＲＩおよび神経学的検査の他に、患者はＣＢＣ、Ｈｂ／Ｈｃｔ、ヘモグロビン電気泳動およびその他の臨床的検査の判定を受ける。治験に組み入れる際、クエン酸処理血漿を調製し、凍結し、ジョンズ・ホプキンズ大学のＢｉｏｌｏｇｉｃ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙに−７０℃で保存する。ＨｂはＳＣＩの独立リスク因子であることが示されているので、本実施例の初期探索コホートは、表１に示すように、そのいずれもがＨｂ＜８．１ｇ／ｄＬのＳＣＩを有する患者５０例およびＳＣＩのない患者５０例を含む。
（大量タンパク質の除去処理）
ＳＣＩを有する小児における血漿発現の変化に伴うタンパク質を同定するため、ＳＣＩ小児および非ＳＣＩ小児の個々の血漿サンプル２５０μＬを、事前に入手することのできた新世代のＬＣ１０ポリクローナル抗体アフィニティカラム（ＩｇＹ高容量ＬＣ１０カラム、ベックマン・コールター）を用いてアフィニティ除去処理した。この新世代カラムは除去処理できる血漿の量が２倍となっているので（１２５μＬから２５０μＬ）、下流の敏感度が上昇する。この新規カラムをＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＰＰＳ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ベックマン・コールター）と組み合わせて、フロースルーおよび結合タンパク質を採取する。除去処理した血漿各２５０μＬにつきフロースルータンパク質を７ｍＬ採取する。各患者由来の血漿計７５０μＬを除去処理し、除去処理したタンパク質＞１ｍｇ（プールカラムフロースルー２１ｍＬとして）を下流ＲＰ−ＨＰＬＣ分画化に提供した。４ｍＬループを用いて、フロースルータンパク質各４ｍＬの独立したラン５回（血漿７５０μＬの除去処理より採取）を、線形アセトニトリル勾配を用いるＣ１８非多孔性カラムと接続したＲＰ ＨＰＬＣ（ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ ＰＰＳ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）で分画化し、３０分間で６０分画を捕集した。各分画のタンパク質濃度を高めるために、５回のＲＰ−ＨＰＬＣランの各ＲＰ−ＨＰＬＣ分画を同じプレートに捕集する。大きな除去処理タンパク質体積（２１ｍＬ）を処理する反復ＲＲ−ＨＰＬＣ分画化は面倒であるが、代替法であるサイズ排除遠心分離よりも優れている。サイズ排除遠心分離では、（ａ）遠心分離カラムへの非特異的なタンパク質の結合；および（ｂ）タンパク質＜１０ｋＤａ（アンジオテンシンＩＩ、ブラジキニンおよびエンドセリンなどの血管作用ペプチドを含み、ＳＣＩの病理において非常に重要となりうる）の固有損失から、許容できないタンパク質損失が生じる。この強度のタンパク質損失は、本実施例に記載するような探索ベースの手法では許容できない。対照的に、反復ＲＰ−ＨＰＬＣ分画化は非常に再現性が高い。
ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムのどのピークをＭＳ用に処理するか判定するために、オーバーレイソフトウェア（３２−Ｋａｒａｔソフトウェア、ベックマン・コールター）およびより新しいアルゴリズム（Ｌｕｄｅｓｉ社と共同開発）を用いた。これらのツールは、いずれも後で探索コホートを分析する際に特に有用である。４つのＳＣＩ ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムおよび４つの非ＳＣＩ ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムの分析によれば、（全６０分画中）３２分画でＳＣＩ患者と非ＳＣＩ患者の間にその後の分析に十分な差がある。図１を参照されたい。
（ＳＣＩにおける小分子かつ少量の血漿タンパク質の同定および定量）
上述のＲＰ ＨＰＬＣ分画に含有されるタンパク質を同定するために、各ＲＰ ＨＰＬＣ分画のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ）分析を用いて非ＳＣＩ／ＳＣＩ血漿タンパク質データベースを策定した。簡単に述べると、１例の患者に由来するＲＰ ＨＰＬＣ分画プールをＳｐｅｅｄＶａｃを用いて完全に乾燥し、中和緩衝液に再懸濁し、一晩トリプシン消化した。トリプシン消化後、ＲＰ ＨＰＬＣ分画をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ）で分析した。各ＲＰ ＨＰＬＣ分画は５０〜１００種類のタンパク質を含有する。（Ｍａｓｐｅｃｔｒａｓの）タンパク質データベースを策定し、２群間のタンパク質発現の差について調査し、その後の分析のために機能的および細胞型特異的タンパク質にコメントした。ＳＣＩ患者および非ＳＩＣ患者由来の特異的ＲＰ−ＨＰＬＣ分画を、目的の潜在的候補タンパク質を含有すると一旦特定したならば、質量分析技法である多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を用いてこれらの分画中のタンパク質を定量した。簡単に述べると、トリプシン処理後に、サンプルをバイオマーカータンパク質のペプチドシグネチャーを用いるＬＣ／ＭＳ／ＭＳ同定および定量に投入した。ＷｅｂベースのＭａｓｐｅｃｔｒａｓデータベースを用いて、生データ、処理したデータおよび分析およびタンパク質プロファイリング用最終プロテオミクスデータを保存した。
（脳損傷タンパク質の同定）
Ｕｎｉｇｅｎｅ（ＮＣＢＩ）のＥＳＴタグに基づくＮＣＢＩの脳特異的タンパク質リストを用いて、ＳＣＩ小児の血中脳タンパク質１０４種類を同定した。表２を参照されたい。これらのペプチドの同定は期待値＜０．９を有する。
（表２．脳損傷タンパク質バイオマーカー）
（非症候性脳損傷の診断を目的としたバイオマーカーパネル）
本明細書に記載のデータ、さらには心臓手術を受けた成人のコホートから取得したデータのさらなる分析より、無症候性脳損傷を診断／評価するために個別に、または複合して用いることのできる以下のバイオマーカーパネルが得られた。
（表３．非症候性脳損傷のバイオマーカーパネル）
（鎌状赤血球症小児における脳損傷の血漿バイオマーカーとしてのグリア線維性酸性タンパク質のプロテオミクス的同定）
鎌状赤血球症（ＳＣＤ）は、多臓器損傷を特徴とする慢性溶血性貧血である。脳卒中は、ＳＣＤにおいて脳に対して最も顕著に発生しうる損傷である。経頭蓋ドップラー速度が上昇した患者を特定しかつ長期的な赤血球輸血を実施することにより、小児の脳卒中リスクは有意に低下している。Adams他、339 N. ENG. J. MED. 5-11（1998）。ＭＲＩ上でサイレント脳梗塞（ＳＣＩ）の存在により確認される脳損傷のリスクが長期的赤血球輸血によって軽減されるかは、現在研究中である。King他、50 PEDIATR. BLOOD CANCER 599-602（2008）。脳卒中リスクのバイオマーカーは、明らかに鎌状赤血球症の診療を変容させている。
小児においては、ＳＣＩは低ＩＱ、学業成績不振、および顕性脳卒中の独立リスク因子である。Miller他、139 J. PEDIATR. 385-90（2001）；およびBernaudin他、15 J. CHILD NERUOL.333-43（2000）。ＭＲＩは、ＳＣＩ患者を特定する唯一の方法である。ＭＲＩは高価であり、使用できる頻度に制限があり、かつ一部の小児患者ではＳＣＤに対して死亡を含むリスクをもたらす麻酔を必要とするので、疾患リスクを追跡するための理想的な技法ではない。Vicinsky他、333 N. ENGL. J. MED. 206-13（1995）を参照されたい。血液は採取および測定することが容易であり、バイオマーカーは神経学的損傷のリスクまたはその顕性脳卒中への進行を判定することができ、かつバイオマーカーは現行および新規ＳＣＩ療法の基準となることも可能であるので、ＳＣＩの血液バイオマーカーは臨床的な空隙を埋めるであろう。
顕性脳卒中を有する成人では、神経および神経膠タンパク質の血漿中レベルは、梗塞領域からの持続的細胞漏出を反映すると考えられる。このグループのバイオマーカーは、脳損傷に対して非常に特異的となり得る。研究者は脳特異性タンパク質を使用するというこの手法をとり、研究用に特定された数種類の候補タンパク質を用いて成人の顕性脳卒中のバイオマーカーを特定している。Allard他、51 CLIN. CHEM. 2043-51（2005）；Allard他、4 PROTEOMICS 2242-51（2004）を参照されたい。しかし、ＳＣＤ患者血漿中への脳特異性タンパク質の漏出からのＳＣＩの特定は報告されていない。
バイアスのないプロテオミクス手法を用いて、ＭＲＩおよびプロテオミクス分析でスクリーニングしたＳＣＩを有するＳＣＤ患者の血漿中でグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）を同定した。ＧＦＡＰは、成人の急性脳卒中および頭部外傷の既知のバイオマーカーである脳特異性が高い中間線維タンパク質である。Vos他、62 NEUROLOGY 1303-10（2004）；Herrmann他、31 STROKE 2670-77（2000）；およびLewis他、81 PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A. 2743-46（1984）。これらの病状において予後および病変密度と相関することが示されている。Nylen他、240 J. NEUROL. SCI. 85-91（2006）；Wunderlich他、13 EUR. J. NEUROL. 1118-23（2006）。プロテオミクススクリーンにおけるＧＦＡＰの同定およびこれを報告する入手可能な文献を考えれば、それゆえにＧＦＡＰ濃度は鎌状赤血球症における脳損傷のバイオマーカーの役割を果たす可能性もあるという仮説が立てられる。
（方法）
（患者）
サイレント梗塞輸血治験（ＳＩＴ治験、ClinicalTrials.gov NCT00072761）のためにスクリーニングされた鎌状赤血球症を有する５〜１４歳の小児の横断サンプル（ＨｂＳＳおよびＨｂＳβ０）を検討した（ｎ＝２５９）。ＳＩＴ治験は、鎌状赤血球症およびＳＣＩを有する小児に対する３年間輸血プログラムの多施設無作為化対照試験である。主要評価項目は顕性脳卒中あるいは新規または進行性ＳＣＩの発生を含む。全ての患者はインフォームドコンセントに署名した。ＳＣＩは、正常な神経学的検査およびＴ２強調画像の２視野で目視できるＭＲＩシグナル異常によって定義される。シグナル異常は、１次元で３ｍｍ以上でなければならない。ＳＣＩ状態は、神経放射線科医および脳神経科医のパネルによって宣告される。Vendt他、22(3）J. DIGIT. IMAGING 326-43（2009）を参照されたい。陽性および陰性対照患者は、ジョンズ・ホプキンズ病院の外来および入院病棟から選択した。陽性対照血漿サンプルは、入院した小児または顕性脳梗塞または脳手術で入院した成人から採取した。陰性対象は、ジョンズ・ホプキンズ病院のＨａｒｒｉｅｔ Ｌａｎｅ小児科外来の５〜１６歳の小児から選択した。外来記録を審査して何らかの急性疾患、神経学的障害、または喘息、肥満および行動／気分障害以外の慢性疾患を有する患者を除外した。ＩＲＢの承認を受けた研究により、これらの対照についての非特定血液サンプルおよび臨床データを取得した。
（血漿標本および質量分析）
血液をＡＣＤまたはＥＤＴＡ管に採取し、ＳＩＴ治験プロトコルに従って１５００ｇで８分間遠心分離し、ジョンズ・ホプキンズ大学ＳＩＴ治験用Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙに分析時まで−７０℃で保存した。ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＰＳ、ベックマン）上のＬＣ１０ ＩｇＹカラム（ベックマン・コ−ルター、カリフォルニア州フラートン）を用いて、血漿５００μＬから１２種類の血漿大量タンパク質を除去処理した。ＩｇＹカラムのフロースルーを、連続アセトニトリル勾配（ＰＰＳ、ベックマン）を用いるＣ１８カラム（Ｊｕｐｉｔｅｒ， Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を通す逆相ＨＰＬＣで３９分画に分離した。分画を乾燥させ（ＳｐｅｅｄＶａｃ、サーモサイエンティフィック、マサチューセッツ州ウォルサム）、３７℃で一晩トリプシン消化した（プロメガ、ウィスコンシン州マジソン）。各サンプルのスペクトルをＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ、サーモサイエンティフィック）により取得した。ＳＥＱＵＥＳＴ（Ｓｏｒｃｅｒｅｒ、ＳａｇｅＮ、ニュージャージー州ペニングトン）およびヒトＩＰＩデータベースバージョン３．４を用いてスペクトルを検索し、タンパク質を同定した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｎｔｅｒを用い、タンパク質同定カットオフ値として信頼水準＜０．９により検索後分析を実施した。
（ＧＦＡＰ測定）
電気化学発光サンドイッチイムノアッセイ（メソスケールディスカバリー、メリーランド州ゲッサーズバーグ）を用いて、非希釈血漿サンプル中のＧＦＡＰを２回ずつ測定した。各ウェルにつきＰＢＳ３０μＬ中のモノクローナル抗ＧＦＡＰブレンドＳＭＩ−２６（コーバンス、ニュージャージー州プリンストン）１００ｎｇを、標準結合ＭＳＤプレート中で一晩インキュベートして捕捉した。スルフォダグ（メソスケールディスカバリー）と直接コンジュゲートしたポリクローナル抗ＧＦＡＰ（ダコ、カリフォルニア州カーピンテリア）をＰＢＳ中１μｇ／Ｌで用いて検出した。標準曲線は、１％ウシ血清アルブミン（ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州ミルフォード）で４倍希釈した精製ＧＦＡＰ（カルビオケム、カリフォルニア州ラ・ホーヤ）を用いて作成した。測定値の変動を最小化するため、対照および鎌形赤血球症患者サンプルは、できるだけ同一のサンプルプレート上で測定した。分析は、Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ２４００（メソスケールディスカバリー）上でメーカーのプロトコルにしたがって実施した。
（統計解析）
ＧＦＡＰ濃度を群間比較するためにスチューデントのｔ−検定を用いた。自然対数に変換したＧＦＡＰ値は正規分布に近似し、これらをパラメトリック分析に用いた。割合の検定はフィッシャーの正確検定を用いて実施した。分析はＳｔａｔａ ｖ１０．１（Ｓｔａｔａ社、テキサス州カレッジステーション）を用いて実施した。
（結果）
（血漿中のＧＦＡＰの質量スペクトル同定）
ＳＣＩを有するＳＩＴ治験被験者より採取した６血漿サンプル中４サンプルで、ＳＥＱＵＥＳＴ検索によりＧＦＡＰペプチドを同定した。図２を参照されたい。
（ＧＦＡＰ電気化学発光イムノアッセイの実施および検証）
