JP2013521838A - 固定された生物学的実体 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)医療装置などの固体対象を処理して、チオール基を有するように官能化されたカチオン性ポリマー外側被膜層を含む表面を提示させ;
(b)チオール基を有するように官能化されたカチオン性ポリマー外側被膜層を、アルケン又はアルキン基を有するように官能化された抗凝血実体と反応させる
を含み、それにより上記抗凝血実体を、チオエーテルを含むリンカーを介してカチオン性ポリマーに結合する。
(a)医療装置などの固体対象を処理して、アルケン又はアルキン基を有するように官能化されたカチオン性ポリマー外側被膜層を提示させ;
(b)アルキン基を有するように官能化されたカチオン性ポリマー外側被膜層を、チオール基を有するように官能化された抗凝血実体と反応させる
を含み、それにより上記抗凝血実体を、チオエーテルを含むリンカーを介して上記カチオン性ポリマーに結合する。
(a)医療装置などの固体対象を処理して、カチオン性ポリマー表面層を提示させ;
(b)当該カチオン性ポリマー表面層と、チオエーテルを含むリンカーを介して結合される多重の負荷電抗凝血実体、例えばヘパリン部分を有する官能化カチオン性ポリマーとを結合させる
を含み、ここで当該カチオン性ポリマーが、多重の負荷電抗凝血実体を有し、そして当該官能化カチオン性ポリマーが全体として負荷電を有する。
(i)アニオン性ポリマー(例えばアニオン性多糖)の溶液を適用して、当該アニオンポリマーの吸着された層を取得し、そして
(ii)さらにそれを官能化カチオン性ポリマー、例えばポリアミンで処理して、官能化カチオン性ポリマーの吸着された外側被膜層を提供し、ここで上記外側被膜層は、チオール基又はアルケン若しくはアルキン基を有するように官能化されている
により組み立てられてもよい。
(a)固体対象、例えば医療装置を処理して、アニオン性ポリマー表面層を提示させ;
(b)当該アニオン性ポリマー表面層と、チオエーテルを含むリンカーを介して結合している多重の負に荷電した抗凝血実体、例えばヘパリンを有する官能化カチオン性ポリマーとを結合させる
を含み、ここで当該官能化カチオン性ポリマーは、多重の負荷電の抗凝血実体を有し、そして全体として正荷電を有する。
(i)カチオン性ポリマー(場合により架橋剤を伴って)を適用して、カチオン性ポリマーの吸着された層を提供し、そして
(ii)次にそれを、アニオン性ポリマー(例えばアニオン性多糖)の溶液で処理して、アニオン性ポリマーの吸着された層を取得する
により組み立てられてもよい。
で表されるアルコキシアミンを、抗凝血実体上のアルデヒド又はヘミアセタール基と、それ自体既知の慣用技術を用いて反応させることにより製造されてもよい。このタイプの反応は、以下の実施例3bに示されており;この反応は、オキシ-イミン官能基の形成を介して反応が進んで、以下の式:
で表される化合物を与える。
Xは、炭化水素リンカー、例えば(CH2)nであり、ここでnは、1〜8、例えば1〜4であるか、又は
Xは、1又は複数(例えば1又は2)のメチレン基がOにより置換される上で記載された炭化水素リンカーであるか;或いは
Xは、1〜100(例えば、1〜50、例えば1〜10)のエチレングリコールユニットを含むPEG鎖を含む}
で表される化合物と反応させて、以下の式:
Xは上に定義される通りであり、かつR’-CH2−は、抗凝血実体の残基である}
で表される生成物を与えることにより形成されてもよい。
で表される多数の第一級アミン基を有するポリアミンポリマーは、以下の式:
で表される化合物と反応させて、以下の式:
で表されるマレイミド官能化ポリアミンを生成してもよい。この反応は、以下の実施例2aにより詳細に示されている。
で表される活性化アルキン含有基と反応させて、以下の式:
で表されるアルキン官能化ポリマーを与えてもよい。この反応は、以下の実施例2bにおいてより詳細に示されている。
で表される多数の第一級アミン基を有するポリアミンポリマーは、活性化チオール含有化合物、例えば以下の式:
で表される化合物と反応されて、以下の式:
で表される誘導体化ポリマーを与えうる。この反応は、下記の実施例2cにより詳細に示されている。
表面上の抗凝血実体の置換の程度が制御できる;
