JP2013511997A - 新規のペプチジルアルファ−ヒドロキシグリシンアルファ−アミド化リアーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
「PAM」または「ペプチジル-グリシンアルファ-アミド化モノオキシゲナーゼ」は、C末端グリシン残基からα-ヒドロキシグリシンへの変換およびα-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換の両方を触媒する二機能性の酵素を指す。また、この酵素は、ペプチジルグリシン2-ヒドロキシラーゼ、ペプチジルアルファ-アミド化酵素、ペプチジルグリシンアルファ-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ、およびペプチジル-アルファ-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼとしても公知である。
Xaa1およびXaa7は、Cysを除く任意の天然に存在するアミノ酸であり得、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa9、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15、Xaa16は、任意の天然に存在するアミノ酸であり得る。
Ser Ser Ser Gly Gly Ser Gly Ser Glu Val Leu Phe Gln (配列番号8)
Ser Ser Ser Gly Ser Gly Glu Val Leu Phe Gln (配列番号9)
SER SER SER GLY GLY SER GLY GLY SER GLY (配列番号10)
Ser Ser Gly Gly Ser Gly Ser Glu Val Leu Phe Gln (配列番号12)
Ser Ser Ser Gly Gly Ser Gly Ser Glu Thr Leu Phe Gln (配列番号14)
SER SER SER GLY GLY SER GLY GLY SER (配列番号16)
1a.α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能である単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、モチーフ1、すなわち、
Xaa1 Val Xaa2 Asp Arg Xaa3 Xaa4 Xaa5 Arg Xaa6 Gln Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Gly Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Trp
を含むアミノ酸配列を有し、
Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8、Xaa9、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15およびXaa16(Xaa1〜Xaa16)が、天然に存在するアミノ酸から独立に選択され、ただし、Xaa1およびXaa7は、Cysではないポリペプチド。
2a.Xaa4がAsnである、項1aに記載のポリペプチド。
3a.Xaa14がLeuである、項1aまたは2aに記載のポリペプチド。
4a.Xaa7が、ValまたはIleである、項1aから3aのいずれかに記載のポリペプチド。
5a.Xaa8が、PheまたはLeuである、項1aから4aのいずれかに記載のポリペプチド。
6a.Xaa9が、AspまたはSerである項1aから5aのいずれかに記載のポリペプチド。
7a.Xaa4がAsnであり、Xaa14がLeuであり、Xaa7が、ValまたはIleであり、Xaa8が、PheまたはLeuであり、Xaa9が、AspまたはSerである、項1aに記載のポリペプチド。
8a.α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能である単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、モチーフ2、すなわち、Asp Gly Tyr Xaa17 Asn Xaa18 Arg Xaa19 Xaa20 Xaa21 Phe Xaa22 Xaa23 Xaa24 Gly Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Xaa30 Xaa31 Xaa32 Xaa33 Gly Xaa34 Xaa35 Xaa36 Gly Xaa37 Phe
を含むアミノ酸配列を有し、
Xaa17、Xaa18、Xaa19、Xaa20、Xaa21、Xaa22、Xaa23、Xaa24、Xaa25、Xaa26、Xaa27、Xaa28、Xaa29、Xaa30、Xaa31、Xaa32、Xaa33、Xaa34、Xaa35、Xaa36、Xaa37(Xaa17〜Xaa37)が、天然に存在するアミノ酸から独立に選択され、ただし、Xaa17はCysではないポリペプチド。
9a.原核生物に由来する、項1aから8aのいずれかに記載のポリペプチド。
10a.前記原核生物が、エリスロバクター属、エキシグオバクテリウム属、クトニオバクター属およびプランクトマイセス属の種からなる群から選択されるか、またはエリスロバクター属、エキシグオバクテリウム属、クトニオバクター属、プランクトマイセス属、バークホルデリア属の種、アルファプロテオバクテリア綱、メタノサルキナ属の種、ソランギウム属、サリニスポラ属の種、メソリゾビウム属、ブラジリゾビウム属(Bradyrhizobium)およびソリバクター属の種からなる群から選択される、項9aに記載のポリペプチド。
11a.野生型配列である、項9aまたは10aに記載のポリペプチド。
12a.シグナルペプチドを有さない成熟配列である、項11aに記載のポリペプチド。
13a.0、1または2つのシステイン残基を含む、項1aから12aのいずれかに記載のポリペプチド。
14a.α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能である単離ポリペプチドであって、
(a)配列番号1のアミノ酸2〜306に対して少なくとも75%の同一性を示すアミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチド、
(b)配列番号2のアミノ酸3〜336に対して少なくとも75%の同一性を示すアミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチド、
(c)配列番号3のアミノ酸3〜305に対して少なくとも75%の同一性を示すアミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチド、および
(d)配列番号4のアミノ酸3〜279に対して少なくとも75%の同一性を示すアミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチド、
(e)配列番号13のアミノ酸に対して少なくとも75%の同一性を示すアミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチド、および
(f)配列番号15のアミノ酸に対して少なくとも75%の同一性を示すアミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチド。
15a.配列番号1のアミノ酸2〜306に対して少なくとも75%、例えば、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%または少なくとも98%等の同一性の程度を示すアミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチドである、項14aに記載のポリペプチド。
16a.配列番号2のアミノ酸3〜336に対して少なくとも75%、例えば、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%または少なくとも98%等の同一性の程度を示すアミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチドである、項14aに記載のポリペプチド。
17a.配列番号3のアミノ酸3〜305に対して少なくとも75%、例として、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%または少なくとも98%の同一性の程度を示すアミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチドである、項14aに記載のポリペプチド。
18a.配列番号4のアミノ酸3〜279に対して少なくとも75%、例えば、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%または少なくとも98%等の同一性の程度を示すアミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチドである、項14aに記載のポリペプチド。
19a.前記アミノ酸配列が、0、1または2つのシステイン残基を含む、項14aから18aのいずれかに記載のポリペプチド。
20a.項14aから19aのいずれかの記載と組み合わせた項1aに記載のポリペプチド。
21a.項14aから19aのいずれかの記載と組み合わせた、項2aから12aのいずれかに記載のポリペプチド。
22a.前記アミノ酸配列が、原核生物に由来する野生型アミノ酸配列と比較して、最高30個の改変を含む、項1aから13aのいずれかに記載のポリペプチド。
23a.前記アミノ酸配列が、原核生物に由来する成熟野生型PAL様酵素のアミノ酸配列と比較して、1〜30個の改変、1〜25個の改変、5〜25個の改変、1〜20個の改変、10〜20個の改変、1〜12個の改変、1〜18個の改変または12〜18個の改変の範囲の改変を含む、項1aから13aのいずれかに記載のポリペプチド。
24a.α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能である単離ポリペプチドであって、
(a)配列番号1のアミノ酸2〜306と比較して改変を有するアミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチド、
(b)配列番号2のアミノ酸3〜336と比較して改変を有するアミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチド、
(c)配列番号3のアミノ酸3〜305と比較して改変を有するアミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチド、および
(d)配列番号4のアミノ酸3〜279と比較して改変を有するアミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチド
からなる群から選択され、
前記改変が、1〜30個の改変、1〜25個の改変、5〜25個の改変、1〜20個の改変、10〜20個の改変、1〜12個の改変、1〜18個の改変または12〜18個の改変であるポリペプチド。
25a.前記改変が、配列中の1つまたは複数のアミノ酸の1つまたは複数の置換、欠失、挿入を包含する付加からなる、項22aから24aのいずれかに記載のポリペプチド。
26a.(i)α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能である酵素である単離ポリペプチドであって、酵素が原核生物に由来することを特徴とする単離ポリペプチド、
(ii)α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能である酵素である単離ポリペプチドであって、大腸菌中で可溶性タンパク質として発現できることを特徴とする単離ポリペプチド、
(iii)ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ活性を有する単離ポリペプチドであって、大腸菌中で可溶性タンパク質として発現させることができることを特徴とする単離ポリペプチド、
(iv)ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ活性を有する単離ポリペプチドであって、0、1または2つのシステイン残基を含むことを特徴とする単離ポリペプチド、
