CN116173297A

CN116173297A - 用于固定生物物质的方法的改进

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Publication number: CN116173297A
Application number: CN202310010152.9A
Authority: CN
Inventors: P·安东尼; M·埃里克森; A·盖尔黑根; E·科赫; D·尼斯特罗姆; C·波施-格拉姆; H·戈兰森
Original assignee: Carmeda AB
Current assignee: Carmeda AB
Priority date: 2018-03-09
Filing date: 2019-03-08
Publication date: 2023-05-30
Also published as: KR20200129114A; ES2953184T3; AU2019232163A2; CN111867647A; WO2019170858A1; AU2019232163A1; EP3762055A1; US20220378985A1; JP7365371B2; JP2021514881A; CN111867647B; EP3762055B1; US20190275212A1; SG11202008063YA; CA3093027A1; BR112020017412A2

Abstract

本发明涉及用于固定生物物质的方法的改进。本发明提供了制备固体物体的方法，所述固体物体具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层包含抗凝物质，该方法包含下列步骤：i)用阳离子聚合物处理固体物体表面；ii)用阴离子聚合物处理所述表面；iii)任选地将步骤i)和ii)重复一次或多次；iv)用阳离子聚合物处理所述表面；和v)用抗凝物质处理阳离子聚合物的最外层，由此使抗凝物质共价连接至阳离子聚合物的最外层；其中阴离子聚合物的特征在于具有：(a)650kDa‑10,000kDa的总分子量；和(b)>4μeq/g的溶液电荷密度；且其中步骤ii)在0.25M‑5.0M的盐浓度下进行。

Description

用于固定生物物质的方法的改进

本申请为2019年3月8日提交的发明名称为“用于固定生物物质的方法的改进”的PCT申请PCT/EP2019/055845的分案申请，该PCT申请进入中国国家阶段日期为2020年9月9日，申请号201980018210.4。

技术领域

本发明涉及用于制备具有包含生物物质(entity)的表面涂层的固体物体的方法。特别地，本发明涉及用于制备包含抗凝物质例如肝素的改进的表面涂层的方法和由此得到的某些产品。

背景技术

当医疗装置植入体内或与体液接触时，许多不同的反应开始活动，其中一些反应导致炎症，而一些反应则导致接触装置表面的血液凝固。为了抵消这些严重的不良反应，在将医疗器械植入体内之前或当其与体液接触时，向患者长期全身施用众所周知的抗凝化合物肝素，以便提供抗血栓作用。

凝血酶是几种凝血因子之一，所有这些因子共同起作用，以导致与血液接触的表面形成血栓。抗凝血酶(也称作抗凝血酶III)(“ATIII”)是最主要的凝血抑制剂。它抵消了凝血酶和其他凝血因子的作用，由此约束或限制了血液凝固。肝素显著提高抗凝血酶抑制凝血因子的速率。肝素辅因子II(“HCII”)是另一种在肝素存在下快速抑制凝血酶的凝血因子。

然而，高剂量肝素的全身治疗通常伴随着严重的副作用，其中出血是主要的。肝素疗法的另一种罕见但严重的并发症是发生称作肝素诱导的血小板减少症(HIT)的过敏反应，该反应可导致血栓形成(静脉和动脉都有)。高剂量全身性肝素治疗(例如在手术期间)还需要频繁监测活化凝血时间(用于监测和指导肝素疗法)，并在需要时进行相应的剂量调整。

因此，已经寻求在不必要或可能限制患者全身性肝素化的情况下的解决方案。人们认为，这可以通过利用肝素和其他抗凝剂的抗凝特性对医疗装置进行表面修饰来实现。因此，已经开发了许多或多或少成功的技术，其中将一层肝素附着到医疗装置的表面，由此寻求使表面抗血栓。对于需要长期生物活性的装置，肝素应当理想地具有抵抗浸出和降解的能力。

肝素是在糖单元上携带负电荷的硫酸根和羧酸基团的多糖。因此尝试了肝素与聚阳离子表面的离子结合，但是由于肝素从表面浸出，因此所述表面修饰缺乏稳定性而导致功能丧失。此后，制备了不同的表面修饰，其中肝素已经与表面上的基团共价结合。

使医疗装置具有血栓抗性的最成功方法之一是将肝素片段共价结合到该装置的修饰表面上。多种专利文件中描述了通用方法及其改进方法(参见EP0086186A1、EP0086187A1、EP0495820B1和US6,461,665B1，它们均在此通过引用将其全部内容并入本文)。

这些文件描述了通过使经修饰以带有末端醛基的肝素与经修饰以带有伯氨基基团的医疗装置的表面反应来制备肝素化表面。形成中间体席夫碱，其在原位被还原以形成稳定的仲胺连接基团，从而共价地固定肝素。

在WO2010/029189A2、WO2011/110684A1和WO2012/123384A1中描述了将肝素共价连接到表面、同时保持其活性的其他方法(将其全部内容通过引用并入本文)。

抗凝物质通常固定在已经用一层或多层聚合物或复合物处理的表面上，而不是直接固定在固体物体的表面上。

EP0086187A1描述了一种表面修饰的底物，其上吸附有复合物，其中该复合物具有聚合的阳离子表面活性剂，其包含伯氨基氮官能团和仲氨基和/或叔氨基官能团以及在两个醛基之间具有1-4个碳原子的二醛。阴离子化合物可以另外与所述复合物键合，并且任选地键合另外的阳离子和阴离子交替化合物。

EP0495820B1描述了一种修饰基质表面的方法，该方法包含以下步骤：(a)吸附具有高平均分子量的聚胺并将所述聚胺与巴豆醛交联；(b)然后在交联的聚胺表面上吸附一层阴离子多糖；(c)任选地重复步骤(a)和(b)一次或多次；和(d)在阴离子多糖层或阴离子多糖的最外层上吸附一层提供游离伯氨基的未交联的聚胺层。在随后的步骤中，可以将携带与所述游离伯氨基反应的官能团的生物活性的化学物质与未交联的聚胺结合，例如肝素。

然而，仍然需要包含抗凝物质例如肝素的改进的表面涂层，特别是其中抗凝物质的生物活性得到维持或增强的涂层。这种改进的表面涂层在医疗装置和其他制品中具有潜在的实用性，这些制品将从抗凝表面中受益。

发明人已经发现，令人惊讶地，在其上固定抗凝物质的表面的性质能够显著影响涂层的特性，特别是所得到的抗凝物质的生物活性。特别地，当将抗凝物质固定在包含阳离子和阴离子聚合物的分层的涂层的固体物体的表面上时，谨慎调节阴离子聚合物层的性质和施加条件可以改善所得的固体物体涂层的特性，包括例如它可能具有的抗血栓性质。

发明内容

在一个方面，本发明提供了用于制备固体物体的方法，所述固体物体具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层包含抗凝物质，该方法包含下列步骤：

i)用阳离子聚合物处理固体物体表面；

ii)用阴离子聚合物处理所述表面；

iii)任选地将步骤i)和ii)重复一次或多次；

iv)用阳离子聚合物处理所述表面；和

v)用抗凝物质处理阳离子聚合物的最外层，由此使抗凝物质共价连接至阳离子聚合物的最外层；

其中，

阴离子聚合物的特征在于具有：(a)650kDa-10,000kDa的总分子量；和(b)>4μeq/g的溶液电荷密度；

且其中，

步骤ii)在0.25M-5.0M的盐浓度下进行。

在另一个方面，本发明提供了用于制备固体物体的方法，所述固体物体具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层包含抗凝物质，该方法包含下列步骤：

i)用阳离子聚合物处理固体物体表面；

ii)用阴离子聚合物处理所述表面；

iii)任选地将步骤i)和ii)重复一次或多次；

iv)用阳离子聚合物处理所述表面；和

其中，

阴离子聚合物为包含-SO₃ ^-基团的聚合物，

阴离子聚合物的特征在于具有：(a)650kDa-10,000kDa的总分子量；和(b)占阴离子聚合物重量的10％-25％的硫含量；

且其中，

步骤ii)在0.25M-5.0M的盐浓度下进行。

i)用阳离子聚合物处理固体物体表面；

ii)用阴离子聚合物处理所述表面；

iii)任选地将步骤i)和ii)重复一次或多次；

iv)用阳离子聚合物处理所述表面；和

其中，

阴离子聚合物的特征在于具有650kDa-10,000kDa的总分子量；

阴离子聚合物为硫酸葡聚糖；

且其中，

步骤ii)在0.25M-5.0M的盐浓度下进行。

附图说明

图1：显示具有单一双层的本发明涂层的实施例；

图2：显示用硫酸葡聚糖4、5、6和7以0.25M和1.7M NaCl浓度涂覆的PVC管的标准化的肝素活性(HA)；

图3：显示用硫酸葡聚糖5、应用不同浓度的不同盐涂覆的PVC管的标准化肝素活性(HA)；

图4：显示用硫酸葡聚糖3、4、5、6和7以1.7M NaCl浓度涂覆的PVC管的肝素浓度(HC)；

图5：显示用硫酸葡聚糖3、4、5、6和7以不同NaCl浓度涂覆的PVC管的肝素浓度(HC)；

图6：显示用硫酸葡聚糖5、应用不同浓度的不同盐涂覆的PVC管的肝素浓度(HC)；

图7：显示用硫酸葡聚糖3、4和5以1.7M NaCl浓度涂覆的PVC管的ζ电位；

图8：显示用硫酸葡聚糖3、6和7以1.7M NaCl浓度涂覆的PVC管的ζ电位；

图9：显示用硫酸葡聚糖3、4和5以0.25M NaCl浓度涂覆的PVC管的ζ电位；

图10：显示用硫酸葡聚糖3、6和7以0.25M NaCl浓度涂覆的PVC管的ζ电位；

图11：显示用硫酸葡聚糖5以不同NaCl浓度涂覆的PVC管的ζ电位；

图12：显示用硫酸葡聚糖5以不同Na₂HPO₄浓度涂覆的PVC管的ζ电位；

图13：显示用硫酸葡聚糖5以不同Na₂SO₄浓度涂覆的PVC管的ζ电位；

图14：显示用硫酸葡聚糖2、4、5、6和7以0.25M NaCl浓度涂覆的PVC管的保存的血小板(％)；

图15：显示用硫酸葡聚糖2、4、5、6和7以0.25M NaCl浓度涂覆的PVC管的F1+2(凝血酶原片段)；

图16：显示用硫酸葡聚糖4、5、6和7以1.7M NaCl浓度涂覆的PVC管的保存的血小板(％)；

图17：显示用硫酸葡聚糖4、5、6和7以1.7M NaCl浓度涂覆的PVC管的F1+2(凝血酶原片段)；

图18：显示在温度和湿度测试之前和之后用硫酸葡聚糖4以0.25M NaCl浓度涂覆的PVC管的保存的血小板(％)；

图19：显示在温度和湿度测试之前和之后用硫酸葡聚糖4以0.25M NaCl浓度涂覆的PVC管的F1+2(凝血酶原片段)；

图20：显示在温度和湿度测试之前和之后用硫酸葡聚糖4、5和7以1.7MNaCl浓度涂覆的PVC管的保存的血小板(％)；

图21：显示在温度和湿度测试之前和之后用硫酸葡聚糖4、5和7以1.7MNaCl浓度涂覆的PVC管的F1+2(凝血酶原片段)；

图22：显示本发明的固体物体的典型ζ电位分布谱。

图23：显示肝素的活性五糖序列。

发明详述

固体物体

使用本发明的方法可以潜在地涂覆任何固体物体，不过，这样的涂层和方法对于医疗装置、分析装置、分离装置以及包括膜的其他工业化制品特别有用。

固体物体可以具有抗血栓表面。在本发明的某些实施方案中，抗血栓表面可通过固定抗凝物质而表现出对凝血反应的直接药理学抑制作用。在本发明的某些实施方案中，抗血栓表面在与血液接触时不会引起任何明显的临床上显著的不良反应，例如血栓形成、溶血、血小板、白细胞和补体活化和/或其他与血液相关的不良反应。

在本领域中，术语“血液相容的”，“非血栓形成性”，“抗血栓形成性”等通常可以解释为等同于术语“抗血栓的”。

在一个实施方案中，固体是医疗装置。当固体物体是医疗装置时，适合地，其为抗血栓的医疗装置。因此，在一个实施方案中，固体物体是抗血栓的医疗装置。为了本专利申请的目的，术语“医疗装置”是指体内或体外装置，但是更通常地是指体内医疗装置。

体内医疗装置是在例如脉管系统或其他体腔、空间或空腔内的解剖结构内使用的装置，其典型地可提供治疗作用。体内装置可以具有长期或临时的用途。在立即进行外科手术后，将长期使用的装置部分或全部留在解剖结构中，以递送它们，例如支架或支架-移植物。临时或短期使用的装置包括那些被暂时插入治疗区域(即被插入并随后在相同的手术步骤中取出)的装置，例如医用气囊。在一个实施方案中，固体物体为体内医疗装置。

可以为永久性或临时性的体内医疗装置的实例包括支架，包括分叉式支架、球囊扩张式支架、自展式支架、神经血管支架和分流支架，支架-移植物，包括分叉式支架-移植物，移植物，包括血管移植物和分叉状移植物，护鞘，包括可缩回的护鞘，例如介入式诊断和治疗护鞘、大口径和标准口径的血管内递送护鞘、带或不带止血控制以及具有或不具有转向装置的动脉导入器护鞘、微导入器护鞘、透析通路护鞘、引导护鞘和经皮护鞘，扩张器，咬合器，例如血管封堵器，栓塞过滤器，栓子清除术装置，导管，人造血管，血液留置监测装置；瓣膜，包括人工心脏瓣膜，起搏器电极，导丝，心脏导联，心肺转流术回路，套管，插头，药物递送装置，气囊，组织贴片装置，血泵，贴片，管线，例如长期输注管线或动脉线，放置线，用于连续蛛网膜下腔输注的装置，饲管，CNS分流器，例如脑室胸腔分流器、脑室心房(VA)分流器、脑室腹腔(VP)分流器、房室分流器、门体分流器和用于腹水的分流器。

导管(catheter)的实例包括但不限于微导管、中心静脉导管、周围静脉内导管、血液透析导管，导管例如涂覆的导管，包括可植入的静脉导管，穿通的静脉导管，用于血管造影术、血管成形术或心脏或周围静脉和动脉中的超声操作的冠状动脉导管，包含分光镜或成像能力的导管，肝动脉滴注导管，CVC(中心静脉导管)，周围静脉内导管，周围插入的中心静脉导管(PIC管线)，流动定向的气囊镶齿的肺动脉导管，胃肠外全面营养导管，长期留置导管(例如长期留置胃肠道导管和长期留置泌尿生殖器导管)，腹膜透析导管，CPB导管(心肺转流术)，导尿管和微导管(例如用于颅内应用)。

在一个实施方案中，固体物体为体内医疗装置，其选自支架、支架-移植物、护鞘、扩张器、封堵器、瓣膜、栓塞过滤器、栓子清除术装置、导管、人造血管、血液留置监测装置、阀门、起搏器电极、导线、心脏导联、心肺转流术回路、套管、插头、药物递送装置、气囊、组织贴片装置、血泵、贴片、管线、放置线，用于蛛网膜下腔连续输注的装置、饲管和分流器。在一个具体的实施方案中，固体物体为支架或支架-移植物。