抗凝血実体、例えばヘパリンを、両方の末端(1の点)結合、及び複数の点での結合することが達成できるが、末端(特に還元末端)結合が好ましい;
抗凝血実体と表面との間のリンカーの長さを制御できる;
全長のヘパリンが使用でき、ヘパリン切断、及び従来技術におけるヘパリンの硝酸分解により生じる切断産物の一部の浪費を避けることができる;
ヘパリンを切断する場合、幾つかのフラグメントにおいて、アンチトロンビン結合配列を破壊でき、その結果スペーサーを介して結合された全長ヘパリン又はヘパリンを使用することは、結合されたヘパリンの生態利用能を改善することができる;
表面における抗凝血実体の均一な分布を得ることができる;
製品の材料にかかわらず、装置に固有の性質、例えば低い血栓形成性をマスクする均一の被膜を得ることができる;
比較的滑らかな被膜を得ることができる;
被膜の生体適合性が向上することができる;
本発明の被膜が、全身ヘパリン処理に対する必要性を低下し、そして接触活性化の可能性を低下することができる;
抗凝血実体の生体適合性を、例えば異なるリンカー(長さ、タイプ)を用いることにより制御することができる;
ヘパリンを浸出させず、そうして長期間の寿命を有する非血栓形成性表面を得ることができる;
生物分子に対する改善した結合能力を有する分析又は分離装置を得ることができる;そして
延長されたヘパリン活性寿命を有する分析又は分離装置を得ることができる。
官能化されたアミノ化ポリマー外側層を有する、アミノ化ポリマーと、硫酸化多糖の層を含む表面は、官能化ヘパリンに結合されて、それによりチオエーテルを形成する。
PVCチューブ(内径3mm)の内腔表面を、イソプロパノール及び酸化剤で洗浄した。これを次に、正に荷電したポリアミン(Polymin)と負に荷電した硫酸化多糖(デキストラン硫酸)からなる4の二重層で下地を作り、そし硫酸化多糖で終えた。
結合されたヘパリンの安置トロンビン結合活性:8.0pmol/cm2
血液ループにより試験されるように非血栓形成性である。実施例1.4を参照のこと。
PVCチューブ(内径3mm)の内腔表面を、イソプロパノール及び酸化剤で洗浄した。これを、正に荷電したポリアミン(Polymin)と負に荷電した硫酸化多糖(デキストラン硫酸)の4の二重層で下地を作り、硫酸化多糖で終えた。
結合されたヘパリンのアンチトロンビン結合活性:1.0pmol/cm2
血液ループにより試験された非トロンビン形成性:実施例1.4を参照のこと。
実施例1.1〜1.3から得た内腔が被膜されたPVCチューブについて血液ループ評価を行い、非血栓形成性表面の保存されたヘパリン生物活性を示した。第一に、被膜チューブの内腔側を、0.15MのNaClで15時間、1ml/分の流速で洗浄して、緩く結合したヘパリンを洗い流し、そして安定な表面が残ることを保証した。次に、洗浄されたチューブを、Anderson et al. (Andersson, J.; Sanchez, J.; Ekdahl, K. N.; Elgue, G.; Nilsson, B.; Larsson, R. J Biomed Mater Res A 2003, 67(2), 458-466)に本質的に従って行われた20rpmでのChandlerループモデル内でインキュベートした。鮮血からの血小板と、ループから回収された血からの血小板をセルカウンターで計数して、血栓形成を意味する血小板の消失を計測した。参照として、非血栓形成性の対照(つまり、PVCに適用されたCermeda(登録商標)BioActive Surface,これはEP−B−0495820に記載される通りに原則的に調製された)、被膜無しPVCチューブ、及び血栓形成性対照(つまり、アンチトロンビンを結合していない、硫酸化多糖の外側層を伴う、3の二重層被膜)を含んだ。
(i) アルデヒド基を備える硝酸分解ヘパリン(US4,613,665の実施例2の通りに実質的に調製)3.25g(乾燥重量)(0.65mmol)
(ii) O−(プロパ−2−イニル)−ヒドロキシルアミンヒドロクロリド(Ref:Xu, R.; Sim, M.K.; Go, M.L., Synthesis and pharmacological characterization of O-alkynyloximes of tropione and N-methylpiperadinone as muscarinic agonists. J Med Chem 1998, 41, (17), 3220-3231)0.70g dry weight (6.5mmol)