(v)ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ活性を有する単離ポリペプチドであって、システイン残基を含まないことを特徴とする単離ポリペプチド
からなる群から選択される単離ポリペプチド。
27a.酵素が、野生型酵素と比較して、最高30個の改変を含む、項26a(i)に記載のポリペプチド。
28a.前記アミノ酸配列が、前記原核生物に由来する成熟野生型PAL様酵素のアミノ酸配列と比較して、1〜30個の改変、1〜25個の改変、5〜25個の改変、1〜20個の改変、10〜20個の改変、1〜12個の改変、1〜18個の改変または12〜18個の改変に及ぶ改変を含む、項27aに記載のポリペプチド。
29a.α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能である単離ポリペプチドであって、配列番号1のアミノ酸配列2〜306を含むまたはからなるポリペプチド。
30a.α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能である単離ポリペプチドであって、配列番号2のアミノ酸配列3〜336を含むまたはからなるポリペプチド。
31a.α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能である単離ポリペプチドであって、配列番号3のアミノ酸配列3〜305を含むまたはからなるポリペプチド。
32a.α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能である単離ポリペプチドであって、配列番号4のアミノ酸配列3〜279を含むまたはからなるポリペプチド。
33a.α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能である単離ポリペプチドであって、配列番号13のアミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチド。
34a.α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能である単離ポリペプチドであって、配列番号15のアミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチド。
35a.ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ活性を有する単離ポリペプチドであって、
(i)ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ(PAL)活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトを含む、非哺乳動物を起源とする、組換え発現の宿主細胞を、前記ポリペプチドの発現に適している条件下で培養する工程と
(ii)ポリペプチドを、(a)細胞の破壊および遠心分離の後の上清ならびに/または(b)増殖培地から回収する工程と
を含む方法により得ることができ、
宿主細胞が、非哺乳動物を起源とし、例えば、大腸菌株等であり、ポリペプチドが、可溶性であり、工程(ii)において回収する際に、触媒活性を得るためにポリペプチドがリフォールディングのステップを必要としないという意味で、活性な形態をとっているポリペプチド。
36a.ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ活性を有する単離ポリペプチドであって、
(i)ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ(PAL)活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトを含む、非哺乳動物を起源とする、組換え発現の宿主細胞を、前記ポリペプチドの発現に適している条件下で培養する工程と
(ii)ポリペプチドを、(a)細胞の破壊および遠心分離の後の上清ならびに/または(b)増殖培地から回収する工程と
を含む方法により得ることができ、
宿主細胞が、非哺乳動物を起源とし、例えば、大腸菌株等であるポリペプチド。
37a.項1aをさらなる特徴とする、項35aまたは36aに記載のポリペプチド。
38a.項2aから14aのいずれかの記載をさらなる特徴とする、項35aまたは36aに記載のポリペプチド。
39a.0、1または2つのシステイン残基を含む、項365または36aに記載のポリペプチド。
40a.原核生物に由来する、項35aまたは36aまたは39aに記載のポリペプチド。
41a.前記原核生物が、エリスロバクター属、エキシグオバクテリウム属、クトニオバクター属、プランクトマイセス属、バークホルデリア属の種、アルファプロテオバクテリア綱、メタノサルキナ属の種、ソランギウム属、メソリゾビウム属、ブラジリゾビウム属、サリニスポラ属の種およびソリバクターの種からなる群から選択され、好ましくは、前記原核生物が、エリスロバクター属、エキシグオバクテリウム属、クトニオバクター属またはプランクトマイセス属の種である、項40aに記載のポリペプチド。
42a.野生型配列である、項40aまたは41aに記載のポリペプチド。
43a.シグナルペプチドを含有しない成熟野生型配列である、項42aに記載のポリペプチド。
44a.前記ポリペプチドの前記アミノ酸配列が、前記原核生物に由来する成熟野生型PAL様酵素のアミノ酸配列と比較して、1〜30個の改変、1〜25個の改変、5〜25個の改変、1〜20個の改変、10〜20個の改変、1〜12個の改変、1〜18個の改変または12〜18個の改変に及ぶ改変を含む、項40aから43aのいずれかに記載のポリペプチド。
45a.前記改変が、配列中の1つまたは複数のアミノ酸の1つまたは複数の置換、欠失、挿入を包含する付加からなる、項44aに記載のポリペプチド。
46a.前記アミノ酸配列が、前記原核生物に由来する成熟野生型PAL様酵素のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%または少なくとも98%の同一性を示す、項40aから43aのいずれかに記載のポリペプチド。
47a.ポリペプチドが、α-ヒドロキシ馬尿酸をベンズアミドに変換することができる、項1aから46aのいずれかに記載のポリペプチド。
48a.前記α-ヒドロキシグリシンが、式R-Gly(OH)のC末端-α-ヒドロキシグリシンであり、式中、Rがペプチドであり、Gly(OH)が、前記ペプチドのC末端に連結されているα-ヒドロキシグリシン残基であり、前記α-アミドが、式R-NH2を有する、項1aから46aのいずれかに記載のポリペプチド。
49a.ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ(PAL)である、項1aから46aのいずれかに記載のポリペプチド。
50a.ポリペプチドが、融合パートナーを含む、項1aから49aのいずれかに記載のポリペプチド。
51a.ポリペプチドが、TAPタグを含む、項1aから49aのいずれかに記載のポリペプチド。
52a.ポリペプチドが、例えば、固定化された金属親和性タグ(His6またはHis8)、グルタチオントランスフェラーゼタグ、抗体を用いて回収されるタグ(FLAGタグ、HAタグ、MYCタグ)、ビオチンおよびストレプトアビジンからなる群から選択された精製タグを含む、項1aから49aのいずれかに記載のポリペプチド。
53a.酵素が、融合パートナーにリンカー配列によりつながっている、項50aから52aのいずれかに記載のポリペプチド。
54a.リンカー配列が、1〜30個、1〜25個、1〜20個または1〜15個のアミノ酸を有する、項53aに記載のポリペプチド。
55a.実質的に純粋である、項1aから54aのいずれかに記載のポリペプチド。
56a.ポリペプチド調製物が、(i)重量に関して最大50%もしくは最大10%もしくは最大5%の未変性の状態に伴うかもしくは組換えに起因して伴うその他のポリペプチド材料を含有するか、または(ii)ポリペプチドが、未変性の状態に伴うかもしくは組換えに起因して伴うその他のポリペプチド材料と比較して、重量に関して少なくとも50%純粋、少なくとも90%純粋もしくは少なくとも95%純粋である、項1aから54aのいずれかに記載のポリペプチド。
57a.前記ポリペプチドが、SDS-PAGEにより決定した場合、その他のポリペプチド材料と比較して、少なくとも5%純粋、少なくとも10%純粋、少なくとも25%純粋、少なくとも50%純粋、少なくとも75%純粋、少なくとも80%純粋、少なくとも90%純粋である、項1aから54aのいずれかに記載のポリペプチド。
58a.項1aから57aまたは73aのいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
59a.項58aに記載のポリヌクレオチドを含む、単離組換え核酸コンストラクト。
60a.ヌクレオチド配列が、発現の宿主中でポリペプチドの生成を導く1つまたは複数の制御配列に作動可能に連結されている、項59aに記載の核酸コンストラクト。
61a.プロモーターを含む、項60aまたは61aに記載の核酸コンストラクト。
62a.核酸が、精製タグおよび/またはリンカーをさらにコードする、項59aから61aのいずれかに記載の核酸。
63a.項59aから62aのいずれかに記載の核酸コンストラクトを含む組換え発現の宿主細胞。
64a.組換え核酸が、宿主細胞のゲノム中にかまたは宿主細胞中で自律的に複製するベクター中に存在する、項63aに記載の宿主細胞。
65a.宿主細胞が、(i)細菌または真菌、(ii)酵母、(iii)哺乳動物宿主細胞、および(iv)原核生物宿主細胞からなる群から選択される、項63aまたは64aに記載の宿主細胞。
66a.宿主細胞が大腸菌である、項63aから65aのいずれかに記載の宿主細胞。
67a.α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能である酵素を生成するための方法であって、項63aから66aのいずれかに記載の宿主細胞を、前記酵素の生成に適している条件下で維持する工程を含む方法。
68a.項1aから57aまたは73aのいずれかに記載のポリペプチドを生成する方法であって、
(i)前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトを含む宿主細胞を、ポリペプチドの生成を促す条件下で培養する工程と、(ii)ポリペプチドを回収する工程と
を含む方法。
69a.ポリペプチドを、細胞破壊後の上清から可溶性の形態で回収する、項68aに記載の方法。
70a.ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ(PAL)活性を有する酵素を生成するための方法であって、
i)酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトを含む、非哺乳動物を起源とする、組換え発現の宿主細胞を、酵素の発現に適している条件下で培養する工程と、
ii)a)細胞の破壊および遠心分離の後の上清、ならびに/または
b)増殖培地
から酵素を回収する工程と
を含み、
宿主細胞が、非哺乳動物を起源とし、例えば、大腸菌株等であり、酵素が、工程ii)において回収する際に、可溶性である方法。
71a.酵素が、0、1または2つのCys残基を含むアミノ酸配列を有する、項70aに記載の方法。
72a.酵素が、工程ii)において回収する際に、触媒活性を得るために酵素がリフォールディングのステップを必要としないという意味で、触媒として活性な形態をとっている、項70aまたは71aに記載の方法。
73a.項70aから72aのいずれかに記載の方法により得ることができる、ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ活性を有する酵素である単離ポリペプチドであって、前記酵素が、R-Gly(OH)->R-NH2の反応を触媒することが可能であり、式中、Rがペプチドであり、Gly(OH)が、前記ペプチドのC末端に連結されているα-ヒドロキシグリシン残基であるポリペプチド。
74a.ペプチド中のC末端α-ヒドロキシグリシン残基からα-アミド残基への変換を触媒するための、項1aから57aまたは73aのいずれかに記載のポリペプチドの使用。
75a.ポリペプチドを、α-アミド化ペプチドを調製するための方法において使用する、項74aに記載の使用。