在一个实施方案中，所述体内医疗装置可以用于神经、外周、心脏、矫形、皮肤或妇科应用。在一个实施方案中，所述支架可用于心脏、外周或神经系统应用。在一个实施方案中，所述支架-移植物可用于心脏、外周或神经系统应用。在一个实施方案中，所述护鞘可用于颈动脉、肾脏、经桡动脉、经中隔、儿科或显微应用。

体外医疗设备的示例是血液处理设备和输血设备。在一个实施方案中，所述体内医疗装置可用于神经、外周、心脏、矫形外科、皮肤或妇科应用。在一个实施方案中，体外医疗装置为充氧器。在另一个实施方案中，体外医疗装置为能够去除病毒、细菌、引起败血症的促炎细胞因子和毒素的过滤器。

例如，膜可以是血液透析膜。

例如，分析装置可以是用于执行分析方法的固体支持物，例如色谱法或免疫学测定、反应化学或催化。这些装置的实例包括载玻片、珠子、孔板和膜。

例如，分离装置可以是用于进行分离方法的固体支持物，例如蛋白质纯化、亲和色谱或离子交换。这类装置的实例包括过滤器和柱。

固体物体尤其可以包含金属、合成的或天然存在的有机或无机聚合物、陶瓷材料、基于蛋白质的材料或基于多糖的材料，或由它们构成。

适合的金属包括但不限于生物相容的金属，例如钛、不锈钢、高氮不锈钢、钴、铬、镍、钽、铌、金、银、铑、锌、铂、铷、铜和镁，以及其组合(合金)。适合的合金包括钴-铬合金，例如L-605、MP35N、Elgiloy，钛合金，包括镍-钛合金(例如镍钛诺)，钽合金，铌合金(例如Nb-1％ Zr)等。

在一个实施方案中，所述生物相容的金属为镍-钛合金，例如镍钛诺。

合成的或天然存在的有机或无机聚合物包括聚烯烃，聚酯(例如聚对苯二甲酸乙二酯和聚对苯二甲酸丁二酯)，聚酯醚，聚酯弹性体共聚物(例如可Wilmington,Del.的杜邦公司以商品名HYTREL.RTM购得的那些)，含氟聚合物，含氯聚合物(例如聚氯乙烯(PVC))，嵌段共聚物弹性体(例如具有苯乙烯端嵌段和由丁二烯、异戊二烯、乙烯/丁烯、乙烯/丙烯形成的中间嵌段的那些共聚物)，嵌段共聚物(例如苯乙烯嵌段共聚物，例如丙烯腈-苯乙烯和丙烯腈-丁二烯-苯乙烯嵌段共聚物，或其中特定嵌段共聚物为热塑性弹性体的嵌段共聚物，其中嵌段共聚物由聚酯或聚酰胺的硬链段和聚醚的软链段构成)，聚氨酯，聚酰胺(例如尼龙12、尼龙11、尼龙9、尼龙6/9和尼龙6/6)，聚醚嵌段酰胺(例如

)，聚醚酯酰胺，聚酰亚胺，聚碳酸酯，聚苯硫醚，聚苯醚，聚醚，硅酮，聚碳酸酯，聚甲基丙烯酸羟乙酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯醇，橡胶，硅酮橡胶，聚羟酸，聚烯丙胺，聚烯丙醇，聚丙烯酰胺，聚丙烯酸，聚苯乙烯，聚四氟乙烯，聚甲基丙烯酸甲酯，聚丙烯腈，聚(乙酸乙烯酯)，聚(乙烯醇)，聚甲醛，聚碳酸酯，酚醛塑料，氨基环氧树脂，基于纤维素的塑料，和橡胶样塑料，生物可吸收性物质(例如聚(D,L-丙交酯)和聚糖脂，以及它们的共聚物)，其衍生物以及其混合物。这些材料的组合可以在交联和不交联的情况下使用。这些种类中的一些既可以作为热固性材料也可以作为热塑性聚合物使用。如本文所用，术语“共聚物”将用于指由两种或多种单体例如2、3、4、5种等形成的任意聚合物。

氟化的聚合物(含氟聚合物)包括氟聚合物，例如膨体聚四氟乙烯(ePTFE)，聚四氟乙烯(PTFE)，氟化乙烯-丙烯(FEP)，全氟化碳共聚物(例如四氟乙烯全氟烷基乙烯基醚(TFE/PAVE)共聚物和四氟乙烯(TFE)和全氟甲基乙烯基醚(PMVE)的共聚物)，以及在聚合物链之间具有交联和不具有交联的上述的组合。

在一个实施方案中，固体物体包含聚醚-嵌段-酰胺例如

在另一个实施方案中，固体物体包含含氯聚合物(例如PVC)或含氟聚合物(例如ePTFE)。

聚合物基材可以任选地与填充剂和/或着色剂共混。因此，适合的基材包括着色的材料，例如着色的聚合物材料。

陶瓷基质可以包括但不限于氧化硅，氧化铝，氧化铝，二氧化硅，羟基磷灰石，玻璃，氧化钙，聚硅醇和氧化亚磷。

基于蛋白质的材料包括丝和羊毛。基于多糖的材料包括琼脂糖和藻酸盐。

抗凝物质(anticoagulant entity)

抗凝物质为能够与哺乳动物血液发生相互作用以防止或减轻凝血或血栓形成的物质。

抗凝物质包括：肝素部分，硫酸皮肤素部分，二硫酸皮肤素部分，水蛭素，依替巴肽，替罗非班(tirofibran)，尿激酶，D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，含RGD肽的化合物，AZX100(模拟HSP20的细胞肽，Capstone Therapeutics公司,USA)，血小板受体拮抗剂，抗凝血酶抗体，抗血小板受体抗体，阿司匹林，前列腺素抑制剂，血小板抑制剂(例如氯吡格雷，一氧化氮(NO)，前列腺素和阿昔单抗)，抗血小板肽，香豆素(即4-羟基香豆素类的维生素K拮抗剂，例如华法林)，阿加曲班，血栓调节蛋白，抗凝蛋白，抗凝酶类(例如三磷酸腺苷双磷酸酶)。在一个实施方案中，抗凝物质选自肝素部分、硫酸皮肤素部分和二硫酸皮肤素部分。

在一个实施方案中，抗凝物质为糖胺聚糖。在一个实施方案中，抗凝物质为凝血酶抑制剂。

术语“肝素部分”是指肝素分子、肝素分子的片段、肝素分子的衍生物或肝素分子的类似物。

在一个实施方案中，抗凝物质为肝素部分。适合地，所述肝素部分选自：全长肝素(天然肝素)，肝素的碱金属或碱土金属盐(例如肝素钠(例如Hepsal或Pularin)，肝素钾(例如Clarin)，肝素锂，肝素钙(例如Calciparine)或肝素镁(例如Cutheparine))，低分子量肝素(例如阿地肝素钠、亭扎肝素钠或达肝素钠)，硫酸乙酰肝素，类肝素，基于肝素的化合物，具有疏水性抗衡离子的肝素，能够通过抗凝血酶介导的抑制因子Xa作用的合成肝素组合物(例如“磺达肝癸钠”组合物(例如来自葛兰素史克公司的Arixtra))和合成的肝素衍生物，其至少包含来自肝素的活性五糖序列(参见例如Petitou等人,Biochimie,2003,85(1-2):83-9)。其他肝素部分包括通过例如适度亚硝酸降解(US4,613,665A，其通过引用全文并入本文)或高碘酸盐氧化(US6,653,457B1，通过引用全文并入本文)和其他本领域已知的修饰反应所修饰的肝素，其中肝素部分的活性得以保留。肝素部分还包括如下所述与连接基团或间隔基团结合的部分。在一个实施方案中，所述肝素部分为全长肝素。

例如，低分子量肝素可以通过氧化解聚、酶降解或脱氨基裂解制备。

在一个实施方案中，肝素部分为肝素片段。可以使用本领域公知的技术生产肝素片段。适合地，所述片段为通过包含降解(例如片段化)天然肝素的方法生产的天然肝素的片段。如下文实施例2e中所示例的，肝素片段可通过天然肝素的部分亚硝酸裂解、任选地随后通过凝胶色谱法分级分离来制备。或者可以通过合成方式生产肝素片段。合成生产可以包括化学酶促和/或传统有机化学方法。

肝素的抗凝活性主要取决于结合抗凝血酶(AT)的五糖序列(‘活性五糖序列’或‘活性序列’；参见图23)。适合地，肝素片段包含活性五糖序列。

例如，肝素片段可以具有5-30、例如5-20、例如5-18、例如5-17、例如5-10、例如6-10个糖残基的长度。或者，例如肝素片段可以具有6-30、例如6-20、例如6-18、例如6-17个糖残基的长度。

US6,461,665B1(Scholander；其通过引用并入本文)公开了通过在固定前处理肝素而改善表面固定的肝素的抗血栓形成活性。这种改善通过在升温下或在升高pH下处理肝素，或通过使肝素接触亲核催化剂，例如胺、醇或硫醇或固定的氨基、羟基或硫醇基来实现。

抗凝物质共价固定在固体物体表面上，因此，基本上不会从所述固体物体上洗脱或浸出。如下所述，可以通过不同方法共价固定抗凝物质。

抗凝物质共价连接至阳离子聚合物的最外层。

适合地，抗凝物质连接于阳离子聚合物的端点，特别是当抗凝物质为肝素部分时。因此，在一个实施方案中，抗凝物质为末端连接的抗凝部分。在一个特定的实施方案中，抗凝物质为末端连接的肝素部分。在适用的情况下，抗凝物质优选通过其还原末端连接。因此，在一个实施方案中，抗凝物质通过其还原末端连接。在一个特定的实施方案中，抗凝物质为通过其还原末端(有时称为还原末端的位置C1)连接的末端连接的肝素部分。末端连接的优势，尤其是还原末端连接的优势在于，由于增强了利用度，因此，与抗凝物质(例如肝素部分)在其他位置的连接相比，抗凝物质(例如肝素部分)的生物活性得以最大化。

在EP0086186B1(Larm；其通过引用整体并入本文)中描述了代表性末端连接方法，该方法公开了将寡聚或聚合的有机物质与包含伯氨基基团的不同类型的底物共价结合的方法。通过重氮化将待偶联的物质(其可以是肝素)进行降解，以形成具有游离末端醛基的物质片段。然后，该物质片段通过其醛基与底物的氨基反应形成席夫碱，然后将其(通过还原)转化为仲胺。肝素末端连接的优势，尤其是还原末端连接(如以上在EP0086186B1中所述)的优势在于，由于抗凝血酶相互作用位点的利用度比在肝素部分中的其他连接更高，因此肝素部分的生物活性得以最大化。

抗凝物质可以通过连接基团共价连接至阳离子聚合物的最外层。因此，在一个实施方案中，抗凝物质通过连接基团共价连接。

在一个实施方案中，所述连接基团包含仲胺。通过仲胺使肝素部分共价连接至聚合物的代表性的方法描述在EP0086186B1中。

在一个实施方案中，所述连接基团包含仲胺。通过涉及3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)的酰胺化反应使肝素部分与聚合物共价键合的代表性方法在WO2012/123384A1中描述(其通过引用整体并入本文)。

在一个实施方案中，所述连接基团包含1,2,3-三唑。通过1,2,3-三唑键合使肝素部分共价连接至聚合物的代表性的方法描述在WO2010/029189A2中(Carmeda AB，其通过引用整体并入本文)。该文献描述了聚胺的叠氮化物-或炔-官能化；炔-和叠氮化物-官能化的肝素的制备(天然的和亚硝酸降解的肝素)；和使衍生的肝素与衍生的聚合物通过1,2,3-三唑连接基团连接的反应。

在一个实施方案中，所述连接基团包含硫醚。通过硫醚键合使肝素部分共价连接至聚合物的代表性的方法描述在WO2011/110684A1中(Carmeda AB等人，其通过引用整体并入本文)。

阳离子聚合物

阳离子聚合物可以为直链聚合物，但更通常是支链聚合物，例如超支化聚合物。在一个实施方案中，阳离子聚合物为支链阳离子聚合物。阳离子聚合物任选地是交联的。在一个实施方案中，阳离子聚合物包含伯/仲胺基团。在一个实施方案中，阳离子聚合物为聚胺，其任选地是交联的。适合地，阳离子聚合物(例如聚胺)具有5kDa-3,000kDa的分子量，例如5kDa-2,000kDa，5kDa-1,500kDa，5kDa-1,000kDa，5kDa-800kDa，5kDa-500kDa，5kDa-300kDa或5kDa-200kDa或800kDa-3,000kDa。当阳离子聚合物(例如聚胺)是交联的时，它适合地使用醛交联剂例如巴豆醛和/或戊二醛交联。在一个实施方案中，阳离子聚合物为聚亚烷基亚胺，例如聚乙烯亚胺。

阳离子聚合物形成阳离子聚合物和阴离子聚合物的逐层涂层的组成部分，该涂层通过用阳离子和阴离子聚合物层交替处理固体物体的表面而形成。双层在本文中定义为一层阳离子聚合物和阴离子聚合物。在逐层涂层中，通常在阴离子聚合物之前涂覆阳离子聚合物，即通常首先用权利要求1)中的第一层阳离子聚合物处理固体物体的表面(步骤i)，随后，在权利要求1)的步骤ii中涂覆第一层阴离子聚合物。根据所需的双层数目的不同，可涂覆阳离子聚合物和阴离子聚合物的其他层(权利要求1中的步骤iii)。当完成阳离子和阴离子聚合物的最终(也可能是第一个)双层时，然后涂覆一层阳离子聚合物(对应于权利要求1中的步骤iv)。然后用抗凝物质处理阳离子聚合物的该层(即最外层)，以便将抗凝物质共价连接至阳离子聚合物层上。因此，可以认为阳离子聚合物的外涂层“包含”抗凝物质。在所述逐层涂层中，最内层是阳离子聚合物的层，而最外层是抗凝物质共价连接至其上的阳离子聚合物的外涂层(参见图1)。

在一个实施方案中，步骤i)的阳离子聚合物为聚胺，其任选地为交联的。在一个实施方案中，步骤iv)的阳离子聚合物为聚胺，其任选地为交联的。在一个实施方案中，步骤i)的阳离子聚合物与步骤iv)的阳离子聚合物相同。

WO2012/123384A1(Gore Enterprise Holdings,Inc.等人,其通过引用整体并入本文)公开了一种具有涂层的装置，该涂层包含多个带有抗凝物质、特别是肝素的超支化聚合物分子。此类超支化聚合物分子可用于阳离子聚合物的最外层，即，此类超支化聚合物可用作步骤iv)的阳离子聚合物，然后在步骤v)中被修饰以携带抗凝物质。

阴离子聚合物

适合于本发明的阴离子聚合物携带来自–COOH、-SO₃H和-PO₃H₂的脱质子化的官能团。因此，在一个实施方案中，阴离子聚合物为包含选自-CO₂ ^-、-SO₃ ^-、-PO₃H^-和-PO₃ ^2-基团的聚合物。适合地，阴离子聚合物为包含-SO₃ ^-基团的聚合物。更适合地，阴离子聚合物携带的脱质子化官能团由-SO₃ ^-基团组成。

阴离子聚合物适合地为阴离子的糖胺聚糖或多糖。聚合物的阴离子特性典型地来源于沿聚合物链的羧酸根或硫酸根基团。因此，在一个实施方案中，阴离子聚合物为带有羧酸根和/或硫酸根基团的糖胺聚糖或多糖，特别是带有羧酸根和/或硫酸根基团的糖胺聚糖。阴离子聚合物可以是支链或非支链的。在一个实施方案中，阴离子聚合物和抗凝物质不相同。