(iii) 酢酸(100%Merck)3ml
(iv) 精製水50ml
官能化ヘパリンの活性は、211IU/mgであり、これは官能化されたヘパリンの活性が、官能化により実質的に影響を受けていないことを示す。
実施例5:二機能性リンカー
5a)N−(4−(2−(ヒドロキシ)エチル)フェニル)ペンタ−4−インアミド
N−ヒドロキシスクシンイミド−(4−ペンチノエート)(Ref:Malkoch, M.; Schleicher, K.; Drockenmuller, E.; Hawker, C. J.; Russell, T.P.; Wu, P.; Fokin, V.V., Structurally Diverse Dendritic Libraries; A Highly Efficient Functionalization Approach Using Click Chemistry. Macromolecules 2005, 38, (9), 3663-3678.)(200mg、1.0mmol)及びp−アミノフェニルエタノール(125mg、0.9mmol)を、トリエチルアミン(140μl、1.0mmol)及び5滴のジメチルホルムアミドを伴う2mlのジクロロメタン中に溶解した。反応混合液を室温で2時間攪拌した。組成反応生成物を濃縮し、10mlの酢酸エチル中に溶解し、そして5mlの水、続いて5mlの0.5M・HCl(aq.)、5mlの10 NaHCO3(aq)及び最終的に5mlの水で洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥し、ろ過し、そして溶媒を蒸発させた。生成物をさらにシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーで、トルエン(T)と酢酸エチル(E)の勾配4:1〜1:2(T:E)で溶出することによりさらに精製した。生成物N−(4−(2−(ヒドロキシ)エチル)フェニル)ペンタ−4−インアミドを、NMRとMALDI−TOFにより特徴決定した。
N−(4−(2−(ヒドロキシ)エチル)フェニル)ペンタ−4−インアミド(210mg、1.0mmol)を、4mlのピリジンに溶解した。メタンスルホニルクロリド(MsCl)(100μl、1.3mmol)を0℃で加えた。攪拌した反応物を、室温に戻し、そして室温で5分間反応させた。溶媒を蒸発させ、そして残渣を10mlの酢酸エチルに再溶解させ、そして5mlの水、次に5mlの0.1M・HCl(aq.)、最後に5mlの水で洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥し、ろ過し、そして溶媒を蒸発させて、生成物N−(4−(2−(メタンスルホナート)エチル)フェニル)ペンタ−4−インアミドを生成した。
N−(4−(2−(メタンスルホナート)エチル)フェニル)ペンタ−4−インアミドを、6mlのアセトニトリルに溶解し、そしてN−ヒドロキシフタルイミド(200mg、0.9mmol)及びトリエチルアミン(250μl、1.8mmol)をいれた2mlのアセトニトリルの溶液に加えた。反応混合液を、50℃で2日間攪拌した。反応混合液をつぎに40mlの酢酸エチルで希釈し、そして20mlの0.5M HCl(aq.)で洗浄し、5×30mlの10 NaHCO3(aq)で洗浄して赤色を取り除き、そして最終的に5mlの水で洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥し、ろ過し、そして溶媒を蒸発させた。粗製生成物を10mlのトルエンで再結晶して、N−(4−(2−(N−オキシフタルイミド)エチル)フェニル)ペンタ−4−インアミドを取得し、これをNMR及びMALDI−TOFにより特徴決定した。
N−(4−(2−(N−オキシフタルイミド)エチル)フェニル)ペンタ−4−インアミド(20mg、5.5μmol)及びエチレンジアミン(200μl、3.0mmol)を2mlのエタノールに溶解した。反応液を75℃で2時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、そして粗製生成物を、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーで、トルエン(T)と酢酸エチル(E)の勾配2:1〜1:3(T:E)を用いて精製した。生成物N−(4−(2−(アミノキシ)エチル)フェニル)ペンタ−4−インアミドを、NMR及びMALDI−TOFにより特徴決定した。