76a.前記ポリペプチドを使用する場合に、Cu2+イオンおよび/またはアスコルビン酸が存在する、項74aまたは75aに記載の使用。
77a.PHM活性を有する酵素を、α-アミド化ペプチドを調製するための方法において使用する、項74aから76aのいずれかに記載の使用。
78a.α-アミド化ペプチドを生成するための方法であって、(i)C末端グリシン残基を有する標的ペプチドを、ペプチジルグリシンアルファ-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ(PHM)および項1aから57aまたは73aのいずれかに記載のポリペプチドの両方と、酵素活性に適している条件下で反応させる工程であって、前記標的ペプチドにおける、前記PHMおよび前記ポリペプチドを用いる反応を、2つの別個のステップにおいてかまたは同時に実施する工程と、(ii)C末端α-アミド化ペプチドを回収する工程とを含む方法。
79a.α-アミド化ペプチドを生成するための方法であって、
(i)原核生物宿主中で、アミド化するペプチドの前駆体(標的ペプチド)を、ペプチドの組換え発現により生成する工程であって、前記前駆体がC末端Glu残基を有する工程と、
(ii)前記前駆体を、PHM様酵素を用いて処理して、前記ペプチドのC末端α-ヒドロキシグリシンを得る工程と、
(iii)前記C末端α-ヒドロキシグリシンを、項1aから57aまたは73aのいずれかに記載のポリペプチドを用いて処理する工程と、
(iv)C末端α-アミド化ペプチドを回収する工程と
を含む方法。
80a.PHMを有する酵素のアミノ酸配列が、哺乳動物生物に由来する、項74aから79aのいずれかに記載の使用または方法。
81a.回収されるα-アミド化ペプチドが、医薬として使用するためのものである、項74aから80aのいずれかに記載の使用または方法。
82a.回収したC末端α-アミド化ペプチドを含む医薬製剤を調製する工程(iii)を含む、項81aに記載の使用または方法。
83a.前記標的ペプチドが、アミリン、神経ペプチドY(NPY)、ペプチドYY(PYY)、PYY-3-36、膵臓ポリペプチド(PP)、グルカゴン様ペプチド(GLP-1)、ガストリン、カルシトニン、カルシトニン関連ペプチド(CGRP)、ガストリン放出ペプチド、バソプレシン、オキシトシン、ニューロキニンA、セクレチン、パンクレアスタチン、プロ-オピオメラノコルチン(POMC)、アルファ-メラノサイト刺激ホルモン(アルファMSH)、ガンマ-メラノサイト刺激ホルモン(ガンマ1MSH)およびアミド化ヒンジペプチド(HP-N)、またはそれらの機能性の類似体からなる群から選択される、項74aから82aのいずれかに記載の使用または方法。
84a.α-アミド化ペプチドを、以下の状態および/または疾患、すなわち、肥満、高血圧、ストレス誘発高血糖、2型糖尿病、耐糖能異常、1型糖尿病を包含する高血糖、熱傷、手術創、治療に同化作用を必要とするその他の疾患または傷害、心筋梗塞、脳卒中、冠状動脈心臓疾患、その他の心血管系障害のうちの1つの治療または予防のために、危篤状態の糖尿病患者および非糖尿病患者ならびに多発ニューロパシーの治療のために使用する、項74aから83aのいずれかに記載の使用または方法。
85a.α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能である単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、モチーフ(モチーフ2と名付ける)、すなわち、Asp Gly Tyr Xaa17 Asn Xaa18 Arg Xaa19 Xaa20 Xaa21 Phe Xaa22 Xaa23 Xaa24 Gly Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Xaa30 Xaa31 Xaa32 Xaa33 Gly Xaa34 Xaa35 Xaa36 Gly Xaa37 Pheを含むアミノ酸配列を有し、Xaa17〜Xaa37が、天然に存在するアミノ酸から独立に選択され、ただし、Xaa17はCysではないポリペプチド。
86a.原核生物に由来する、項85aに記載の単離ポリペプチド。
87a.0、1または2つのシステイン残基を含む、項85aまたは86aに記載のポリペプチド。
88a.前記α-ヒドロキシグリシンが、式R-Gly(OH)のC末端-α-ヒドロキシグリシンであり、式中、Rがペプチドであり、Gly(OH)が、前記ペプチドのC末端に連結されているα-ヒドロキシグリシン残基であり、前記α-アミドが、式R-NH2を有する、項85aから87aのいずれかに記載のポリペプチド。
89a.ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ活性を有する単離ポリペプチドであって、配列番号19のアミノ酸配列
(PNSQPNPYRTVEGWFQMPAGRTMGSTSAVFVAPGGHIWVAERCGANTCAGSDVAPLLEFDTAGKWSSFGAGMFQFPHGIWIEPDGSIWLTDGQGANGKGHQVFKFSPQGKVLMTLGKAGVAGDGPDTFNQPNAVAVSANGDVFISDGHNAGRGNARVLKYSKDGTFIKQWGGHGSGPGQFEVPHTLAFDSKGRLFVGDRANNRIQIFDQDGKFLDEWKQFGRPSGIFIDRNDAMYVTDSESTDRDGYGHNPGWKRGIRIGSAKDGSVTAFIPDPSPGAGATSAAEGVAADAKGNVYGAEVGPKDVKKYVRK、ソリバクター属の種に由来する)を含むまたはからなるポリペプチド。
90a.ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ活性を有する単離ポリペプチドであって、配列番号20のアミノ酸配列
(TVSDPAVGAIPEDRLLRPWGRLPATARIGTGITVGPTGEIALLHRAGTAFAYDAVIDTDTVVVLNPRDGTVRQTWGAGRFRSPHSITADSEGRYWVTDVSTNKITTFDAAGRQVGELGHDYPTGLETALRVRNVLSNLPCTLDEYIFARPTDVAVSADGSIVVADGYRNSRVARFDTHRVLTGQWGELGDQPAQFNIPHGVALDSNGAVYVADRRNARVQVFNADGSVRHVWHSSALGRPYDVAIGPDDAVYVLDGGDLLDENNGEQRGYVCRLSTTGRVTHRWALADQRANPHQLAIGVRGEIYVAALAGAPLWRWAPQ、サリニスポラ属の種に由来する)を含むまたはからなるポリペプチド。
91a.ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ活性を有する単離ポリペプチドであって、配列番号21のアミノ酸配列
(MLTSGHGMYITAQDDLFVVTYDAHQVLHFDPNQELVKALGTFNEPHWEAPFNHPTDVAVGAEGDIYVADGYGNAQVHRFASDGSYLNGWGTPGISAGEFSTPHAIWVLPDERVLVVDRDNDRIQVFDRNGAVLDEWRGLVRPMDIWADPEGQRIYVTEQAPRITCLDSAGVVIGRARTFGIYPHGIWGAPDGSLYVAEQGYPHQIVKYERI、バークホルデリア属の種に由来する)を含むまたはからなるポリペプチド。
92a.ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ活性を有する単離ポリペプチドであって、配列番号22のアミノ酸配列
(MLPGPSVITDGQYRYHADQHWAKLPAGQQFGPISQLAVDASNRVIVVQRDTPAVLVFSHDGTLELAWHHPKLTSVHGLCVAPDESLFIVSFDAHQVLKFSRSGELLLELGKFSSPNWIEPFNHPTDVAVANDGEIYVTDGYGNARVHRFAADGTYIGGWGQHGNKTGEFSCPHGIWIDEDVGRVLAVDRDNDRVQVFDRSGQYLSEWTGFRRPMDIWGTPNGTFYIVDQAPGLSIVDRNGRLRARARMYPTYSHGIGGDANGNLFVAAQGPSRVVRLERLDNEE、バークホルデリア属の種に由来する)を含むまたはからなるポリペプチド。
93a.ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ活性を有する単離ポリペプチドであって、配列番号23のアミノ酸配列
QLGPSDAYRTTYGWEKMPAGRALGVSSGVFPDRDGKHIWILARCGGNNCAGSDADPILKFDMAGNLVTSFGKGVLAFPHGFFIDAEGNVWVTEGAPVGDRRGDAGFKIGKGHQVFKFSPEGKLLMTLGVAGVAGDDNKHFNGPSGVAIAPNGDIWVVDGHRGGNNRVVRFSKDGKFIRAIGGGVGSESADTGRFSDPHGIAIDSAGRIFVADRGNNRIQILDPEGNFLAEWKQFGKPSGVYIDARDRIYVGDGMSTPERNPGVVPGIRVGDAKTGKVTAFIPDNEKYKQGESGVEFLAADADGNIYAGEVTRQRFGKHIPLK
を含むまたはからなるポリペプチド。
94a.ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ活性を有する単離ポリペプチドであって、配列番号19に対して少なくとも75%、例として、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%または少なくとも98%の同一性の程度を示すアミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチド。
95a.ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ活性を有する単離ポリペプチドであって、配列番号20に対して少なくとも75%、例として、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%または少なくとも98%の同一性の程度を示すアミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチド。
96a.ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ活性を有する単離ポリペプチドであって、配列番号21に対して少なくとも75%、例として、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%または少なくとも98%の同一性の程度を示すアミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチド。
97a.ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ活性を有する単離ポリペプチドであって、配列番号22に対して少なくとも75%、例として、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%または少なくとも98%の同一性の程度を示すアミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチド。
98a.ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ活性を有する単離ポリペプチドであって、配列番号23に対して少なくとも75%、例として、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%または少なくとも98%の同一性の程度を示すアミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチド。
99a.前記アミノ酸配列が、0、1または2つのシステイン残基を含む、項89aから98aのいずれかに記載のポリペプチド。
100a.融合パートナーを含む、項85aから99aのいずれかに記載のポリペプチド。
101a.前記ポリペプチドが、α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能であり、前記α-ヒドロキシグリシンが、式R-Gly(OH)のC末端-α-ヒドロキシグリシンであり、式中、Rがペプチドであり、Gly(OH)が、前記ペプチドのC末端に連結されているα-ヒドロキシグリシン残基であり、前記α-アミドが、式R-NH2を有する、項85aから100aのいずれかに記載のポリペプチド。