Petzoldによって報告されさらにＭＳＤプラットフォームに適合化された抗体試薬を用いたＧＦＡＰ測定法を開発した。Petzold他、287 J. IMMNOL. METHODS 169-77（2004）を参照されたい。この方法の検証を実施した。至適抗体濃度、プレートの種類、およびブロッキング材料を判定する実験の後、本明細書に報告された全てのＧＦＡＰ値に対して用いられた最終的な測定は、ブランクウェルのバックグラウンドより２ＳＤ高いと定義した０．００１１ｎｇと低い検出限界値を有した（実験回数ｎ＝１９）。０．０１ｎｇ／ｍＬにおける信号雑音比は１．１７であった（実験回数ｎ＝１９）。算出濃度±既知の濃度の２０％となる最小希釈度と定義される定量下限値は０．０２６ｎｇ／ｍＬであった（実験回数ｎ＝３）。日間再現性は１０ｎｇ／ｍＬにおいて２．４％であり、かつ０．１５６ｎｇ／ｍＬにおいては３．４％であった（実験回数ｎ＝２１）。ＧＦＡＰを１０ｎｇ／ｍＬで添加した血漿は、ＢＳＡにおいて生成した標準曲線と比較して４９．８％±２２．９％の回収率を示す。血漿中のＧＦＡＰが室温で安定であるか少なくとも４８時間判定し、測定値がインビトロタンパク分解のアーチファクトでないことを確認した。ｔ＝０、６、２４、および４８時間における同一の分取物の連続測定は、２ｎｇ／ｍＬにおいてＣＶ２．５％、０．２ｎｇ／ｍＬにおいて１２．１％を示し、血漿中のＧＦＡＰの安定性を証明する。
（鎌状赤血球症および対照の血漿ＧＦＡＰ）
ＧＦＡＰ測定法が脳損傷の状況における血漿ＧＦＡＰの上昇を検出することを実証するため、急性脳卒中、脳生検または部分脳切除患者の０〜５日後の小児および成人に由来する血漿サンプルより構成される陽性対照集団を測定した。図３は、脳卒中（中央値０．４４６ｎｇ／ｍＬ、範囲０．０２９〜４．２９ｎｇ／ｍＬ）、脳生検（中央値０．９６ｎｇ／ｍＬ、範囲０．１６２〜０．９３ｎｇ／ｍＬ）および脳切除（中央値１．２９ｎｇ／ｍＬ、範囲０．１２２〜２４．１ｎｇ／ｍＬ）についてのＧＦＡＰレベルを示す。小児におけるＧＦＡＰの血漿濃度は不明であるので、一般の小児科外来からの年齢マッチングした対照（５〜１６歳）を用いて正常範囲を確立した。健康対照被験者はスクリーニング用に血液を採取されており、かつ急性疾患はなかった。健康対照のうち４６／４７例はアフリカ系であった。年齢マッチングした正常対照におけるＧＦＡＰの９５パーセンタイルは０．２４４ｎｇ／ｍＬであった。陽性対照のうち７４％は、正常対照の９５パーセンタイルよりも高いＧＦＡＰ値を有していた（ｐ＜０．０００１）。
ＳＩＴＴ参加者集団と健康対照の比較により、２つの群は血漿ＧＦＡＰの平均濃度が同程度であることが示される（ｐ＝０．１２）。ＳＩＴＴ参加者のＧＦＡＰ中央値は０．０６５ｎｇ／ｍＬ（１０パーセンタイル０．０２６、９０パーセンタイル０．２２５）であり、健康対照の中央値は０．０５５ｎｇ／ｍ（１０パーセンタイル０．０２５、９０パーセンタイル０．２０７）であるが；しかし、数例の鎌状赤血球症被験者は年齢マッチング対照の最高値よりもはるかに高い血漿ＧＦＡＰ濃度を有している。年齢マッチング健康対照の９５パーセンタイルのカットオフ値を用いると、ＳＩＴＴスクリーニングサンプルの８．９％が上昇していた（ｐ＝０．２９）。ＳＩＴＴスクリーニングサンプル中１０サンプル（３．９％）は、顕性脳損傷（脳生検、切除または脳卒中）を有する陽性対照群と匹敵する、年齢マッチング健康対照の最高レベル０．４４ｎｇ／ｍＬ（上昇ＳＩＴＴ被験者のＧＦＡＰの中央値：１．３ｎｇ／ｍＬ、範囲０．４７〜４．４１ｎｇ／ｍＬ）を上回るＧＦＡＰレベルを示した。
（血漿ＧＦＡＰとＳＣＩ）
いくつかの研究はＧＦＡＰを急性脳損傷のマーカーとして評価している。ＳＣＩおよび脳卒中は、鎌状赤血球症において発生することが十分に立証されたＣＮＳ事象である。図４に示すように、ＳＣＩ群の小児も非ＳＣＩ群の小児もＧＦＡＰ濃度が上昇していた。ＳＣＩ陽性患者とＳＣＩ陰性患者の間でＧＦＡＰ濃度に統計的な差はなかった（ｐ＝０．６９）。ＧＦＡＰが年齢マッチング健康対照の９５パーセンタイルを上回って上昇しているＳＣＩ患者の割合は、ＧＦＡＰを有する非ＳＣＩ患者の割合よりも高かったが、この差は統計的に有意ではない（１３．４％対７．６％、ｐ＝０．１４）。
（ＳＣＤにおける急性脳卒中における血漿ＧＦＡＰ）
ＳＩＴＴ血漿サンプルは特異で貴重なリソースであるものの、実証の目的に対しては、試験組み入れ時の血漿サンプルとＳＣＩ脳病変の発症との間に予測可能な時間的関係がないという点で特別な問題を呈する。小児期ＳＣＤ集団において非症候性および顕性脳卒中のマーカーとしてのＧＦＡＰをさらに実証するために、図５に、臨床的に髄膜炎と疑われる熱性疾患中に急性脳卒中を呈した１１歳のホモ接合型鎌形赤血球症患者（非ＳＩＴＴ患者）からの連続血漿ＧＦＡＰ濃度を示す。ＣＳＦを検査したところ感染および出血は陰性であった（６ＷＢＣ／μＬ、２ＲＢＣ／μＬ）。脳卒中の臨床診断より３２時間前に採取した血漿で初期ＧＦＡＰ濃度を測定した（１．５ｎｇ／ｍＬ、正常小児の９５パーセンタイルの６倍）。脳卒中の臨床診断より２５時間後のＣＳＦのＧＦＡＰレベルは４４．６ｎｇ／ｍＬであった。参照として、１７歳未満の全小児患者のＣＳＦ中のＧＦＡＰの研究では、急性損傷がない場合のＣＳＦ中ＧＦＡＰレベルは０．１〜０．５ｎｇ／ｍＬであることが示された。Osterlundh他、50 PEDIATR. BLOOD CANCER 793-98（2008）。脳卒中の臨床診断より２９時間後に実施したＭＲＩは右前大脳動脈梗塞を示した。図６を参照されたい。赤血球交換後もＧＦＡＰレベルが低下を続けたことから、この患者はＧＦＡＰが急性脳損傷のみのマーカーである可能性があることも証明する。脳卒中より１週間後、やはりホモ接合型鎌状赤血球症である患者の８歳の妹も熱性疾患を発症し、その間の妹の血漿ＧＦＡＰ濃度は０．０８８ｎｇ／ｍＬであった。
（その他の鎌状赤血球症状態における血漿ＧＦＡＰ）
鎌形赤血球症におけるＧＦＡＰの脳損傷に対する特異度をさらに探索するため、ＨｂＳＳ患者１７例の連続血漿サンプルをＧＦＡＰについて検討した（ｎ＝４０）。入院の理由は急性胸部症候群、疼痛発作、インフルエンザ、発熱、骨髄無形成発症（ＰＣＲでパルボウイルスＢ１９を確認）および持続勃起症であった。ＳＣＤを有する疾患小児でＧＦＡＰが常に上昇することは確認されておらず、３９／４０サンプルで濃度が正常範囲にあった（範囲０．０１〜０．２４ｎｇ／ｍＬ）。最高値（０．４４ｎｇ／ｍＬ）は発熱で入院した４歳の患者に認められた。この数値は正常範囲の９５パーセンタイルを上回るものの、正常対照の最高値と同等である。
（考察）
鎌形赤血球症のバイアスのない血漿プロテオームスクリーンを用い、既知の脳損傷マーカーＧＦＡＰを同定した。鎌形赤血球症患者の血漿からの脳特異性の高いタンパク質の探索により、本実施例で用いられるバイオマーカー探索の実験的手法が実証される。
本実施例より、ＧＦＡＰは、ＳＣＩの高精度バイオマーカーではないものの、ＳＣＩの時期が不明であるＳＩＴ治験参加者の横断的研究においてＭＲＩで診断された鎌形赤血球症における脳梗塞のバイオマーカーであることが証明される。５〜１４歳の安定期鎌状赤血球症小児の横断的母集団のうち３．９％は、明らかな神経学的損傷を伴わない極度のＧＦＡＰ上昇を有した。ＧＦＡＰレベルが著明に上昇したこれらの小児は無症候性脳損傷を有しているという仮説が立てられる。病歴および神経学的検査では明らかな欠損はなかった。
ＳＣＩはＭＲＩまたは剖検で定義される病的状態である。Moser他、17 AM. J. NEURORADIOL. 965-72（1996）；およびRothman他、20 ANN. NEUROL. 684-90（1986）。鎌状赤血球症におけるＳＣＩは、ＳＣＩのない鎌状赤血球症患者よりも低い認知神経科学的能力と関連しているが、多くの鎌状赤血球病小児は、脳ＭＲＩが正常であるにもかかわらず認知神経科学的機能が低い。Schatz他、56 NEUROLOGY 1109-11（2001）；およびArmstrong 他、97 PEDIATRICS 864-70（1996）。脳に対する特異性の高いタンパク質の血漿レベルによる脳損傷の検出は、損傷を検出するより感度の高い手段となりうる。
ＳＣＩは急性または慢性血管発作によって生じる挿間的事象である。大半のＳＣＩ患者では血漿ＧＦＡＰは上昇せず、またＧＦＡＰが上昇する場合はＳＣＩ陽性患者と陰性患者の間で均等に分布する。横断的データを用いれば、挿間的事象と一過性の血漿バイオマーカーの上昇との関連は偶然の事象となり；したがって本発明者らは、ＧＦＡＰがＳＣＩ条件下で上昇する場合は一過性の上昇であると結論づける。本明細書に記載された脳卒中を有する鎌状赤血球症患者は、血漿ＧＦＡＰが少なくとも１３日間上昇しており、またおそらくその上昇はＳＣＩよりも短い。その他の候補バイオマーカーは、鎌状赤血球症患者にＳＣＩおよび顕性脳卒中の素因を与える慢性脳および血管損傷を反映しうる。
顕性脳卒中の診断前のＨｂＳＳ患者における血漿ＧＦＡＰの診断前上昇は、病状の悪い鎌状赤血球患者におけるスクリーニング検査としてＧＦＡＰを使用できる可能性を高める。脳梗塞は非造影頭部ＣＴで視覚化することが可能であったので、診断時は少なくとも１日経過していた。病院入院直後のこの小児のＧＦＡＰレベルがこのように高かったことを認識していれば、進展性脳損傷のより迅速な評価および治療の契機となっていたかもしれない。非神経学的急性症状で入院した他の１７例の鎌状赤血球症患者では血漿ＧＦＡＰは上昇しなかったので、脳卒中の早期診断に役立つ血漿ＧＦＡＰの有用性についての予測的研究は、ホスホリパーゼＡ２が急性胸部症候群の予測因子として研究されていることと同程度に実施可能であると見られる。Styles他、136 BR. J. HAEMATOL. 343-44（2007）。鎌状赤血球症小児患者における脳卒中の約１９％は医学的前駆事象と関連し（Scothorn他、140 J. PEDIATR. 348-54（2002））、また選択された入院患者集団に対するスクリーニングは進展性脳卒中のより早期の介入にとって有用となりうる。
血漿はバイオマーカー探索にとって特異なソースである。利点は、大量のタンパク質を含有し、研究用に幅広く利用可能であり、かつ器官特異性サブプロテオームの組み合わせを含みうることであり、血漿分析によってこれらの組織の状態についての情報が提供される。血漿中の血漿バイオマーカー研究にとっての主な困難は、含有量のより少ない候補タンパク質の探索を不明瞭にする数種類のタンパク質の高い濃度である。大量タンパク質の血漿除去処理によって、１ｎｇ／ｍＬ未満の濃度で存在する候補タンパク質の探索が容易になっている。
小児プロテオミクス研究にとって特に困難なことは、年齢別参照データベースがないことである。ヒトプロテオーム機構（ＨＵＰＯ）の構想の１つにヒト血漿プロテオームプロジェクトがある（http://www.hupo.org/research/hppp/）。少なくとも１つのペプチドによって同定されたタンパク質９，５０４種類の参照リストは、全ての血漿バイオマーカー探索のための基準である。しかし、これらのデータの小児への適用は明確ではない。本実施例においては、実証のために年齢マッチング対照の蓄積を組み立てた。将来の目標は、年齢マッチング対照の血漿プロテオームを同定し、本研究および他の全ての小児プロテオミクス研究についてのバイオマーカー探索に役立てることである。
要約すると、本研究の結果より、他の集団においてＣＮＳ損傷のバイオマーカーであることが知られているＧＦＡＰを同定することにより、鎌状赤血球症患者の脳損傷の潜在的バイオマーカーを同定するためのバイアスのない戦略が実証される。臨床症状の顕在的エビデンスがない鎌状赤血球症患者の血漿の相当の割合においてＧＦＡＰが同定されることは、本研究では説明されないが、これらのＳＤＣ患者の脳損傷の性質についての興味深い問題を提起する。ＳＣＤにおける脳特異性タンパク質のさらなるプロテオミクス研究は、ＳＣＤにおけるＣＮＳ損傷に対する我々の理解、その検出および治療にとって非常に興味深いものとなる見込みがある。
（体外膜型酸素供給後の脳損傷のマーカーおよび神経学的転帰の予測因子としての血漿グリア線維性酸性タンパク質）
本実施例は、ＥＣＭＯを受ける小児において血漿ＧＦＡＰレベルが急性神経学的損傷と関連するか判定するために実施した。これは、２００８年４月から２００９年８月までにジョンズ・ホプキンズ病院の２６床ＰＩＣＵにおいてＥＣＭＯを受けた小児を対象とした予測的観察的コホート研究であった。任意の適応によりＥＣＭＯを必要とし、かつＥＣＭＯの過程で非分画化ヘパリンの連続点滴を受けた生後１日から１８歳未満までの全ての小児を、本研究の対象とした。２２例の患者をＧＦＡＰ分析に組み入れた。年齢の中央値は生後１０日であり（範囲：生後１日〜１６歳）、男児は１２例（５４．５％）であり、かつ１２例（５４．５％）がアフリカ系アメリカ人であった。主要な疾患カテゴリーは循環器系以外の内科が１４例（６４％）、またＥＣＭＯの適応症は呼吸不全が１２例（５４．５％）、心不全が６例（２７．３％）、ＥＣＰＲが３例（１３．６％）、および敗血症が１例（４．６％）であった。
ピークＧＦＡＰレベルの中央値（図７）は脳損傷を有する小児の方が脳損傷のない小児よりも高く（１０．２ｎｇ／ｍＬ対０．０９ｎｇ／ｍＬ、ｐ＜０．０１）、かつ非生存者の方がＰＩＣＵ退院時生存者と比べて高かった（５．９ｎｇ／ｍＬ対０．０９ｎｇ／ｍＬ、ｐ＝０．０１）。各患者から採取した全連続サンプルに由来するデータを用いたところ、ＧＦＡＰの１ｎｇ／ｍＬ上昇毎の脳損傷のオッズ比（ＯＲ）は１．５であった（９５％ＣＩ、１．０１〜２．１６；ｐ＝０．０４６）。異常なＧＦＡＰレベル（すなわち＞９５パーセンタイル）は、重度の神経学的損傷または脳死の患者４例中２例の画像診断より１〜２日前に認められた。我々の先験的定義により急性神経学的損傷を有すると分類された以下の３例の患者では、血漿ＧＦＡＰレベルは正常値のままであった：頭部超音波検査で右小脳出血と診断され非神経学的な理由によりＥＣＭＯ期間が終了した患者１例、および小さな軸外出血を有する患者２例：生存して神経機能が良好な小さな硬膜下血腫を有する患者１例、および同じく生存して神経機能が良好なグレードＩ脳室内出血の患者１例。このＥＣＭＯ患者の初期コホートは、ＥＣＰＲを受けた患者３例を含んだ：１例は生存して神経学的転帰が良好でありかつＥＣＭＯの過程を通じてＧＦＡＰレベルが正常であり（中央値：０．０７ｎｇ／ｍＬ、ＩＱＲ：０．０５〜０．０９ｎｇ／ｍＬ）；１例は喘息重責発作による低酸素性電気機械解離心停止に陥り、脳死に進展し、かつ血漿ＧＦＡＰレベルが高く（中央値：２７．２ｎｇ／ｍＬ、ＩＱＲ：９．５〜４４．９ｎｇ／ｍＬ）、また１例の患者は重度の脳浮腫を発症し、最終的には多臓器不全のため生命維持装置を取り外し、かつ同じくＧＦＡＰレベルが高かった（中央値：５．８ｎｇ／ｍＬ、ＩＱＲ：２．８〜１０．５ｎｇ／ｍＬ）。
急性神経学的損傷患者７例のうち４例は血漿ＧＦＡＰが年齢マッチング対照の９５パーセンタイルを上回り、またＥＣＭＯの過程で診断された急性神経学的損傷のない１３／１５例の患者は正常なＧＦＡＰレベルを有していた。ＥＣＭＯの過程では診断された急性神経学的損傷の診断はないが血漿ＧＦＡＰが９５パーセンタイルを上回った２例の患者は、ＥＣＭＯの過程を通じて連日の経泉門超音波検査が正常な乳児であった。しかし、それぞれＥＣＭＯカニューレ抜去後第２週および第６週に、１例の患者は過去の虚血事象と一致する片側単葉巣状脳軟化のあることが確認され、もう一方の患者は小さな陳旧性脳室内出血および実質内出血病巣の所見を有していた。探索的ではあるものの、本分析により、ＥＣＭＯ中の急性神経学的損傷について許容できる範囲の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積が得られる（０．７５、９５％Ｃ：０．５２〜０．９８）。
本実施例の結果より、ＧＦＡＰは、ＥＣＭＯ中の急性神経学的損傷に対する有用な診断手段、およびこの高リスク群における転帰予測因子として、重大な臨床的ギャップを埋めることも可能であることが示される。