N−(4−(2−(アミノキシ)エチル)フェニル)ペンタ−4−インアミド(2.5mg)を計量フラスコに配置し、そしてアセトニトリル(1000μl)を加えてリンカーを溶解させた。
Claims (37)
- 外側被膜層を含む表面を有する固体対象であって、当該外側被膜層が、ポリマーと、哺乳動物血液と相互作用して、凝血又は血栓形成を予防することができる抗凝血実体とを含み、当該抗凝血実体が、チオエーテルを含むリンカーを介して当該ポリマーに共有結合できる、前記固体対象。
- 前記抗凝血実体が、ヘパリン部分である、請求項1に記載の固体対象。
- 前記抗凝血実体が、末端結合されたヘパリン部分である、請求項1又は2に記載の固体対象。
- 前記末端結合されたヘパリン部分が、その還元末端を介して接続されている、請求項3に記載の固体対象。
- 前記抗凝血実体が、全長ヘパリンである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の固体対象。
- 前記表面が、2又はそれより多くの被膜層を含み、外側被膜層のみが、抗凝血実体に結合されている、請求項1〜5のいずれか一項に記載の固体対象。
- 前記表面が、カチオン性ポリマーとアニオン性ポリマーとの1又は複数の被膜二重層を含み、最深部の層が、カチオン性ポリマーの層であり、そして最外層は、カチオン性ポリマーの層であり、それに対し抗凝血実体が、チオエーテルを含むリンカーを介して共有結合する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の固体対象。
- 同じタイプの複数のリンカーを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の固体対象。
- 同じタイプの複数の抗凝血実体を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の固体対象。
- 1を超える抗凝血実体がリンカーに結合されている、請求項1から9のいずれか一項に記載の固体対象。
- 被膜が、カチオン性ポリマーとしてポリアミンを含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の固体対象。
- 前記被膜が、高い平均分子量のポリアミンの層と、アニオン性ポリマーとしてアニオン性多糖の層を含む、請求項11に記載の固体対象。
- 前記ポリアミンが架橋されている、請求項11又は12に記載の固体対象。
- 前記固体対象が、金属又は合成若しくは天然の有機若しくは無機ポリマーを含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の固体対象。
- 医療装置である、請求項1から14のいずれか一項に記載の固体対象。
- 解剖学的部位へのインプラント又は他の配置のための滅菌医療装置である、請求項15に記載の固体対象。
- 前記対象が、表面1平方センチメートルあたり、少なくとも1ピコモル(pmol/cm2)のアンチトロンビンIIIのアンチトロンビンIII結合活性を有する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の固体対象。
- 前記対象が、表面の1平方センチメートルあたり、少なくとも5ピコモル、例えば少なくとも10ピコモル(pmol/cm2)のアンチトロンビンIII結合活性を有する、請求項17に記載の固体対象。
- 外側被膜層を含む表面を有する固体対象の製造方法であって、当該外側被膜層が、ポリマーと、哺乳動物血液と相互作用して凝血又は血栓形成を予防することができる抗凝血実体とを含み、当該抗凝血実体が、チオエーテルを含むリンカーを介して当該ポリマーに共有結合しており;当該方法が、アルケン若しくはアルキン基を有する対応する抗凝血実体を、チオール基を有する対応の表面と反応させるか、或いはチオール基を有する対応する抗凝血実体を、アルケン又はアルキンを有する対応の表面と反応させることを含む、前記方法。
- (a)固体対象を処理して、官能化されてチオール基を有するカチオン性ポリマー外側被膜層を含む表面を提示させ;