102a.項74aから84aのいずれかの定義に従う使用または方法における、項85aから101aのいずれかの記載により定義したポリペプチドの使用。
103a.項85aから101aのいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
104a.項85aから101aに記載のポリヌクレオチドを含む単離組換え核酸コンストラクト。
105a.ヌクレオチド配列が、発現の宿主中でポリペプチドの生成を導く1つまたは複数の制御配列に作動可能に連結されている、項104aに記載の核酸コンストラクト。
106a.プロモーターを含む、項104aまたは105aに記載の核酸コンストラクト。
107a.核酸が、精製タグおよび/またはリンカーをさらにコードする、項104aから106aのいずれかに記載の核酸。
108a.項104aから107aのいずれかに記載の核酸コンストラクトを含む組換え発現の宿主細胞。
109a.組換え核酸が、宿主細胞のゲノム中にかまたは宿主細胞中で自律的に複製するベクター中に存在する、項108aに記載の宿主細胞。
110a.宿主細胞が、(i)細菌または真菌、(ii)酵母、(iii)哺乳動物宿主細胞、および(iv)原核生物宿主細胞からなる群から選択される、項107aまたは109aに記載の宿主細胞。
111a.宿主細胞が大腸菌である、項108aから110aのいずれかに記載の宿主細胞。
1.酵素が原核生物に由来することを特徴とする、α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能である酵素。
2.酵素が、モチーフ、すなわち、Xaa1 Val Xaa2 Asp Arg Xaa3 Xaa4 Xaa5 Arg Xaa6 Gln Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Gly Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Trpを含み、Xaa1およびXaa7が、Cysを除く任意の天然に存在するアミノ酸であり得、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa8、Xaa9、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15、Xaa16が、任意の天然に存在するアミノ酸であり得る、項1に記載の酵素。
3.Xaa4がAsnであり得る、項2に記載の酵素。
4.Xaa14がLeuであり得る、項2または3に記載の酵素。
5.Xaa7が、ValまたはIleであり得る、項2から4に記載の酵素。
6.Xaa8が、PheまたはLeuである、項2から5に記載の酵素。
7.Xaa9が、AspまたはSerであり得る、項2から6に記載の酵素。
8.エリスロバクター属、エキシグオバクテリウム属、クトニオバクター属またはプランクトマイセス属の種から単離される、項1から7に記載の酵素。
9.α-ヒドロキシ馬尿酸をベンズアミドに変換することができる、項1から3に記載の酵素。
10.野生型酵素である、項1から9に記載の酵素。
11.野生型酵素と比較して、最高30個の改変を含む、項1から5に記載の酵素。
12.1〜30個の改変を含む、項1から11に記載の酵素。
13.5〜25個の改変を含む、項1から12に記載の酵素。
14.10〜20個の改変を含む、項1から13に記載の酵素。
15.12〜18個の改変を含む、項1から14に記載の酵素。
16.少なくとも1つのCys残基が、置換されているかまたは欠失している、項1および11から15に記載の酵素。
17.融合パートナーを含む、項1から16に記載の酵素。
18.TAPタグを含む、項1から17に記載の酵素。
19.固定化された金属親和性タグ(His6またはHis8)、グルタチオントランスフェラーゼタグ、抗体を用いて回収されるタグ(FLAGタグ、HAタグ、MYCタグ)、ビオチンまたはストレプトアビジンからなる群から選択される精製タグを含む、項1から17に記載の酵素。
20.融合パートナーにリンカー配列によりつながっている、項17から19に記載の酵素。
21.リンカー配列が、1〜30個、1〜25個、1〜20個または1〜15個のアミノ酸を有する、項20に記載の酵素。
22.Xaa4がAsnであり得、Xaa14がLeuであり得、Xaa7が、ValまたはIleであり得、Xaa8が、PheまたはLeuであり、Xaa9が、AspまたはSerであり得る、項1から21のいずれかに記載の酵素。
23.α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能である、配列番号1を含む酵素。
24.α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能である、配列番号2を含む酵素。
25.α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能である、配列番号3を含む酵素。
26.α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能である、配列番号4を含む酵素。
27.α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能である配列番号13を含む酵素。
28.α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能である配列番号15を含む酵素。
29.1〜30個の改変を含む、項23から27に記載の酵素。
30.5〜25個の改変を含む、項23から28に記載の酵素。
31.10〜20個の改変を含む、項23から29に記載の酵素。
32.12〜18個の改変を含む、項23から30に記載の酵素。
33.少なくとも1つのCys残基が、置換されているかまたは欠失している、項23から31に記載の酵素。
34.ペプチド中のC末端α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒するための、項1から33のいずれかに記載の酵素の使用。
35.α-アミド化ペプチドを調製するための方法における、項34に記載の使用。
36.Cu2+イオンおよび/またはアスコルビン酸が存在する、項34から35に記載の使用。
37.PHM活性を有する酵素を、α-アミド化ペプチドを調製するための方法において使用する、項34から36に記載の使用。
38.ペプチドが、アミリン、NPY、PYY-3-36、PP、GLP-1、ガストリン、カルシトニン、ガストリン放出ペプチド、バソプレシン、オキシトシン、ニューロキニンA、セクレチン、POMC、アルファMSH、ガンマ1MSHおよびHP-N、またはそれらの機能性の類似体からなる群から選択される標的ペプチドである、項34から37に記載の使用。
39.α-アミド化ペプチドを、以下の状態、すなわち、肥満、高血圧、ストレス誘発高血糖、2型糖尿病、耐糖能異常、1型糖尿病を包含する高血糖、熱傷、手術創、治療に同化作用を必要とするその他の疾患または傷害、心筋梗塞、脳卒中、冠状動脈心臓疾患、その他の心血管系障害の治療または予防のため、危篤状態の糖尿病患者および非糖尿病患者ならびに多発ニューロパシーの治療のために使用する、項34から38に記載の使用。
40.α-アミド化ペプチドを生成するための方法であって、標的ペプチドを項1から33に記載の酵素と反応させる工程と、α-アミド化ペプチドを精製する工程とを含む方法。
41.PHM活性を有する酵素を使用する、項40に記載の方法。
42.標的ペプチドが、アミリン、NPY、PYY-3-36、PP、GLP-1、ガストリン、カルシトニン、ガストリン放出ペプチド、バソプレシン、オキシトシン、ニューロキニンA、セクレチン、POMC、アルファMSH、ガンマ1MSHおよびHP-N、またはそれらの機能性の類似体からなる群から選択される、項40から41に記載の方法。
43.項1から33のいずれかに記載の酵素をコードする単離核酸。
44.a.プロモーター、
b.項43に記載の単離核酸
を含む組換え核酸。
45.精製タグをさらにコードする、項44に記載の組換え核酸。
46.リンカーをさらにコードする、項44から45に記載の組換え核酸。
47.項44から46に記載の組換え核酸を含むベクター。
48.項44から46に記載の組換え核酸を含む宿主細胞。
49.組換え核酸が、宿主細胞のゲノム中にかまたは宿主細胞中で自律的に複製するベクター中に存在する、項48に記載の宿主細胞。
50.宿主細胞が、細菌、真菌、例えば、酵母である、項48から49に記載の宿主細胞。
51.宿主細胞が大腸菌である、項48から50に記載の宿主細胞。
52.α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能である酵素を生成するための方法であって、項47に記載の宿主細胞を、前記酵素の生成に適している条件下で維持する工程を含む方法。
データベースの使用および以下の特徴づけによって同定された本発明の酵素に関するすべての実施例は、Signal P(Henrik Nielsenら、「Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites」Protein Engineering 10、1〜6頁(1997))を用いて高い信頼性をもって予測されたシグナルペプチドを含有した。シグナルペプチドは、通常、成熟した機能酵素の一部ではないので、予測に従ってオリジナル配列から除去した。下記に記載する実施例1〜6における酵素は、配列GluValLeuPheGln/GlyProを認識するHRV14 3Cプロテアーゼを用いるTAP融合パートナーの除去を促進するために、GlyPro N末端伸張部分を有するように設計した。
精製タグとしてのリボソームタンパク質L9およびエリスロバクター属種SD-21由来のPAL様ドメインを有する融合タンパク質のクローニング
エリスロバクターPAL様ドメインの4つの配列変異体をクローニングして発現させ、評価した。これらの変異体は、PAL様ドメインのN末端に対する異なる融合パートナー、リンカーまたは伸長部分が発現および溶解性に影響するかどうかを評価するために作製した。
配列番号13は、エリスロバクター属種SD-21細菌に由来するPAL様ドメインをコードする。このタンパク質の分子量は33467.1Daと計算された。Gly/Serリッチで柔軟なリンカー(配列番号10)を介して耐熱性アルカリ性タンパク質(TAP)精製タグ(配列番号7)に融合すると、この融合酵素は、51231.7Daの分子量を有し、Table1(表2)に記載のタンパク質1に相当するものになる。
リンカー領域およびエリスロバクターPAL様ドメインのN末端部分の中に小さな変化を含む約110bpのXhol/Ncol合成断片(Geneart)をプラスミドAのXhol/Ncol部位にライゲーションし、それによってタンパク質2を生じさせることにより、エリスロバクター属種SD-21のPAL様ドメイン(プラスミドB)の別の変異体を得た。タンパク質2はタンパク質1に記載のものと同じ精製タグ配列番号7を含むが、HRV14 3Cプロテアーゼ切断部位(ELTFQ)を有するリンカー(配列番号14)を有しかつPAL様ドメイン(配列番号15)のN末端中に変化を有する。この融合タンパク質の理論分子量は52092.6Daであり、HRV14 3Cプロテアーゼが遊離するPAL様ドメインについては33823.5Daである。
リンカー領域およびエリスロバクターPAL様ドメインのN末端部分の中に小さな変化を含むXhol/Ncol合成断片(Geneart)をプラスミドBのXhol/Ncol部位にライゲーションし、それによってタンパク質3を生じさせることにより、エリスロバクターPAL様ドメインの別の変異体(図1のベクターマップ上に例示したプラスミドC)を得た。タンパク質3は、配列番号7の精製タグを含むが、タンパク質2と比較して、HRV14 3Cプロテアーゼによる切断が可能であるわずかに改変されたリンカー(配列番号8)、ならびにタンパク質2と比較して4個のアミノ酸(配列番号1)およびタンパク質1と比較して1個のアミノ酸が切り詰められ、かつN末端Gly残基を含む(配列番号1)PAL様エリスロバクタードメインを有する。この融合タンパク質の理論分子量は51591.1Daであり、HRV14 3Cプロテアーゼが遊離するPAL様ドメインについては33324Daである。
タンパク質4