在一个实施方案中，阴离子聚合物为任选交联的。

在一个实施方案中，阴离子聚合物选自硫酸葡聚糖、透明质酸、聚(2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸)、聚(2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸-共-丙烯腈)丙烯腈、聚(丙烯酸)、聚茴香磺酸、聚(4-苯乙烯磺酸钠)、聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)、聚(硫酸乙烯酯)、聚乙烯磺酸以及其盐。适合地，阴离子聚合物为硫酸葡聚糖。

硫酸葡聚糖为脱水葡萄糖的硫酸化聚合物。硫酸葡聚糖的硫酸化程度和由此的硫含量可以变化。

在一些实施方案中硫含量为10％-25％重量，例如硫含量为15％-20％重量。

在一个实施方案中，阴离子聚合物的特征在于具有750kDa-10,000kDa、例如1,000kDa-10,000kDa的总分子量。在一个实施方案中，阴离子聚合物的特征在于具有650kDa-1,000kDa、例如750kDa-1,000kDa的总分子量。在一个实施方案中，阴离子聚合物的特征在于具有1,000kDa-4,500kDa、例如2,000kDa-4,500kDa的总分子量。在一个实施方案中，阴离子聚合物的特征在于具有4,500kDa-7,000kDa的总分子量。在一个实施方案中，阴离子聚合物的特征在于具有7,000kDa-10,000kDa的总分子量。适合地，根据评价方法G来测定阴离子聚合物的总分子量。

在一个实施方案中，阴离子聚合物的特征在于具有在>4μeq/g到7μeq/g、例如在>5μeq/g到7μeq/g之间的溶液电荷密度。适合地，阴离子聚合物的溶液电荷密度根据评价方法H测定。

阳离子和阴离子聚合物的涂层双层

本发明的方法涉及形成固体物体，其具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面。如上所述，将一个双层在本文定义为一层阳离子聚合物和阴离子聚合物(参见图1)。

分层的涂层包含一个或多个涂层双层，例如2个或更多，3个或更多，4个或更多，5个或更多，6个或更多，7个或更多，8个或更多，9个或更多或10个或更多个涂层双层。当涂覆一个以上的涂层双层时，重复步骤i)和ii)，即步骤iii)不是任选的。在本发明方法的一个实施方案中，步骤iii)不是任选的。在该实施方案中，将步骤iii)重复多次以达到所需的涂层双层所必须的数量，例如1次，2次，3次，4次，5次，6次，7次，8次或9次。在本发明方法的一个实施方案中，在步骤iii)中，将步骤i)和ii)重复1至10次，例如1、2、3、4、5或6次。

如果步骤iii)不是任选的(即当步骤i)和ii)重复一次或多次时)，则每个重复的精确工艺条件不必相同(例如，在步骤ii)中用阴离子聚合物处理所述表面中使用的盐类型和/或浓度在每次重复中不一定相同)。在一个实施方案中，在每次重复中，加工条件(例如，在步骤ii)中用阴离子聚合物处理所述表面中使用的盐的类型和/或浓度)是相同的。

方法步骤

本发明提供了用于制备固体物体的方法，所述固体物体具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层包含抗凝物质，该方法包含下列步骤：

i)用阳离子聚合物处理固体物体表面；

ii)用阴离子聚合物处理所述表面；

iii)任选地将步骤i)和ii)重复一次或多次；

iv)用阳离子聚合物处理所述表面；和

其中，

且其中，

步骤ii)在0.25M-5.0M的盐浓度下进行。

应当注意，步骤i)-v)以给定顺序依次地进行，即，步骤i)-iv)的每一个步骤隐含地跟随有“然后”。这不排除在每个指定步骤i)-v)之间进行一个或多个其他步骤。因此，在一个实施方案中，本发明的方法还包含步骤i)与步骤ii)之间，步骤ii)与步骤iii)之间，步骤iii)与步骤iv)之间或步骤iv)与步骤v)之间的步骤。

例如，应当理解，洗涤步骤可在所述的加工步骤之间进行。

发明人令人惊讶地发现，步骤ii)的盐浓度(即当涂覆阴离子聚合物涂层时所存在的盐浓度)影响固体物体涂层的所得到的特性，特别是最终固体物体的抗血栓性质。发明人发现，当在盐浓度为0.25M-5.0M下进行步骤ii)时，所得固体物体的涂层的特性，特别是最终固体物体的抗血栓性质可以得到改善，如实施例2a和3a中所示。

在一个实施方案中，步骤ii)在0.25M-4.0M的盐浓度下进行，例如0.25M-3.0M、0.5M-3.0M、1.0M-3.0M、1.5M-3.0M、0.25M-1.5M、0.5M-1.5M、0.75M-1.5M或1.0M-2.0M，特别是1.0M-3.0M的盐浓度，例如1.0M-2.0M或0.75M-1.5M或1.5M-3.0M。

在一个实施方案中，所述盐为无机盐。适合地，所述盐选自钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、锂盐、铵盐、钡盐和锶盐。

在一个实施方案中，所述盐为无机钠盐。

在一个实施方案中，所述盐选自氯化钠、硫酸钠、磷酸氢钠和磷酸钠。

在一个实施方案中，所述盐为氯化钠。

在一个实施方案中，所述盐不为氯化钠。

在一个实施方案中，所述盐为0.25M-3.0M浓度的氯化钠，例如0.5M-3.0M，例如1.0M-3.0M，例如1.5M-3.0M。

在一个实施方案中，所述盐为0.25M-1.5M浓度的硫酸钠，例如0.5M-1.5M，例如0.75M-1.5M。

在一个实施方案中，所述盐为0.25M-3.0M浓度的磷酸氢钠，例如0.5M-3.0M，例如1.0M-3.0M，例如1.0M-2.0M。

在一个实施方案中，所述盐为0.25M-3.0M浓度的磷酸钠，例如0.5M-3.0M，例如1.0M-3.0M，例如1.0M-2.0M。

在步骤i)(用阳离子聚合物处理固体物体表面)之前，固体物体的表面可以任选地经历预处理步骤。

预处理步骤可以为清洁步骤，以改善后续涂层的附着力和表面覆盖率。适合的清洁剂包括溶剂，例如醇，高pH值的溶液，例如包含醇和氢氧化物化合物的水溶液(例如氢氧化钠)的混合物的溶液，氢氧化钠溶液，包含四甲基氢氧化铵(TMAH)的溶液，酸性溶液，如食人鱼溶液(硫酸和过氧化氢的混合物)，碱性食人鱼溶液，和其他氧化剂，包括硫酸和高锰酸钾的组合或不同类型的过氧硫酸或过氧二硫酸溶液(也可为铵、钠和钾盐)，或通过在空气、氩气或氮气气氛或其组合中使固体物体经受等离子体处理。

因此，在一个实施方案中，本发明的方法在步骤i)之前还包含预处理步骤。适合地，预处理步骤为清洁步骤。

或者，预处理步骤可以包括在涂覆步骤i)-v)之前，将根据步骤i)-v)的待涂覆的固体物体的表面用例如聚合物或底涂层这样的材料覆盖。该“预备性”涂层可以例如允许将待涂覆的固体物体的表面“雕刻”或修饰以产生期望的表面形貌或质地，从而优化随后的分层涂覆工艺。所述附加涂层还可以改善随后的分层涂层的粘附性，特别是有助于在加工过程中维持其完整性。这种在固体物体上的底涂层的实例为使用化学气相沉积(CVD)涂覆的涂层。这种在固体物体上的底涂层的另一个实例是聚多巴胺或其类似物的涂层。

在一个实施方案中，预处理步骤包含用聚合物处理固体物体表面，所述聚合物选自聚烯烃，聚异丁烯，乙烯-α-烯烃共聚物，丙烯酸聚合物，丙烯酸共聚物，聚氯乙烯，聚乙烯基甲基醚，聚偏二氟乙烯，聚偏二氯乙烯，氟聚合物(例如膨体聚四氟乙烯(ePTFE)，聚四氟乙烯(PTFE)，氟化乙烯-丙烯(FEP)，全氟化碳共聚物，例如四氟乙烯全氟烷基乙烯基醚(TFE/PAVE)共聚物，四氟乙烯(TFE)与全氟甲基乙烯基醚(PMVE)的共聚物，TFE与包含乙酸酯、醇、胺、酰胺、磺酸酯官能团等的官能单体的共聚物，如美国专利号8,658,707(WL Gore和Associates)中所述，其通过引用完整地并入本文；及其组合)，聚丙烯腈，聚乙烯酮，聚苯乙烯，聚醋酸乙烯酯，乙烯-甲基丙烯酸甲酯共聚物，丙烯腈-苯乙烯共聚物，ABS树脂，尼龙12，尼龙12的嵌段共聚物，聚己内酯，聚甲醛，聚醚，环氧树脂，聚氨酯，人造丝-三乙酸酯，纤维素，醋酸纤维素，丁酸纤维素，赛璐酚，硝酸纤维素，丙酸纤维素，纤维素醚，羧甲基纤维素，几丁质，聚乳酸，聚乙醇酸，聚乳酸-聚环氧乙烷共聚物，聚乙二醇，聚丙二醇，聚乙烯醇，弹性体聚合物，例如硅酮(例如聚硅氧烷或取代的聚硅氧烷)，聚氨酯，热塑性弹性体，乙烯乙酸乙烯酯共聚物，聚烯烃弹性体，EPDM橡胶及其混合物。

在一个实施方案中，提供了用于制造如本文所述的固体物体的方法，该方法由如本文所定义的步骤i)-v)组成，即，除了由步骤i)-v)产生的那些之外，该固体物体没有其他涂层。

可以对根据本发明的方法涂覆的固体物体进行灭菌。适合的灭菌方法包括但不限于使用环氧乙烷、蒸气过氧化氢、等离子体相过氧化氢、干热、高压釜蒸汽灭菌、二氧化氯灭菌、伽马射线灭菌或电子束灭菌进行灭菌。

如实施例7中所示，使根据本发明的方法涂覆的固体物体经受升高的温度和湿度并保持其抗血栓性质。温度和湿度升高的条件可以用作严格的灭菌条件的模拟，尤其是环氧乙烷灭菌条件。因此，预期根据本发明的方法涂覆的固体物体可被稳定地灭菌。

涂层特性

典型地，涂层具有约10nm-约1000nm、例如约10nm-约800nm、例如约10nm-约500nm、约10nm-约400nm、约10nm-约300nm、约10nm-约200nm或约10nm-约100nm的平均总厚度。可以使用适合的涂层厚度分析仪或量规，通过使用具有深度测定谱的X线光电子分光镜检查(参见评价方法J)或通过使用具有消散的石英晶体微天平(参见评价方法O)来测量涂层厚度。适合地，使用评价方法O测量涂层厚度。

在一个实施方案中，根据本发明方法涂覆的固体物体具有至少1pmol/cm²用于结合ATIII的表面、例如至少2pmol/cm²用于结合ATIII的表面、至少3pmol/cm²用于结合ATIII的表面、至少4pmol/cm²用于结合ATIII的表面或至少5pmol/cm²用于结合ATIII的表面的抗凝物质活性(特别是肝素活性)，适合地，其根据评价方法B测定。

在一个实施方案中，固体物体的抗血栓表面具有至少1pmol/cm²用于结合ATIII的表面、例如至少2pmol/cm²用于结合ATIII的表面、至少3pmol/cm²用于结合ATIII的表面、至少4pmol/cm²用于结合ATIII的表面或至少5pmol/cm²用于结合ATIII的表面的抗凝物质活性(特别是肝素活性)，适合地，其根据评价方法B测定。

在一个实施方案中，根据本发明方法涂覆的固体物体具有至少5pmol/cm²用于结合HCII的表面、例如至少12pmol/cm²用于结合HCII的表面、至少20pmol/cm²用于结合HCII的表面、至少50pmol/cm²用于结合HCII的表面的抗凝物质活性(特别是肝素活性)，适合地，其根据评价方法M测定。

在一个实施方案中，固体物体的抗血栓表面具有至少5pmol/cm²用于结合HCII的表面、例如至少12pmol/cm²用于结合HCII的表面、至少20pmol/cm²用于结合HCII的表面、至少50pmol/cm²用于结合HCII的表面的抗凝物质活性(特别是肝素活性)，适合地，其根据评价方法M测定。

在一个实施方案中，根据本发明方法涂覆的固体物体具有至少80％保存的血小板、例如至少85％保存的血小板、例如至少90％保存的血小板的血液接触性能，适合地，其根据评价方法E测定。

在一个实施方案中，固体物体的抗血栓表面具有至少80％保存的血小板、例如至少85％保存的血小板、例如至少90％保存的血小板的血液接触性能，适合地，其根据评价方法E测定。

在一个实施方案中，根据本发明方法涂覆的固体物体具有<10,000pmol/L、例如小于7,500pmol/L、小于5,000pmol/L或小于4,000pmol/L的F1+2值，适合地，其根据评价方法F测定。

在一个实施方案中，固体物体的抗血栓表面具有<10,000pmol/L、小于7,500pmol/L、小于5,000pmol/L或小于4,000pmol/L的F1+2值，适合地，其根据评价方法F测定。

在一个实施方案中，抗凝物质为肝素部分，其中固体物体具有至少1μg/cm²例如至少2μg/cm²、至少4μg/cm²、至少5μg/cm²或至少6μg/cm²的肝素浓度。适合地，其根据评价方法A测定。

适合地，可使用评价方法D测定根据本发明的方法涂覆的固体物体的ζ电位谱。图22显示根据本发明的方法涂覆的固体物体的典型的ζ电位谱，其表明可以使用多种参数定性和定义ζ电位谱，特别是等电点(IEP)(1A)，它对应于ζ电位为0mV时的特定pH值；曲线的总体极小值(总体最低值)对应于ζ电位(2B)最小时的pH(2A)；和对应于在总体极小值(3A)时的ζ电位与在pH 9(3B)时的ζ电位之差的Δ值(Δ)。

如图7-13(实施例4a和4b)中可见，对于根据本发明的方法用硫酸葡聚糖4-7涂覆的固体物体已经获得了相似的泽塔(ζ)电位谱。因此，至少在其优选方面，ζ电位谱可视为根据本发明的方法涂覆的固体物体的电位指纹。根据该电位指纹，优选IEP(1A)低于pH 3，曲线的总体极小值(2A)低于pH 5，并且Δ值，即在总体极小值(3A)时的ζ电位和在pH 9(3B)时的ζ电位之差，至少为20mV。适合地，这些参数根据评估方法D测定。

适合地，根据本发明方法涂覆的固体物体具有带有低于pH 3的等电点(IEP)的ζ电位谱，因为肝素的酸性性质在涂覆的表面上占主导地位。相反，惰性聚合物材料具有在约pH4的IEP。观察到具有酸性基团的样品向碱性区域的溶胀特性。这种溶胀将迫使剪切平面朝主体方向，并且应当得到较低的绝对ζ电位值(接近0mV)。例如，当根据评价方法B、M、E或F评价时，ζ电位的高Δ值与高抗血栓性质相关。此外，在本发明方法中使用的较高盐浓度在碱性区域得到了较低的绝对ζ电位值，无论测试的盐是什么，仍再次与抗凝血酶结合值相关。不受理论的限制，这可以用增加的抗凝血酶对可经受溶胀的涂层中肝素分子的进入来解释。