（新生児の神経学的損傷のマーカーとしてのＧＦＡＰ）
低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）は２．５／１０００正期産出生児で発生する新生児脳卒中のサブセットである。残念なことに、分娩期胎児モニタリングおよび分娩後脳画像検査では、周産期脳損傷の乳児を迅速に特定することができない。重要なことに、生後６時間以内に頭部冷却を受けた中等度から重度のＨＩＥを有する新生児は生存率が改善すると共に神経発生的障害が低下することがある。ＨＩＥリスクの高い新生児を治療する治療法は開発されつつあるものの、リスクの高い小児において特定の脳損傷を迅速に特定するか、ＨＩＥ療法の有効性を追跡するか、または新規治療法を評価するバイオマーカーは知られていない。出生の時点で実施することのできる迅速検査は、これらの検査的処置から恩恵を得、治療効果を鑑別し、かつ早期に予後情報を提供することを目的としてＨＩＥリスクの高い乳児を特定する際に大きな臨床的恩恵となるであろう。過去１２ヶ月間に新生児集中治療室に入院した、染色体が正常かつ重大な先天的奇形のない予測的１０３例の予備分析を実施した。低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）、脳室周囲白質軟化、てんかん性発作、および頭蓋出血を含む神経学的損傷を有する新生児（ｎ＝２７）を、神経学的損傷のない新生児（ｎ＝７６）と比較した。これらの神経学的損傷を受けた新生児および損傷のない新生児は、妊娠期間（損傷乳児３３．７±５．７週、非損傷乳児３３．２±４．５週、ｐ＝０．６７）または出生体重（損傷乳児２２６４±１１２９ｇ、非損傷乳児１９６１±９６６ｇ、ｐ＝０．１８）に差がなかった。以下の表４を参照されたい。
神経学的損傷を有する新生児は生後１日目のＧＦＡＰレベルが有意に高かった（損傷乳児０．１７±０．１９ｎｇ／ｍＬ、非損傷乳児０．０９±０．１８ｎｇ／ｍＬ、ｐ＝０．０３）。表４および図８を参照されたい。この生後１日目のＧＦＡＰレベルの差は生後２日目まで続かず（損傷乳児０．１２±０．２１、非損傷乳児０．１５±０．６９、ｐ＝０．８６）、神経学的損傷が有限であって進行中でないことを反映している可能性があり、これは臨床家にとって非常に有用な情報である。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線（図９）を構築し、神経学的損傷を特定するための生後２４時間以内のＧＦＡＰレベルの至適カットオフ値を判定した。ＧＦＡＰレベル＞０．０８ｎｇ／ｍＬの新生児では、神経学的損傷の発生率は６６．７％であるのに対し、ＧＦＡＰレベルがこのカットオフ値未満の新生児では３６．０％であった。ＧＦＡＰレベル＞０．０８ｎｇ／ｍＬは、羊水混濁、５分後ＡＰＧＡＲ＜７、または代謝アシドーシス（ｐＨ＜７．０および過剰塩基＜−１２ｍＭ）を示す分娩時臍帯動脈ガスなどの子宮内低酸素性虚血の存在について一般的に用いられる他のマーカーよりも、新生児神経学的損傷を鑑別するＲＯＣ曲線下面積が高かった。たとえば、羊水混濁のＲＯＣ曲線を図９に示す。感度の高いＧＦＡＰ測定法と組み合わせれば、ＧＦＡＰは分娩時損傷の結果としての機能的および構造的神経学的損傷と相関させることができる。重要なことに、本実施例は分娩関連神経学的損傷の血中マーカーとしてＧＦＡＰを実証する。
（グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）は新生児神経学的損傷のバイオマーカーの役割を果たす）
ＧＦＡＰはヒト星状細胞の主要な中間フィラメントであり、かつ中枢神経系に対する特異的マーカーである。患者血清中におけるその出現は、外傷性脳損傷および脳卒中後の患者の神経学的転帰を予測することが確認されている。虚血後の脳浮腫は血液脳関門の欠損を引き起こし、またＧＦＡＰは虚血プロセスにおいて星状細胞内で著明にアップレギュレートされる。本実施例の目的は、生後２４時間以内に得られた血清ＧＦＡＰレベルを用いて神経学的損傷を有する新生児を特定できるか判定することであった。
新生児集中治療室に入院した先天的または染色体異常のない新生児について、高感度電気化学発光測定法を用いて、分娩時臍帯静脈血および生後１日の新生児血液中のＧＦＡＰレベルを測定した。ＧＦＡＰレベルが新生児神経学的損傷と相関するか判定するために、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を構築して生後１日目のＧＦＡＰレベルの至適カットオフポイントを判定し、頭蓋出血および低酸素性虚血性脳症を含んだ神経学的損傷の構成変数を特定した。
組み入れ基準を満たした６１例の新生児のうち１５例は、くも膜下出血１例、帽状腱膜下出血２例、脳室内出血６例および低酸素性虚血性脳症６例を含む神経学的損傷を有していた。神経学的損傷を有する新生児は、妊娠期間（損傷新生児３３．２±６．２週、非損傷新生児３３．５±３．４週）、出生体重（２３２６±１３７９ｇ、２０３１±９１８ｇ）または帝王切開の発生率（４１．２％、５４．５％）に有意な差がなかった。分娩時の臍帯血のＧＦＡＰレベルは損傷新生児０．１６±０．２３ｎｇ／ｍＬ、非損傷新生児０．０９±０．１１ｎｇ／ｍＬ、ｐ＝０．２６；また生後１日目は損傷新生児０．１２±０．０６ｎｇ／ｍＬ、非損傷新生児０．０９±０．１２ｎｇ／ｍＬ、ｐ＝０．４０であった。１７例の患者は、ＧＦＡＰレベルが、神経学的損傷の特定におけるＲＯＣ曲線下面積０．８１（ｐ＜０．００１）を有する至適カットオフ点０．０８ｎｇ／ｍＬよりも高くなった。神経損傷は、ＧＦＬＰレベルが正常である群（１０．０％）よりもＧＦＡＰ上昇群（６８．８％）の方が有意に多かった（ｐ＝０．０２）。図１０を参照されたい。
分娩時または新生児期の早期における単独または他の臨床マーカーと複合した血清ＧＦＡＰ上昇の所見のさらなる実証は、早期治療を行う患者の適切なトリアージ、およびこれらの高リスク乳児の治療的治験への組入れのために神経学的損傷リスクの高い乳児を特定するために役立ちうる。
（ＥＣＭＯ中の心疾患小児患者の神経学的損傷を検出するＧＦＡＰの能力）
心肺バイパス（ＣＰＢ）を受けた小児は、症例の３０〜７０％が神経学的損傷を経験する。McQuillen他、38 STROKE 736-41（2007）；およびMahle他、106 CIRCULATION I-109-I-114（2002）を参照されたい。体外膜型酸素供給（ＥＣＭＯ）は、同様の支援方式を代表し、症例の１０〜６０％で神経学的損傷のリスクを伴う。Cengiz他、33(12）CRIT. CARE MED. 2817-24（2005）；およびIbrahim他、69（1）ANN. THORAC. SURG. 186-92（2000）を参照されたい。脳特異的タンパク質であるグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）は、これらのＥＣＭＯ中の脆弱な患者において、神経学的損傷についての血漿バイオマーカーの役割を果たす可能性もあるという仮説が立てられる。
ＥＣＭＯ中の小児患者の予測的研究の一環として、危険な心疾患およびＥＣＭＯの病歴を有する患者のみを本評価に含めた。年齢などの人口統計学的情報、診断名、ＥＣＭＯの期間およびＰＩＣＵ退院時の転帰を記録した。当院で開発した電気発光測定法を用いて、ＥＣＭＯ過程における連続血液サンプルのＧＦＡＰを評価した。
危険な心疾患を有する小児７例を組み入れた。ＥＣＭＯサポートの期間の中央値は５．２日であった（範囲：１〜１２日）。ＣＰＢ後にＥＣＭＯを受けた２例の小児は、ＧＦＡＰレベルがＥＣＭＯのみを受けた他の小児と同様であった。急性神経学的損傷を経験した１例の患者は、ＧＦＡＰレベルが神経学的損傷のない患者よりも１００倍高く；血漿ＧＦＡＰの上昇は画像による神経学的損傷の検出と同時であった。各患者のＥＣＭＯ過程における血漿ＧＦＡＰレベルを以下の表５に示す。
略語：ｐｔ−患者、ＸＣ−遮断、Ｎｅｕｒｏ−神経学的、ＤＣＭ−拡張型心筋症、ｂｉｖａｄ−両心補助循環装置、ｍｉｎ−分、ＩＣＨ−頭蓋内出血、ＡＳ−大動脈弁狭窄、ＭＳ−僧帽弁狭窄、ＰＰＨＮ−新生児持続性肺高血圧、Ｄ−ＴＧＡ−大動脈右遷移、ＰＯＤ−術後日数、ＢＡＳ−バルーン心房中隔開口術、ＰＡ−肺動脈、ＴＯＦ−ファロー四徴症、ＲＶ−右心室、ＴＡ−総動脈幹症。
血漿ＧＦＡＰは、この一連の危険な心疾患を有するＥＣＭＯ中患者における神経学的損傷と相関すると見られる。これは、ＥＣＭＯ中およびＣＰＢ中の患者における神経学的損傷の検出の際に役立ちうる。
（ＧＦＡＰは先天性心疾患の修復を目的とした心肺バイパス中に上昇する）
脳卒中、脳ＭＲＩの異常、および神経発達欠損として顕在化する脳損傷は、先天性心疾患（ＣＨＤ）の外科的矯正後の乳児の３０％から７０％に発生する。Andropoulos他、139 J. THORAC. CARDIOVASC. SURG. 543-56（2010）；およびMcQuillen他、38 STROKE 736-41（2007）を参照されたい。１室または２室ＣＨＤの新生児期修復の研究（ｎ＝６２）では、患者の３９％が術前に損傷を有し（ほとんどが脳卒中）、また３５％が術後に新規病変を有すると報告した。McQuillen他、38 STROKE 736-41（2007）を参照されたい。本発明者らは、ＧＦＡＰが、先天性心疾患の外科的修復を目的とした心肺バイパス中の脳損傷の診断的／予後判定的バイオマーカーの役割を果たす可能性があるか検討している。心肺バイパス血清サンプルは、２０例の連続乳児症例（生後２日〜３ヶ月）より、先天性心疾患の外科的修復を目的とした心肺バイパスを受ける前、心肺バイパス中（３０分おき）、および心肺バイパス後に採取した。
図１１に示すように、定量可能なＧＦＡＰレベルを有する症例の数は、バイパスが進行するにつれてバイパス開始後１時間（Ｅａｒｌｙ Ｂｙｐａｓｓ）に上昇を開始し、バイパス終了時（Ｌａｔｅ Ｂｙｐａｓｓ）にピークに達する。バイパス前にはわずか１例のみでＧＦＡＰが定量可能レベルであったが、バイパス終了時には全２０例が測定可能値を有していた。図１２に示すように、ＧＦＡＰのレベルは、Ｍｉｄ、Ｌａｔｅ、Ｏｆｆ ｂｙｐａｓｓで有意に上昇する（バイパス前およびバイパス初期のレベルと比較してそれぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．００１およびｐ＜０．００１）。症例のうち４例における上昇度は、顕性脳卒中に見られるレベルと同等である（０．５〜２．５ｎｇ／ｍＬ）。これら４例の乳児のうち２例は術後に脳ＭＲＩを実施し、急性脳卒中を有していたことが確認された。図１３も参照されたい。
このデータは、乳児における脳損傷の高感度バイオマーカーとしてのＧＦＡＰにさらなるエビデンスを提供する。さらに、身体を１８℃に冷却しても血流中への有意なＧＦＡＰ放出は防止されないことも証明される。ＨＩＥのために冷却した新生児のように、ＧＦＡＰレベルは再加温するとピークに達し（バイパス後期）、再加温は損傷に対する脆弱性が高まる時であることが暗示される。
（体外膜型酸素供給を受けている小児の脳損傷バイオマーカーとしてのＧＦＡＰ）
本試験の目的は、小児において血漿グリア線維性酸性タンパク質が体外膜型酸素供給中の脳損傷および死亡と関連しているか判定することであった。２００８年４月から２００９年８月までに体外膜型酸素供給を必要とした生後１日から１８歳までの予測的患者を検討した。ジョンズ・ホプキンズ大学で開発した電気化学発光イムノアッセイを用いてグリア線維性酸性タンパク質を測定した。対照サンプルは、健康な小児９９例（０．５〜１６歳）および神経学的損傷のない新生児集中治療室乳児５９例から採取した。対照においては、グリア線維性酸性タンパク質濃度の中央値は０．０５５ｎｇ／ｍＬ（四分位数間範囲、０〜０．０９２ｎｇ／ｍＬ）であり、グリア線維性酸性タンパク質の９５パーセンタイルは０．４３６ｎｇ／ｍＬであった。体外膜型酸素供給中の患者において、カニューレ留置より６、１２時間後および２４時間毎に血漿グリア線維性酸性タンパク質を測定した。体外膜型酸素供給を受けた２２例の小児を組み入れた。年齢の中央値は生後７日であり（四分位間数範囲、生後２日から９歳）、また体外膜型酸素供給の主な適応症は：心不全、２２例中６例（２７．３％）；呼吸不全、２２例中１２例（５４．５％）；体外循環式心肺蘇生２２例中３例（１３．６％）；および敗血症、２２例中１例（４．６％）であった。２２例中７例（３２％）の患者は急性神経学的損傷（頭蓋内出血、脳死、または画像によって診断される脳浮腫）を発症した。２２例中１５例（６８％）は退院まで生存した。体外膜型酸素供給群では、ピークグリア線維性酸性タンパク質レベルは脳損傷を有する小児の方が脳損傷のない小児よりも高く（中央値５．９ｎｇ／ｍＬ対０．０９ｎｇ／ｍＬ、ｐ＜０．０４）、かつ非生存者の方が退院時生存者よりも高かった（５．９ｎｇ／ｍＬ対０．０９ｎｇ／ｍＬ、ｐ＝０．０１）。グリア線維性酸性タンパク質＞０．４３６ｎｇ／ｍＬの正常値に対する脳損傷オッズ比は１１．５であり（９５％信頼区間、１．３〜９８．３）、かつ死亡オッズ比は１３．６であった（９５％信頼区間、１．７〜１０８．５）。
体外膜型酸素供給中の高いグリア線維性酸性タンパク質は、急性脳損傷および死亡と有意に関連する。脳損傷バイオマーカーは、転帰を改善しかつ新規治療法の基準とすることを目的とした体外膜型酸素供給中の患者の転帰予測および神経学的モニタリングに有用となりうる。
（材料と方法）
（試験デザイン）
本研究は、２００８年４月から２００９年８月までに大学病院小児科センターである単独の三次診療施設の２６床小児集中治療室でＥＣＭＯを受けた小児を対象とした予測的観察的コホート研究であった。何らかの適応症によりＥＣＭＯを必要とした１８歳未満の患者が本研究の対象であった。このコホートは、この集団における脳損傷バイオマーカーを検討することを副次的な目的とした、ＥＣＭＯ中の神経学的損傷の凝血関連リスク因子の研究のために開始された。除外基準は、ヘパリン起因性血小板減少症の病歴およびＥＣＭＯ中の抗凝血を目的とした直接トロンビン阻害薬の使用歴であった。患者が安定した後のＥＣＭＯカニューレ留置より６時間以内に、両親または法律上の保護者が小児集中治療室にいる場合にのみ同意を申し入れた。電話で同意を取得することはなかった。組み入れた患者についてそれぞれ人口統計学的データ、臨床データ、臨床検査データ、画像検査データ、および生存データを収集した。ＥＣＭＯ回路は：シリコンレザバー付きカスタムパック１／４インチまたは３／８インチフレキシブル塩化ビニルチューブ（メドトロニック、ミネソタ州ミネアポリス）、ブラダーボックス（ジョンズ・ホプキンズ病院、メリーランド州ボルチモア）、０．８ｍ２から４．５ｍ２の膜式酸素供給装置（メドトロニック）、熱交換器（メドトロニック）、およびローラーポンプ（Ｓｏｒｉｎ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ＵＳＡ、コロラド州アルバダ）より構成された。本研究は、ジョンズ・ホプキンズ大学治験審査委員会により承認された。
（バイオマーカーのサンプリングおよび分析）