プラスミドDを得るために、ベクターCからXhol/BamHI断片を切り取り、一続きの配列番号9および10の配列をコードする融合パートナーを含むベクターにこの断片をライゲーションすることにより、エリスロバクター属種SD-21 PAL様ドメイン配列番号1の別の変異体を得た。このコードされた融合タンパク質は、エリスロバクターPAL様ドメイン配列番号1の前にN末端ヒスチジン6タグ(配列番号9)およびHRV14 3Cプロテアーゼ切断部位(配列番号12)を有するリンカーを含み、理論分子量35645.4Daを有する。
十分な記載のあるPALドメインと本発明において開示の細菌由来新規PAL様ドメインとを比較するために、ラット(Rattus norvegicus)(リンカー中に相違を含む、タンパク質5をコードするプラスミドEおよびタンパク質6をコードするプラスミドF)ならびにアフリカツメガエル(タンパク質7をコードするプラスミドG)のPALドメインを、基本的にタンパク質1について記載のように、同じ融合パートナー(配列番号7)を用いてクローニングし、以前に記載されている、2つのジスルフィド架橋を含有する典型的な真核生物PAL(例えば、Stoffers, D.Aら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:735〜739頁(1989)およびMizuno Kら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 148:546〜552頁(1987))の発現プロファイルを評価した。
プラスミド番号:A (エリスロバクター1):配列番号26
ATGAAAGTGATTCTGCTGCGTGATGTGCCGAAAATTGGCAAAAAAGGCGAAATCAAAGAAGTGAGCGACGGCTACGCGCGTAACTATCTGATTCCGCGTGGCTTTGCGAAAGAATATACCGAAGGCCTGGAACGTGCGATTAAACACGAAAAAGAAATCGAAAAACGCAAAAAAGAACGCGAACGTGAAGAAAGCGAAAAAATCCTGAAAGAACTGAAAAAACGTACCCATGTGGTGAAAGTGAAAGCGGGCGAAGGCGGCAAAATTTTTGGCGCGGTGACCGCGGCGACCGTGGCGGAAGAAATTAGCAAAACCACCGGCCTGAAACTGGATAAACGCTGGTTCAAACTGGACAAACCGATTAAAGAACTGGGCGAATATAGCCTGGAAGTGAGCCTGCCGGGTGGCGTGAAAGATACCATTAAAATTCGCGTGGAACGCGAAGAAAGCTCGAGCGGTGGCAGCGGCGGTAGCGGTGAAGCCCCGCCGGTTACCATCGATGAAAGCTGGCCGGATATTCCGGAAAGCGCCGTGTTTGGCGAACCGACCGCCATTGATGTGGATAGCCATGGCCATATCTTTGTGCTGCATCGTGCCGGTCGCGAATGGACCCAGCCGTTTCCGAGCGATCCGATTAGCGAACCGACCGTGTTCATGTTCGCCGCGAACGGCAAACTGCTGAGCAAATGGGGCGCGGGCGAACTGGTTATGCCGCATGGTCTGAGCATTGATGGTGATAACAAAGTGTGGATTACCGATGTGGCGCGTGAACAGGTTCTGCGTTTTACCCATGAAGGTGCGGAAGAACTGGTTCTGGGCACCCGTGGCGAAACCGGCCAGGATGAAAGCCATTTCGGCCGTCCGGCGGATGTTACCTTTGTGGGTGATCGTGTGCTGGTGGCCGATGGCTATCTGAACCGTCGTATTATGGTGTTTGATCGCGCGGGCAACTTCCTGGAACAGTGGGGTAAAGAAGGTGAAGATGCGGGCGAATTTAATCTGCCGCATGCGATCGCGGCCGATAGCGAACGTATTTATGTGGCGGATCGTGAAAACGCGCGTGTTCAGGTGCTGAGCCTGGATGGTGAACCGCTGGCCCGCTGGCGCCAGGATGGCACCGGCCATCCGTATGCCGTGAAACCGATTGGCAGCGGCTATGTTCTGGCGATTGAAGGCCGCGATCGCGCGGGTCGCAATACCGCCATTGGCCGCATTTATCGTGCGGATGGTGGCCTGGAACGTGTGTTTGATGCGGGCGTTGAACCGCATACCGGCACCAGCCTGGGCCATGATGTGGCGATTGGTCCGGATGGTAGCGCGTATATGGTCGACAACAAAGCGAATCGTGTTATTAAATTTGATCTGAGCCGCGCCGGCGTTGAAGAAGCGGATGCGGAT
プラスミド番号:B (エリスロバクター2):配列番号27
ATGAAAGTGATTCTGCTGCGTGATGTGCCGAAAATTGGCAAAAAAGGCGAAATCAAAGAAGTGAGCGACGGCTACGCGCGTAACTATCTGATTCCGCGTGGCTTTGCGAAAGAATATACCGAAGGCCTGGAACGTGCGATTAAACACGAAAAAGAAATCGAAAAACGCAAAAAAGAACGCGAACGTGAAGAAAGCGAAAAAATCCTGAAAGAACTGAAAAAACGTACCCATGTGGTGAAAGTGAAAGCGGGCGAAGGCGGCAAAATTTTTGGCGCGGTGACCGCGGCGACCGTGGCGGAAGAAATTAGCAAAACCACCGGCCTGAAACTGGATAAACGCTGGTTCAAACTGGACAAACCGATTAAAGAACTGGGCGAATATAGCCTGGAAGTGAGCCTGCCGGGTGGCGTGAAAGATACCATTAAAATTCGCGTGGAACGCGAAGAAAGCTCGAGCGGCGGCAGCGGTAGCGAAACCCTGTTTCAGGCGCGTGAAGAAGCGCCGCCGGTTACCATTGATGAAAGCTGGCCGGATATTCCGGAAAGCGCGGTGTTTGGCGAACCGACCGCGATTGATGTGGATAGCCATGGCCATATTTTTGTGCTGCATCGCGCGGGCCGCGAATGGACCCAGCCGTTTCCGAGCGATCCGATTAGCGAACCGACCGTGTTTATGTTTGCGGCGAACGGCAAACTGCTGAGCAAATGGGGCGCGGGCGAACTGGTGATGCCGCATGGCCTGAGCATTGATGGCGATAACAAAGTGTGGATTACCGATGTGGCGCGCGAACAGGTGCTGCGCTTTACCCATGAAGGCGCGGAAGAACTGGTGCTGGGCACCCGCGGCGAAACCGGCCAGGATGAAAGCCATTTTGGCCGCCCGGCGGATGTGACCTTTGTGGGCGATCGCGTGCTGGTGGCGGATGGCTATCTGAACCGCCGCATTATGGTGTTTGATCGCGCGGGCAACTTTCTGGAACAGTGGGGCAAAGAAGGCGAAGATGCGGGCGAATTTAACCTGCCGCATGCGATTGCGGCGGATAGCGAACGCATTTATGTGGCGGATCGCGAAAACGCGCGCGTGCAGGTGCTGAGCCTGGATGGCGAACCGCTGGCGCGCTGGCGCCAGGATGGCACCGGCCATCCGTATGCGGTGAAACCGATTGGCAGCGGCTATGTGCTGGCGATTGAAGGCCGCGATCGCGCGGGCCGCAACACCGCGATTGGCCGCATTTATCGCGCGGATGGCGGCCTGGAACGCGTGTTTGATGCGGGCGTGGAACCGCATACCGGCACCAGCCTGGGCCATGATGTGGCGATTGGCCCGGATGGCAGCGCGTATATGGTCGACAACAAAGCGAACCGCGTGATTAAATTTGATCTGAGCCGCGCGGGCGTGGAAGAAGCGGATGCGGAT
プラスミド番号:C (エリスロバクター3):配列番号28
ATGAAAGTGATTCTGCTGCGTGATGTGCCGAAAATTGGCAAAAAAGGCGAAATCAAAGAAGTGAGCGACGGCTACGCGCGTAACTATCTGATTCCGCGTGGCTTTGCGAAAGAATATACCGAAGGCCTGGAACGTGCGATTAAACACGAAAAAGAAATCGAAAAACGCAAAAAAGAACGCGAACGTGAAGAAAGCGAAAAAATCCTGAAAGAACTGAAAAAACGTACCCATGTGGTGAAAGTGAAAGCGGGCGAAGGCGGCAAAATTTTTGGCGCGGTGACCGCGGCGACCGTGGCGGAAGAAATTAGCAAAACCACCGGCCTGAAACTGGATAAACGCTGGTTCAAACTGGACAAACCGATTAAAGAACTGGGCGAATATAGCCTGGAAGTGAGCCTGCCGGGTGGCGTGAAAGATACCATTAAAATTCGCGTGGAACGCGAAGAAAGCTCGAGCGGCGGCAGCGGTAGCGAAGTGCTGTTTCAGGGCCCGCCGGTTACCATTGATGAAAGCTGGCCGGATATTCCGGAAAGCGCGGTGTTTGGCGAACCGACCGCGATTGATGTGGATAGCCATGGCCATATCTTTGTGCTGCATCGTGCCGGTCGCGAATGGACCCAGCCGTTTCCGAGCGATCCGATTAGCGAACCGACCGTGTTCATGTTCGCCGCGAACGGCAAACTGCTGAGCAAATGGGGCGCGGGCGAACTGGTTATGCCGCATGGTCTGAGCATTGATGGTGATAACAAAGTGTGGATTACCGATGTGGCGCGTGAACAGGTTCTGCGTTTTACCCATGAAGGTGCGGAAGAACTGGTTCTGGGCACCCGTGGCGAAACCGGCCAGGATGAAAGCCATTTCGGCCGTCCGGCGGATGTTACCTTTGTGGGTGATCGTGTGCTGGTGGCCGATGGCTATCTGAACCGTCGTATTATGGTGTTTGATCGCGCGGGCAACTTCCTGGAACAGTGGGGTAAAGAAGGTGAAGATGCGGGCGAATTTAATCTGCCGCATGCGATCGCGGCCGATAGCGAACGTATTTATGTGGCGGATCGTGAAAACGCGCGTGTTCAGGTGCTGAGCCTGGATGGTGAACCGCTGGCCCGCTGGCGCCAGGATGGCACCGGCCATCCGTATGCCGTGAAACCGATTGGCAGCGGCTATGTTCTGGCGATTGAAGGCCGCGATCGCGCGGGTCGCAATACCGCCATTGGCCGCATTTATCGTGCGGATGGTGGCCTGGAACGTGTGTTTGATGCGGGCGTTGAACCGCATACCGGCACCAGCCTGGGCCATGATGTGGCGATTGGTCCGGATGGTAGCGCGTATATGGTCGACAACAAAGCGAATCGTGTTATTAAATTTGATCTGAGCCGCGCCGGCGTTGAAGAAGCGGATGCGGAT
プラスミド番号:D (エリスロバクター4):配列番号29
ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACTCGAGCGGCGGCAGCGGTAGCGAAGTGCTGTTTCAGGGCCCGCCGGTTACCATTGATGAAAGCTGGCCGGATATTCCGGAAAGCGCGGTGTTTGGCGAACCGACCGCGATTGATGTGGATAGCCATGGCCATATCTTTGTGCTGCATCGTGCCGGTCGCGAATGGACCCAGCCGTTTCCGAGCGATCCGATTAGCGAACCGACCGTGTTCATGTTCGCCGCGAACGGCAAACTGCTGAGCAAATGGGGCGCGGGCGAACTGGTTATGCCGCATGGTCTGAGCATTGATGGTGATAACAAAGTGTGGATTACCGATGTGGCGCGTGAACAGGTTCTGCGTTTTACCCATGAAGGTGCGGAAGAACTGGTTCTGGGCACCCGTGGCGAAACCGGCCAGGATGAAAGCCATTTCGGCCGTCCGGCGGATGTTACCTTTGTGGGTGATCGTGTGCTGGTGGCCGATGGCTATCTGAACCGTCGTATTATGGTGTTTGATCGCGCGGGCAACTTCCTGGAACAGTGGGGTAAAGAAGGTGAAGATGCGGGCGAATTTAATCTGCCGCATGCGATCGCGGCCGATAGCGAACGTATTTATGTGGCGGATCGTGAAAACGCGCGTGTTCAGGTGCTGAGCCTGGATGGTGAACCGCTGGCCCGCTGGCGCCAGGATGGCACCGGCCATCCGTATGCCGTGAAACCGATTGGCAGCGGCTATGTTCTGGCGATTGAAGGCCGCGATCGCGCGGGTCGCAATACCGCCATTGGCCGCATTTATCGTGCGGATGGTGGCCTGGAACGTGTGTTTGATGCGGGCGTTGAACCGCATACCGGCACCAGCCTGGGCCATGATGTGGCGATTGGTCCGGATGGTAGCGCGTATATGGTCGACAACAAAGCGAATCGTGTTATTAAATTTGATCTGAGCCGCGCCGGCGTTGAAGAAGCGGATGCGGAT
プラスミド番号:E (ラット1):配列番号30
ATGAAAGTGATTCTGCTGCGTGATGTGCCGAAAATTGGCAAAAAAGGCGAAATCAAAGAAGTGAGCGACGGCTACGCGCGTAACTATCTGATTCCGCGTGGCTTTGCGAAAGAATATACCGAAGGCCTGGAACGTGCGATTAAACACGAAAAAGAAATCGAAAAACGCAAAAAAGAACGCGAACGTGAAGAAAGCGAAAAAATCCTGAAAGAACTGAAAAAACGTACCCATGTGGTGAAAGTGAAAGCGGGCGAAGGCGGCAAAATTTTTGGCGCGGTGACCGCGGCGACCGTGGCGGAAGAAATTAGCAAAACCACCGGCCTGAAACTGGATAAACGCTGGTTCAAACTGGACAAACCGATTAAAGAACTGGGCGAATATAGCCTGGAAGTGAGCCTGCCGGGTGGCGTGAAAGATACCATTAAAATTCGCGTGGAACGCGAAGAAAGCTCGAGCGGGAGCGGCGAAGTTCTGTTTCAGGGCGATTTTCATGTGGAAGAGGAACTGGATTGGCCGGGTGTTTATCTGCTGCCGGGGCAGGTGAGCGGCGTTGCCCTGGATAGTAAAAACAACCTGGTGATTTTCCACCGTGGAGATCATGTGTGGGATGGTAACTCATTCGATAGCAAATTTGTCTATCAGCAGCGCGGCCTGGGTCCTATTGAAGAAGATACCATCCTGGTTATCGATCCGAATAATGCGGAAATTCTGCAAAGTTCTGGAAAAAACCTGTTCTACCTGCCTCATGGGCTGAGCATCGATACCGATGGTAACTACTGGGTTACCGATGTAGCCCTGCATCAGGTCTTCAAACTGGACCCACATTCAAAAGAAGGTCCGCTGCTGATTCTGGGACGTTCTATGCAGCCTGGCAGCGATCAGAACCATTTTTGCCAACCAACAGATGTCGCCGTGGAGCCGTCGACTGGTGCTGTGTTTGTGTCGGACGGCTACTGTAACTCCCGTATCGTCCAGTTTAGCCCGTCAGGTAAATTTGTTACACAGTGGGGCGAAGAGTCGTCTGGCTCTAGTCCGCGCCCGGGCCAGTTTTCGGTGCCGCATAGCCTGGCCCTGGTGCCGCATCTGGACCAGCTGTGTGTGGCCGACCGTGAGAACGGCCGCATTCAATGCTTTAAAACTGATACAAAGGAATTTGTTCGCGAAATTAAACACGCCAGCTTTGGACGTAATGTTTTCGCGATTTCATACATTCCAGGCTTTCTGTTTGCAGTCAACGGCAAACCATATTTTGGCGATCAGGAACCGGTACAGGGTTTTGTTATGAATTTTTCATCGGGCGAAATTATTGATGTTTTTAAACCTGTGCGCAAACATTTCGATATGCCACATGATATTGTGGCTAGCGAGGACGGTACGGTTTATATTGGGGATGCGCACACGAACACCGTGTGGAAATTCACCCTGACCGAAAAAATGGAACACCGTTCGGTC
プラスミド番号:F (ラット2):配列番号31
ATGAAAGTGATTCTGCTGCGTGATGTGCCGAAAATTGGCAAAAAAGGCGAAATCAAAGAAGTGAGCGACGGCTACGCGCGTAACTATCTGATTCCGCGTGGCTTTGCGAAAGAATATACCGAAGGCCTGGAACGTGCGATTAAACACGAAAAAGAAATCGAAAAACGCAAAAAAGAACGCGAACGTGAAGAAAGCGAAAAAATCCTGAAAGAACTGAAAAAACGTACCCATGTGGTGAAAGTGAAAGCGGGCGAAGGCGGCAAAATTTTTGGCGCGGTGACCGCGGCGACCGTGGCGGAAGAAATTAGCAAAACCACCGGCCTGAAACTGGATAAACGCTGGTTCAAACTGGACAAACCGATTAAAGAACTGGGCGAATATAGCCTGGAAGTGAGCCTGCCGGGTGGCGTGAAAGATACCATTAAAATTCGCGTGGAACGCGAAGAAAGCTCGAGCGGGGGTAGCGGCGGCTCTGGCGATTTTCATGTGGAAGAGGAACTGGATTGGCCGGGTGTTTATCTGCTGCCGGGGCAGGTGAGCGGCGTTGCCCTGGATAGTAAAAACAACCTGGTGATTTTCCACCGTGGAGATCATGTGTGGGATGGTAACTCATTCGATAGCAAATTTGTCTATCAGCAGCGCGGCCTGGGTCCTATTGAAGAAGATACCATCCTGGTTATCGATCCGAATAATGCGGAAATTCTGCAAAGTTCTGGAAAAAACCTGTTCTACCTGCCTCATGGGCTGAGCATCGATACCGATGGTAACTACTGGGTTACCGATGTAGCCCTGCATCAGGTCTTCAAACTGGACCCACATTCAAAAGAAGGTCCGCTGCTGATTCTGGGACGTTCTATGCAGCCTGGCAGCGATCAGAACCATTTTTGCCAACCAACAGATGTCGCCGTGGAGCCGTCGACTGGTGCTGTGTTTGTGTCGGACGGCTACTGTAACTCCCGTATCGTCCAGTTTAGCCCGTCAGGTAAATTTGTTACACAGTGGGGCGAAGAGTCGTCTGGCTCTAGTCCGCGCCCGGGCCAGTTTTCGGTGCCGCATAGCCTGGCCCTGGTGCCGCATCTGGACCAGCTGTGTGTGGCCGACCGTGAGAACGGCCGCATTCAATGCTTTAAAACTGATACAAAGGAATTTGTTCGCGAAATTAAACACGCCAGCTTTGGACGTAATGTTTTCGCGATTTCATACATTCCAGGCTTTCTGTTTGCAGTCAACGGCAAACCATATTTTGGCGATCAGGAACCGGTACAGGGTTTTGTTATGAATTTTTCATCGGGCGAAATTATTGATGTTTTTAAACCTGTGCGCAAACATTTCGATATGCCACATGATATTGTGGCTAGCGAGGACGGTACGGTTTATATTGGGGATGCGCACACGAACACCGTGTGGAAATTCACCCTGACCGAAAAAATGGAACACCGTTCGGTC
プラスミド番号:G (アフリカツメガエル):配列番号32
ATGAAAGTGATTCTGCTGCGTGATGTGCCGAAAATTGGCAAAAAAGGCGAAATCAAAGAAGTGAGCGACGGCTACGCGCGTAACTATCTGATTCCGCGTGGCTTTGCGAAAGAATATACCGAAGGCCTGGAACGTGCGATTAAACACGAAAAAGAAATCGAAAAACGCAAAAAAGAACGCGAACGTGAAGAAAGCGAAAAAATCCTGAAAGAACTGAAAAAACGTACCCATGTGGTGAAAGTGAAAGCGGGCGAAGGCGGCAAAATTTTTGGCGCGGTGACCGCGGCGACCGTGGCGGAAGAAATTAGCAAAACCACCGGCCTGAAACTGGATAAACGCTGGTTCAAACTGGACAAACCGATTAAAGAACTGGGCGAATATAGCCTGGAAGTGAGCCTGCCGGGTGGCGTGAAAGATACCATTAAAATTCGCGTGGAACGCGAAGAAAGCTCGAGCGGGAGCGGCGAAGTTCTGTTTCAGGGCGATGTGCATCTGGAAGAAGATACCGACTGGCCGGGTGTGAACCTTAAAGTGGGCCAGGTGAGCGGGCTAGCCCTGGACCCGAAAAACAACCTGGCCATTTTTCATCGTGGCGATCATGTGTGGGATGAAAACAGCTTTGATCGCAACTTTGTGTATCAGCAGCGTGGCATTGGCCCGATTCAGGAAAGCACCATTCTGGTTGTTGATCCGAGCAGCAGCAAAGTGCTGAAAAGCACCGGCAAAAACCTGTTTTTTCTGCCGCATGGCCTGACCATTGATCGTGATGGCAACTATTGGGTGACCGATGTGGCGCTGCATCAGGTGTTTAAACTGGGTGCGGGCAAAGAAACCCCGCTGCTGGTGCTGGGTCGTGCGTTTCAGCCGGGCAGCGATCGTAAACATTTTTGCCAGCCGACCGATGTTGCGGTTGATCCGATTACCGGCAACTTTTTTGTGGCGGATGGCTATTGCAACAGCCGTATTATGCAGTTTAGCCCGAACGGCATGTTTATTATGCAGTGGGGCGAAGAAACCAGCAGCAACGTGCCGCGTCCGGGCCAGTTTCGTATTCCGCACAGCCTGACCATGGTGCCGGATCAGGGCCAGCTGTGCGTGGCGGATCGTGAAAACGGCCGTATTCAGTGCTTTCATGCGGAAACCGGCAATTTTGTGAAACAAATCAAACATCAGGAATTTGGCCGCGAAGTTTTTGCGGTGAGCTATGCGCCGGGTGGTGTGCTGTATGCGGTGAACGGCAAACCGTATTATGGCTATAGCGCACCGGTGCAGGGCTTTATGCTGAACTTTAGCAACGGCGATATTCTGGATACCTTTATTCCGGCGCGTAAAAACTTTGATATGCCGCATGATATTGCGGCAGCGGATGATGGCACCGTGTATGTGGGCGATGCGCATGCGAACGCGGTGTGGAAATTTAGCCCGAGCAAAGCGGAACATCGGTCCGTG
正確なDNA配列を有するプラスミドを大腸菌発現株BL21(DE3)に形質転換し、LB/アンピシリンプレート上で一晩培養した。プラスミドを有するBL21(DE3)宿主細胞をLB培地中で増殖させ、T7/IPTG発現系を用いてタンパク質発現を誘導した。
1Lのバッフル付シェーカーフラスコ中で30℃にて3時間、BL21(DE3)中のプラスミドから発現する際には、エリスロバクタータンパク質変異体であるタンパク質3、タンパク質1またはタンパク質2は、約50kDaの推定分子量および極めて類似した発現レベルを示した。一貫して高い溶解度(約80%)が中性pHで観察された(25mM NaP04 pH7を含有する緩衝液中、図2Aにタンパク質2について例示した)。
上記のように、1〜2Lのバッフル付シェーカーフラスコ中で30℃にて3時間、PAL様酵素(タンパク質1、タンパク質2もしくはタンパク質3)またはラットPAL(タンパク質6)を発現させた後に、SP Sepharose FF 5mlカラムを用いる陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製を、以下に記載のように実施した。
緩衝液A: 50mMリン酸ナトリウム、pH7
緩衝液B: 50mMリン酸ナトリウム、pH7 + 1M NaCl
TAPタグ付きHRV14 3Cプロテアーゼによる切断