治疗方法

如上所述的根据本发明方法涂覆的固体物体、特别是医疗装置具有医学治疗中的用途。

在本发明的一个方面，提供了一种根据上文所述的本发明的方法涂覆的固体物体(特别是医疗装置)，其用于治疗人体或动物体内的组织。待治疗的组织包括任何体腔、空间或中空的器官通道，例如血管、泌尿道、肠道、鼻腔、神经鞘、椎间的区域、骨腔、食道、子宫内腔、胰管和胆管、直肠，以及之前已植入血管移植物、支架、假体或其他类型的医疗植入物的人体空间。在本发明的另一个方面，可以部署根据上文所述的本发明的方法涂覆的固体物体(例如，医疗装置)以治疗脑中的微动脉瘤。

如本文所述的涂覆的固体物体(特别是医疗装置)可以具有以下用途：用于从血管去除阻塞物例如栓子和血栓，作为用于使闭塞的体内通道恢复通畅的扩张装置，作为选择性递送用于阻塞或填充通道或空间的工具的闭塞装置，以及作为管腔内的手术器械如导管的定中心机制。

在一个实施方案中提供了根据上文描述的本发明的方法涂覆的固体物体(特别是医疗装置，例如支架、移植物或支架-移植物)，其用于预防或治疗人体血管中的狭窄或再狭窄。在另一个实施方案中，提供了根据如上所述的本发明的方法涂覆的固体物体(特别是医疗装置，例如支架、移植物或支架-移植物)，其用于预防或治疗血管狭窄或再狭窄，其中先前放置的洗脱结构失效。在另一个实施方案中，根据上文所述的本发明的方法涂覆的固体物体(特别是医疗装置，例如支架、移植物或支架-移植物)可以用于建立或维持动静脉进入位点，例如在肾透析期间使用的那些位点。在另一个实施方案中，根据上文描述的本发明的方法涂覆的固体物体(特别是医疗装置，例如支架、移植物或支架-移植物，例如血管移植物)可以用于使流体在阻塞区域或血管狭窄区域周围重新定向。在另一个实施方案中，可以部署根据如上所述的本发明的方法涂覆的固体物体(特别是医疗装置，例如支架、移植物或支架-移植物)以恢复患病血管区域的通畅性或排除动脉瘤。在又一个实施方案中，可以部署根据上文所述的本发明的方法涂覆的固体物体(特别是医疗装置，例如支架、移植物或支架-移植物)，以在血管成形术之后加固患病的血管。在又一个实施方案中，可以使用气囊辅助或线圈辅助方法，将根据上文所述的本发明的方法涂覆的固体物体(特别是医疗装置，例如支架、移植物或支架-移植物)部署在脑中。

在一个实施方案中，根据上文所述的本发明的方法涂覆的固体物体(特别是医疗装置)可用于患有外周动脉阻塞性疾病的患者的经皮腔内血管成形术(PTA)。

本发明的另一个方面提供了预防或治疗狭窄或再狭窄的方法，该方法包含将根据如上所述的本发明的方法涂覆的固体物体(特别是医疗装置)植入人体的所述血管中。

本发明的其他实施方案

上述有关本发明方法的实施方案和优选方案同样适用于如下实施方案。

在一个实施方案中，提供了用于制备固体物体的方法，所述固体物体具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层为包含阳离子聚合物的层，该方法包含下列步骤：

i)用阳离子聚合物处理固体物体表面；

ii)用阴离子聚合物处理所述表面；

iii)任选地将步骤i)和ii)重复一次或多次；和

iv)用阳离子聚合物处理所述表面；

其中，

且其中，

步骤ii)在0.25M-5.0M的盐浓度下进行。

在一个实施方案中，提供了固体物体，其具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中最外层为包含阳离子聚合物的层；

且其中阴离子聚合物的特征在于具有：(a)650kDa-10,000kDa的总分子量；和(b)>4μeq/g的溶液电荷密度。

在一个实施方案中，提供了用于制备固体物体的方法，所述固体物体具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层为包含阴离子聚合物的层，该方法包含下列步骤：

i)用阳离子聚合物处理固体物体表面；

ii)用阴离子聚合物处理所述表面；

iii)任选地将步骤i)和ii)重复一次或多次；

其中，

且其中，

步骤ii)在0.25M-5.0M的盐浓度下进行。

在一个实施方案中，提供了固体物体，其具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层为包含阴离子聚合物的层；且其中阴离子聚合物的特征在于具有：(a)650kDa-10,000kDa的总分子量；和(b)>4μeq/g的溶液电荷密度。

在一个实施方案中，提供了用于制备固体物体的方法，所述固体物体具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层包含抗凝物质，该方法包含下列步骤：

i)用阳离子聚合物处理固体物体表面；

ii)用阴离子聚合物处理所述表面；

iii)任选地将步骤i)和ii)重复一次或多次；

iv)用阳离子聚合物处理所述表面；和

其中，

且其中，

步骤ii)在0.25M-5.0M的盐浓度下进行。

在一个实施方案中，提供了固体物体，其具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层为包含与抗凝物质共价连接的阳离子聚合物的层；且其中阴离子聚合物的特征在于具有：(a)650kDa-10,000kDa的总分子量；和(b)>4μeq/g的溶液电荷密度。适合地，阴离子聚合物以0.25M-5.0M、例如0.25M-4.0M或0.25M-3.0M的盐浓度涂布于表面。

在一个实施方案中，提供了固体物体，其具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层为包含与抗凝物质共价连接的阳离子聚合物的层；且其中阴离子聚合物的特征在于具有：(a)650kDa-1,000kDa的总分子量；和(b)>4μeq/g的溶液电荷密度。适合地，阴离子聚合物以0.25M-5.0M、例如0.25M-4.0M或0.25M-3.0M的盐浓度涂布于表面。

在一个实施方案中，提供了固体物体，其具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层为包含与抗凝物质共价连接的阳离子聚合物的层；且其中阴离子聚合物的特征在于具有：(a)1,000kDa-4,500kDa的总分子量；和(b)>4μeq/g的溶液电荷密度。适合地，阴离子聚合物以0.25M-5.0M、例如0.25M-4.0M或0.25M-3.0M的盐浓度涂布于表面。

在一个实施方案中，提供了固体物体，其具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层为包含与抗凝物质共价连接的阳离子聚合物的层；且其中阴离子聚合物的特征在于具有：(a)4,500kDa-7,000kDa的总分子量；和(b)>4μeq/g的溶液电荷密度。适合地，阴离子聚合物以0.25M-5.0M、例如0.25M-4.0M或0.25M-3.0M的盐浓度涂布于表面。

在一个实施方案中，提供了固体物体，其具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层为包含与抗凝物质共价连接的阳离子聚合物的层；且其中阴离子聚合物的特征在于具有：(a)7,000kDa-10,000kDa的总分子量；和(b)>4μeq/g的溶液电荷密度。适合地，阴离子聚合物以0.25M-5.0M、例如0.25M-4.0M或0.25M-3.0M的盐浓度涂布于表面。

i)用阳离子聚合物处理固体物体表面；

ii)用阴离子聚合物处理所述表面；

iii)任选地将步骤i)和ii)重复一次或多次；

iv)用阳离子聚合物处理所述表面；和

其中，

阴离子聚合物为包含-SO₃ ^-基团的聚合物，

阴离子聚合物的特征在于具有：(a)650kDa-10,000kDa的总分子量；和(b)占阴离子聚合物重量10％-25％的硫含量；

且其中，

步骤ii)在0.25M-5.0M的盐浓度下进行。

i)用阳离子聚合物处理固体物体表面；

ii)用阴离子聚合物处理所述表面；

iii)任选地将步骤i)和ii)重复一次或多次；

iv)用阳离子聚合物处理所述表面；和

其中，

阴离子聚合物的特征在于具有650kDa-10,000kDa的总分子量；

阴离子聚合物为硫酸葡聚糖；

且其中，

步骤ii)在0.25M-5.0M的盐浓度下进行。

在一个实施方案中，提供了固体物体，其具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层为包含与抗凝物质共价连接的阳离子聚合物的层；阴离子聚合物为包含-SO₃ ^-基团的聚合物，且其中阴离子聚合物的特征在于具有：(a)650kDa-10,000kDa的总分子量；和(b)占阴离子聚合物重量10％-25％的硫含量。

i)用阳离子聚合物处理固体物体表面；

ii)用阴离子聚合物处理所述表面；

iii)任选地将步骤i)和ii)重复一次或多次；和

iv)用阳离子聚合物处理所述表面；

其中，

阴离子聚合物为包含-SO₃ ^-基团的聚合物，

且其中，

步骤ii)在0.25M-5.0M的盐浓度下进行。

i)用阳离子聚合物处理固体物体表面；

ii)用阴离子聚合物处理所述表面；

iii)任选地将步骤i)和ii)重复一次或多次；和

iv)用阳离子聚合物处理所述表面；

其中，

阴离子聚合物的特征在于具有650kDa-10,000kDa的总分子量；

阴离子聚合物为硫酸葡聚糖；

且其中，

步骤ii)在0.25M-5.0M的盐浓度下进行。

在一个实施方案中，提供了固体物体，其具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中最外层为包含阳离子聚合物的层；阴离子聚合物为包含-SO₃ ^-基团的聚合物，且其中阴离子聚合物的特征在于具有：(a)650kDa-10,000kDa的总分子量；和(b)占阴离子聚合物重量10％-25％的硫含量。

i)用阳离子聚合物处理固体物体表面；

ii)用阴离子聚合物处理所述表面；

iii)任选地将步骤i)和ii)重复一次或多次；

其中，

阴离子聚合物为包含-SO₃ ^-基团的聚合物，

且其中，

步骤ii)在0.25M-5.0M的盐浓度下进行。

i)用阳离子聚合物处理固体物体表面；

ii)用阴离子聚合物处理所述表面；

iii)任选地将步骤i)和ii)重复一次或多次；

其中，

阴离子聚合物的特征在于具有650kDa-10,000kDa的总分子量；

阴离子聚合物为硫酸葡聚糖；

且其中，

步骤ii)在0.25M-5.0M的盐浓度下进行。

在一个实施方案中，提供了固体物体，其具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层为包含阴离子聚合物的层；阴离子聚合物为包含-SO₃ ^-基团的聚合物，且其中阴离子聚合物的特征在于具有：(a)650kDa-10,000kDa的总分子量；和(b)占阴离子聚合物重量10％-25％的硫含量。

本发明的条目

本发明的其他条目：

1.用于制备固体物体的方法，所述固体物体具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层包含抗凝物质，该方法包含下列步骤：

i)用阳离子聚合物处理固体物体表面；

ii)用阴离子聚合物处理所述表面；

iii)任选地将步骤i)和ii)重复一次或多次；

iv)用阳离子聚合物处理所述表面；和

其中，

且其中，

步骤ii)在0.25M-5.0M的盐浓度下进行。

2.条目1的用于制备固体物体的方法，其中阴离子聚合物为硫酸葡聚糖。

3.条目1或条目2的用于制备固体物体的方法，其中阴离子聚合物的特征在于具有750kDa-10,000kDa的总分子量，例如1,000kDa-10,000kDa。

4.条目1-3任一项所述的用于制备固体物体的方法，其中阴离子聚合物的特征在于具有从>4μeq/g到7μeq/g的溶液电荷密度，例如从>5μeq/g到7μeq/g。

5.条目1-4任一项所述的用于制备固体物体的方法，其中步骤ii)在0.25M-4.0M的盐浓度下进行，例如0.25M-3.0M。

6.条目1-5任一项所述的用于制备固体物体的方法，其中所述盐选自氯化钠、硫酸钠、磷酸氢钠和磷酸钠，且特别是氯化钠。

7.条目1-6任一项所述的用于制备固体物体的方法，其中步骤i)的阳离子聚合物为聚胺，其为任选交联的；和/或

其中步骤iv)的阳离子聚合物为聚胺，其为任选交联的。

8.条目1-7任一项所述的用于制备固体物体的方法，其中抗凝物质为肝素部分，例如末端连接的肝素部分，其通过其还原末端连接。

9.条目1-8任一项所述的用于制备固体物体的方法，其中固体物体为抗血栓的医疗装置。

10.固体物体，其具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层为包含与抗凝物质共价连接的阳离子聚合物的层；

11.条目10所述的固体物体，其中阴离子聚合物的特征在于具有650kDa-1,000kDa或1,000kDa-4,500kDa或4,500kDa-7,000kDa或7,000kDa-10,000kDa的总分子量。

12.条目10或11任一项所述的固体物体，其中阴离子聚合物以0.25M-5.0M、例如0.25M-4.0M或0.25M-3.0M的盐浓度涂布于表面。

13.用于制备固体物体的方法，所述固体物体具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层为包含阳离子聚合物的层，该方法包含下列步骤：

i)用阳离子聚合物处理固体物体表面；

ii)用阴离子聚合物处理所述表面；

iii)任选地将步骤i)和ii)重复一次或多次；和

iv)用阳离子聚合物处理所述表面；

其中，

且其中，

步骤ii)在0.25M-5.0M的盐浓度下进行。

14.固体物体，其具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中最外层为包含阳离子聚合物的层；

15.用于制备固体物体的方法，所述固体物体具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层为包含阴离子聚合物的层，该方法包含下列步骤：

i)用阳离子聚合物处理固体物体表面；

ii)用阴离子聚合物处理所述表面；

iii)任选地将步骤i)和ii)重复一次或多次；

其中，

阴离子聚合物的特征在于具有：(a)650kDa 10,000kDa的总分子量；和(b)>4μeq/g的溶液电荷密度；

且其中，

步骤ii)在0.25M-5.0M的盐浓度下进行。

优点

至少在一些实施方案中，预期根据本发明的方法涂覆的固体物体具有以下一种或多种优点或优势：

·例如，如使用评价方法C(甲苯胺蓝染色测试)或评价方法I(SEM)测定的，可以得到具有均匀分布和相对光滑的抗凝物质涂层；

·可以得到均匀的涂层，该涂层将掩盖固体物体的固有特性，例如用于改善装置的抗血栓性质，不管其制造材料如何；

·例如，如通过使用评价方法B或M测定的，可以得到具有良好抗凝物质活性例如肝素活性的涂层；

·由于其共价结合，可得到不渗出抗凝物质例如肝素的抗血栓涂层，由此可以得到具有长的使用期限；

·可以得到在灭菌时(例如用EO灭菌)保留其性能的涂层；

·由于各层之间形成可逆的离子相互作用的可能性，因此可得到自修复的涂层；

·例如，如使用评价方法N测定的，可得到具有良好生物相容性的涂层；

·可得到一种涂层，该涂层可以减少对抗凝剂例如肝素的全身施用的需要，并减少接触活化的可能性，例如使用评价方法E(血小板)和/或评价方法F(血液循环)测定的；

·可以得到具有通过使用评价方法N测定的抗炎特性和抗血栓性质的组合的固体物体，这在某些应用中可能是有益的，例如心血管应用；

·可以得到对生物分子具有良好结合容量的分析或分离装置；和

·可以得到具有长的肝素活性使用期限的分析或分离装置。

本发明涵盖所示的组和上述组的实施方案的所有组合。

缩写

Ac 乙酰基

ABS 丙烯腈丁二烯苯乙烯

ATIII 抗凝血酶III

CNS 中枢神经系统

CPB 心肺转流术

CVC 中心静脉导管

CVD 化学气相沉积

Da 道尔顿

DI 去离子的

EDC 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺

EO 环氧乙烷

EPDM 乙烯丙烯二烯单体(M-类)

ePTFE 膨体聚四氟乙烯

FEP 氟化乙烯-丙烯

GPC 凝胶渗透色谱法

HCII 肝素辅因子II

HIT 肝素诱导的血小板减少症

IEP 等电点

M 摩尔浓度

MBTH 3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐

PAVE 全氟烷基乙烯基醚

PES-Na 聚乙烯硫酸钠

PTA 经皮腔内血管成形术

PIC 外周插入的中央导管

PMVE 全氟甲基乙烯基醚

PTFE 聚四氟乙烯

PUR 聚氨酯

PVC 聚氯乙烯

RGD 精氨酰甘氨酰天冬氨酸

SEM 扫描电子显微术/显微镜

SPDP 3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯

TFE 四氟乙烯

TMAH 氢氧化四甲基铵

TMB 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺

VA 心室心房的

VP 脑室腹膜的

XPS X射线光电子分光光度法

具体实施方式

实施例

通用方法

化学品

异丙醇、磷酸二氢钠二水合物、硫酸钠和氯化钠可购自Sigma Aldrich和VWRChemicals，并以所收到的产品进行使用。基本上如EP0086186A1中所述用亚硝酸处理药典品质的肝素并在实施例中使用。聚胺可购自如US9,101,696B2中所述的供应商。硫酸葡聚糖可以购自如实施例1的表1所示的供应商。在以下实施例中使用去离子(DI)水。