静脈血サンプル（クエン酸ナトリウム３．２％に５ｍＬ）をＥＭＣＯ開始後６、１２および２４時間、さらにその後ＥＭＣＯカテーテル抜去まで連日採取した。１時間以内に遠心分離した後、血小板量の低い血漿を−８０℃で保存した。ジョンズ・ホプキンズ大学でメソスケールディスカバリープラットフォーム（メソスケールディスカバリー、メリーランド州ゲーサーズバーグ）上で開発し、かつPetzold他、287 J. IMMUNOL. METHODS 169-77（2004）の測定法に基づく電気化学発光サンドイッチイムノアッセイを用いたＧＦＡＰ測定には、未希釈血漿サンプル５０μＬを２回ずつ用いた。捕捉抗体としてモノクローナル抗ＧＦＡＰブレンドＳＭＩ−２６（コ−バンス、ニュージャージー州プリンストン）各ウェル１００ｎｇを、メーカーによって、または実験室でリン酸緩衝化生理食塩水を用いて１晩インキュベートしてコーティングした標準的な結合プレート（メソスケールディスカバリー）において用いた。スルフォダグ（メソスケールディスカバリー）と直接コンジュゲートしたポリクローナル抗ＧＦＡＰ（ダコ、カリフォルニア州カーピンテリア）を、リン酸緩衝化生理食塩水中に１μｇ／Ｌで検出のために用いた。プレートはＳｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ２４００（メソスケールディスカバリー）で読み取った。標準曲線は、１％ウシ血清アルブミン溶液（ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州ミルフォード）中の精製ＧＦＡＰ（カルビオケム、カリフォルニア州ラ・ホーヤ）を用いて構築した。至適抗体濃度、プレートの種類、およびブロッキング材料を決定する実験の後、最終的なＧＦＡＰ値の測定法は線形定量範囲０．０４０〜４０．０ｎｇ／ｍＬの標準曲線を有した。本ＧＦＡＰ測定法は、２ＳＤがブランクウェルのバックグラウンドを上回ると定義される検出下限値が０．０１１ｎｇ／ｍＬであった（実験回数ｎ＝１９）。数値＜０．０４０ｎｇ／ｍＬはゼロとして報告した。０．０１ｎｇ／ｍＬにおける信号雑音比は１．１７であった（実験回数ｎ＝１９）。算出濃度±既知の濃度の２０％となる最小希釈度と定義される定量下限値は０．０４０ｎｇ／ｍＬであった（実験回数ｎ＝３）。日間再現性は１０ｎｇ／ｍＬにおいて２．４％であり、かつ０．１５６ｎｇ／ｍＬにおいては３．４％であった（実験回数ｎ＝２１）。ＧＦＡＰを１０ｎｇ／ｍＬで添加した血漿は、ウシ血清アルブミンにおいて生成した標準曲線と比較して４９．８％±２２．９％の回収率を示す。ＧＦＡＰ測定法の実証は、廃棄された正常および陽性対照診断検体を用いて実施した。このＧＦＡＰ測定法実証試験は、ジョンズ・ホプキンズ病院治験審査会で同意の放棄とともに別個の申請で承認された。
（転帰指標）
主要独立変数は、小児の正常値の９５パーセンタイルを上回る血漿ＧＦＡＰの上昇であった。主要転帰は、患者がＥＣＭＯサポートを受ける間に、小児神経科医が脳画像検査および／または神経学的検査によって診断する、脳死と一致する頭蓋内出血、脳梗塞または脳浮腫と定義される、ＥＣＭＯ中の急性神経学的損傷の発症であった。新生児および泉門が閉鎖していない乳児の頭部超音波検査を毎日実施するのは院内プロトコルであり；より年齢の高い小児は脳コンピュータ断層撮影または磁気共鳴画像検査を担当医の裁量で撮影した。全ての画像検査は、小児放射線科医が通常の診療の一環として審査した。副次転帰は神経学的転帰および退院時までの生存であった。神経学的転帰は、小児脳機能カテゴリー（ＰＣＰＣ）を用いて測定した。Fiser他、28 CRIT. CARE MED. 2616-20（2000）；およびFiser他、121 J. PEDIATR. 68-74（1992）を参照されたい。ＰＣＰＣは、小児集中治療における認知能力の変化を評価することを目的としてグラスゴー転帰スケールから開発された６点スケールである。ＰＣＰＣの６カテゴリーは、１）正常、年齢に対して適切な神経発達機能；２）軽度の脳障害、３）中等度の脳障害；４）重度の脳障害；５）昏睡または植物状態、および６）脳死である。Fiser他、28 CRIT. CARE MED. 2616-20（2000）；およびFiser他、121 J. PEDIATR. 68-74（1992）を参照されたい。熟練した小児クリティカルケア専門医が、入院時および退院時の患者の病状のチャートを審査することより、遡及的にＰＣＰＣを当てはめた。良好な神経学的転帰は、先験的に、退院時のＰＣＰＣが１または２であるか、または入院時のＰＣＰＣから変化しないと定義した。
（統計解析）
探索的記述データ解析を実施して患者特性およびＥＣＭＯ過程の特性を検討し、被験者におけるＧＦＡＰ値の分布を記述し、かつＧＦＡＰレベルが９５パーセンタイルを上回る被験者の割合を判定した。クラスカル・ワリス検定を用いて正常対照のＧＦＡＰ濃度を年齢カテゴリー間で比較した。患者は各転帰で２つのカテゴリー：急性神経学的損傷を有する者と損傷のない者、退院時の神経学的転帰が良好な者と不良な者、および退院時生存者と非生存者に分類した。マン・ホイットニーＵ検定を用いて、これらの群間でピークＧＦＡＰの中央値を比較した。フィッシャーの正確検定を用いて、群間でピークＧＦＡＰの９５パーセンタイルを上回る症例および下回る症例の百分率を比較した。患者別のクラスター化によるロジスティック回帰を用い、全連続ＧＦＡＰデータポイントを用いて脳損傷および死亡のオッズを概算した。クラスター化分析のために、被験者は画像検査による脳損傷まで急性神経学的損傷がないか、または初回の神経学的検査が脳死と一致するかでコード化した。その後の所見は、急性神経学的損傷を有するとしてコード化した。オッズ比（ＯＲ）および９５％信頼区間（ＣＩ）を提供する。ｐ値０．０５は有意と見なした。統計分析はＳＴＡＴＡ１０．１（ＳｔａｔａＣｏｒｐ、テキサス州カレッジステーション）を用いて実施した。
（結果）
（患者特性）
条件を満たす患者４６例のうち２２例を組み入れた；１８例の患者の両親は小児集中治療室にいなかったか、または６時間の同意取得期間内に同意について完全に話し合うことが不可能であり、５例の患者は同意を辞退し、１例の患者は試験に利用できるサンプルがなかった。評価した２２例の患者の人口統計学的および臨床的特性を図１４に示す。
個々の患者の特性および転帰を図１５に示す。２２例中７例（３１．８％）は、先験的定義に基づくＥＣＭＯ中の急性神経学的損傷を有した。初期および退院時ＰＣＰＣを用いたところ、患者２２例中１４例（６３．６％）は神経学的転帰が良好であり、かつ患者２２例中８例（３６．４％）は神経学的転帰が不良であり；１例はＰＣＰＣ＞２であり、７例は死亡した。死因は脳死（１例）、頭蓋内大出血（２例）、および不可逆的多臓器不全に際し医学的に無益であることから機械的サポートを中止（４例）であった。
ＥＣＭＯ期間の中央値は１２日であった（四分位数間範囲［ＩＱＲ］：５〜１７日）。患者別のＧＦＡＰ測定値の中央値は４．５であった（範囲１〜１６）。患者１７例は３回またはそれ以上の測定値を有し、３例は２回の測定値、および２例は１回のみの測定値を有していた。
（ＧＦＡＰの結果：対照）
既知の神経学的損傷のない正常小児対照において、ＧＦＡＰレベルは中央値が０．０５５ｎｇ／ｍＬ（ＩＱＲ、０〜０．０９２ｎｇ／ｍＬ）であった。ＧＦＡＰレベルは年齢カテゴリーにわたって同様であった（新生児：中央値０．０４１ｎｇ／ｍＬ［ＩＱＲ，０〜０．０９６ｎｇ／ｍＬ］、生後６ヶ月から４歳：中央値０．０４６ｎｇ／ｍＬ［ＩＱＲ、０〜０．１１７ｎｇ／ｍＬ］、５〜１６歳：中央値０．０５７ｎｇ／ｍＬ［ＩＱＲ、０〜０．０８８ｎｇ／ｍＬ］、ｐ＝０．７）。小児における正常値の９５パーセンタイルカットオフ値（血漿ＧＦＡＰ≦０．４３６ｎｇ／ｍＬ）は、乳児および小児１５８例のサンプル：既知の遺伝的障害または頭蓋内病変のない新生児集中治療室内の生後＜４日の新生児５９例、および健康小児検診のためにジョンズ・ホプキンズ病院小児科外来を受診した生後６ヶ月から１６歳の健康小児９９例を用いて決定した。当該測定法は、脳腫瘍切除（ｎ＝１３）、脳生検（ｎ＝３）、および脳卒中の患者（ｎ＝１２）における神経学的損傷の検出についてさらに実証した。陽性対照サンプル中のＧＦＡＰレベルは、全般的に正常対照よりも１から５５倍高かった。
（ＧＦＡＰの結果：ＥＣＭＯ患者）
ＥＭＣＯ開始より１２時間以内の初期ＧＦＡＰレベルの中央値は０．０７ｎｇ／ｍＬ（ＩＱＲ、０〜０．１５５ｎｇ／ｍｌ）であった。カニューレ留置より２４時間の間にＧＦＡＰ濃度が異常であった患者が２２例中３例あり；２例は心停止が持続して右頸部血管の静動脈カニューレ留置によるＥＣＰＲを受けた患者であり、かつ１例はダブルルーメン右頸静脈カニューレ留置により静静脈ＥＣＭＯに置かれた既知の神経学的損傷のない患者であった。２２例のうち他の１９例は、カニューレ留置より２４時間のＧＦＡＰレベルが低かった。サンプルが３件またはそれ以上である小児のＥＣＭＯ最終日のＧＦＡＰレベルの中央値は０．０７ｎｇ／ｍＬであった（ＩＱＲ、０．０５３〜０．７９５ｎｇ／ｍＬ；ｎ＝１７）。新生児と小児および生後＞３０日の乳児のピークＧＦＡＰ濃度を比較したところ同様であった（それぞれ０．１５５ｎｇ／ｍＬと０．１６２ｎｇ／ｍＬ、ｐ＝０．４８）。
ピークＧＦＡＰレベルの中央値は、ＥＣＭＯの過程で急性神経学的損傷と診断された小児の方が損傷のない小児よりも（５．９対０．０９ｎｇ／ｍＬ、ｐ＝０．０４）（図１６）、神経学的転帰が不良の小児は良好な小児に対して（３．６ｎｇ／ｍＬ対０．０９ｎｇ／ｍＬ、ｐ＝０．０１）、さらに非生存者は退院時生存者と比較して（５．９ｎｇ／ｍＬ対０．０９ｎｇ／ｍＬ、ｐ＝０．０４）有意に高かった。急性神経学的損傷を有する患者および損傷のない患者の連続ＧＦＡＰ濃度を図１７に示す。
正常対照の９５パーセンタイルを上回るピーク血漿ＧＦＡＰ濃度（すなわち＞０．４３６ｎｇ／ｍＬ）は、２２例中６例（２７．３％）に認められた。急性神経学的損傷を有する患者の割合は、ピークＧＦＡＰ＞０．４３６ｎｇ／ｍＬの患者の方がピークＧＦＡＰ≦０．４３６ｎｇ／ｍＬの患者よりも高かった（６例中４例［６６．７％］対１６例中３例［１８．８％］；ｐ＝０．０５４）。神経学的予後不良は、ピークＧＦＡＰ＞０．４３６ｎｇ／ｍＬの患者の方が正常ＧＦＡＰ値を有する患者よりも頻繁に見られた（６例中５例［８３．３％］対１６例中３例［１８．８％］；ｐ＝０．０１）。同様に、院内死亡率はピークＧＦＡＰ＞０．４３６ｎｇ／ｍＬの患者の方が正常ＧＦＡＰ値を有する患者よりも高かった（６例中４例［６６．７％］対１６例中３例［１８．８％］；ｐ＝０．０５４）。
患者毎の反復測定値を説明するため、患者別にクラスター化したロジスティック回帰を用いて１２６連続ＧＦＡＰレベル全てと転帰との関連を評価した。ＧＦＡＰが上昇した場合（＞０．４３６ｎｇ／ｍＬ）の急性神経学的損傷のオッズは１１．５であった（９５％ＣＬ、１．３〜９８．３）。同様に統計学的に有意な結果は、神経学的予後不良（ＯＲ、２５．７；９５％ＣＩ、２．２〜２９８．５）および院内死亡率（ＯＲ、１３．６；９５％ＣＩ、１．７〜１０８．５）でも認められた。
新生児状態（≦３０日）について調節すると、血漿ＧＦＡＰが異常上昇した患者における急性神経学的損傷のオッズは、正常ＧＦＡＰ患者と比較して有意に高いままであった（調節済みＯＲ、１５．７；９５％ＣＩ、１．８〜１３９．９）。ＥＣＭＯ期間中に頭部超音波検査を連日実施した新生児および乳児１７例のサブグループにおいては、急性神経学的損傷の非調節ＯＲは２２．３であった（９５％ＣＩ、２．０〜２４５．９）。
探索的ではあるものの、この分析により急性神経学的損傷（受信者動作特性曲線下面積、０．７２；９５％ＣＩ、０．５０〜０．９４）、神経学的転帰不良（受信者動作特性曲線下面積、０．７８；９５％ＣＩ、０．５８〜０．９７）、および死亡（受信者動作特性曲線下面積、０．７２；９５％ＣＩ、０．５０〜０．９４）について許容できる範囲の受信者動作特性曲線下面積が得られる。
ＧＦＡＰの上昇は、ＥＭＣＯ中の脳損傷の画像診断と時間的に相関した。患者４例中２例において、異常なＧＦＡＰレベル（＞０．４３６ｎｇ／ｍＬ）が、重度の急性神経学的損傷の画像診断または脳死より１〜２日前に認められた。小さな硬膜下血腫がありかつ退院時の神経学的機能が良好な（ＰＣＰＣ＝１）患者１例、グレードＩ脳室内出血がありかつ退院時の神経学的機能が良好な患者１例（ＰＣＰＣ＝１）、および多臓器不全を発症して最終的に死亡した小さな右小脳出血の患者１例を含む、ＥＣＭＯ中に頭部超音波検査で急性神経学的損傷と診断された３例の患者においては、ＧＦＡＰレベルは正常のままであった（図１７）。前者２例の患者では病変が小さくかつ位置が実質外であったためにＧＦＡＰの上昇が認められなかったと推測されるが、３例目の患者における小脳実質内出血に対するＧＦＡＰ「反応」の不在には良い説明が存在しない。注意すべき点は、この後者の患者の死因は神経学的損傷とは関係せず、むしろ多臓器不全および医学的に無益であることによる生命維持の中止と関係していたことであった。
ＥＣＭＯ中には急性神経学的損傷の診断がなかったが、それぞれＥＣＭＯ第１日目および１０日目にピークＧＦＡＰが９５パーセンタイルを上回った患者が２例あった（図１７）。これらはＥＣＭＯの過程を通じて連日頭部超音波検査が正常である新生児であった。しかし、それぞれＥＣＭＯカニューレ抜去後第６週および第２週に、１例の患者は小さな陳旧性脳室内出血および実質内出血病巣があることが確認され、またもう一方は脳磁気共鳴画像検査で過去の虚血事象と一致する片側単葉巣状脳軟化の所見があった。
このＥＣＭＯ患者の初期コホートは、ＥＣＰＲを受けた患者３例を含んだ；１例は良好な神経学的転帰で生存しかつＥＣＭＯの過程を通じてＧＦＡＰレベルが正常であり（ＧＦＡＰ中央値：０．０７ｎｇ／ｍＬ、ＩＱＲ：０．０５〜０．０９ｎｇ／ｍＬ）；２例の患者は転帰が不良で：１例は喘息重責発作の結果として低酸素性電気機械解離心停止が持続し、かつ脳死に進展し（ＧＦＡＰ中央値：２７．２ｎｇ／ｍＬ、ＩＱＲ：９．５〜４４．９ｎｇ／ｍＬ）、また１例の患者は重度の脳浮腫を発症し、ＥＣＭＯカニューレは問題なく抜去したが、最終的には多臓器不全および医学的無益のため生命維持を取り外した（ＧＦＡＰ中央値：５．８ｎｇ／ｍＬ、ＩＱＲ：２．８〜１０．５ｎｇ／ｍＬ）。
（考察）
ＥＣＭＯは、頭蓋内出血、脳梗塞および脳死を含む脳損傷のリスクの高い手技である。Cengiz他33 CRIT. CARE MED. 2817-24（2005）；Conrad他、51 ASAIO J. 4-10（2004）；およびCilley他、78 PEDIATRICS 699-704（1986）。ＥＣＭＯ中の患者に対するそのような損傷の適時評価のための手段を欠くことが多い。急性の神経学的発作は危険な病状の患者においては大きな懸念であるが、多くの共同作業が進行中ではあるものの通常の臨床診療で利用できる脳損傷バイオマーカーはまだない。Kaneko他、80 RESUSCITATION 790-94（2009）；およびLaskowitz et al., 40 STROKE 77-85（2009）を参照されたい。本研究で用いられる血漿ＧＦＡＰバイオマーカーは、脳に対する高い特異性、血液が小体積であることによるサンプル採取の容易さ、高速度処理、高精度定量、低コスト、および測定法に必要とされる技術的専門性が最小限であることなど、多くの利点を有する。したがって、連続ＧＦＡＰ測定は神経学的状態および潜在的な神経保護的介入に対する反応をモニタリングし、急性脳損傷の迅速な診断を補助し、さらに転帰を予測するために用いることも可能である。
本研究は、ＧＦＡＰの血漿濃度がＥＣＭＯ中の小児の脳損傷と関連することを証明する。連続ＧＦＡＰ濃度は神経学的発作の不在下で経時的に安定に見え、かつＥＭＣＯ中に脳損傷と診断された患者では有意に上昇した。大多数の患者（２２例中１９例）はＥＣＭＯカニューレ留置後２４時間のＧＰＡＰレベルが正常であり、右頸静脈±右頸動脈へのカニューレ留置は反応性神経膠症およびＧＦＡＰ上昇につながる損傷を伴わないことを示唆した。４例の患者で脳損傷の診断前にＧＦＡＰ濃度が上昇し；２例はＥＣＭＯ中に急性神経学的損傷と診断され、また２例はＥＭＣＯカニューレ抜去後に過去の脳梗塞または出血の画像エビデンスがあった。これは、経泉門超音波検査によって検出することができないために臨床家に誤って異常がないという情報を提供する、実質内病変を有する乳児にとっては特に重要となりうる。