タンパク質3から精製タグを除去するために、50mM Tris HCl pH7.5、10%グリセロール緩衝液、1mM TCEPの中に存在する融合タンパク質約1.5mgを、TAPタグ付きHRV14 3Cプロテアーゼ(国際公開第2008/043847号パンフレットから)を用いて、反応容量3ml、酵素対基質比1:25で30℃にて一晩切断した(NanoDrop2000、Thermo Scientificを用いて、製造業者の説明書に従いタンパク質濃度を測定した後、比を評価した)。クーマシー染色SDS-PAGEゲルおよびLC-MS分析を用いて、以下のプロトコールにより酵素切断が起こったことを確認した。LC-MSD_TOF(Agilent technologies)機器を、製造業者が推奨するMSセッティングと共に使用して、分析用Poroshell 300SB-C8、Micro Bore 1.0×75mm、5ミクロン(Agilent Technologies)カラムを用い、流速0.3ml/分およびカラム温度40℃の標準的HPLC条件で試料を分析した。グラジエント溶出は20分で形成され、8.8mMギ酸アンモニウムを含有する0.1%ギ酸水溶液(緩衝液A)およびアセトニトリル(緩衝液B)を用いて以下のとおり実施した。
遊離された成熟PALドメインを含有する消化物を、25mM NaP04 pH7を用いて1:3に希釈して、試料アプリケーションを、1mlのHiTrap Q Sepharose High Performance(HP)陰イオン交換カラム(GE Healthcare 17-1153-01)に負荷し、AKTA Explorer 100システム(GE Healthcare)を用いて、以下の精製緩衝液により分離した。
緩衝液A: 50mMリン酸ナトリウム、pH 7
緩衝液B: 50mMリン酸ナトリウム、pH7 + 1M NaCl
クローニング、精製タグとしてのリボソームタンパク質L9およびエキシグオバクテリウム属種(株ATCC BAA-1283/AT1b)由来のPAL様ドメインを有する発現融合タンパク質、ならびに融合タンパク質および成熟PAL様ドメインの精製
タンパク質8は、N末端精製タグ(配列番号7)およびHRV14 3Cプロテアーゼ部位を含有するリンカー(配列番号8)と連結したエキシグオバクテリウム(Exiguibacterium)PAL様ドメイン(配列番号2)である。この融合タンパク質の計算分子量は56.115Daであり、成熟PAL様ドメインの計算分子量は37848.5Daである。
ATGAAAGTGATTCTGCTGCGTGATGTGCCGAAAATTGGCAAAAAAGGCGAAATCAAAGAAGTGAGCGACGGCTACGCGCGTAACTATCTGATTCCGCGTGGCTTTGCGAAAGAATATACCGAAGGCCTGGAACGTGCGATTAAACACGAAAAAGAAATCGAAAAACGCAAAAAAGAACGCGAACGTGAAGAAAGCGAAAAAATCCTGAAAGAACTGAAAAAACGTACCCATGTGGTGAAAGTGAAAGCGGGCGAAGGCGGCAAAATTTTTGGCGCGGTGACCGCGGCGACCGTGGCGGAAGAAATTAGCAAAACCACCGGCCTGAAACTGGATAAACGCTGGTTCAAACTGGACAAACCGATTAAAGAACTGGGCGAATATAGCCTGGAAGTGAGCCTGCCGGGTGGCGTGAAAGATACCATTAAAATTCGCGTGGAACGCGAAGAAAGCTCGAGCGGCGGCAGCGGTAGCGAAGTGCTGTTTCAGGGTCCGCGTACCGATCCGATTTTTAAAGATGAATATGATGAAAAAGCCAAAAGCAGCCGTTATACCAGCAGCTGGGTTTGGCCTGAAAAAGATAGCGTTAGCCATCGTGGTGGTGAAGGTAGCGGTGTTAGCACCAGCCCGAGCGGTTATGTTTATTATCTGCATCGTGGTGATGGTAGCTATGCAAATGAAGAACTGATTACCACCCCGACCATTACCGTTTTTGATCCGAATACCAATGAAATTGTGGATGAATTTGGCGATAACCTGTTTCAGTCTCCGCATGGTATTGAAGTTGATAGCCAGAATAATATTTGGGTGACCGATATTATGCTGAATAAAGTGTTTAAACTGGATGAACGTGGTAATGTTCTGGCCACCTTTGGTGATGATTATCGTCTGGGCACCGAAACCAGCCTGCGTATTCGTAATGAACTGCCGAATTTTCCGGTTCCGATGAATGAATACACCTTTGCACGTCCGACCGATGTTACCGTTATGGAAGATGGCAGCTTTATTGTTGCAGATGGCTATCGCAATCATCGTATTGTGAAATTTAATCGTGATGGCAATATTCAGTGGGAAGTTGATGCATATGGTAGCTCTGATGGCGAATTTAATCTGCCGCATGGCATTACCCATGATCAGAGCGGCAATATTTATGTTGCCGATCGCAATAATGCACGTATTCAGGTGTTTGATCAGGATGGTCAGCATCTGAGCACCTGGGATGATACCGAAATTGGCCGTCCTTATGGAATCGATGCAGGCAATGATGGTAATATTTATCTGGTGGATGGTGGCGATTATCTGAATGGTGAACGTGAAACCCCGAAAAGCCAGATTGTTGTTCTGAGCCCGAAAGGTGAAGTTATTGAACGTTTTGGTAGCTGGGGTAACAAAATGGGTCAGCTGCGTATTCCGCATGATCTGACCGTGCTGGAAGATGGTACAATTTTTGTTGCCGAACTGCTGAATGAACGTCTGCAGAAATTTACCATTACCGAA
精製タグとしてのリボソームタンパク質L9およびクトニオバクター・フラバス(Chthoniobacter flavus) Ellin428由来のPAL様ドメインを有する融合タンパク質のクローニング、発現および精製
タンパク質9は、N末端精製タグ(配列番号7)およびHRV14 3Cプロテアーゼ部位含有リンカー(配列番号8)と連結したクトニオバクター・フラバスEllin428(配列番号3)である。この融合タンパク質の計算分子量は51650.4Daであり、N末端がGly-Proである成熟PAL様ドメインの計算分子量は33383.3Daである。
ATGAAAGTGATTCTGCTGCGTGATGTGCCGAAAATTGGCAAAAAAGGCGAAATCAAAGAAGTGAGCGACGGCTACGCGCGTAACTATCTGATTCCGCGTGGCTTTGCGAAAGAATATACCGAAGGCCTGGAACGTGCGATTAAACACGAAAAAGAAATCGAAAAACGCAAAAAAGAACGCGAACGTGAAGAAAGCGAAAAAATCCTGAAAGAACTGAAAAAACGTACCCATGTGGTGAAAGTGAAAGCGGGCGAAGGCGGCAAAATTTTTGGCGCGGTGACCGCGGCGACCGTGGCGGAAGAAATTAGCAAAACCACCGGCCTGAAACTGGATAAACGCTGGTTCAAACTGGACAAACCGATTAAAGAACTGGGCGAATATAGCCTGGAAGTGAGCCTGCCGGGTGGCGTGAAAGATACCATTAAAATTCGCGTGGAACGCGAAGAAAGCTCGAGCGGCGGCAGCGGTAGCGAAGTGCTGTTTCAGGGTCCGGAAAGCCGTTATGAAGTTGTTCCGCATTGGCCTGTTCTGCCGGAAGGTCGTAGCCTGGGTGTTTGTGCAGGTGTTGGTGTTGATAGCCATGGTAATGTGTTTGTGTTTCATCGTAATGAACGTAATTGGACCGCAGCATTTCCGGAAGAACCGATTGCAGAACCGACCATTTCTGTTTTTGATGGTCAGAGCGGCAAACTGCTGACCGAATGGGGTGCAGGTGAATTTATTATGCCGCATGGTCTGACCCTGGATCGTGAAGATAATGTTTGGCTGACCGATGTTGGTCGTCAGCAGGTTTTTAAATATGCCCATGATGGTCATCTGCTGCTGACCCTGGGTGAACGTGGTGTTGCAGGTAGCGATCAGACCCATTTTAATCTGCCGACCGATGTTGCAGTGCTGCCTGATGGAAGCTTTTATGTGTCTGATGGCTATCGTAATACCCGTGTGGTTAAATTTGATGCCGCAGGCCATTATCAGTTTGAATGGGGTGGTAAAGGCACCGAACCGGGTAAATTTCGTCTGCCTCATGGAGTTGCAGTTGATTCTCATGGTCGTGTTTTTGTTTGCGATCGTACCAATAGCCGTCTGCAGGTTTTTGATCCGAAAGGTAAATTTCTGGCCGAATGGAAAGGTCCGCAGGTTGGTCGTCCGTATGGTGTTAGCGTTGCAGCAAATGATCATGTGTTTGTGATTGATGGTGGTGATCAGCTGCCGAATCAGCCGGAACATGCAAAAGCAGTTGAACTGGACCCTGAAGGTAATGTTGTTCCGCGTTTTGGTAGCTATGGTCGTGATCCGGGTCAGTTTCAGCTGGGTCATGATATTGCAGTTGCACCGGATGGTTCTGTTTATGTTGGTGATGCCAAAGGTAAACGCGTTCAGAAATTTGTTCCGGTGCATCCG
精製タグとしてのリボソームタンパク質L9およびプランクトマイセス・マレス(Planctomyces mares) DSM 8797由来のPAL様ドメインを有する融合タンパク質のクローニング、発現および精製
タンパク質10は、N末端精製タグ(配列番号7)およびHRV14 3Cプロテアーゼ部位含有リンカー(配列番号8)と連結したプランクトマイセスDSM8797由来のPAL様ドメイン(配列番号4)である。プランクトマイセスPAL様ドメインについては、野生型配列に存在する2つのCys残基はアラニンおよびバリン残基に置換した。
ATGAAAGTGATTCTGCTGCGTGATGTGCCGAAAATTGGCAAAAAAGGCGAAATCAAAGAAGTGAGCGACGGCTACGCGCGTAACTATCTGATTCCGCGTGGCTTTGCGAAAGAATATACCGAAGGCCTGGAACGTGCGATTAAACACGAAAAAGAAATCGAAAAACGCAAAAAAGAACGCGAACGTGAAGAAAGCGAAAAAATCCTGAAAGAACTGAAAAAACGTACCCATGTGGTGAAAGTGAAAGCGGGCGAAGGCGGCAAAATTTTTGGCGCGGTGACCGCGGCGACCGTGGCGGAAGAAATTAGCAAAACCACCGGCCTGAAACTGGATAAACGCTGGTTCAAACTGGACAAACCGATTAAAGAACTGGGCGAATATAGCCTGGAAGTGAGCCTGCCGGGTGGCGTGAAAGATACCATTAAAATTCGCGTGGAACGCGAAGAAAGCTCGAGCGGTGGTAGCGGTAGCGAAGTTCTGTTTCAGGGTCCGGCAGATAAAATTGATTTTGAACCGGCAGCCATTAATATTGAACTGCCGGAAGGTCTGGCACTGGGTCCTGCAAGCGCAGTTGATTTTGATAGCAAAGGTCGCATGTACCTGTTTCATCGTGGTCCGCAGCCGATTCTGGTTTTTGATCAGAGCGGTAAATTTGTTCGTAGCTGGGGTGATAAACTGATTAGCCAGGCACATGGCTTAAGAGTTGCACCGGATGAAACCATTTGGGTTACCGATATTGGCAACCACATGGTGTTTCAGTTTAACCCGGAAGGTAAACTGCTGCTGGCCCTGGGTCAGGCAGGTAAACCGGGTGATAGCCAGGATCAGTTTAATAAACCGACCGATATTGCATTTGGTCCGCAGGGCGAATTCTATATTTCTGACGGCTATGGTAATAGCCGTGTGATGAAATTTGCAGCCAATGGTAAAAATCTGGGTCAGTGGGGTACACCGGGTAAAGGTCCGGGTGAATTTAATCTGCCGCATAGCATTCTGGTTGATGCAAAAGGTCGTGTTCTGGTTGGTGATCGTGAAAATGATCGCGTGCAGATCTTTGATCTGGAAGGCAATCTGCTGGAAATTTGGACCGGTTTTGCACCGTATGGTATGGAATTTGATAGCCGTGGTAACCTGTTTGTTGCAGATGGTCGTGCAAATAAAGTTCTGCAGCTGAATGCAAGCGGTAAAGTTGAAAATAGCTGGGGTAAAACCGGCAAAGAACCGGGTGAGTATAACCTGCCTCACATGCTGGCAGTCGACGCAGCAGGCAACCTGTTTGTGACCGAAATTGGTGGTAAACGTCTGCAGAAACTGCAGCGCAAA