材料

PVC管购自Flextubing Products。PUR管购自NewAge Industries。不锈钢取样管购自Helab Mekano AB。

评价方法

括号中给出了通过每种方法评价的参数。

评价方法A:肝素浓度测试(定量肝素附着)

可以通过完全降解肝素，然后比色测定释放到溶液中的反应产物来对表面固定的肝素进行定量。降解通过在酸性条件下使肝素表面与过量的亚硝酸钠反应来实现。基本上如Smith R.L.和Gilkerson E(1979),Anal Biochem 98,478-480中所述，在与MBTH(3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐)的反应中进行比色法定量分析降解产物(主要是二糖)，该文献通过引用整体并入本文。

评价方法B:肝素活性测试(使用ATIII的定量肝素功能)

对于根据本发明的方法涂覆的包含肝素涂层的固体物体，可以通过如Pasche,等人在“A binding of antithrombin to immobilized heparin under varying flowconditions”(Artif.Organs 1991；15:281-491,通过引用整体并入本文)和Larsen M.L,等人在“Assay of plasma heparin using thrombin and the chromogenic substrate H-D-Phe-Pip-Arg-pNA”(S-2238)(Thromb.Res.1978；13:285-288,通过引用整体并入本文)中所述测定肝素结合抗凝血酶III(ATIII)的能力或容量来测定装置的肝素活性，并且可用于评价固体物体的抗血栓性质。将洗涤的样品与过量的抗凝血酶溶液一起温育，以饱和肝素表面所有可用的抗凝血酶结合位点。用盐溶液冲洗掉非特异性吸附的抗凝血酶。随后，通过与高浓度的肝素溶液一起温育来释放特异性结合至与表面结合的肝素的抗凝血酶。最后，基于生色的凝血酶底物，在凝血酶抑制测定中测量从肝素表面释放的抗凝血酶。将结果表示为装置的每表观平方厘米结合的皮摩尔抗凝血酶III(ATIII)(pmol ATIII/cm²固体物体表面)。表观固体物体表面积不考虑多个覆盖表面，也不考虑由多孔材料构成的固体物体的孔隙率。如果固体物体的表面是多孔的，则在这些计算中不考虑孔隙率对表面积的影响。例如，对于任何圆柱形几何形状，将带有固定在包含管状移植物内表面的基质材料上的肝素的圆柱形管状ePTFE血管移植物(由多孔材料制成)的表观表面积计算为2ττrL：其中r为移植物的内径；L为轴向长度；且π为数字pi。该方法可用于测量具有ATIII结合活性的任何抗凝物质的活性。

评价方法C:甲苯胺蓝染色测试验(肝素分布)

使用甲苯胺蓝染色溶液评价肝素分布。通过将200mg甲苯胺蓝溶于1L水中来制备溶液。在进行大量水冲洗之前，将样品置于染色溶液中2分钟。蓝色/紫色染色表示带负电荷的肝素分子均匀分布在外涂层中。

评价方法D:ζ电位测量值(表面电荷指示物)

在SurPASS仪器上确定涂层的作为表面电荷指示物的ζ电位。通过使电解质在表面上循环来进行测量，该电解质通常是简单的电解质例如KCl或NaCl的1mM溶液。测量所得的流动电位并用于测定ζ电位。通过分别向溶液中添加酸或碱在3至9的pH范围内测定涂层的ζ电位。使用如T.Luxbacher,The ZETA guide,Principles of the streaming potentialtechnique,第1版,Anton Paar GMBH出版,ISBN 978-3-200-03553-9(其通过引用整体并入本文)中所述的如下方程1计算ζ电位。

dU/dP＝流动电位与压差的斜率

K_B＝电解质电导率

η＝电解质粘度

ε＝电解质介电系数

ε₀＝真空介电常数

评价方法E:血液循环评估测试(血小板损失的测量)

可以在涂覆的物体上进行血液接触评价，以评价其抗血栓性质。当固体物体是管状装置例如一块PVC管时可以使用的方法如下。首先，用0.15M盐溶液以1mL/min的流速将涂覆的管的管腔侧洗涤15小时，以确保完全润湿并除去任何松散结合的抗凝物质，从而保留稳定的表面。然后将洗涤的管在基本上按照Andersson等人(Andersson,J.；Sanchez,J.；Ekdahl,K.N.；Elgue,G.；Nilsson,B.；Larsson,R.J Biomed Mater Res A 2003,67(2),458-466,通过引用整体并入本文)进行的Chandler环模型中以20rpm温育。在细胞计数器中对来自新鲜血液和从循环中采集的血液中的血小板计数，以测量血小板的损失。血小板的大量损失表明表面的抗血栓性能差。相反，血小板的最小损失指示为抗血栓表面。

评价方法F:血液循环评估测试(用于F1+2测定)

F1+2(凝血酶原片段)的测定用作凝血的激活标记(即凝血酶的间接测量值)。F1+2与凝血酶的形成成正比，并解释为凝血酶生成的间接度量，并且可以用于评价固体物体的抗血栓性质。血浆中F1+2的定量测定采用标准ELISA试剂盒(酶联免疫吸附剂测定法)(Enzygnost F1+2ELISA,OPBDG03,Siemens)进行酶促免疫分析进行。样品中的F1+2抗原与捕获在96-孔微量滴定板包被表面上的抗体偶联，且随后通过过氧化物酶偶联的抗-F1+2抗体进行检测。偶联的过氧化物酶的量通过添加特定的底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)进行测量。通过添加稀硫酸来终止底物向色原体的酶促转化。孔中在450nm处的吸光度与样品中F1+2的浓度成正比。通过与已知F1+2浓度的标准曲线比较来确定样品的浓度。

评价方法G:溶液中阴离子聚合物例如硫酸葡聚糖的分子量

硫酸葡聚糖样品的分子量的测定使用凝胶渗透色谱(GPC)仪进行。将硫酸葡聚糖样品溶于基于水的洗脱介质中，并在适用于分子量范围1,000Da-100,000Da(Superose柱)或100,000Da-2,000,000Da(Sephacryl柱)的GPC仪器上进行分析。适当分子量的硫酸葡聚糖标准品用于验证校准曲线的精确度。聚合物例如硫酸葡聚糖是分散的分子，即具有分子量分布，可以用不同的分子量平均值来描述。通常报道的值为重均分子量(Mw)。参见OdianG.,Principles of Polymerization,第3版,第1.4节Molecular weight,p.24(其通过引用整体并入本文)，其解释了使用GPC技术测定聚合物的分子量的理论。除硫酸葡聚糖以外的阴离子聚合物的分子量也可以使用该方法测定。

评价方法H:阴离子聚合物例如硫酸葡聚糖在溶液中的溶液电荷密度

用Mütek粒子电荷检测器通过滴定聚电解质溶液(0.001M)(聚二烯丙基二甲基氯化铵(Poly-Dadmac)和聚乙烯硫酸钠(PES-Na))进行电荷密度的定量测定。将样品溶于水(允许的最大粘度为6000mPas)至0.06g/L的浓度。对于所有样品溶液，将pH调节至3。每次测量添加10mL/样品溶液，然后以每3秒1个单位的间隔滴定适当的聚电解质溶液。参见Farris等人,Charge Density Quantification of Polyelectrolyte Polysaccharides byConductometric Titration:An Analytical Chemistry Experiment,J.Chem.Educ.,2012,89(1),pp 121–124(其通过引用全文并入本文)。除硫酸葡聚糖以外的阴离子聚合物的溶液电荷密度也可以使用该方法来测定。

评价方法I:具有能量分散X射线分光光度法的扫描电子显微镜检查(涂层覆盖度和均匀性)

TM3000是由Hitachi制造的台式扫描电子显微镜(SEM)，其用于得到关于例如样品厚度、形貌(表面结构)和表面覆盖率的信息。与传统的光学显微镜相比，使用台式SEM可以得到更高的放大倍率，因为它是用于创建图像的电子。TM3000还配备了Quantax70。这是一种用于测定样品化学组成的能量色散X-射线光谱仪(EDS)。此外，还存在旋转/倾斜台作为附件，以帮助分析样品的不同组成部分。将样品用碳带(也用作接地)固定在支架上，然后放置在测试室中。在开始评价样品之前，将室排空至较低压力。SEM技术基于电子束对整个样品的扫描，其中一些电子为反射的反向散射电子，而其他电子则作为次级电子。检测器用于测量由反射的反向散射电子产生的电流。电流被成像在显示器上，其中每个像素对应于样本的位置。如果反射许多电子(高电子密度)，则得到明亮的像素；如果反射较少电子(低电子密度)，则得到较暗的像素。

评价方法J:带有深度测定谱(XPS)的X射线光电子分光镜检查(涂层厚度)

X射线光电子分光镜检查(XPS或ESCA)是最广泛使用的表面表征技术，其可对固体材料提供无损的化学分析。样品用单能X-射线照射，使光电子从样品表面的顶部1nm–10nm处发射。电子能量分析仪确定光电子的结合能。可以对除氢和氦之外的所有元素进行定性和定量分析，检出限为约0.1-0.2原子百分比。分析光斑的大小范围为10μm-1.4mm。也能够使用元素和化学状态映射生成特征的表面图像。使用依赖于角度的测量值，能够进行深度测定谱分析，以得到在表面的顶部10nm内的非破坏性分析，或使用破坏性分析(例如离子刻蚀)得到整个涂层深度的谱分析。

评价方法K:增加的温度和湿度测试(杀菌稳定性的通用模型)

将根据本发明方法涂覆的固体物体放入透气的聚乙烯小袋(例如Tyve小袋)中，并在40℃和50％相对湿度下将小袋放入气候室(例如Climacell)1周，然后在真空室内进行2小时干燥。进行此通用模型以考察灭菌稳定性后，可以使用例如评价方法E或F评价涂覆的物体的抗血栓性质/活化。

评价方法L:对环氧乙烷的稳定性

将根据本发明方法涂覆的固体物体放入透气的聚乙烯小袋(例如Tyve小袋)中，并在50℃和60％相对湿度下进行至少12小时的预处理，然后在50℃和366mBar的压力下暴露于环氧乙烷2小时。然后将室在50℃下脱气至少10小时。可以在Synergy Health IrelandLtd.进行环氧乙烷灭菌。灭菌后，可以使用例如评价方法E或F评价涂覆的物体的抗血栓性质/活化。

评价方法M:肝素活性测试(使用HCII的定量肝素功能)

对于根据本发明的方法涂覆的包含肝素涂层的固体物体，可以通过WO2009/064372A2(Gore Enterprise Holdings,Inc.；通过引用整体并入本文)中所述测定肝素结合肝素辅因子II(HCII)的能力或容量来测定装置的肝素活性，使用如Larsen M.L.等人在"Assay of plasma heparin using thrombin and the chromogenic substrate H-D-Phe-Pip-Arg-pNA(S-2238)."Thromb Res 13:285-288(1978)和Pasche B.等人在"A bindingof antithrombin to immobilized heparin under varying flow conditions."Artif.Organs 1991；15:281-491)中所述的测定法测定肝素结合已知量的肝素辅因子Il(HCII)的能力或容量，并且可用于评价固体物体的抗血栓性质。将结果表示为固体物体表面的每表观平方厘米结合的皮摩尔肝素辅因子Il(HCII)(pmol HCll/cm²固体物体表面)。表观固体物体表面积不考虑多个覆盖表面，也不考虑由多孔材料构成的固体物体的孔隙率。如果固体物体的表面是多孔的，则在这些计算中不考虑孔隙率对表面积的影响。例如，对于任何圆柱形几何形状，将带有固定在包含管状移植物内表面的基质材料上的肝素的圆柱形管状ePTFE血管移植物(由多孔材料制成)的表观表面积计算为2ττrL：其中r为移植物的内径；L为轴向长度；且π为数字pi。该方法可用于测量具有HCII结合活性的任何抗凝物质的活性。

评价方法N–表面生物相容性

可以如Lappegard,K.T 2008,J.Biomed.Mater.Res.第87卷,129-135(其通过引用整体并入本文)中所述评价根据本发明的方法涂覆的固体物体的表面的生物相容性。可用于评价炎症反应的方法如下。首先，将涂覆的固体物体用0.15M盐水溶液洗涤15分钟。将润湿的涂覆的固体物体放置在含有全血的肝素化PVC管中，并使其在循环中以20rpm旋转(参见Ekdahl K.N.,Advances in Experimental Medicine and Biology,2013,735,257-2700(其通过引用整体并入本文)作为代表性方法)。温育后，将血液在4℃以3220g离心15min。随后将血浆以等分试样冷冻在-70℃下，用于随后的细胞因子分析。根据Lappegard等人(上文)描述的方法，使用多重细胞因子测定法(Bio-Plex Human Cytokine 27-Plex Panel,Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)分析血浆样品。

阴性对照是不使用任何装置的肝素化PVC空循环。这代表非炎性对照，其温育的血液应当显示无或仅有少量的炎性标志物。阳性对照为没有不使用任何装置的非肝素化PVC空循环。这代表炎性对照，对其应当观察到更大量的炎性标志物。纳入对照以确保实验和血液的质量。

评价方法O–带有耗散的石英晶体微量天平(涂层厚度)

Q-sense E4为带有耗散(QCM-D)监测仪器的晶体微量天平。QCM-D为一种用于测量分子层的质量和结构特性的技术，并且可看作是超灵敏的称重装置。

QCM传感器由一块薄石英盘组成，其中最常用的是AT切割晶体。石英盘放置在两个电极之间，并且通过向石英晶体施加电压，可以使石英盘以其共振频率振荡。石英表面质量的变化诱导通过Sauerbrey相关性涉及的振动晶体频率的变化(参见Rodahl,M.,等人,Quartz crystal microbalance setup for frequency and Q factor measurements ingaseous and liquid environments.Review of scientific environments,1995.66(7):p.3924-3930.(其通过引用整体并入本文)。将根据本发明的方法涂覆的固体物体的涂层厚度报道为干涂层厚度。