急性神経学的損傷は、他の適応症のためＥＣＭＯを受ける患者と比較して、ＥＣＰＲを受ける患者でより頻繁に認められる。Barrett他、10 PEDIATR. CRIT. CARE MED. 445-51（2009）；およびConrad他、51 ASAIO J. 4-10（2004）を参照されたい。最近の研究では、ＥＣＰＲを受けて退院時まで生存した小児患者は７３％であり、生存者の７５〜７８％は神経学的転帰が良好であると報告される。Barrett他、10 PEDIATR. CRIT. CARE MED. 445-51（2009）；およびProdhan他、80 RESUSCITATION 1124-29（2009）を参照されたい。急性神経学的損傷はＥＣＰＲを受ける小児患者の２２％に発生し；これらのうち８９％は退院前に死亡する。Barrett他、10 PEDIATR. CRIT. CARE MED. 445-51（2009）。本研究では、ＥＣＰＲを受け、生存して神経学的転帰が良好な１例の患者で正常連続ＧＦＡＰレベルが認められた。対照的に、ＥＣＰＲを受けた後に重度の低酸素性脳損傷を発症した２例の小児は、血漿ＧＦＡＰレベルが正常小児の９５パーセンタイルより２０〜１００倍高かった。本発明者らが知る限りでは、これはＥＣＰＲの潜在的予測的バイオマーカーとしてのＧＦＡＰの初の報告であり；心停止後ＧＦＡＰの先行研究２件はＥＣＰＲを受けた患者を除外していた。Hayashida他、12(2）NEUROCRIT. CARE 252-57（2010）；およびKaneko他80 RESUSCITATION 790-94（2009）を参照されたい。しかし、これらのデータは非常に予備的であり、現時点ではこれ以上の推測はできない。
（全身冷却で治療された新生児低酸素性虚血性脳症のバイオマーカーとしてのＧＦＡＰ）
（被験者）
これは、治験審査委員会の承認を受け、単独の三次診療大学病院の新生児集中治療室（ＮＩＣＵ）に入院した新生児を検討した予測的コホート研究である。被験者は妊娠第３６〜４１週に出生した生存出生、非奇形、無症候乳児であった。本研究はジョンズ・ホプキンズ病院で出生した新生児、さらにはメリーランド州内で出生して生後６時間以内にＮＩＣＵに搬送された新生児を含んだ。
記録を審査して、母親および新生児の退院時点で入手可能であった臨床的情報を抽出した。子癇前症はタンパク尿および新規発症高血圧と定義した。分娩前の母親に対する硫酸マグネシウム静脈内投与は新生児脳損傷のリスク低下と関連付けられているので、この治療法を記録した。Rouse他、359 N. ENGL. J. MED. 895-905（2008）。子宮内胎児発育遅延は、推定胎児体重が妊娠期間についての１０パーセンタイルを下回ると定義した。Hadlock他、181 RADIOLOGY 129-33（1991）。胎児心拍数モニタリング異常は、手術的経膣分娩または帝王切開を促すほど重大な心拍数モニタリングであった。敗血症は、血液および／または脳脊髄液培養が陽性の新生児についてのみ存在すると見なした。
全身冷却の基準を満たす中等度から重度の脳症を有する新生児を、ＮＩＣＵに入院し、１週間以内に妊娠期間で１：１のマッチングを行った神経学的損傷のない新生児と比較した。Shankaran他、353 N. ENGL. J. MED. 1574-84（2005）；およびSarnat他、33 ARCH. NERUOL. 696-705（1976）。条件を満たした妊娠３６週またはそれ以上の新生児は、生後６時間以内に伝導水冷低体温システムおよび低体温ブランケットを用いて冷却し、直腸温度３３．５℃で７２時間維持する。
全身冷却で治療されたＨＩＥ新生児は、全てＮＩＣＵから退院する前に常用的に標準的新生児脳ＭＲＩ画像診断を受ける。本試験については、これらの画像はＧＦＡＰ結果について盲検化されている熟練した小児神経科医（Ｔ．Ａ．Ｇ．Ｍ．Ｈ．）によって審査された。
脳ＭＲＩが異常な新生児をその脳ＭＲＩが正常な新生児と比較した。低酸素性虚血性損傷と関連する巣状またはびまん性病変について画像を審査した。ＭＲＩ脳異常は、脳腫脹；皮質輝度上昇；巣状または全脳的灰白質−白質識別の消失；基底核および視床における信号強度異常；内包後脚の正常信号強度の消失；急性および亜急性実質、脳室内または脳外出血；および動脈領域内または傍矢状または分水界分布する急性進展性巣状梗塞と定義した。Cowan他、361 LANCET 736-42（2003）を参照されたい。
（検体）
ＧＦＡＰ測定用に採取した検体は臍帯血および新生児血清を含んだ。臍帯血については、分娩時に常用的に採取する臍帯静脈血サンプルより少量を分取した。新生児サンプルについては、臨床適応の検査が終了した後に連日の臨床検査から残りの血清分画を採取した。新生児血清検体は、ＮＩＣＵ入院時（生後６時間以内）、およびその後非神経学的損傷対照は生後連日４日間、また全身冷却を受けたＨＩＥ新生児は連日７日間採取した。
（ＧＦＡＰ測定）
メソスケールプラットフォーム（メソスケールディスカバリー、メリーランド州ゲッサーズバーグ）を用いて、ＧＦＡＰ用に電気化学発光サンドイッチイムノアッセイを開発した。Pelinka他、57 J. TRAUMA 1006-12（2004）を参照されたい。これは、３種類の捕捉用マウスモノクローナル抗体および検出用のウサギポリクローナル抗体を用いるPetzold他の方法の後に開発された。Bembea他、11 PEDIATR. CRIT. CARE MED. 723-30（2010）；およびPetzold他、287 J. IMMUNOL. METHODS 169-77（2004）を参照されたい。血清サンプルは２回測定し、平均濃度を分析に用いた。定量下限値は０．０４ｎｇ／ｍＬであり；これ以下の数値は０と報告した。
（統計解析）
カテゴリー変数にはχ２検定またはフィッシャーの正確検定、および連続変数には対応のないスチューデントのｔ−検定を用いて比較した。ノンパラメトリックデータのためのウィルコクソン順位和検定を用いてＧＦＡＰレベルを比較した。有意性はｐ＜０．０５に設定した。線形回帰を用いて、非神経学的損傷対照集団のＧＦＡＰレベルに対する妊娠期間の影響を判定した。
受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を構築して、ＮＩＣＵ入院時の血清ＧＦＡＰレベルの至適カットオフ値（最大曲線下面積により判定）を判定して、全身冷却に適したＨＩＥを特定すると共にＭＲＩ上に脳の異常がある新生児を特定した。ＲＯＣ曲線下面積を用いて、入院時ＧＦＡＰがＭＲＩスキャン上に異常のある新生児を特定する能力を、現在これらの乳児の特定に使用されている他の検査：胎児心拍数モニタリング異常、羊水混濁、５分後Ａｐｇａｒ＜７、および臍帯動脈ｐＨ＜７．０または１２ｍＭを上回る塩基欠乏と比較した。統計分析はＳｔａｔａ ｖ１０（ＳｔａｔａＣｏｒｐ、テキサス州カレッジステーション）を用いて実施した。
（結果）
（被験集団および臨床的特性）
２００９年４月２８日から２０１０年７月１１日までの期間中、ＮＩＣＵに６５２例の入院があり、このうち連続２３例の新生児が全身冷却に適した中等度／重度の臨床的ＨＩＥと診断された。これら２３例の新生児は、生後１週間以内に、非神経学的適応症でＮＩＣＵに入院した新生児と妊娠期間により１：１でマッチングした。冷却を受けた新生児の平均（ＳＤ）妊娠期間は３８．７（１．５）週であり、対照は３９（１．４）週であった。
母親と新生児の特性を図１８に要約する。母親の人口統計学および帝王切開発生率に違いはなかった。対照の入院の理由として最も可能性の高いのは呼吸困難および敗血症を除外することであった。被験者は出生時体重が２９１ｇ軽く、これは統計的に有意であるが臨床的には有意でなく、かつ胎盤剥離、代謝性アシドーシス、５分後Ａｐｇａｒ＜７を有する可能性が有意に高く、かつＮＩＣＵ入院期間が長かった。
（ＨＩＥバイオマーカーとしてのＧＦＡＰ）
血清量が不足、その日に採血を実施していない、または外部の病院で分娩したため臍帯血を採取していないために、対照については所望の１３８測定時のうち５４測定時（３９．１％）、冷却を受けた被験者については２０７測定時中５０測定時（２４．２％）でＧＦＡＰレベルを測定することができなかった。全身冷却で治療された臨床的に中等度から重度のＨＩＥ新生児を対照と比較したところ、生後６時間以内のＮＩＣＵ入院時および生後１，３，および４日の新生児の血清中の平均ＧＦＡＰレベルは、それぞれｐ＝０．０３２、ｐ＝０．０１３、ｐ＝０．０１３、およびｐ＝０．００３で有意に上昇した。図１９を参照されたい。
血清ＧＦＡＰの持続性はＨＩＥ群の方がはるかに大きく、生後１から４日の血清中ＧＦＡＰが定量可能であった新生児は対照２３例中６例（２６％）およびＨＩＥ新生児２３例中１７例（７４％）であった（ｐ＝０．００１）。対照新生児のＮＩＣＵ入院時のＧＦＡＰレベルは妊娠期間によって有意に変化しなかった（ｒ＝０．２２、ｐ＝０．２２）。対照の分娩時から生後４日までのＧＦＡＰ値を合わせると、中央値は０ｎｇ／ｍＬでありかつ９５パーセンタイルは０．２０ｎｇ／ｍＬであることが示された。対照ではいずれもＧＦＡＰ値が９５パーセンタイルを上回らなかったのに対し、冷却を受けた新生児は２３例中１０例（４３．４％）が上回った（ｐ＜０．００１）。冷却を受けた被験者２３例中４例（１７．４％）は７２時間の冷却療法を完了した翌日にＧＦＡＰが突然上昇した。図１９を参照されたい。
全身冷却による治療を要する中等度から重度のＨＩＥについてのスクリーニング検査としてＮＩＣＵ入院時のＧＦＡＰレベルを検査するために、ＧＦＡＰレベルの様々な閾値についてのＲＯＣ曲線を生成した。０．０８ｎｇ／ｍＬまたはそれ以上のＮＩＣＵ入院時ＧＦＡＰは、群間識別するための至適カットオフ値であり、ＲＯＣ曲線下面積０．７０９を生成した。
（ＧＦＡＰと、ＭＲＩ脳損傷エビデンスおよび退院時の機能的転帰の相関）
全身冷却を受けた２３例の新生児は、いずれもそのＮＩＣＵ入院中に臨床的脳ＭＲＩ検査を受けた。分娩後にこれらのＭＲＩスキャンを実施した時期に差はなく、異常ＭＲＩ群では平均（ＳＤ）が生後７．４（３．７）日であり、また正常ＭＲＩ群では生後７．４（３．９）日であった（ｐ＝０．４９）。ＨＩＥを示唆する所見は２３例中８例の脳ＭＲＩスキャンに見られた（３５％）。異常脳ＭＲＩ新生児は胎盤剥離後に娩出された可能性の方が有意に高いものの、ＨＩＥの臨床マーカーはいずれもＭＲＩの異常と関連しなかった。図２０を参照されたい。
血清ＧＦＡＰレベルは、脳ＭＲＩスキャンが異常であった全身冷却で治療された新生児において一定して高かった。図２１を参照されたい。これらの比較は、生後１〜２日および４〜７日で統計的に有意であり、それぞれｐ＝０．０２、ｐ＝０．００７、ｐ＝０．００１、ｐ＝０．００１およびｐ＝０．００７であった。ＭＲＩ異常のあった８例の新生児のうち４例では（５０％）、冷却終了の翌日にＧＦＡＰレベルの有意な上昇が認められた。
ＲＯＣ分析を用いると、全ての全身冷却を受けた新生児のうち脳ＭＲＩスキャンに異常のある新生児を特定するための至適カットオフ値は、０．１５ｎｇ／ｍＬまたはそれ以上のＮＩＣＵ入院時ＧＦＡＰである（ＲＯＣ曲線下面積０．７１８）。これは、胎児心拍数モニタリング異常（ＲＯＣ曲線下面積０．６１３）、羊水混濁（０．５０８）、５分後Ａｐｇａｒ＜７（０．５００）、および臍帯動脈ｐＨ＜７．０または１２ｍＭを上回る塩基欠乏（０．５００）などの、分娩時ＨＩＥを特定するために現在用いられている指標よりも優れていた。
ＧＦＡＰレベルを機能的転帰と関連付けるために、経口摂取までの時間を用いた。図２２を参照されたい。全身冷却を受けたＭＲＩが正常な新生児１５例については、完全経口摂取までの時間は平均（ＳＤ）で９．１（５．４）日であった。ＭＲＩスキャンが異常であった新生児８例については、１例が生後７日で死亡し、５例が平均（ＳＤ）で生後１１４（８１）日に胃管を必要とし、２例は平均（ＳＤ）生後１７（９）日で完全経口摂取した。ＮＩＣＵ入院時の血清ＧＦＡＰレベルは、死亡した乳児は０．６１ｎｇ／ｍＬ、胃管補助を受けた状態で退院した新生児は平均（ＳＤ）で０．２６（０．１０）ｎｇ／ｍＬ（いずれも非神経学的損傷新生児のＧＦＡＰレベルの９５パーセンタイルを上回った）、さらに完全経口摂食状態で退院した新生児は平均（ＳＤ）で０．０４（０．０６）ｎｇ／ｍＬであった（ｐ＝０．０３）。
中等度から重度のＨＩＥにより冷却治療された全ての乳児では、ＮＩＣＵ入院時の血清ＧＦＡＰレベルの異常脳ＭＲＩの予測におけるＲＯＣ曲線下面積は０．７３であり、敏感度は５０．０％、特異度は８４．６％、陽性的中度は６０．０％、さらに陰性的中度は７８．６であった。
（考察）
本実施例は、中等度から重度の臨床的ＨＩＥ、脳損傷のＭＲＩエビデンスの発生、および機能的転帰と相関する血清バイオマーカーとしての脳特異性タンパク質ＧＦＡＰの初の使用を記載する。ＨＩＥは１０００正期産出生児につき２．５例発生し、脳性麻痺症例全体のうち１４．５％は分娩時低酸素性虚血と関連するものの、これらの損傷の時期、持続期間および転帰については十分に定義されていない。Graham他、199 AM. J. OBSTET. GYNECOL. 587-95（2008）を参照されたい。
バイオマーカーは疾患損傷、進展および転帰の代用の役割を果たす。ＨＩＥを厳密に定義した新生児に関する公表文献（３６週間以上）１１０件の体系的総説の著者は、バイオマーカーがない場合は治療法の時期、期間および有効性は比較的場当たり的に確認されると結論づけた。Ramaswamy他、40 PEDIATR. NEUROL. 215-26（2009）；および米国産科婦人科学会、米国小児科学会、第８章を参照されたい。基準は、脳性麻痺を引き起こすのに十分な急性分娩時低酸素事象を定義することを必要とした。『新生児脳症と脳性麻痺』Washington, DC: ACOG; 2003:73-80に記載。彼らは、予測的研究では介入によって利益を受ける新生児を最もよく特定するのはどのバイオマーカーであるか判定することに重点を置くべきであるとも結論づけた。
１件の研究では脳脊髄液ＧＦＡＰレベルを測定し、さらにそれらが新生児死亡のみを予測するものの、生存者の異常転帰は予測しないことを確認したが；しかしながら血中ＧＦＡＰレベルは探索しなかった。Blennow他、90 ACTA. PAEDIATR. 1171-75（2001）。本研究においては、ＧＦＡＰの新規高感度測定法を用いて、ＧＦＡＰがＨＩＥの初期バイオマーカーであることを確認した。本研究の対照群は正常新生児を含まなかったが、一般的なＮＩＣＵ非未熟児疾患新生児集団を代表しており；したがって、ＨＩＥの診断バイオマーカーとしてのＧＦＡＰに関する結論は保守的であり、かつ他の器官系の不全と潜在的に交絡する状況での新生児脳損傷に対するＧＦＡＰの特異度を強調しうる。
ＨＩＥを検出するために数種類の血液、脳脊髄液および尿中の生後バイオマーカーが検討されているが、大半は限界がある。尿中乳酸／クレアチニン比は専用の核磁気共鳴技術を必要とし（Oh他、153 J. PEDIATR. 375-8（2008））、脳脊髄液は連続サンプル採取になじまず（Ramaswamy他、40 PEDIATR. NEUROL. 215-26（2009）；およびBlennow他、90 ACTA. PAEDIATR. 1171-75（2001））、また他のタンパク質バイオマーカー（例：ニューロン特異性エノラーゼおよびＳ１００Ｂ）は組織特異性に限界がある。Ramaswamy他、40 PEDIATR. NEUROL. 215-26（2009）を参照されたい。
