JP2013511997A5 - - Google Patents

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  1. α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能である、原核生物に由来する単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、モチーフ1、すなわち、
    Xaa1 Val Xaa2 Asp Arg Xaa3 Xaa4 Xaa5 Arg Xaa6 Gln Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Gly Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Trp
    を含むアミノ酸配列を含み、
    Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8、Xaa9、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15およびXaa16が、天然に存在するアミノ酸から独立に選択され、ただし、Xaa1およびXaa7は、Cysではないポリペプチド。
  2. α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能である、原核生物に由来する単離ポリペプチドであって、
    (a)配列番号1のアミノ酸2〜306に対して少なくとも80%の同一性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、
    (b)配列番号2のアミノ酸3〜336に対して少なくとも80%の同一性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、
    (c)配列番号3のアミノ酸3〜305に対して少なくとも80%の同一性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、
    (d)配列番号4のアミノ酸3〜279に対して少なくとも80%の同一性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
    (f)システイン残基を含まないか、または最大1つもしくは最大2つのシステイン残基を含むアミノ酸配列を有することを特徴とする、ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ活性を有するポリペプチド
    からなる群から選択されるポリペプチド。
  3. ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ活性を有する、原核生物に由来する単離ポリペプチドであって、大腸菌中で可溶性タンパク質として発現させることができることを特徴とするポリペプチド。
  4. 0、1または2つのシステイン残基を含む、請求項1から3のいずれかに記載のポリペプチド。
  5. α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能であり、前記α-ヒドロキシグリシンが、式R-Gly(OH)のC末端-α-ヒドロキシグリシンであり、式中、Rがペプチドであり、Gly(OH)が、前記ペプチドのC末端に連結されているα-ヒドロキシグリシン残基であり、
    前記α-アミドが、式R-NH2を有する、
    請求項1から4のいずれかに記載の原核生物に由来するポリペプチド。
  6. ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ(PAL)活性を有する、原核生物に由来する酵素を生成するための方法であって、
    (i)酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトを含む、非哺乳動物を起源とする、組換え発現の宿主細胞を、酵素の発現に適している条件下で培養する工程と、
    (ii)(a)細胞の破壊および遠心分離の後の上清、ならびに/または
    (b)増殖培地
    から酵素を回収する工程と
    を含み、宿主細胞が、非哺乳動物を起源とし、例えば、大腸菌株であり、前記酵素が、工程(ii)において回収する際に、可溶性である方法。
  7. 原核生物に由来する酵素が、工程(ii)において回収する際に、触媒活性を得るために酵素がリフォールディングのステップを必要としないという意味で、触媒として活性な形態をとっている、請求項6に記載の方法。
  8. 請求項6または7に記載の方法により得ることができる、ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ活性を有する、原核生物に由来する酵素である単離ポリペプチドであって、前記酵素が、
    R-Gly(OH)→R-NH2
    の反応を触媒することが可能であり、
    式中、Rがペプチドであり、Gly(OH)が、前記ペプチドのC末端に連結されているα-ヒドロキシグリシン残基であるポリペプチド。
  9. 請求項1から5のいずれかの記載をさらなる特徴とする、請求項8に記載のポリペプチド。
  10. ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ活性を有する、原核生物に由来する酵素を生成するための方法であって、請求項1から5のいずれかまたは請求項8もしくは9いずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸を含む組換え発現の宿主細胞を、前記酵素の生成に適している条件下で維持する工程を含む方法。
  11. ペプチド中のC末端α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒するための、請求項1から5のいずれかまたは請求項8もしくは9いずれかに記載の、原核生物に由来するポリペプチドの使用。
  12. 原核生物に由来するα-アミド化ペプチドを生成するための方法であって、
    (i)C末端グリシン残基を有する標的ペプチドを、ペプチジルグリシンアルファ-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ(PHM)および請求項1から5のいずれかまたは請求項8もしくは9に記載のポリペプチドの両方と、酵素活性に適している条件下で反応させる工程であって、前記標的ペプチドにおける、前記PHMおよび前記ポリペプチドを用いる反応を、2つの別個のステップにおいてかまたは同時に実施する工程と、
    (ii)C末端α-アミド化ペプチドを回収する工程と
    を含む方法。
  13. 原核生物に由来する回収されるα-アミド化ペプチドが、医薬として使用するためのものである、請求項11に記載の使用または請求項12に記載の方法。
  14. 前記原核生物に由来するペプチドが、アミリン、神経ペプチドY(NPY)、ペプチドYY(PYY)、PYY-3-36、膵臓ポリペプチド(PP)、グルカゴン様ペプチド(GLP-1)、ガストリン、カルシトニン、カルシトニン関連ペプチド(CGRP)、ガストリン放出ペプチド、バソプレシン、オキシトシン、ニューロキニンA、セクレチン、パンクレアスタチン、プロ-オピオメラノコルチン(POMC)、アルファ-メラノサイト刺激ホルモン(アルファMSH)、ガンマ-メラノサイト刺激ホルモン(ガンマ1MSH)およびアミド化ヒンジペプチド(HP-N)、またはそれらの機能性の類似体からなる群から選択される、請求項10から13のいずれかに記載の方法または使用。
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