评价方法P–肝素片段组分的分子量测定

基本上根据USP<209>低分子量肝素分子量测定，通过分析型凝胶渗透色谱(GPC)在由两个串联的Superdex柱(S-75和S-200)组成的系统上测定肝素片段组分的分子量。峰位置基于“低分子量肝素的分子量校准的第二个国际标准”(NIBSC,UK)的洗脱曲线鉴定，其中该标准的最小延迟峰为二糖。

评价方法Q–肝素片段浓度测定

溶液中的分离的肝素片段的量通过与肝素标准曲线有关的咔唑测定法分析尿酸含量来估算(Bitter,T.；Muir,H.M.,Anal.Biochem.,1962,(4),330-334)。

实施例1:涂覆固体物体的方法(带有抗凝物质的外涂层的阳离子和阴离子聚合物的分层涂层)

通用涂覆方法–装管

基本上使用Larm等人在EP0086186A1、EP0495820B1和EP0086187A1(全部通过引用整体并入本文)中描述的方法，在一段管子(例如PVC或PUR管)的管腔表面上逐层涂覆阳离子聚合物和阴离子聚合物。

具体地，首先用异丙醇和氧化剂清洁管的内腔表面。通过交替吸附阳离子聚合物(聚胺，在水中0.05g/L)和阴离子聚合物(硫酸葡聚糖，在水中0.1g/L)构成涂层双层。聚胺与双官能醛(巴豆醛)交联。硫酸葡聚糖原料按以下每个实施例的规定进行变化，并在不同浓度的不同钠盐的存在下使用，其也如以下各实施例所述。将每对聚胺和硫酸化多糖称作一个双层，即，将双层定义为阳离子和阴离子聚合物的一层，并且使用相同的条件来构建每个双层。管的内腔表面涂覆有三个双层(对于涂覆单一双层的固体物体，参见图1)。然后吸附最终的聚胺最外层。

然后基本上如Larm等人在EP0086186A1和EP0495820B1(均通过引用整体并入本文)中所述，通过还原氨化将肝素固定在聚胺的最外层上。

通用涂覆方法–钢制取样管

任何固体物体均可以使用上述用于管的通用涂覆方法进行涂覆。在以下使用钢制取样管的实施例中，涂覆了取样管的整个表面。

实施例1.1-1.56中使用的硫酸葡聚糖

所评价的硫酸葡聚糖购自如表1中所示的不同供应商。

表1–实施例中评价的硫酸葡聚糖

*根据评价方法G测定的重均分子量(Mw)

**根据评价方法H测定的溶液电荷密度

实施例1.1:使用硫酸葡聚糖1和0.25MNaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖1以0.25M NaCl浓度涂布。

实施例1.2:使用硫酸葡聚糖1和1.7M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖1以1.7M NaCl浓度涂布。

实施例1.3:使用硫酸葡聚糖2和0.25MNaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖2以0.25M NaCl浓度涂布。

实施例1.4:使用硫酸葡聚糖3和0.05M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖3以0.05M NaCl浓度涂布。

实施例1.5:使用硫酸葡聚糖3和0.1M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖3以0.1M NaCl浓度涂布。

实施例1.6:使用硫酸葡聚糖3和0.25M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖3以0.25M NaCl浓度涂布。

实施例1.7:使用硫酸葡聚糖3和1.0M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

实施例1.8:使用硫酸葡聚糖3和1.7M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖3以1.7M NaCl浓度涂布。

实施例1.9:使用硫酸葡聚糖3和2.6M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖3以2.6M NaCl浓度涂布。

实施例1.10:使用硫酸葡聚糖3和3.0M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖3以3.0M NaCl浓度涂布。

实施例1.11:使用硫酸葡聚糖4和0.05M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖4以0.05M NaCl浓度涂布。.

实施例1.12:使用硫酸葡聚糖4和0.1M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖4以0.1M NaCl浓度涂布。

实施例1.13:使用硫酸葡聚糖4和0.25 MNaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖4以0.25M NaCl浓度涂布。

实施例1.14:使用硫酸葡聚糖4和1.0M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

实施例1.15:使用硫酸葡聚糖4和1.7MNaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖4以1.7M NaCl浓度涂布。

实施例1.16:使用硫酸葡聚糖4和3.0M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖4以3.0M NaCl浓度涂布。

实施例1.17:使用硫酸葡聚糖5和0.05MNaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管。参见表1，硫酸葡聚糖5以0.05M NaCl浓度涂布。

实施例1.18:使用硫酸葡聚糖5和0.25M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖5以0.25M NaCl浓度涂布。

实施例1.19:使用硫酸葡聚糖5和0.5 M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖5以0.5M NaCl浓度涂布。

实施例1.20:使用硫酸葡聚糖5和0.85MNaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖5以0.85M NaCl浓度涂布。

实施例1.21:使用硫酸葡聚糖5和1.0M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖5以0.1M NaCl浓度涂布。

实施例1.22:使用硫酸葡聚糖5和1.7 M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖5以1.7M NaCl浓度涂布。

实施例1.23:使用硫酸葡聚糖5和3.0M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖5以3.0M NaCl浓度涂布。

实施例1.24:使用硫酸葡聚糖6和0.05MNaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖6以0.05M NaCl浓度涂布。

实施例1.25:使用硫酸葡聚糖6和0.25M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖6以0.25M NaCl浓度涂布。

实施例1.26:使用硫酸葡聚糖6和0.5M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖6以0.5M NaCl浓度涂布。

实施例1.27:使用硫酸葡聚糖6和1.7M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖6以1.7M NaCl浓度涂布。

实施例1.28:使用硫酸葡聚糖6和3.0 M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖6以3.0M NaCl浓度涂布。

实施例1.29:使用硫酸葡聚糖7和0.05MNaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖7以0.05M NaCl浓度涂布。

实施例1.30:使用硫酸葡聚糖7和0.1M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖7以0.1M NaCl浓度涂布。

实施例1.31:使用硫酸葡聚糖7和0.25 MNaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖7以0.25M NaCl浓度涂布。

实施例1.32:使用硫酸葡聚糖7和0.5M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖7以0.5M NaCl浓度涂布。

实施例1.33:使用硫酸葡聚糖7和0.85M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖7以0.85M NaCl浓度涂布。

实施例1.34:使用硫酸葡聚糖7和1.0M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

实施例1.35:使用硫酸葡聚糖7和1.7M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖7以1.7M NaCl浓度涂布。

实施例1.36:使用硫酸葡聚糖7和2.6M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖7以2.6M NaCl浓度涂布。

实施例1.37:使用硫酸葡聚糖7和3.0M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖7以3.0M NaCl浓度涂布。

实施例1.38:使用硫酸葡聚糖7和3.4M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖7以3.4M NaCl浓度涂布。

实施例1.39:使用硫酸葡聚糖5和0.05M的Na₂HPO₄浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖5以0.05M的Na₂HPO₄浓度涂布。

实施例1.40:使用硫酸葡聚糖5和0.25M的Na₂HPO₄浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖5以0.25M的Na₂HPO₄浓度涂布。

实施例1.41:使用硫酸葡聚糖5和0.85M的Na₂HPO₄浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖5以0.85M的Na₂HPO₄浓度涂布。

实施例1.42:使用硫酸葡聚糖5和1.7M的Na₂HPO₄浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖5以1.7M的Na₂HPO₄浓度涂布

实施例1.43:使用硫酸葡聚糖5和0.05M的Na₂SO₄浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖5以0.05M的Na₂SO₄浓度涂布。

实施例1.44:使用硫酸葡聚糖5和0.25M的Na₂SO₄浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖5以0.25M的Na₂SO₄浓度涂布。

实施例1.45:使用硫酸葡聚糖5和0.85M的Na₂SO₄浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖5以0.85M的Na₂SO₄浓度涂布。

实施例1.46:使用硫酸葡聚糖7和0.85M的Na₂HPO₄浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖7以0.85M的Na₂HPO₄浓度涂布。

实施例1.47:使用硫酸葡聚糖7和0.85M的Na₂SO₄浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖7以0.85M的Na₂SO₄浓度涂布。

实施例1.48:使用硫酸葡聚糖7和0.05M NaCl浓度制备PUR管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PUR管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖7以0.05M NaCl浓度涂布。

实施例1.49:使用硫酸葡聚糖7和0.25MNaCl浓度制备PUR管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PUR管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖7以0.25M NaCl浓度涂布。

实施例1.50:使用硫酸葡聚糖7和1.7M NaCl浓度制备PUR管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PUR管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖7以1.7M NaCl浓度涂布。

实施例1.51:使用硫酸葡聚糖7和3.0M NaCl浓度制备PUR管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PUR管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖7以3.0M NaCl浓度涂布。

实施例1.52:使用硫酸葡聚糖7和0.05M NaCl浓度制备钢制取样管上的涂层

根据上述通用方法涂覆钢制取样管(15.0mm x 3.35mm)。参见表1，硫酸葡聚糖7以0.05M NaCl浓度涂布。

实施例1.53:使用硫酸葡聚糖7和0.25MNaCl浓度制备钢制取样管上的涂层

根据上述通用方法涂覆钢制取样管(15.0mm x 3.35mm)。参见表1，硫酸葡聚糖7以0.25M NaCl浓度涂布。

实施例1.54:使用硫酸葡聚糖7和1.7MNaCl浓度制备钢制取样管上的涂层

根据上述通用方法涂覆钢制取样管(15.0mm x 3.35mm)。参见表1，硫酸葡聚糖7以1.7M NaCl浓度涂布。

实施例1.55:使用硫酸葡聚糖7和3.0MNaCl浓度制备钢制取样管上的涂层

根据上述通用方法涂覆钢制取样管(15.0mm x 3.35mm)。参见表1，硫酸葡聚糖7以3.0M NaCl浓度涂布。

实施例1.56:使用硫酸葡聚糖2和1.7M NaCl浓度制备PVC管上的涂层

根据上述通用方法涂覆PVC管(I.D.3mm)。参见表1，硫酸葡聚糖2以1.7M NaCl浓度涂布。

实施例2a:使用不同的硫酸葡聚糖在不同的NaCl浓度下涂覆的PVC管的标准化的肝素活性

如评价方法B(肝素活性测试)中所述，测定根据实施例1.11-1.19,1.21-1.32,1.34-1.38(对应于硫酸葡聚糖4、5、6和7)在不同NaCl浓度下涂覆的PVC管的肝素活性。

当用评价方法B测定时，所有测试的涂覆的固体物体均展示出至少1pmol/cm²的肝素活性。将下表2所示的肝素活性值按照在1.7M NaCl(实施例1.22)下用硫酸葡聚糖5涂覆的PVC管所观察到的最高肝素活性值进行标准化。

表2–使用硫酸葡聚糖4、5、6和7以不同NaCl浓度涂覆的PVC管的标准化的肝素活性 (％)

图2显示了在0.25M和1.7M NaCl下涂覆硫酸葡聚糖4、5、6和7的PVC管的标准化的肝素活性值。从图2可见，尽管两种盐浓度均导致涂层具有可接受的抗血栓性能，但在添加硫酸葡聚糖层的步骤中使用较高的盐浓度(1.7M)比使用较低的盐浓度(0.25M)产生更高的肝素活性。从表2中可见，使用小于0.25M的盐浓度会降低肝素活性。使用电荷密度高于6μeq/g的硫酸葡聚糖(硫酸葡聚糖4、5、7)得到最高的肝素活性。

实施例2b:使用硫酸葡聚糖5与不同浓度的不同盐的涂覆的PVC管的标准化肝素活性

如评价方法B(肝素活性测试)中所述，测定使用不同浓度的NaCl、Na₂HPO₄或Na₂SO₄的根据实施例1.17、1.18、1.20、1.22和1.39-1.45(对应于硫酸葡聚糖5)涂覆的PVC管的肝素活性。

全部测试的涂覆的固体物体均展示出至少1pmol/cm²的肝素活性。将下表3中所示的肝素活性值根据在1.70M NaCl下用硫酸葡聚糖5涂覆的PVC管(实施例1.22)观察到的最高肝素活性进行标准化。

表3–使用不同的盐以不同的浓度涂覆的PVC管(硫酸葡聚糖5)的标准化的肝素活性(％)

*在1.7M下不溶于水

来自表3中的标准化肝素活性值如图3中所示。从图3可见，通过一系列的盐显示在添加硫酸葡聚糖层的步骤中使用较高的盐浓度对肝素活性的有益作用。使用氯化钠得到最高的肝素活性值。

实施例2c:使用硫酸葡聚糖5和7与0.85M浓度的不同盐的涂覆的PVC管的标准化肝素活性

根据评价方法B(肝素活性测试)测定根据实施例1.20、1.33、1.41和1.45-1.47(对应于硫酸葡聚糖5和7)，使用0.85M NaCl、Na₂HPO₄或Na₂SO₄涂覆的PVC管的肝素活性。

全部测试的涂覆的固体物体均展示出至少1pmol/cm²的肝素活性。将以下表4所示的肝素活性值根据实施例1.22中观察到的最高肝素活性值进行标准化。

表4–使用不同盐以0.85M浓度涂覆的PVC管(硫酸葡聚糖5和7)的标准化肝素活性 (％)

可以看到，使用不同的盐例如NaCl、Na₂HPO₄和Na₂SO₄不会显著影响肝素活性值。无论使用哪种盐，盐浓度都会影响肝素的活性。

实施例2d:使用硫酸葡聚糖7与不同浓度的NaCl涂覆的固体物体的标准化的肝素活性

按照评价方法B(肝素活性测试)中所述，测定使用不同浓度的NaCl的根据实施例1.29、1.31、1.35、1.37和1.48-1.55(对应于硫酸葡聚糖7)的各种涂覆的固体物体的肝素活性。

全部测试的涂覆的固体物体均展示出至少1pmol/cm²的肝素活性。将以下表5所示的肝素活性值根据实施例1.22中观察到的最高肝素活性值进行标准化。

表5–(硫酸葡聚糖7)与不同浓度的NaCl的不同涂覆的固体物体的标准化肝素活性 (％)

实施例编号	硫酸葡聚糖编号	盐浓度[M]	PVC	PUR	钢制品
						1.29/1.48/1.52	7	0.05	46	40	65
1.31/1.49/1.53	7	0.25	60	62	81
						1.35/1.50/1.54	7	1.70	98	110	135
1.37/1.51/1.55	7	3.00	64	72	88

从表5可以明显看出，盐浓度会影响肝素的活性，而与所涂覆的固体物体的材料无关。聚氨酯(PUR)制成的管和钢制取样管用硫酸葡聚糖7以不同盐浓度涂覆，得到的标准化肝素活性值表明存在明显的盐依赖性。

实施例2e:使用硫酸葡聚糖5和1.7M NaCl浓度的肝素片段(八糖)涂覆的PVC管的标准化的肝素活性

按照上述通用方法，参见表1，用硫酸葡聚糖5以1.7M NaCl浓度给PVC管(I.D.3mm)涂布肝素片段(八糖)。

通过肝素解聚、然后分级分离制备的肝素片段组分

主要为八个糖单元(八糖)大小的寡糖可通过将天然肝素进行部分亚硝酸裂解，然后通过凝胶色谱分级分离来制备。亚硝酸裂解产生的八糖是能够包含功能活性序列的最短片段(Thunberg L.等人,FEBS Letters 117(1980),203-206)。

肝素的解聚:通过搅拌过夜将10g肝素钠溶于36ml水。将0.30g NaNO₂加入到肝素溶液中并使其溶解。通过加入4M HCl将该液酸化至pH 2.5。在室温下总反应时间2h后，通过添加4M NaOH中和该溶液。