低酸素性虚血性脳損傷直後の軽度の低体温は、脳のエネルギー代謝を保持し、細胞毒性浮腫を低下させ、かつ組織学的および機能的転帰を改善する。Thoresen他、5 SEMIN. NEONATOL. 61-73（2000）。選択的頭部冷却または全身冷却で治療された正期産ＨＩＥ乳児の研究では（Inder他、145 J. PEDIATR. 835-7（2004））、いずれの様式も異常転帰を予測する基底核および視床病変の低下と関連することが確認され、また選択的な頭部冷却により重度の皮質病変の減少が見られた。Rutherford他、116 PEDIATRICS 1001-6（2005）を参照されたい。
臨床的ＨＩＥ乳児における冷却は死亡および神経学的障害の減少と関連しているものの（Edwards他、340 BMJ c363（2010））、提供している間に有効性をモニタリングする手段がないので、画一的な治療法として使用される。低体温療法は、小児における重度の外傷性脳損傷後に血清ＧＦＡＰレベルを変化させないことが示されている。Fraser他、12 PEDIATR. CRIT. CARE MED. 319-24（2011）を参照されたい。
上述のように、冷却中の血清ＧＦＡＰの上昇はＭＲＩによる脳損傷のエビデンスと有意に関連する。冷却中のＧＦＡＰレベルをモニタリングできることにより、エリスロポエチン（Kim他、23 J. KOREAN MED. SCI. 484-91（2008））、抗てんかん薬（Glass他、9 CURR. TREAT. OPTIONS NEUROL. 414-23（2007）、およびキセノンなどの他の治療法を加えた冷却による治療法の強化に向けた新生児のトリアージが可能となる。Hobbs他、39 STROKE 1307-13（2008）を参照されたい。本研究のＭＲＩ上で脳損傷のある新生児の５０％は、７２時間冷却プロトコル完了後にＧＦＡＰレベルの著明な上昇があった。またこれらの新生児のみで冷却中の連日測定ＧＦＡＰレベルが上昇しているため、このパターンによって異常ＭＲＩを１００％予測できた。冷却後のこの上昇は、冷却によって抑制されていた脳損傷の持続によって発生した可能性、または再加温損傷のエビデンスである可能性がある。
７２時間冷却期間終了時に見られるＧＦＡＰレベルの劇的な上昇は、至適期間はどれだけであるかという点で疑問も投げかける。この点では、治療成功の代用的マーカーはなく、また新規治療法が開発されると共にこれを比較する基準はない。ＧＦＡＰのような血中脳タンパク質バイオマーカーがこのギャップを埋める可能性がある。
画像検査の使用によって脳損傷における診断の正確度は大きく改善しているものの、これらの検査は低酸素性虚血性損傷後の初期数時間に限定されており、かつ危険な病状の新生児に実施することは困難である。結果として、脳損傷の迅速血液検査がきわめて貴重となる状況がある。
ＭＲＩはＨＩＥ新生児の評価に用いられる最も一般的な臨床的検査法であり、転帰と関連している。Barnett他、33 NEUROPEDIATRICS 242-8（2002）。本実施例より、ＮＩＵＣ入院時および冷却中のＧＦＡＰレベルは異常ＭＲＩを予測することを証明する。
要約すると、ＧＦＡＰは冷却療法を受けている臨床的ＨＩＥ新生児を特定およびモニタリングするバイオマーカーの役割を果たしうる。ＨＩＥによる脳の異常を有する新生児を特定するその予測能力は、現在使用されている臨床的指標よりも優れている。本研究の結果によれば、ＧＦＡＰは、分娩時の脳損傷をより特異的にかつ高感度で診断し、補助療法を加えた低体温療法によるＨＩＥ治療プロトコルに向けての乳児のトリアージを促進し、進展性ＨＩＥの治療法の基準となる中間的転帰の役割を果たし、かつこれらの高リスク小児の両親に予後情報を与えるために使用することも可能である。
（鎌状赤血球症小児の非症候性脳損傷の血漿バイオマーカーとしてのトロンボスポンジン−１およびＬ−セレクチンのプロテオミクス同定）
脳損傷のバイオマーカーには、経頭蓋ドップラーに例示されるように、鎌状赤血球症の診療を変換させる能力がある。鎌状赤血球症（ＳＣＤ）患者から採取した血漿のバイアスのないプロテオミクススクリーンによって、無症候性脳損傷のバイオマーカーが得られるであろうという仮説が立てられた。１２種類の最も含有量の高いタンパク質を血漿から除去処理した後、サイレント梗塞輸血（ＳＩＴ）治験の一環として採取した血漿の質量分析スクリーンにより、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）および可溶性Ｌ−セレクチン（ＳＥＬＬ）が得られた。市販のＥＬＩＳＡを用いたところ、ＴＳＰ−１およびＳＥＬＬは正常年齢マッチング対照（ｎ＝２３）とＳＣＤ患者（ｎ＝１２３）間で差がなかった。しかし、ＳＩＴ治験にスクリーニングされた５〜１４歳のＳＣＤ被験者の無作為サンプリングＳＣＩ患者（ｎ＝６２）および非ＳＣＩ患者（ｎ＝５１）は、ＴＳＰ−１およびＳＥＬＬが有意に上昇することを示した（それぞれｐ＝０．０１３およびｐ＝０．０２１）。これらのデータより、鎌状赤血球症における脳損傷の実験的バイオマーカー探索手法が実証され、かつＳＣＩの血流バイオマーカーが始めて記載される。
（序論）
鎌状赤血球症（ＳＣＤ）は、多臓器損傷を特徴とする慢性溶血性貧血である。脳卒中は、ＳＣＤにおいて脳に対して最も顕著に発生しうる損傷である。経頭蓋ドップラー速度が上昇した患者を特定しかつ長期的な赤血球輸血を実施することにより、小児の脳卒中リスクは有意に低下している。King他、50 PEDIATR. BLOOD CANCER 599-602（2008）；およびAdams 他、339 N. ENGL. J. MED. 5-11（1998）を参照されたい。ＭＲＩ上でサイレント脳梗塞（ＳＣＩ）の存在により確認される脳損傷のリスクが長期的赤血球輸血によって軽減されるかは、現在研究中である。King他、50 PEDIATR. BLOOD CANCER 599-602（2008）。脳卒中リスクのバイオマーカーは、明らかに鎌状赤血球症の診療を変容させている。
小児においては、ＳＣＩは低ＩＱ、学業成績不振、および顕性脳卒中の独立リスク因子である。Miller他、139 J. PEDIATR. 385-90（2001）；およびMERNAUDIN他、15 J. CHILD NEUROL. 333-43（2000）を参照されたい。ＭＲＩは、ＳＣＩ患者を特定する唯一の方法である。ＭＲＩは高価であり、使用できる頻度に制限があり、かつ一部の小児患者ではＳＣＤに対して死亡を含むリスクをもたらす麻酔を必要とするので、疾患リスクを追跡するための理想的な技法ではない。血液は採取および測定することが容易であり、バイオマーカーは神経学的損傷のリスクまたはその顕性脳卒中への進行を判定することができ、かつバイオマーカーは現行および新規ＳＣＩ療法の基準となることも可能であるので、ＳＣＩの血液バイオマーカーは臨床的な空隙を埋めるであろう。
バイアスのない質量分析によるプロテオミクス手法を用いて、ＭＲＩおよびプロテオーム分析でスクリーニングしたＳＣＩを有するＳＣＤ患者の血漿中でトロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）およびＬ−セレクチン（ＳＥＬＬ）を同定した。ＴＳＰ−１およびＳＥＬＬはＳＣＣにおいて研究されていたが役割は十分に定義されず、また急性脳損傷においては脳回復の重要な因子（ＴＳＰ−１）（Lin et al., 34(1）STROKE 177-86（2003））または予測的バイオマーカー（ＳＥＬＬ）（Lo et al., 26(9）J. NEUROTRAMA 1479-87（2009））としてのエビデンスがあった。プロテオミクススクリーンにおけるＴＳＰ−１およびＳＥＬＬの同定および入手可能な文献を考慮すると、ＴＳＰ−１およびＳＥＬＬ濃度は鎌状赤血球症における脳損傷のバイオマーカーの役割を果たす可能性があるという仮説が立てられる。
（方法）
（患者）
サイレント梗塞輸血治験（ＳＩＴ治験、ClinicalTrials.gov NCT00072761）のためにスクリーニングされた鎌状赤血球症を有する５〜１４歳の小児の横断サンプル（ＨｂＳＳおよびＨｂＳβ０）を検討した（ｎ＝２５９）。ＳＩＴ治験は、鎌状赤血球症およびＳＣＩを有する小児に対する３年間輸血プログラムの多施設無作為化対照試験である。主要評価項目は顕性脳卒中あるいは新規または進行性ＳＣＩの発生を含む。全ての患者はインフォームドコンセントに署名した。ＳＣＩは、正常な神経学的検査およびＴ２強調画像の２視野で目視できるＭＲＩシグナル異常によって定義される。シグナル異常は、１次元で３ｍｍ以上でなければならない。ＳＣＩ状態は、神経放射線科医および脳神経科医のパネルによって宣告される。陽性および陰性対照患者は、ジョンズ・ホプキンズ病院の外来および入院病棟から選択した。陽性対照血漿サンプルは、入院した小児または顕性脳梗塞または脳手術で入院した成人から採取した。陰性対象は、ジョンズ・ホプキンズ病院のＨａｒｒｉｅｔ Ｌａｎｅ小児科外来の５〜１６歳の小児から選択した。外来記録を審査して何らかの急性疾患、神経学的障害、または喘息、肥満および行動／気分障害以外の慢性疾患を有する患者を除外した。ＩＲＢの承認を受けた研究により、これらの対照についての非特定血液サンプルおよび臨床データを取得した。
（血漿標本および質量分析）
血液をＡＣＤまたはＥＤＴＡ管に採取し、ＳＩＴ治験プロトコルに従って１５００ｇで８分間遠心分離し、ジョンズ・ホプキンズ大学ＳＩＴ治験用Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙに分析時まで−７０℃で保存した。ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＰＳ、ベックマン）上のＬＣ１０ ＩｇＹカラム（ベックマン・コ−ルター、カリフォルニア州フラートン）を用いて、患者１５例（探索コホート、非ＳＣＩ ｎ＝７、およびＳＣＩ ｎ＝８）より採取した血漿５００μＬから１２種類の血漿大量タンパク質を除去処理した。ＩｇＹカラムのフロースルーを、連続アセトニトリル勾配（ＰＰＳ、ベックマン）を用いるＣ１８カラム（Ｊｕｐｉｔｅｒ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を通す逆相ＨＰＬＣで３９分画に分離した。分画を乾燥させ（ＳｐｅｅｄＶａｃ、サーモサイエンティフィック、マサチューセッツ州ウォルサム）、３７℃で一晩トリプシン消化した（プロメガ、ウィスコンシン州マジソン）。各サンプルのスペクトルをＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ、サーモサイエンティフィック）により取得した。Ｘｔａｎｄｅｍ！およびヒトＩＰＩデータベースバージョン３．４を用いてスペクトルを検索し、タンパク質を同定した。ＰＡＳＳ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ社、メリーランド州ベセスダ）を用い、信頼水準＜０．９をタンパク質同定カットオフ値として検索後分析を実施した。
（ＴＳＰ−１およびＳＥＬＬ定量値）
ＴＳＰ−１およびＳＥＬＬは、メーカーのプロトコルにしたがい、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ）を用いて希釈血漿サンプルで２回測定した。ＳＣＩおよび非ＳＣＩ患者サンプルを無作為に選択した。
（統計解析）
血漿濃度を群間比較するためにスチューデントのｔ−検定を用いた。
（結果）
（ＳＣＤ血漿中のＴＳＰ−１およびＳＥＬＬの質量スペクトル同定）
ＴＳＰ−１およびＳＥＬＬはそのＳＣＤにおける役割が十分に理解されていない白血球接着分子として機能するが（Ugochukwu他、30(4）INT. J. LAB. HEMATOL. 312-16（2008）；およびBrittain他、97(7）BLOOD 2159-64（2001））、血中ＳＥＬＬは小児の脳外傷の高感度かつ特異的バイオマーカーであることが示されている。探索コホート（患者数ｎ＝１５）の検索にＸｔａｎｄｅｍ！を用いたところ、それぞれ１０例および１３例の患者においてＴＳＰ−１については１４の特異なペプチド、およびＳＥＬＬにおいては３種類のペプチド。Ｘｔａｎｄｅｍ！Ｌｏｇ（ｅ）スコアの範囲は−１．１から−１０．１であった。ＴＳＰ−１（図２３）およびＳＥＬＬ（図２４）のそれぞれについてのペプチドの代表的スペクトルを示す。
（血漿ＴＳＰ−１とＳＣＩ）
いくつかの研究により、脳内の原位置ＴＳＰ−１は脳損傷の回復にとって重要であり、かつＴＳＰ−１はＳＣＤ赤血球の内皮細胞への接着性を高める役割も果たすことができることが示されている。表６および図２５に示すように、ＴＳＰ−１レベルは、年齢マッチングした正常小児とＳＣＤ小児間で比較するとき、濃度に有意差がない（ｐ＝０．４９）。しかし、表７および図２６に示すように、ＳＣＩ陽性患者とＳＣＩ陰性患者の間でＴＳＰ−１濃度の統計的に有意差な上昇があった（ｐ＝０．０１３）。
（表６．対照とＳＣＤのＴＳＰ−１レベル）
（表７．ＳＣＩおよび非ＳＣＩ小児のＴＳＰ−１濃度）
（血漿ＳＥＬＬとＳＣＩ）
ＳＥＬＬは、そのＳＣＤにおける役割が十分に理解されていない白血球接着分子であるが、血流中ＳＥＬＬは小児脳外傷の高感度かつ特異的バイオマーカーであることが示されている。Lo他、26(9）J. NEUROTRAUMA 1479-87（2009）。ＳＥＬＬはＳＩＴＴ探索コホート１５例中１３例に認められたので、ＳＥＬＬがＳＣＤ血漿中に存在することおよびＳＣＩにとっての重要性が実証された。平均ＳＥＬＬレベルは人種および年齢マッチング対照とＳＣＤ患者の間で有意差がない。しかし、ＳＣＩおよび非ＳＣＩ群を比較するとき（図２７）、平均ＳＥＬＬレベルはＳＣＩ群で有意に上昇していた（ｐ＝０．０２１）。
（考察）
鎌形赤血球症における血漿プロテオームのバイアスのないスクリーンを用いたところ、２つの血中タンパク質ＴＳＰ−１およびＳＥＬＬが、ＳＣＤ小児におけるＳＣＩと有意に関連するとして同定された。鎌形赤血球症患者の血漿からのこのような特異性の高いタンパク質の探索により、本実施例で用いられるバイオマーカー探索の実験的手法が実証される。
本発明者らは、ＳＣＩの時期が不明であるＳＩＴ治験参加者の横断的検討において、ＴＳＰ−１およびＳＥＬＬがＭＲＩで診断した鎌形赤血球症におけるサイレント脳梗塞のバイオマーカーであることを示している。５〜１４歳の安定期鎌状赤血球症小児の横断的母集団のうち、ＳＣＩの３０％および非ＳＣＩの４％は極度のＴＳＰ−１上昇を有した。ＴＳＰ−１は脳損傷修復および血管新生において重要な役割を果たすことが知られているマーカーである。ＴＳＰ−１レベルが著明に上昇したこれらの小児は、病歴および神経学的検査で見かけ上の欠損がないという定義による無症候性脳損傷を有する。
ＳＣＩは、ＭＲＩまたは剖検で定義される病的状態である。Moser 他、17 AM. J. NEURORADIOL. 965-72（1996）；およびRothman他、20 ANN. NEUROL. 684-90（1986）を参照されたい。鎌状赤血球症におけるＳＣＩは、ＳＣＩのない鎌状赤血球症患者よりも低い認知神経科学的能力と関連付けられているが（Schatz他、56 NEUROLOGY 1109-11（2001）；Armstrong他、 97 PEDIATRICS 864-70（1996））、多くの鎌状赤血球病小児は、脳ＭＲＩが正常であるにもかかわらず低い認知神経科学的機能を有する。脳に対する特異性の高いタンパク質の血漿レベルによる脳損傷の検出は、損傷を検出するためのより感度の高い手段となりうる。