α-ヒドロキシ馬尿酸およびベンズアミドの変換を評価するための酵素活性アッセイ
酵素反応
PAL活性を測定するための酵素アッセイは、以前に記載されており(Katopodis AGら: Biochemistry. (1990) 29(26):6115〜20頁)、α-ヒドロキシ馬尿酸のベンズアミドへの変換を測定する。α-ヒドロキシ馬尿酸をベンズアミドに変換するPALドメインの能力を試験するために、酵素反応を以下のようにセットアップした。
酵素(上記実施例に記載のもの): 約0.2mg/ml
α-ヒドロキシ馬尿酸(Sigma): 1mg/ml
Zn2S04: 1mM
緩衝液: MES pH5.5またはTris pH7.5: 100mM
UPLC分離条件
Waters ACQ-TUV機器のセットアップ:
カラム: Waters社製のUPLC BEH300 C18、1.7mm、2.1×150mmカラム(部品番号186003687)
溶媒A: 0.1% TFA、
溶媒B: 90% MeCN、0.1% TFA(v/v)
ラットPHMで共同処理された、C末端にGlyが伸長したTAPタグ付きアミリン(Amylin)アナログ基質に対するPAL様ドメインの活性についての試験
細菌PAL様ドメインがC末端にGlyが伸長した組換えペプチドのα-アミド化に適しているかどうかを試験するために、細菌PAL様ドメインおよびラット(ラット)由来の周知のPHMドメインによる酵素反応をセットアップした。ラットPHMドメイン(完全長ラットPAM配列976アミノ酸のうちの36〜497のアミノ酸配列を含む)は、C末端α-ヒドロキシグリシンの形成を促進するために使用した。このドメインは、基本的に、Husten EJら (1993) J. Biol. Chem.; 268(13):9709〜17頁に記載のように、HEK293細胞における一時的な組換え発現の後に精製したものである。
5μL ラットPHM-His(0.15mg/ml)
5μL PAL様ドメイン(タンパク質3(0.4mg/ml)またはタンパク質10(0.6mg/ml))
10μL 100mM Tris pH7.5
10mM アスコルビン酸
10μM ZnS04
10μM CuS04
30μg/ml カタラーゼ
30μL TAPタグ付きアミリンアナログ(V17H)(0.3mg/ml)
前駆体形態(C末端にGly残基を含有する): 13934.66Da
中間体形態(C末端にα-ヒドロキシグリシンを含む): 13951Da
C-末端がアルファアミド化された形態: 13876.62Da
C末端にGlyが伸長したTAPタグ付きアミリンアナログ基質(プラムリンチド(Pramlintide))に対するPAL様ドメインの活性についての試験
プラムリンチドと呼ばれる、ヒトアミリンのC末端にGlyが伸長したペプチドアナログ(以下のアミノ酸置換を含有する: Ala25Pro、Ser28ProおよびSer29Pro)(配列番号25)について、細菌PAL様ドメインを試験した。プラムリンチドは、固相ペプチド合成により得て、精製の後に凍結乾燥した。プラムリンチドの3つの形態についての理論的な平均同位体質量は次のとおりである。
Glyが伸長したプラムリンチド: 4007.5Da
アルファヒドロキシグリシンが伸長したプラムリンチド: 4023.5Da
アルファアミド化プラムリンチド 3949.4Da
配列番号25: KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTYG
C末端にGlyが伸長した合成プラムリンチドを、最終濃度1mg/mlになるように100mM Tris pH7.5中に溶解した。この溶液を、下表に記載のように酵素対基質比1:20(w/w)を用いて、ラットPHMドメイン(実施例6で使用した)と共にインキュベートした。
緩衝液A: 95% H2O 5% ACN 0.1% TFA
緩衝液B: 70% ACN 20%イソプロパノール 0.1% TFA。
PAL様ドメイン(配列番号1、2、3および4)の活性を試験するために、調製したアルファ-ヒドロキシル化配列番号25をペプチド基質として用いる、100mM Tris pH7.5緩衝液中の下記の反応をセットアップした。
アッセイ(I)
活性の評価
PAL酵素の活性は、実施例5に記載のように測定することができる。PAL酵素の活性は、Katopodis AGら、Biochemistry 1990、29(26):6115〜6120頁に記載のように、α-ヒドロキシ馬尿酸のベンズアミドへの変換を測定することにより実証することができる。記載のHPLC法を用いる代わりに、適応UPLC法を用いる方が利点がある。UPLC法のための条件は、実施例5に記載している。
Claims (15)
- α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能である単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、モチーフ1、すなわち、
Xaa1 Val Xaa2 Asp Arg Xaa3 Xaa4 Xaa5 Arg Xaa6 Gln Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Gly Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Trp
を含むアミノ酸配列を含み、
Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8、Xaa9、Xaa10、Xaa11、Xaa12、Xaa13、Xaa14、Xaa15およびXaa16が、天然に存在するアミノ酸から独立に選択され、ただし、Xaa1およびXaa7は、Cysではないポリペプチド。 - α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能である単離ポリペプチドであって、
(a)配列番号1のアミノ酸2〜306に対して少なくとも80%の同一性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(b)配列番号2のアミノ酸3〜336に対して少なくとも80%の同一性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(c)配列番号3のアミノ酸3〜305に対して少なくとも80%の同一性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(d)配列番号4のアミノ酸3〜279に対して少なくとも80%の同一性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
(f)システイン残基を含まないか、または最大1つもしくは最大2つのシステイン残基を含むアミノ酸配列を有することを特徴とする、ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ活性を有するポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチド。 - ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ活性を有する単離ポリペプチドであって、大腸菌中で可溶性タンパク質として発現させることができることを特徴とするポリペプチド。
- 0、1または2つのシステイン残基を含む、請求項1から3のいずれかに記載のポリペプチド。
- 原核生物に由来する、請求項1から4のいずれかに記載のポリペプチド。
- α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒することが可能であり、前記α-ヒドロキシグリシンが、式R-Gly(OH)のC末端-α-ヒドロキシグリシンであり、式中、Rがペプチドであり、Gly(OH)が、前記ペプチドのC末端に連結されているα-ヒドロキシグリシン残基であり、
前記α-アミドが、式R-NH2を有する、
請求項1から5のいずれかに記載のポリペプチド。 - ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ(PAL)活性を有する酵素を生成するための方法であって、
(i)酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトを含む、非哺乳動物を起源とする、組換え発現の宿主細胞を、酵素の発現に適している条件下で培養する工程と、
(ii)(a)細胞の破壊および遠心分離の後の上清、ならびに/または
(b)増殖培地
から酵素を回収する工程と
を含み、宿主細胞が、非哺乳動物を起源とし、例えば、大腸菌株であり、前記酵素が、工程(ii)において回収する際に、可溶性である方法。 - 酵素が、工程(ii)において回収する際に、触媒活性を得るために酵素がリフォールディングのステップを必要としないという意味で、触媒として活性な形態をとっている、請求項7に記載の方法。
- 請求項7または8に記載の方法により得ることができる、ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ活性を有する酵素である単離ポリペプチドであって、前記酵素が、
R-Gly(OH)→R-NH2
の反応を触媒することが可能であり、
式中、Rがペプチドであり、Gly(OH)が、前記ペプチドのC末端に連結されているα-ヒドロキシグリシン残基であるポリペプチド。 - 請求項1から6のいずれかの記載をさらなる特徴とする、請求項9に記載のポリペプチド。
- ペプチジル-α-ヒドロキシグリシンアルファ-アミド化リアーゼ活性を有する酵素を生成するための方法であって、請求項1から6のいずれかまたは請求項8もしくは9いずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸を含む組換え発現の宿主細胞を、前記酵素の生成に適している条件下で維持する工程を含む方法。
- ペプチド中のC末端α-ヒドロキシグリシンからα-アミドへの変換を触媒するための、請求項1から6のいずれかまたは請求項8もしくは9いずれかに記載のポリペプチドの使用。
- α-アミド化ペプチドを生成するための方法であって、
(i)C末端グリシン残基を有する標的ペプチドを、ペプチジルグリシンアルファ-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ(PHM)および請求項1から6のいずれかまたは請求項8もしくは9に記載のポリペプチドの両方と、酵素活性に適している条件下で反応させる工程であって、前記標的ペプチドにおける、前記PHMおよび前記ポリペプチドを用いる反応を、2つの別個のステップにおいてかまたは同時に実施する工程と、
(ii)C末端α-アミド化ペプチドを回収する工程と
を含む方法。 - 回収されるα-アミド化ペプチドが、医薬として使用するためのものである、請求項12に記載の使用または請求項13に記載の方法。
- 前記ペプチドが、アミリン、神経ペプチドY(NPY)、ペプチドYY(PYY)、PYY-3-36、膵臓ポリペプチド(PP)、グルカゴン様ペプチド(GLP-1)、ガストリン、カルシトニン、カルシトニン関連ペプチド(CGRP)、ガストリン放出ペプチド、バソプレシン、オキシトシン、ニューロキニンA、セクレチン、パンクレアスタチン、プロ-オピオメラノコルチン(POMC)、アルファ-メラノサイト刺激ホルモン(アルファMSH)、ガンマ-メラノサイト刺激ホルモン(ガンマ1MSH)およびアミド化ヒンジペプチド(HP-N)、またはそれらの機能性の類似体からなる群から選択される、請求項11から14のいずれかに記載の方法または使用。
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