通过凝胶渗透色谱法(GPC)，基于分子大小分离降解混合物，其中将3ml的部分以2.5ml/min的流速上柱(HiLoad 26/600Superdex 30pg，流动相0.15M NaCl)。基本上如Smith R.L.和Gilkerson E(1979),Anal Biochem 98,478-480中所述，通过MBTH反应分析采集的流分(3ml)中的醛。采集以八糖洗脱位置为中心的宽峰。通过蒸发将来自几个制备性运行的合并的寡糖洗脱流分浓缩至18ml的体积，并在同一柱上再进行色谱分离。对于所有重新色谱分离的运行，采集和合并代表十糖、八糖和六糖片段的三个组分。

通过评价方法P分析采集的组分。“六”组分由代表六糖的主峰和代表八糖的肩峰组成。“八”组分由代表八糖的主峰和代表六糖的肩峰以及代表十糖的小肩峰组成。“十”组分由代表十糖的主峰和代表八糖的肩峰与代表十二糖的小肩峰组成。

通过评价方法Q测定肝素片段组分的浓度(参见下表)。

八糖的固定

将PVC管涂布16ml用84ml 0.05M NaCl稀释的“八”组分，然后通过还原氨化将八组分固定在聚胺的最外层，基本上如Larm等人在EP0086186A1和EP0495820B1中所述(均通过引用整体并入本文)。

使用肝素片段涂覆的PVC管的甲苯胺染色的评价

将寡糖涂覆的表面进行如评价方法C中所述的甲苯胺蓝染色测试。在管的腔表面观察到强烈的蓝色/紫色，表明肝素片段广泛共价结合。对于测试管得到的均匀染色表明形成均匀的涂层。

使用肝素片段涂覆的PVC管的肝素密度评价

通过评价方法A测定表面肝素密度并且结果如下表中所示。

使用肝素片段涂覆的PVC管的肝素活性的评价

通过评价方法B测定八糖涂覆的表面(实施例2e)的肝素活性。将下表中所示的肝素活性值根据在1.70M NaCl下用硫酸葡聚糖5的涂覆的PVC管(实施例1.22)观察到的最高肝素活性进行标准化。

实施例编号	肝素密度(μg/cm²)	肝素活性(％)
			2e	5.6	5
1.22	6.5	100

尽管八糖涂层(实施例2e)和肝素涂层(实施例1.22)的肝素密度值相似，但是八糖涂层的AT结合容量(肝素活性；‘HA’)比肝素涂层低。然而，考虑到溶液中八糖组分表现出的相对低的抗-FXa活性(数据未显示)，这是所预期的。因此，八糖片段看起来在固定后基本保留了其AT结合容量。

实施例3a:使用不同的硫酸葡聚糖在不同的NaCl浓度下涂覆的PVC管的肝素浓度

如评价方法A中所述，测定根据实施例1.4-1.19,1.21-1.32和1.34-1.38(对应于硫酸葡聚糖3、4、5、6和7)以不同NaCl浓度涂覆的固体物体(PVC管)的肝素浓度。

全部测试的涂覆的固体物体展示出至少1μg/cm²的肝素浓度。肝素浓度值如下表6中所示。

表6–使用硫酸葡聚糖3、4、5、6和7以不同NaCl浓度的涂覆的PVC管的肝素浓度(μg/ cm²)

图4显示了在1.7M NaCl下涂覆硫酸葡聚糖3、4、5、6和7的PVC管的肝素浓度。从图4可见，在这些条件下，在添加硫酸葡聚糖层的步骤中使用较高分子量的硫酸葡聚糖，存在更高的肝素浓度的趋势。在本实施例中，硫酸葡聚糖3为参比的硫酸葡聚糖。

图5显示了在不同NaCl浓度下涂覆硫酸葡聚糖3、4、5、6和7的PVC管的肝素浓度。从图5可见，在添加硫酸葡聚糖层的步骤中，硫酸葡聚糖4、5、6和7表现出随着盐浓度增加(至少高达1.7M)而升高的肝素浓度的趋势。可以看出，使用小于0.25M的盐浓度通常会导致较低的肝素活性。硫酸葡聚糖3并不遵循这种趋势，当其使用时，肝素浓度会随着该步骤中盐浓度的增加而降低。在本实施例中，硫酸葡聚糖3为参比硫酸葡聚糖。不受理论的限制，发明人将这种趋势差异归因于以下事实：硫酸葡聚糖3具有远低于硫酸葡聚糖4、5、6和7的电荷密度。

实施例3b:使用硫酸葡聚糖5与不同浓度的不同盐涂覆的PVC管的肝素浓度

如评价方法A中所述，测定根据实施例1.17、1.18、1.20、1.22和1.39-1.45(对应于硫酸葡聚糖5)，使用NaCl、Na₂HPO₄或Na₂SO₄以不同浓度涂覆的PVC管的肝素浓度。

全部测试的涂覆的固体物体展示出至少1μg/cm²的肝素浓度。肝素浓度值如下表7中所示。

表7–使用不同浓度的不同盐涂覆的PVC管(硫酸葡聚糖5)的肝素浓度(μg/cm²)

/>

*Na₂SO₄在1.7M不溶于水

表7中的肝素浓度值如图6中所示。从图6中可见，对于一定范围的不同的盐，在添加硫酸葡聚糖层的步骤中，硫酸葡聚糖5表现出随着盐浓度增加而增加肝素浓度的趋势。

实施例3c:使用硫酸葡聚糖5和7与0.85M浓度的不同盐涂覆的PVC管的肝素浓度

根据评价方法A中所述，测定根据实施例1.20、1.33、1.41、1.45、1.46和1.47(对应于硫酸葡聚糖5和7)，使用NaCl、Na₂HPO₄或Na₂SO₄以0.85M涂覆的PVC管的肝素浓度。

全部测试的涂覆的固体物体展示出至少1μg/cm²的肝素浓度。肝素浓度值如下表8中所示。

表8–使用0.85M浓度的不同盐涂覆的PVC管(硫酸葡聚糖5和7)的肝素浓度(μg/ cm²)

实施例编号	硫酸葡聚糖编号	盐浓度[M]	Na₂HPO₄	Na₂SO₄	NaCl
						1.41/1.45/1.20	5	0.85	5.0	4.2	3.5
1.46/1.47/1.33	7	0.85	3.3	3.6	3.7

可以看出，不同的盐例如NaCl、Na₂HPO₄和Na₂SO₄的应用不会显著影响肝素浓度值。

实施例3d:使用硫酸葡聚糖7与不同浓度的NaCl的不同涂覆固体物体的肝素浓度

如评价方法A所述，测定使用不同浓度的NaCl涂覆的根据实施例1.29、1.31、1.35、1.37和1.48-1.55(对应于硫酸葡聚糖7(12))的各种固体物体的肝素浓度。

所有测试的涂层固体物体均显示出至少1μg/cm²的肝素浓度。肝素浓度值显示在下表9中。

表9–使用不同浓度的NaCl的不同涂覆的固体物体(硫酸葡聚糖7)的肝素浓度(μg/ cm²)

实施例编号	硫酸葡聚糖编号	盐浓度[M]	PVC	PUR	钢制品
						1.29/1.48/1.52	7	0.05	4.0	2.9	7.2
1.31/1.49/1.53	7	0.25	5.7	2.5	7.7
						1.35/1.50/1.54	7	1.70	6.8	3.5	10.4
1.37/1.51/1.55	7	3.00	7.3	4.1	8.9

从表9可以明显看出，盐浓度会影响肝素浓度，而与所涂布的固体物体的材料无关。聚氨酯(PUR)制成的管和钢制取样管均以不同盐浓度用硫酸葡聚糖7涂覆，得到的肝素浓度值表明存在明显的盐依赖性。

实施例4a:使用不同的硫酸葡聚糖在1.7M和0.25M NaCl浓度下涂覆的PVC管的ζ电位测定

如评价方法D中所述，测定根据实施例1.1、1.2、1.3、1.6、1.8、1.13、1.15、1.18、1.22、1.25、1.27、1.31、1.35和1.56(对应于硫酸葡聚糖1、2、3、4、5、6和7)以不同的NaCl浓度涂覆的PVC管的表面电荷。

使用硫酸葡聚糖1-7以1.7M NaCl涂覆的PVC管的ζ电位值如表10所示。

表10–使用硫酸葡聚糖1-7以1.7M NaCl涂覆的PVC管的ζ电位

硫酸葡聚糖1-7都具有低于pH 3的IEP。然而，较低分子量的硫酸葡聚糖(参比实施例硫酸葡聚糖1-3)无法实现所有的优选特征(即，上述根据本发明方法涂覆的固体物体的电位指纹)。硫酸葡聚糖1和2具有在高于5的pH下出现的总体极小值(总体最低值)，且硫酸葡聚糖3具有低于20mV的Δ值。用硫酸葡聚糖4-7涂覆的本发明的固体物体却满足这些标准。

使用硫酸葡聚糖3、4和5在1.7M NaCl(对应于实施例1.8、1.15和1.22)下涂覆的PVC管的ζ电位如图7中所示。

使用硫酸葡聚糖3、6和7在1.7M NaCl(对应于实施例1.8、1.27和1.35)下涂覆的PVC管的ζ电位如图8中所示。

使用硫酸葡聚糖1-7在0.25M NaCl下涂覆的PVC管的ζ电位值如表11中所示。

表11–使用硫酸葡聚糖1-7在0.25M NaCl下涂覆的PVC管的ζ电位

硫酸葡聚糖1-7都具有低于pH 3的IEP。然而，较低分子量的硫酸葡聚糖(参比实施例硫酸葡聚糖1-3)并不能满足所有优选特征(即，上述根据本发明的方法涂覆的固体物体的电位指纹)。硫酸葡聚糖2具有在pH值高于5时出现的总体极小值，而硫酸葡聚糖1和3具有低于20mV的Δ值。涂覆有硫酸葡聚糖4至7的本发明的固体物体却满足了这些标准。

使用硫酸葡聚糖3、4和5在0.25M NaCl下涂覆的PVC管(对应于实施例1.6、1.13和1.18)的ζ电位如图9中所示。

使用硫酸葡聚糖3、6和7在0.25M NaCl下涂覆的PVC管(对应于实施例1.6、1.25和1.31)的ζ电位如图10中所示。

实施例4b:使用硫酸葡聚糖5在不同浓度的不同盐下涂覆的PVC管的ζ电位的测定

如评价方法D中所述，测定使用不同浓度的NaCl、Na₂HPO₄或Na₂SO₄的根据实施例1.18、1.22、1.39-1.42和1.44-1.45(均为硫酸葡聚糖5)涂覆的PVC管的表面电荷。

使用硫酸葡聚糖5在不同NaCl浓度下涂覆的PVC管的ζ电位如表12所示。

表12–使用硫酸葡聚糖5在不同NaCl浓度下涂覆的PVC管的ζ电位

实施例编号	盐浓度[M]	Δ值[mV]	pH(总体极小值)	IEP
					1.18	0.25	38	4.5	2.4
1.22	1.7	28	4.5	2.5

图11显示了使用硫酸葡聚糖5以0.25M和1.7M NaCl浓度涂覆的PVC管(对应于实施例1.18和1.22)的ζ电位谱，其中盐对ζ电位的影响很明显。在0.25和1.7M NaCl浓度下满足优选特征(即，上述根据本发明的方法涂覆的固体物体的电位指纹)。

使用硫酸葡聚糖5在不同的Na₂HPO₄浓度下涂覆的PVC管的ζ电位值如表13中所示。

表13–使用硫酸葡聚糖5在不同Na₂HPO₄浓度下涂覆的PVC管的ζ电位

图12显示了用硫酸葡聚糖5以0.25M、0.85M和1.7M Na₂HPO₄浓度涂覆的PVC管(对应于实施例1.40、1.41和1.42)的ζ电位谱，其中可以观察到，使用不同浓度的Na₂HPO₄满足了所有的优选特征(即，上述根据本发明的方法涂覆的固体物体的电位指纹)。

使用硫酸葡聚糖5以不同Na₂SO₄浓度涂覆的PVC管的ζ电位值如表14中所示。

表14–使用硫酸葡聚糖5以不同Na₂SO₄浓度涂覆的PVC管的ζ电位

实施例编号	盐浓度[M]	Δ值[mV]	pH(总体极小值)	IEP
					1.44	0.25	40	4.5	2.6
1.45	0.85	39	4.3	2.6
					N/A**	1.7	*	*	*

*在1.7M下不溶于水

**N/A＝不适用

图13显示了使用硫酸葡聚糖5以Na₂SO₄浓度为0.25M和0.85M涂覆的PVC管(对应于实施例1.44和1.45)的ζ电位谱，其中可以看出，使用不同浓度的Na₂SO₄满足了所有优选特征(即，根据上述本发明的方法涂覆的固体物体的电位指纹)。从表12、13和14可以看出，使用不同浓度的不同类型的盐不会显著影响ζ电位谱。另外很清楚的是，也存在对于不同的盐类型的盐依赖性。

实施例5:使用不同的硫酸葡聚糖以不同NaCl浓度涂覆的PVC管的血液接触活化(血小板损失和F1+2)

分别如评价方法E和F中所述，测定根据实施例1.1、1.3、1.13、1.18、1.25和1.31(对应于硫酸葡聚糖1、2、4、5、6和7)以不同NaCl浓度涂覆的PVC管暴露于血液中后保存的血小板百分比和F1+2(凝血酶原片段)。

结果如表15和图14和15(0.25M NaCl浓度)以及表16和图16和17(1.7MNaCl浓度)中所示。

从这些表和图中可见，对于根据本发明的方法用硫酸葡聚糖4、5、6和7以0.25M和1.7M NaCl浓度涂覆的固体物体，没有观察到显著的血小板损失(血小板损失表明血栓形成)。通过对相同的硫酸葡聚糖中观察到的低F1+2值(凝血酶原片段)进一步证实了所述涂层的抗血栓性质。与本发明涂覆硫酸葡聚糖4-7的固体物体相比，使用分子量为50kDa的对比硫酸葡聚糖1和分子量为100kDa的对比硫酸葡聚糖2涂覆的管还显示出显著的血栓形成和凝血酶原片段的高度生成。

未涂覆的PVC管和凝血实施例在本实验中显示显著的血栓形成。

表15–用硫酸葡聚糖1、2、4、5、6和7以0.25M NaCl浓度涂覆的PVC管的保存的血小板(％)和F1+2(pmol/L)

表16–使用硫酸葡聚糖1、4、5、6和7以1.7M NaCl浓度涂覆的PVC管的保存的血小板 (％)和F1+2(pmol/L)

实施例6：使用不同硫酸葡聚糖以不同盐浓度涂覆的PVC和PUR管和钢制取样管的甲苯胺染色

使根据实施例1.1-1.55涂覆的PVC和PUR管和钢制取样管经历如评价方法C中所述的甲苯胺蓝染色测试。

在所述管和钢制取样管的管腔表面上观察到蓝色/紫色，表明末端官能化的肝素的共价连接。对于测试的根据本发明的方法涂覆的固体物体得到的均匀染色，表明形成均匀的涂层(特别是均匀的肝素分布)，该涂层可以使用不同的硫酸葡聚糖以不同浓度的盐在不同的固体物体上得到。