要約すると、本実施例の結果より、他の集団においてＣＮＳ損傷修復のバイオマーカーであることが知られているＴＳＰ−１を同定することにより、鎌状赤血球症患者の脳損傷の潜在的バイオマーカーを同定するためのバイアスのない戦略が実証される。有意な割合の鎌状赤血球症およびＳＣＩ患者の血漿中にＴＳＰ−１が同定されたことは、ＴＳＰ−１をＳＣＩリスクのバイオマーカーとして潜在的に暗示し、かつ／またはＳＣＩ修復または損傷経路の一部に関与している。ＳＣＤにおける脳特異性タンパク質のさらなるプロテオミクス研究は、ＳＣＤにおけるＣＮＳ損傷に対する我々の理解、その検出および治療にとって非常に興味深いものとなる見込みがある。
（ニューログラニン測定法の開発）
（ヒトＮＲＧＮ特異性アプタマーの同定）
指数関数的濃縮によるリガンドの系統的発生法（ＳＥＬＥＸ）の手順を用いて、ヒトＮＲＧＮ特異性アプタマーを同定した。簡単に述べると、フィルター固定により一本鎖ＲＮＡのプールから特異的アプタマーを選択した。ＲＮＡ−ＮＲＧＮ標的複合体はニトロセルロースフィルターと結合することが可能であり、かつ遊離ＲＮＡが通過して濾過された。特異的アプタマーをフィルターより回収し、ＰＣＲ増幅した。数ラウンドの選択の後、ＮＲＧＮに対する親和性の最も高い特異性アプタマーを濃縮し、シークエンシングにより同定した。
（選択用ライブラリを作成する）
一本鎖ＤＮＡオリゴプールを化学的に合成した。ＤＮＡオリゴは、２つの定常配列に挟まれた４０量体ランダム中心核を有し、またライブラリはライブラリの５’および３’保存末端を標的とする１対のプライマーによって増幅することができる。ライブラリの配列は：
５’−ＴＣＴ ＣＧＧ ＡＴＣ ＣＴＣ ＡＧＣ ＧＡＧ ＴＣＧ ＴＣＴ Ｇ（Ｎ４０）Ｃ ＣＧＣ ＡＴＣ ＧＴＣ ＣＴＣ ＣＣＴ Ａ−３’（配列番号１）
（ＲＮＡライブラリの生成）
まず一本鎖ＤＮＡライブラリをＳｅｌ２ ５’プライマーでアニーリングし、配列はインビトロ転写のためのＴ７プロモーターを含む５’−ＧＧＧ ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＴＡ ＡＴＡ ＣＧＡ ＣＴＣ ＡＣＴ ＡＴＡ ＧＧＧ ＡＧＧ ＡＣＧ ＡＴＧ ＣＧＧ−３’（配列番号２）であった。ギャップは、３７℃で１．５時間実施するＫｌｅｎｏｗ反応で埋めた。反応物は、フェノール：クロロホルム：イソアミル（２５：２４：１）およびクロロホルム：イソアミル（２４：１）抽出各１回によって精製し、またさらにＣｅｎｔｒｉｃｏｎ ３０を用いて４℃で濃縮した。濃縮プロセス中、ＴＥ緩衝液ｐＨ７．４を用いて反応物を２回洗った。最終ＯＤ２６０を測定し、濃度を算出した。
上記のアニーリングしたオリゴプールを用いて、メーカーの反応条件に従い、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅ（登録商標）Ｔ７転写キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、ＤＳ０１０９１０）を用いてインビトロ転写によるＳＥＬＥＸ用ＲＮＡライブラリを生成した。２’−フルオリン−ＣＴＰ（２’−Ｆ−ｄＣＴＰ）および２’−フルオリン−ＵＴＰ（２’−Ｆ−ｄＵＴＰ）を用いて、転写反応においてＣＴＰとＵＴＰを置換し、最終的なＤｕｒａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＮＡ（２’−フルオリン−修飾ＲＮＡ）はＲＮアーゼＡに対して完全に抵抗性である。インビトロ転写後、ＤＮアーゼＩを用いて反応物を処理し、さらにフェノール：クロロホルム：イソアミル（２５：２４：１）およびクロロホルムでＲＮＡを１回ずつ抽出し、その後Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ３０を用いて４℃で濃縮および脱塩した。
ＲＮＡは変性ＰＡＧＥ（１２％、７Ｍ尿素）ゲル精製でさらに精製した。ＲＮＡバンドをＰＡＧＥゲルから切り取り、ＴＥ緩衝液２ｍＬ中でＲＮＡを４℃で１晩溶出させた。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ３０を用いて純粋なＲＮＡを再度濃縮し、またＲＮＡの濃度を従来法で測定した。
（ニトロセルロースフィルター予備洗浄）
１３ｍｍ Ｓｗｉｎ−Ｌｏｋフィルターホルダー（ワットマン）（直径１３ｍｍ）、孔径０．４５μｍのＨＡＷＰニトロセルロースディスクフィルター（ミリポア）を組み立てた。フィルターは、Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４を２０ｍＭ、ＮａＣｌを５０ｍＭおよびＣａＣｌ２を２ｍＭ含有する洗浄緩衝液１ｍＬで事前に湿らせた。５００ｐｍｏｌのＲＮＡを１００μＬの１×結合緩衝液（０．１％ＢＳＡを添加した以外は洗浄緩衝液と同じ処方）で希釈し、さらにフィルターホルダーのレザバーに適用した。フィルターホルダーを５０ｍＬコニカルチューブに密封し、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、１ｍＬシリンジを用いてフィルターユニットを通過させることによりＲＮＡを回収し、また１００μＬの１×結合緩衝液を用いて１回洗った。フィルターを通過したＲＮＡを回収した；事前洗浄ＲＮＡの総量は約１８０μＬであった。
（結合反応）
結合反応は、５０ｐｍｏｌヒトＮＲＧＮタンパク質を事前洗浄ＲＮＡに添加することによって構築され、ＲＮＡ：タンパク質の分子比率は約１０：１であった。総体積は１×結合緩衝液中で２００μＬとした。反応物を３７℃で１５分間インキュベートした。新しいフィルターホルダーを組み立て、上述の方法で事前に湿らせ、結合反応物をフィルターに適用し、５ｍＬシリンジを用いて結合サンプルを通過させて押し出し、さらにフィルターを５ｍＬ洗浄緩衝液で洗った。
（選択したＲＮＡを回収）
フィルターホルダーを分解し、さらにフェノール：クロロホルム：イソアミル（２５：２４：１）６００μＬを入れた１．５ｍＬ遠心管にフィルターを移した。遠心管をボルテックスミキサーで約１分間激しく振盪した後、室温で３０分間インキュベートした。Ｈ２Ｏを２００μＬ添加し、再度ボルテックスミキサーで振盪した後、１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。回収したＲＮＡを含有する上清をクロロホルム４００μＬで１回抽出した後、エタノール５００μＬ、３Ｍ酢酸Ｎａ２０μＬ（ｐＨ５．２）およびグリコーゲンブルー（Ａｍｂｉｏｎ、５ｍｇ／ｍＬ）３μＬを添加することで沈殿させ、その後−８０℃で一晩インキュベートした。１４０００ｒｐｍで２０分間４℃で遠心分離することによりＲＮＡを回収した後、７５％エタノール１ｍＬで１回洗い、その後ＲＮＡを遠心分離して風乾した。乾燥したＲＮＡペレットをＨ２Ｏ２０μＬに溶解した。
（選択したＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅）
回収したＲＮＡ５μＬを用いて第１のＤＮＡ鎖を合成した。プライマーＳｅｌ２ ３’２μｍｏｌを反応物に添加した。Ｓｅｌ２ ３’プライマーの配列は：５’−ＴＣＴ ＣＧＧ ＡＴＣ ＣＴＣ ＡＧＣ ＧＡＧ ＴＣＧ ＴＣ−３’（配列番号３）である。反応物にロシェより入手した逆転写酵素（カタログ番号：１０ １０９ １１８ ００１）を用い、条件はメーカーが推奨する通りとした。
ＰＣＲ反応は以下の通りに構築した：第１のＤＮＡ鎖（上記の段階より）５μＬ、１０μＭプライマー（上記の段階よりＳｅｌ２ ３’および上記の段階よりＳｅｌ２ ５’）それぞれ３μＬ、Ｈ２Ｏ ３９μＬおよび２×ＴｏｐＴａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（キアゲン）５０μＬ。合計８反応（８００μＬ）を実施した。ＰＣＲサイクル条件は以下の通りであった：９４℃／５分→（９４℃／３０秒→５５℃／３０秒→７２℃／３０秒）×２０サイクル→４℃。ＰＣＲ生成物は、３％アガロースゲル電気泳動で確認し、さらに残りのＰＣＲ生成物はＣｅｎｔｒｉｃｏｎ３０を４℃で用いて脱塩および濃縮した。ＰＲＣ生成物の濃度は、ＯＤ／２６０ｎｍを測定することにより判定した。
（選択を反復する）
濃縮ＰＣＲ生成物１μｇを用いて、次のラウンドの選択に用いるＲＮＡを生成し、インビトロ転写のプロトコルの後に上述の操作を実施した。合計１０ラウンドの選択を実施した。
１０ラウンドの選択後、選択の厳密性を高めるために高塩結合緩衝液を用いてさらに３ラウンドの選択を実施した。１×結合緩衝液Ｆおよび洗浄緩衝液Ｆの処方は、ＮａＣｌの濃度が１５０ｍＭに増加している以外は、上述の緩衝液と同じである。その他の詳細な手順は上述のものと同じである。
１３ラウンドの選択後の最終ＰＣＲ生成物をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（プロメガ）にクローニングし、濃縮したアプタマーをＤＮＡシークエンシングにより同定した。プライマーの全長および４０量体インサートを含むクローンを、ＣｌｕｓｔａｌＷ２ ａｔ ＥＭＢＬ−ＥＢＩウェブサイトを用いてアラインした。
（同定されたヒトＮＲＧＮ特異性アプタマー）
６種類のクローンをシークエンシング用に選択し、また全ての配列の品質は非常に高かった。ＤＮＡアラインメント分析後、ＮＲＧＮ−Ａ４のヌクレオチドが１個異なっていたことを除いて（下線部）６種類のクローンのうち５種類はほぼ同一であった。類似性の低い配列ＮＲＧＮ−Ａ６は、整合性の良い他の５クローンと比較すると、その全てが２Ｔに富むモチーフを有し、これらがＣＣ／ＣＡ（囲み部分）によって分離されていることを示した。ＮＲＧＮ−Ａ１およびＮＲＧＮ−Ａ６を実証の対象に選択した。以下にアプタマーの配列を示す：
（アプタマーＮＲＧＮ相互作用の実証）
同定された配列に従ってＮＲＧＮ−Ａ１およびＮＲＧＮ−Ａ６ ＲＮＡを化学的に合成し；ＲＮＡ３’末端にビオチンリンカーを付加した。異なる２種類の戦略を用いてＮＲＧＮアプタマーとＮＲＧＮ組換えタンパク質の相互作用を試験した。詳細を以下に記載する。
（ニトロセルロース上でＲＮＡタンパク質複合体を検出するためにドットブロットを用いること）
ＳＥＬＥＸ手順で用いたものと同じメカニズムに基づいてＲＮＡ−タンパク質複合体をニトロセルロース膜上に保持することが可能であり、ドットブロットを用いてビオチン標識ＲＮＡアプタマーを検出した。まず、Ｈｉｓ−ＮＲＧＮ組換えタンパク質の連続２倍希釈を作製し、タンパク質の量の範囲は１０ｐｍｏｌから０とし；その後さらに各サンプルをＮＲＧＮアプタマーＲＮＡ１ｐｍｏｌと混合した。最終結合反応の体積を１×結合緩衝液Ｆで２０μＬに維持し、反応物を３７℃で１５分間インキュベートした。
その間に、ドットブロット装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、＃１７０−６５４５）を準備した。ニトロセルロース膜を切り、使用前に１×洗浄緩衝液Ｆ中で３０分間振盪した。ニトロセルロース膜を事前に湿らせたワットマンろ紙上に乗せ、装置の底部に留置し、その後吸引器を組み立て、接続した。膜を各ウェルにつき１×洗浄緩衝液Ｆ１００μＬで１回洗浄した後、結合反応物を適用した。反応物を通過させた後、膜を１×洗浄緩衝液Ｆ２００μＬで１回洗浄し、その後吸引により排液した。その後膜をＵＶ架橋させた（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、＃１６５−５０３１）。
メーカーの指示に従い、Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｐｉｅｒｃｅ、＃８９８８０）を用いて、ニトロセルロース上に保持されたビオチン標識ＲＮＡアプタマーを検出した。簡単に述べると、膜をストレプトアビジン−ＨＲＲコンジュゲートと共にインキュベートし、さらにＨＲＰの化学発光基質を用いて検出した。
その結果、ＮＲＧＮアプタマーＮＲＧＮ−Ａ１およびＡ６はいずれもＮＲＧＮタンパク質と結合し、この方法を用いた検出に必要とされるタンパク質の最小量は、夫々、１．２５ｐｍｏｌおよび０．６３ｐｍｏｌであった。同モル数のヒトアルブミンを対照として用いたところ、使用したアルブミンの量にもかかわらず信号を検出することができなかった。この結果より、これら２つのアプタマーはいずれもＨｉｓ−ＮＲＧＮタンパク質と特異的に結合することが示された。図２８を参照されたい。
（プルダウン測定法）
ビオチン標識アプタマーをストレプトアビジン粒子に固定し、さらにプルダウン測定法を実施した。アプタマーをＴＥＮ１００緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ）で１ｐｍｏｌ／μＬに希釈し、６５℃で５分間加熱した後、室温で２０分間放置してＲＮＡをその天然コンホメーションにフォールディングさせた。ストレプトアビジン磁性粒子（ロシェ、１１６４１７７８００１）を２倍体積のＴＥＮ１００緩衝液で３回洗った後、アプタマーサンプルを添加して回転させながら室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、粒子をＴＥＮ１００緩衝液で３回洗い、その後１×結合緩衝液Ｆで１回平衡させた。種々の量のＮＲＧＮタンパク質（０〜２ｎｍｏｍ）を１×結合緩衝液で希釈し、アプタマーを固定した磁性粒子に添加した後、３７℃で１５分間インキュベートした。
結合インキュベーション後、粒子をＴＥＮ１００緩衝液で２回洗った。アプタマータンパク質複合体は、溶離緩衝液（１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）２６μＬで１０分間室温でインキュベートすることにより解離させた。溶離したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、さらにタンパク質バンドをクマシー染色で可視化した。ヒトアルブミンタンパク質を陰性対照として用いた。典型的な染色ゲルを図２９に示す。
ドットブロットおよびプロダウン測定法は、いずれもアプタマーがヒトＮＲＧＮ組換えタンパク質と特異的に結合することを示した。
（ニューログラニン多重反応モニタリング（ＭＲＭ）測定法の開発）
質量分析定量ＭＲＭ測定法用のニューログラニンシグネチャーペプチドを開発した。ペプチドの配列および転移を以下の表に示す。標識ＧＰＧＰＧＧＰＧＧＡＧＶＡＲ（配列番号７）をサンプルに添加して、シグネチャーペプチドＧＰＧＰＧＧＰＧＧＡＧＶＡＲ（配列番号７）の濃度を測定するための標準曲線を作製した。ペプチドＫＧＰＧＰＧＧＰＧＧＡＧＶＡＲ（配列番号８）もモニタリングして、トリプシン消化による誤った開裂がないことを確認する。
（表８．ニューログラニンペプチドの配列）
図３０に、ＡＢＩ Ｓｃｉｅｘ Ｑｔｒａｐ ４０００トリプル四重極質量分析器を用いたニューログラニンシグネチャーペプチドおよび標識標準ペプチドのシグナルを示す。
（Ｈｉｓ−ＮＲＧＮ組換えタンパク質の生成）
ヒトＮＲＧＮ ｃＤＮＡクローンはＯｒｉｇｅｎｅより購入した（カタログ番号：ＲＣ２０１２０９）。コード配列を、制限酵素（Ｓｇｆ Ｉ＋Ｍｌｕ Ｉ）フラグメントスワッピングによりデスティネーションベクター（Ｏｒｉｇｅｎｅ、ｐＥＸ−Ｎ−Ｈｉｓ、カタログ番号ＰＳ１０００３０）にクローニングし、ｐＥＸ−Ｎ−Ｈｉｓ−ＮＲＧＮ発現プラスミドを生成した。コード配列およびリーディングフレームはＤＮＡシークエンシングにより確認した。