(b)チオール基を有するように官能化された当該カチオン性ポリマー外側被膜層を、アルケン又はアルキン基を有するように官能化された抗凝血実体と反応させ;
それにより、抗凝血実体を、チオエーテルを含むリンカーを介してカチオン性ポリマーに結合させる
を含む、請求項19に記載の方法。 - (a)固体対象を処理して、アルケン又はアルキン基を有するように官能化されたカチオン性ポリマー外側被膜層を提示させ;
(b)アルキン基を有するように官能化された当該カチオン性ポリマー外側被膜層を、チオール基を有するように官能化された抗凝血実体と反応させる
を含み、それにより抗凝血実体を、チオエーテルを含むリンカーを介してカチオン性ポリマーに結合させる、請求項19に記載の方法。 - (a)固体対象を処理して、カチオン性表面層を提示させ;
(b)当該カチオン性ポリマー表面層と、チオエーテルを含むリンカーを介して結合されたヘパリンなどの負に荷電した複数の抗凝血実体を有する官能基化カチオン性ポリマーとを結合させ、当該カチオン性ポリマーは、複数の負に荷電した抗凝血実体を有し、そして当該官能化されたカチオン性ポリマーは全体として負荷電を有する
を含む請求項19に記載の方法。 - (a)固体対象を処理して、アニオン性ポリマー表面層を提示させ;
(b)当該アニオン性ポリマー表面層と、チオエーテルを含むリンカーを介して結合されたヘパリンなどの負に荷電した複数の抗凝血実体を有する官能化されたカチオン性ポリマーとを結合させ、当該官能化カチオン性ポリマーは、複数の負に荷電した抗凝血実体を有し、そして全体として正荷電を有する
を含む請求項19に記載の方法。 - 前記アニオン性ポリマーがデキストラン硫酸又はその誘導体である、請求項23に記載の方法。
- 前記カチオン性ポリマーがポリアミンである、請求項20〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固体対象が、医療装置である、請求項19〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固体対象が、多糖とポリアミンの1又は複数の層を含む表面を有し、前記方法が、全体として負の荷電を有する多糖の外側層を有する対応の表面を、全体として正の荷電を有する、チオエーテルを含むリンカーを介して対応の抗凝血実体を有するポリアミンと反応させることを含む、請求項19に記載の方法。
- 前記固体対象が、多糖とポリアミンの1又は複数の層を含む表面を有し、前記方法が、全体として負荷電を有する多糖の外側層を有する対応の表面を、全体として正荷電を有する、チオール又はアルケン若しくはアルキン基を有するポリアミンと反応させ、そして得られた生成物を、アルケン若しくはアルキン、又はチオール基をそれぞれ有する抗凝血実体と反応させることを含む、請求項19に記載の方法。
- 前記固体対象が、多糖とポリアミンの1又は複数の層を含む表面を有し、当該方法が、全体として正荷電を有するポリアミンの外側層を有する対応の表面を、ポリアミンが全体として負の荷電を有するように、チオエーテルを含むリンカーを介して複数の対応の抗凝血実体を有するポリアミンと反応させることを含む、請求項19に記載の方法。
- 請求項19〜29のいずれか一項に記載の方法により取得可能な固体対象。
- チオール又はアルケン基を有するポリアミン表面を有する固体対象。
- 前記チオール又はアルケン基が、リンカーを介してポリアミン表面のアミノ基に結合されている、請求項31に記載の固体対象。
- 医療装置である、請求項31又は32に記載の固体対象。
- 哺乳動物血液と相互作用して、凝血又は血栓形成を予防することができるヘパリン部分であって、当該抗凝血実体が、アルケン又はチオール基を有しており、当該アルケン又はチオール基が、リンカーに結合されており、ここでリンカーがヘパリン部分に末端で結合している、前記ヘパリン部分。
- 全長ヘパリンである、請求項34に記載のヘパリン部分。
- 1又は複数のチオール或いは1又は複数のアルケン基を有する官能化ポリアミン。
- 哺乳動物血液と相互作用して、凝血又は血栓形成を予防することができる抗凝血実体を、チオエーテルを含むリンカーを介して有する官能化ポリアミン。
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