实施例7:涂覆的PVC管的血液接触活化(血小板损失和F1+2)–在温湿度测试之后

将以不同的NaCl浓度根据实施例1.13、1.15、1.22和1.35(对应于硫酸葡聚糖4、5和7)涂覆的PVC管暴露于升高的温度和相对湿度(40℃，50％RH，1周，根据评价方法K)，然后根据评价方法E(保存的血小板)和F(F1+2)进行评价。结果如表17和图18和19以及表18和图20和21中所示。

如这些表和图中所示，对于使用硫酸葡聚糖4、5和7的根据本发明的方法涂覆的固体物体，暴露于升高的温度和湿度下后保存的血小板和F1+2值没有显著变化。在0.25M和1.7M NaCl浓度下制备的使用硫酸葡聚糖4、5和7根据本发明的方法涂覆的固体物体得到相似的结果。

这些结果表明，尽管暴露于苛刻的条件下，例如升高的温度和湿度，但是根据本发明的方法制备的涂覆的固体物体的抗血栓性能仍得以保留。

表17–使用硫酸葡聚糖4以0.25M NaCl浓度涂覆的PVC管的保存的血小板(％)和F1 +2(pmol/L)–暴露于升高的温度和湿度之前和之后

表18–使用硫酸葡聚糖4、5和7以1.7M NaCl浓度涂覆的PVC管的保存的血小板(％)和F1+2(pmol/L)–暴露于升高的温度和湿度之前和之后

本文引用的所有专利和专利申请均通过引用整体并入本文。

在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”和变型例如“包括”和“含有”将被理解为暗示包括所述整数、步骤、整数组或步骤组，但不排除任何其他整数、步骤、整数组或步骤组。

实施方案：

i)用阳离子聚合物处理固体物体表面；

ii)用阴离子聚合物处理所述表面；

iii)任选地将步骤i)和ii)重复一次或多次；

iv)用阳离子聚合物处理所述表面；和

其中，

且其中，

步骤ii)在0.25M-5.0M的盐浓度下进行。

2.实施方案1所述的用于制备固体物体的方法，其中阴离子聚合物为硫酸葡聚糖。

3.实施方案1或实施方案2所述的用于制备固体物体的方法，其中阴离子聚合物的特征在于具有750kDa-10,000kDa的总分子量，例如1,000kDa-10,000kDa。

4.实施方案1-3任一项所述的用于制备固体物体的方法，其中根据评价方法G测定阴离子聚合物的总分子量。

5.实施方案1-4任一项所述的用于制备固体物体的方法，其中阴离子聚合物的特征在于具有从>4μeq/g到7μeq/g的溶液电荷密度，例如5μeq/g到7μeq/g。

6.实施方案1-5任一项所述的用于制备固体物体的方法，其中步骤ii)在0.25M-4.0M，例如0.25M-3.0M的盐浓度下进行。

7.实施方案1-6任一项所述的用于制备固体物体的方法，其中所述盐为无机盐。

8.实施方案7所述的用于制备固体物体的方法，其中所述盐为无机钠盐。

9.实施方案8所述的用于制备固体物体的方法，其中所述盐选自氯化钠、硫酸钠、磷酸氢钠和磷酸钠。

10.实施方案9所述的用于制备固体物体的方法，其中所述盐为氯化钠。

11.实施方案1-10任一项所述的用于制备固体物体的方法，其中步骤iii)不是任选的。

12.实施方案11所述的用于制备固体物体的方法，其中在步骤iii)中，将步骤i)和ii)重复1-10次，例如1、2、3、4、5或6次。

13.实施方案1-12任一项所述的用于制备固体物体的方法，其中步骤i)的阳离子聚合物与步骤iv)的阳离子聚合物相同。

14.实施方案1-13任一项所述的用于制备固体物体的方法，其中步骤i)的阳离子聚合物为聚胺，其为任选交联的。

15.实施方案1-14任一项所述的用于制备固体物体的方法，其中步骤iv)的阳离子聚合物为聚胺，其为任选交联的。

16.实施方案1-15任一项所述的用于制备固体物体的方法，其还包含步骤i)之前的预处理步骤。

17.实施方案1-16任一项所述的用于制备固体物体的方法，其还包含在步骤i)与步骤ii)、步骤ii)与步骤iii)、步骤iii)与步骤iv)、或步骤iv)与步骤v)之间的步骤。

18.实施方案1-17任一项所述的用于制备固体物体的方法，其中抗凝物质为肝素部分。

19.实施方案18所述的用于制备固体物体的方法，其中肝素部分为末端连接的肝素部分。

20.实施方案19所述的用于制备固体物体的方法，其中末端连接的肝素部分通过其还原末端连接。

21.实施方案18所述的用于制备固体物体的方法，其中所述抗凝物质为全长的肝素。

22.实施方案1-21任一项所述的用于制备固体物体的方法，其中所述抗凝物质通过连接基团共价连接。

23.实施方案22所述的用于制备固体物体的方法，其中所述连接基团包含仲胺。

24.实施方案22所述的用于制备固体物体的方法，其中所述连接基团包含仲酰胺。

25.实施方案22所述的用于制备固体物体的方法，其中所述连接基团包含1,2,3-三唑。

26.实施方案22所述的用于制备固体物体的方法，其中所述连接基团包含硫醚。

27.实施方案1-26任一项所述的用于制备固体物体的方法，其中该固体物体为医疗装置、分析装置、分离装置或膜。

28.实施方案27所述的用于制备固体物体的方法，其中该固体物体为抗血栓的医疗装置。

29.实施方案27的用于制备固体物体的方法，其中该固体物体为体外医疗装置。

30.实施方案28所述的用于制备固体物体的方法，其中该固体物体为体内医疗装置。

31.实施方案30所述的用于制备固体物体的方法，其中体内医疗装置为支架或支架-移植物。

32.实施方案1-31任一项所述的用于制备固体物体的方法，其中该固体物体具有至少1pmol/cm²用于结合ATIII的表面的抗凝物质活性，例如至少2pmol/cm²用于结合ATIII的表面，至少3pmol/cm²用于结合ATIII的表面，至少4pmol/cm²用于结合ATIII的表面或至少5pmol/cm²用于结合ATIII的表面，适合地，其根据评价方法B测定。

33.实施方案1-32任一项所述的用于制备固体物体的方法，其中该固体物体具有至少80％保存的血小板、例如至少85％保存的血小板、例如至少90％保存的血小板的血液接触性能，适合地，其根据评价方法E测定。

34.实施方案1-33任一项所述的用于制备固体物体的方法，其中该固体物体具有<10,000pmol/L、小于7,500pmol/L、小于5,000pmol/L或小于4,000pmol/L的F1+2值，适合地，其根据评价方法F测定。

35.实施方案1-34任一项所述的用于制备固体物体的方法，其中所述抗凝物质为肝素部分，且其中所述固体物体具有至少1μg/cm²、例如至少2μg/cm²、至少4μg/cm²、至少5μg/cm²或至少6μg/cm²的肝素浓度，适合地，其根据评价方法A测定。

36.实施方案1-35任一项所述的用于制备固体物体的方法，其中该固体物体具有ζ电位谱，适合地，根据评价方法D测定，其特征在于等电点(IEP)低于pH 3，曲线的总体极小值低于pH 5，且Δ值即在总体极小值时的ζ电位与在pH9时的ζ电位之差为至少20mV。

37.实施方案1-36任一项所述的用于制备固体物体的方法，其中阴离子聚合物为包含选自-CO₂ ^-、-SO₃ ^-、-PO₃H^-和-PO₃ ^2-的基团的聚合物。

38.实施方案37所述的用于制备固体物体的方法，其中阴离子聚合物为包含-SO₃ ^-基团的聚合物。

39.实施方案38所述的用于制备固体物体的方法，其中阴离子聚合物的硫含量占阴离子聚合物重量的10％-25％。

40.用于制备固体物体的方法，所述固体物体具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层包含抗凝物质，该方法包含下列步骤：

i)用阳离子聚合物处理固体物体表面；

ii)用阴离子聚合物处理所述表面；

iii)任选地将步骤i)和ii)重复一次或多次；

iv)用阳离子聚合物处理所述表面；和

其中，

阴离子聚合物为包含-SO₃ ^-基团的聚合物，

且其中，

步骤ii)在0.25M-5.0M的盐浓度下进行。

41.用于制备固体物体的方法，所述固体物体具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层包含抗凝物质，该方法包含下列步骤：

i)用阳离子聚合物处理固体物体表面；

ii)用阴离子聚合物处理所述表面；

iii)任选地将步骤i)和ii)重复一次或多次；

iv)用阳离子聚合物处理所述表面；和

其中，

阴离子聚合物的特征在于具有650kDa-10,000kDa的总分子量；

阴离子聚合物为硫酸葡聚糖；

且其中，

步骤ii)在0.25M-5.0M的盐浓度下进行。

42.实施方案40或41所述的用于制备固体物体的方法，其中抗凝物质为肝素部分。

43.固体物体，其具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层为包含与抗凝物质共价连接的阳离子聚合物的层；

44.实施方案43所述的固体物体，其中阴离子聚合物的特征在于具有650kDa-1,000kDa的总分子量。

45.实施方案43所述的固体物体，其中阴离子聚合物的特征在于具有1,000kDa-4,500kDa的总分子量。

46.实施方案43所述的固体物体，其中阴离子聚合物的特征在于具有4,500kDa-7,000kDa的总分子量。

47.实施方案43所述的固体物体，其中阴离子聚合物的特征在于具有7,000kDa-10,000kDa的总分子量。

48.实施方案43-47任一项所述的固体物体，其中阴离子聚合物在0.25M-5.0M、例如0.25M-4.0M或0.25M-3.0M的盐浓度下涂覆于表面。

49.实施方案48所述的固体物体，其中阴离子聚合物为包含选自-CO₂ ^-、-SO₃ ^-、-PO₃H^-和-PO₃ ^2-的基团的聚合物。

50.实施方案49所述的固体物体，其中阴离子聚合物为包含-SO₃ ^-基团的聚合物。

51.实施方案50所述的固体物体，其中阴离子聚合物的硫含量占阴离子聚合物重量的10％-25％。

52.固体物体，其具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层为包含与抗凝物质共价连接的阳离子聚合物的层；阴离子聚合物为包含-SO₃ ^-基团的聚合物，且其中阴离子聚合物的特征在于具有：(a)650kDa-10,000kDa的总分子量；和(b)占阴离子聚合物重量10％-25％的硫含量。

53.用于制备固体物体的方法，所述固体物体具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层为包含阳离子聚合物的层，该方法包含下列步骤：

i)用阳离子聚合物处理固体物体表面；

ii)用阴离子聚合物处理所述表面；

iii)任选地将步骤i)和ii)重复一次或多次；和

iv)用阳离子聚合物处理所述表面；

其中，

且其中，

步骤ii)在0.25M-5.0M的盐浓度下进行。

54.用于制备固体物体的方法，所述固体物体具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层为包含阳离子聚合物的层，该方法包含下列步骤：

i)用阳离子聚合物处理固体物体表面；

ii)用阴离子聚合物处理所述表面；

iii)任选地将步骤i)和ii)重复一次或多次；和

iv)用阳离子聚合物处理所述表面；

其中，

阴离子聚合物为包含-SO₃ ^-基团的聚合物，

且其中，

步骤ii)在0.25M-5.0M的盐浓度下进行。

55.用于制备固体物体的方法，所述固体物体具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层为包含阳离子聚合物的层，该方法包含下列步骤：

i)用阳离子聚合物处理固体物体表面；

ii)用阴离子聚合物处理所述表面；

iii)任选地将步骤i)和ii)重复一次或多次；和

iv)用阳离子聚合物处理所述表面；

其中，

阴离子聚合物的特征在于具有650kDa-10,000kDa的总分子量；

阴离子聚合物为硫酸葡聚糖；

且其中，

步骤ii)在0.25M-5.0M的盐浓度下进行。

56.固体物体，其具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层为包含阳离子聚合物的层；

57.固体物体，其具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层为包含阳离子聚合物的层；阴离子聚合物为包含-SO₃ ^-基团的聚合物，且其中阴离子聚合物的特征在于具有：(a)650kDa-10,000kDa的总分子量；和(b)占阴离子聚合物重量10％-25％的硫含量。

58.用于制备固体物体的方法，所述固体物体具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层为包含阴离子聚合物的层，该方法包含下列步骤：

i)用阳离子聚合物处理固体物体表面；

ii)用阴离子聚合物处理所述表面；

iii)任选地将步骤i)和ii)重复一次或多次；

其中，

且其中，

步骤ii)在0.25M-5.0M的盐浓度下进行。

59.用于制备固体物体的方法，所述固体物体具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层为包含阴离子聚合物的层，该方法包含下列步骤：

i)用阳离子聚合物处理固体物体表面；

ii)用阴离子聚合物处理所述表面；

iii)任选地将步骤i)和ii)重复一次或多次；

其中，

阴离子聚合物为包含-SO₃ ^-基团的聚合物，

且其中，

步骤ii)在0.25M-5.0M的盐浓度下进行。

60.用于制备固体物体的方法，所述固体物体具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层为包含阴离子聚合物的层，该方法包含下列步骤：

i)用阳离子聚合物处理固体物体表面；

ii)用阴离子聚合物处理所述表面；

iii)任选地将步骤i)和ii)重复一次或多次；

其中，

阴离子聚合物的特征在于具有650kDa-10,000kDa的总分子量；

阴离子聚合物为硫酸葡聚糖；

且其中，

步骤ii)在0.25M-5.0M的盐浓度下进行。

61.固体物体，其具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层为包含阴离子聚合物的层；且其中阴离子聚合物的特征在于具有：(a)650kDa-10,000kDa的总分子量；和(b)>4μeq/g的溶液电荷密度。

62.固体物体，其具有包含阳离子和阴离子聚合物的分层涂层的表面，其中外涂层为包含阴离子聚合物的层；阴离子聚合物为包含-SO₃ ^-基团的聚合物，且其中阴离子聚合物的特征在于具有：(a)650kDa-10,000kDa的总分子量；和(b)占阴离子聚合物重量10％-25％的硫含量。

Claims

i)用阳离子聚合物处理固体物体表面；

ii)用阴离子聚合物处理所述表面；

iii)任选地将步骤i)和ii)重复一次或多次；

iv)用阳离子聚合物处理所述表面；和

其中，

且其中，

步骤ii)在0.25M-5.0M的盐浓度下进行。

2.权利要求1所述的用于制备固体物体的方法，其中阴离子聚合物为硫酸葡聚糖。

3.权利要求1或权利要求2所述的用于制备固体物体的方法，其中阴离子聚合物的特征在于具有750kDa-10,000kDa的总分子量，例如1,000kDa-10,000kDa。

4.权利要求1-3任一项所述的用于制备固体物体的方法，其中根据评价方法G测定阴离子聚合物的总分子量。

5.权利要求1-4任一项所述的用于制备固体物体的方法，其中阴离子聚合物的特征在于具有从>4μeq/g到7μeq/g的溶液电荷密度，例如5μeq/g到7μeq/g。

6.权利要求1-5任一项所述的用于制备固体物体的方法，其中步骤ii)在0.25M-4.0M，例如0.25M-3.0M的盐浓度下进行。

7.权利要求1-6任一项所述的用于制备固体物体的方法，其中所述盐为无机盐。

8.权利要求7所述的用于制备固体物体的方法，其中所述盐为无机钠盐。

9.权利要求8所述的用于制备固体物体的方法，其中所述盐选自氯化钠、硫酸钠、磷酸氢钠和磷酸钠。

10.权利要求9所述的用于制备固体物体的方法，其中所述盐为氯化钠。