メーカーの指示に従い、ｐＥＸ−Ｎ−Ｈｉｓ−ＮＲＧＮプラスミドをＲｏｓｅｔｔａ ２（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、＃７１３９７）に形質転換した。Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｉｎｓｔａｎｔ ＴＢ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎｏｖａｇｅｎ ＃７１４９１）中で細菌を３７℃で１６〜１８時間培養し、その後回収してＴＥＮ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５Ｍ ＮａＣｌ）に懸濁した。１％ＮＰ−４０、リゾチーム２５ｍｇおよび完全プロテイナーゼ阻害剤（ロシェ）を加え、氷浴上で３０分間静置し、その後１回凍結−解凍することにより細菌を溶解した。遠心分離により溶解物を清澄化した後、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズ（キアゲン）を上清に添加し、さらに４℃で１時間回転させた。洗浄緩衝液（２０ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ ＫＣｌおよび０．５Ｍ ＮａＣｌ）を用いてビーズを３回洗浄した。ビーズを４℃の溶離緩衝液（１００ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ Ｋ３ＰＯ４および１６７ｍＭ ＮａＣｌ）中で１０分間回転させることにより、組換えタンパク質をビーズより溶離させた。溶離したタンパク質を３ＬのＰＢＳで一晩透析し、従来のタンパク質測定法でタンパク質濃度を判定した。図３１は、クマシー染色後のＰＡＧＥゲル上の典型的Ｈｉｓ−ＮＲＧＮを示し；Ｈｉｓ−ＮＲＧＮの予測分子量は８．５Ｋｄである。
（ニューログラニンモノクローナルの開発）
ジョンズ・ホプキンズ大学において、モノクローナル抗体の産生のために上記の組換えニューログラニンを用いてマウスを免疫した。３０のクローンをスクリーニングし、クローン３０．５．２を図３２に示す直接ＥＬＩＳＡにおいて高希釈度ニューログラニンと結合すると特定した。
（ニューログラニン用サンドイッチＥＬＩＳＡの開発）
濃度７５ｎｇ／ウェルのニューログラニン抗ヒトモノクローナル抗体（ジョンズ・ホプキンズ）を捕捉抗体として用い、かつ濃度０．５μｇ／ｍＬのニューログラニンに対するウサギポリクローナル抗体（ジョンズ・ホプキンズ）を検出抗体として用いた。濃度１μｇ／ｍＬのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ウサギ抗体（ＭＳＤカタログ番号Ｒ３２ＡＢ−１）を濃度１μｇ／ｍＬで標識レポーターとして用いた。ＧＳＴ＿ＮＲＧＮ組換えタンパク質（ジョンズ・ホプキンズ）を、開始濃度２０ｎｇ／ｍＬ、その後ＰＢＳ／１％ＢＳＡの７希釈用に対して１：２で標準物質として用いた。ＰＢＳ／１％ＢＳＡをブランクとして用いた。本測定法の標準曲線を図３３に示す。
（ニューログラニンは急性脳損傷のバイオマーカーである）
上記のニューログラニンサンドイッチ測定法を用いると、心呼吸器不全のために２７日間ＥＣＭＯサポートを受ける乳児から採取した血清サンプル。乳児は連日頭部超音波測定を実施し、死亡時には脳損傷がないと考えられた。剖検では、脳に多発性皮質梗塞がありそれらは超音波では診断されなかった。図３４に示すように、ＧＦＡＰレベルはＥＣＭＯサポートの粗さを通じて変化しなかった。しかし、ニューログラニンレベルは１４日間のＥＣＭＯサポートの間に初期値の１５倍のピークまで上昇した。ニューログラニンは灰白質、ニューロンマーカーであるので皮質灰白質損傷に対する感度は白質損傷マーカーＧＦＡＰよりも高かった。これは、ニューログラニンが急性皮質脳損傷の血中バイオマーカーでありかつＧＦＡＰと組み合わせると脳白質損傷を脳灰白質損傷と識別することができるというエビデンスを提供する。

Claims (28)

  1. 患者の無症候性脳損傷（ＳＣＩ）を診断するための方法であって：
    ａ．前記患者からサンプルを採取すること；
    ｂ．前記患者から採取した前記サンプル中の１つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベルを測定すること；および
    ｃ．前記１つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベルをＳＣＩを有する患者と相関する同じバイオマーカーの事前に定義したレベルおよびＳＣＩのない患者と相関する同じバイオマーカーの事前に定義したレベルと比較することであって、
    前記の事前に定義したレベルのうち１つとの相関が診断を提供することを特徴とする比較することという段階を含む前記方法。
  2. 請求項１に記載の前記方法であって、前記の１つまたはそれ以上のバイオマーカーがアストロタクチン１（ＡＳＴＮ１）、脳血管新生阻害物質３（ＢＡＩ３）；カルノシンジペプチダーゼ（ＣＮＤＰ１）；ＥＲＭＩＮ；グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）；代謝型グルタミン酸受容体３（ＧＲＭ３）；ケルヒ様タンパク質３２（ＫＬＨ３２）；メラノーマ抗原ファミリーＥ，２（ＭＡＧＥ２）；ニューレグリン３（ＮＲＧ３）；ニューログラニン（ＮＲＧＮ）；乏突起膠細胞ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）；溶質輸送体ファミリー３９（亜鉛輸送体）、メンバー１２（ＳＬＣ３９Ａ１２）；レティキュロン（ＲＴＮ１）；およびメタロチオネイン（ＭＴ３）からなる群から選択されることを特徴とする前記方法。
  3. 請求項１に記載の前記方法であって、前記の１つまたはそれ以上のバイオマーカーがＮＲＧＮを含むことを特徴とする前記方法。
  4. 請求項１に記載の前記方法であって、前記の１つまたはそれ以上のバイオマーカーがＯＭＧを含むことを特徴とする前記方法。
  5. 請求項１に記載の前記方法であって、前記の１つまたはそれ以上のバイオマーカーがＭＴ３を含むことを特徴とする前記方法。
  6. 請求項１〜３のうちいずれかに記載の前記方法であって、前記の１つまたはそれ以上のバイオマーカーがＧＦＡＰをさらに含むことを特徴とする前記方法。
  7. 請求項１に記載の前記方法であって、前記の１つまたはそれ以上のバイオマーカーがＮＲＧＮ、ＯＭＧおよびＭＴ３を含むことを特徴とする前記方法。
  8. 請求項５に記載の前記方法であって、前記の１つまたはそれ以上のバイオマーカーがＧＦＡＰをさらに含むことを特徴とする前記方法。
  9. 請求項２に記載の前記方法であって、前記の１つまたはそれ以上のバイオマーカーが表１および表２に列挙されたバイオマーカーをさらに含むことを特徴とする前記方法。
  10. 請求項１に記載の前記方法であって、前記サンプルが血液、血漿血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）または尿サンプルであることを特徴とする前記方法。
  11. 請求項１０に記載の前記方法であって、前記サンプルが血液サンプルであることを特徴とする前記方法。
  12. 請求項１０に記載の前記方法であって、前記サンプルが血清サンプルであることを特徴とする前記方法。
  13. 患者のＳＣＩを診断するための方法であって：
    ａ．前記患者からサンプルを採取すること；
    ｂ．バイオマーカーパネルがＡＳＴＮ１、ＢＡＩ３、ＣＮＤＰ１、ＥＲＭＩＮ、ＧＦＡＰ、ＧＲＭ３、ＫＬＨ３２、ＭＡＧＥ２、ＮＲＧ３、ＮＲＧＮ、ＯＭＧ、ＳＬＣ３９Ａ１２、ＲＴＮ１、およびＭＴ３を含むことを特徴とする、前記患者から採取した前記サンプル中の前記バイオマーカーパネルのレベルを測定すること；および
    ｃ．前記バイオマーカーパネルのレベルをＳＣＩを有する患者と相関する同じバイオマーカーパネルの事前に定義したレベルおよびＳＣＩのない患者と相関する同じバイオマーカーパネルの事前に定義したレベルと比較することであって、
    前記の事前に定義したレベルのうち１つとの相関が診断を提供することを特徴とする比較することという段階を含む前記方法。
  14. 患者のＳＣＩを診断するための方法であって：
    ａ．前記患者からサンプルを採取すること；
    ｂ．バイオマーカーパネルがＮＲＧＮおよびＧＦＡＰを含むことを特徴とする、前記患者から採取した前記サンプル中の前記バイオマーカーパネルのレベルを測定すること；および
    ｃ．前記バイオマーカーパネルのレベルをＳＣＩを有する患者と相関する同じバイオマーカーの事前に定義したレベルおよびＳＣＩのない患者と相関する同じバイオマーカーの事前に定義したレベルと比較することであって、
    前記の事前に定義したレベルのうち１つとの相関が診断を提供することを特徴とする比較することという段階を含む前記方法。
  15. 請求項１４に記載の前記方法であって、前記のバイオマーカーパネルがＯＭＧ、およびＭＴ３をさらに含むことを特徴とする前記方法。
  16. 請求項１４に記載の前記方法であって、前記バイオマーカーパネルがＡＳＴＮ１、ＢＡＩ３、ＣＮＤＰ１、ＥＲＭＩＮ、ＧＲＭ３、ＫＬＨ３２、ＭＡＧＥ２、ＮＲＧ３、ＯＭＧ、ＳＬＣ３９Ａ１２、ＲＴＮ１、およびＭＴ３をさらに含むことを特徴とする前記方法。
  17. 請求項１３または１４に記載の前記方法であって、前記サンプルが血液、血漿血清、ＣＳＦまたは尿サンプルであることを特徴とする前記方法。
  18. 請求項１７に記載の前記方法であって、前記サンプルが血液サンプルであることを特徴とする前記方法。
  19. 請求項１７に記載の前記方法であって、前記サンプルが血清サンプルであることを特徴とする前記方法。
  20. 患者のＳＣＩを診断するための方法であって：
    ａ．前記患者から血漿サンプルを採取すること；
    ｂ．バイオマーカーパネルがＮＲＧＮおよびＧＦＡＰを含むことを特徴とする、前記患者から採取した前記血漿サンプル中の前記バイオマーカーパネルのレベルを測定すること；および
    ｃ．前記バイオマーカーパネルのレベルをＳＣＩを有する患者と相関する同じバイオマーカーの事前に定義したレベルおよびＳＣＩのない患者と相関する同じバイオマーカーの事前に定義したレベルと比較することであって、
    前記の事前に定義したレベルのうち１つとの相関が診断を提供することを特徴とする比較することという段階を含む前記方法。
  21. 請求項２０に記載の前記方法であって、前記のバイオマーカーパネルがＯＭＧおよびＭＴ３をさらに含むことを特徴とする前記方法。
  22. 請求項２０に記載の前記方法であって、前記バイオマーカーパネルがＡＳＴＮ１、ＢＡＩ３、ＣＮＤＰ１、ＥＲＭＩＮ、ＧＲＭ３、ＫＬＨ３２、ＭＡＧＥ２、ＮＲＧ３、ＯＭＧ、ＳＬＣ３９Ａ１２、ＲＴＮ１、およびＭＴ３をさらに含むことを特徴とする前記方法。
  23. 患者の脳損傷状態を判定するための方法であって：
    ａ．前記患者からサンプルを採取すること；
    ｂ．バイオマーカーパネルがＡＳＴＮ１、ＢＡＩ３、ＣＮＤＰ１、ＥＲＭＩＮ、ＧＦＡＰ、ＧＲＭ３、ＫＬＨ３２、ＭＡＧＥ２、ＮＲＧ３、ＮＲＧＮ、ＯＭＧ、ＳＬＣ３９Ａ１２、ＲＴＮ１、およびＭＴ３を含むことを特徴とする、前記患者から採取した前記サンプル中の前記バイオマーカーパネルのレベルを測定すること；および
    ｃ．前記バイオマーカーパネルのレベルを脳損傷を有すること、脳損傷がないこと、脳損傷が進行すること、および脳損傷が後退することからなる群から選択される１つまたはそれ以上の脳損傷状態と相関する同じバイオマーカーパネルの事前に定義したレベルと比較することであって、
    前記の事前に定義したレベルのうち１つとの相関が前記患者の前記脳損傷状態を判定することを特徴とする比較することという段階を含む前記方法。
  24. 患者のＳＣＩ状態を判定するための方法であって：
    ａ．前記患者からサンプルを採取すること；
    ｂ．バイオマーカーパネルがＡＳＴＮ１、ＢＡＩ３、ＣＮＤＰ１、ＥＲＭＩＮ、ＧＦＡＰ、ＧＲＭ３、ＫＬＨ３２、ＭＡＧＥ２、ＮＲＧ３、ＮＲＧＮ、ＯＭＧ、ＳＬＣ３９Ａ１２、ＲＴＮ１、およびＭＴ３を含むことを特徴とする、前記患者から採取した前記サンプル中の前記バイオマーカーパネルのレベルを測定すること；および
    ｃ．前記バイオマーカーパネルのレベルをＳＣＩを有すること、ＳＣＩがないこと、ＳＣＩが進行すること、およびＳＣＩが後退することからなる群から選択される１つまたはそれ以上のＳＣＩ状態と相関する同じバイオマーカーパネルの事前に定義したレベルと比較することであって、
    前記の事前に定義したレベルのうち１つとの相関が前記患者のＳＣＩ状態を判定することを特徴とする比較することという段階を含む前記方法。
  25. 患者の脳損傷を診断するための方法であって：
    ａ．前記患者からサンプルを採取すること；
    ｂ．前記患者から採取した前記サンプル中の１つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベルを測定すること；および
    ｃ．前記１つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベルを脳損傷を有する患者と相関する同じバイオマーカーの事前に定義したレベルおよび脳損傷のない患者と相関する同じバイオマーカーの事前に定義したレベルと比較することであって、
    前記の事前に定義したレベルのうち１つとの相関が診断を提供することを特徴とする比較することという段階を含む前記方法。
  26. 請求項１に記載の前記方法であって、前記の１つまたはそれ以上のバイオマーカーがアストロタクチン１（ＡＳＴＮ１）、脳血管新生阻害物質３（ＢＡＩ３）；カルノシンジペプチダーゼ（ＣＮＤＰ１）；ＥＲＭＩＮ；グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）；代謝型グルタミン酸受容体３（ＧＲＭ３）；ケルヒ様タンパク質３２（ＫＬＨ３２）；メラノーマ抗原ファミリーＥ，２（ＭＡＧＥ２）；ニューレグリン３（ＮＲＧ３）；ニューログラニン（ＮＲＧＮ）；乏突起膠細胞ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）；溶質輸送体ファミリー３９（亜鉛輸送体）、メンバー１２（ＳＬＣ３９Ａ１２）；レティキュロン（ＲＴＮ１）；およびメタロチオネイン（ＭＴ３）からなる群から選択されることを特徴とする前記方法。
  27. 請求項１〜２６のうちいずれかに記載の前記方法であって、前記の測定する段階がイムノアッセイ、免疫ブロット法、免疫沈降測定法、免疫染色法、定量測定法、免疫蛍光測定法、または化学発光測定法を含むことを特徴とする前記方法。
  28. 患者の脳損傷状態を判定するためのキット方法であって：
    ａ．患者から生物学的サンプルを採取するための基材；および
    ｂ．ＡＳＴＮ１、ＢＡＩ３、ＣＮＤＰ１、ＥＲＭＩＮ、ＧＦＡＰ、ＧＲＭ３、ＫＬＨ３２、ＭＡＧＥ２、ＮＲＧ３、ＮＲＧＮ、ＯＭＧ、ＳＬＣ３９Ａ１２、ＲＴＮ１、およびＭＴ３からなる群から選択される１つまたはそれ以上のバイオマーカーのレベルを測定するための手段を含む前記キット。
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