JP2013116106A - 微粒子とユニークプローブとの組み合わせを用いて結合相互作用をスクリーニングする方法 - Google Patents

微粒子とユニークプローブとの組み合わせを用いて結合相互作用をスクリーニングする方法 Download PDF

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Abstract

【課題】微粒子の複数の組み合わせを用いて結合相互作用をスクリーニングする方法の開発。
【解決手段】限られた微粒子の組み合わせからデータを取得するための方法であり、当該組み合わせは、同定可能な同じ特性を有しており、また、一つまたはそれ以上の組み合わせが、微粒子の一部を含み、そして、当該微粒子の一部が、生体試料に含まれる標的分子に対する結合パートナーとして機能する少なくとも一つのユニークプローブ。特に、これら微粒子の複数の組み合わせを用いて、提供者の組織、または、移植者の組織において組織適合検査用抗原を検出する方法。
【選択図】なし

Description

本願は、本願明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する、2007年５月３日に出願された、米国仮特許出願第60/915,920号の優先権を主張する。
本願発明は、微粒子の複数の組み合わせを用いて結合相互作用をスクリーニングする方法に関し、当該組み合わせは、同定可能な同じ特性を有しており、また、一つまたはそれ以上の組み合わせが、微粒子の一部を含み、そして、当該微粒子の一部が、生体試料に含まれる標的分子に対する結合パートナーとして機能する少なくとも一つのユニークプローブを提供する。 特に、本願発明は、これら微粒子の複数の組み合わせを用いて、提供者の組織、または、移植者の組織において組織適合検査用抗原を検出する方法を提供する。
組織適合検査用抗原の一つに、ヒト白血球抗原(ＨＬＡ)がある。 妊婦や、輸血または臓器移植を受けたことのある人々は、ＨＬＡ抗原に対して感作されやすくなる。 ＨＬＡ対立遺伝子に対する感受性を決定するための試験(提供者特異的適合性確認)は、組織移植および臓器移植に関係するものであり、すなわち、移植者が、提供者のＨＬＡ抗原に対する抗体を有しておれば、移植片拒絶の危険性の高さは増すこととなる。 選択されたＨＬＡ抗原のパネルに対して、対象となる全移植者について、ヒト個体群と、血清に対して反応性を示すＨＬＡ対立遺伝子のパーセンテージとを決定する試験を行うことが、移植分野においては標準的な作業となっている。 この既存抗体(ＰＲＡ)検査反応は、通常のヒト個体群において高いパーセンテージで存在するＨＬＡ対立遺伝子に対する患者の血清について行われるものであり、また、移植片拒絶の危険性の高さを示すものでもある。
実際のところ、ＨＬＡ遺伝子座は、多型性に富んでいる。 Nomenclature for Factors of the HLA System 2000 (Hum. Immunol; 62(4):419-68), 2001)に開示されているように、これまでに、124個のＨＬＡ-Ａ対立遺伝子、258個のＨＬＡ-Ｂ対立遺伝子、74個のＨＬＡ-Ｃ対立遺伝子、221個のＨＬＡ-DRB１対立遺伝子、19個のDRB３対立遺伝子、89個のDRB４対立遺伝子、14個のDRB５対立遺伝子、19個のDQA１対立遺伝子、および、39個のDQB１対立遺伝子が明らかにされており、また、新種の対立遺伝子も、引き続いて発見されている。 この急速な進展を裏付けるように、ＷＨＯに属するＨＬＡ系因子の命名委員会によって、2007年４月の時点で更新されたデータ(www.anthonynolan.com/HIG/)によれば、これまでに、545個のＨＬＡ-Ａ対立遺伝子、895個のＨＬＡ-Ｂ対立遺伝子、307個のＨＬＡ-Ｃ対立遺伝子、８個のＨＬＡ-Ｅ対立遺伝子、12個のＨＬＡ-Ｈ対立遺伝子、９個のＨＬＡ-Ｊ対立遺伝子、６個のＨＬＡ-Ｋ対立遺伝子、４個のＨＬＡ-Ｌ対立遺伝子、４個のＨＬＡ-Ｐ対立遺伝子、３個のＨＬＡ-Ｖ対立遺伝子、３個のDRA対立遺伝子、494個のDRB１対立遺伝子、１個のDRB２対立遺伝子、44個のDRB３対立遺伝子、13個のDRB４対立遺伝子、18個のDRB５対立遺伝子、３個のDRB６対立遺伝子、２個のDRB７対立遺伝子、10個のDRB８対立遺伝子、１個のDRB９対立遺伝子、34個のDQA１対立遺伝子、83個のDQB１対立遺伝子、23個のDPA１、126個のDPB１対立遺伝子、４個のDMA対立遺伝子、７個のDMB対立遺伝子、12個のDOA対立遺伝子、および、９個のDOB対立遺伝子が明らかにされている。
ＨＬＡ-Ａ、-Ｂ、および、-Ｃのすべての対立遺伝子が、同様の配列を有している。 また、DRB１、DRB３、DRB４、および、DRB５の配列についても、同様のことが言える。 このような類似性が故に、ポリメラーゼ連鎖反応配列特異的プライミング(ＰＣＲ-ＳＳＰ)において一対のプライマーを用いた場合に、頻繁に、二つまたはそれ以上の対立遺伝子が増幅されたり、あるいは、診断用配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ検出(ＳＳＯ)システムにおいては、二つまたはそれ以上の対立遺伝子がハイブリダイズしたりする。 したがって、ユニークＰＣＲ-ＳＳＰまたは検出用-ＳＳＯパターンを各対立遺伝子に付与するために、多くのプライマー対やプローブを使用しなくてはならない。 さらに、ＨＬＡ適合検査での診断用ハイブリダイゼーションＳＳＯプローブの使用は、ＨＬＡ対立遺伝子が共有している高レベルの相同性が理由で、その信頼性は低い。 Bugawan et al., Tissue Antigens 44:137-147 (1994)を含む多くの従来の組織適合検査法は、ＨＬＡ適合検査やその他の用途で必要とされている精度を欠いている。
ＰＣＲは、標的ＤＮＡテンプレートに関する配列の特徴を明らかにするために用いることができる。 増幅が認められれば、テンプレートＤＮＡが、そこで用いたプライマーと同じ配列を有していることとなる。 増幅が認められなければ、テンプレートＤＮＡが、プライマー配列と異なることとなる。 Newton et al.,の米国特許第5,595,890号は、ＰＣＲ-ＳＳＰを用いたＨＬＡの分子適合検査を含んだ、適合検査のためのＰＣＲ診断法を開示している。 この方法によれば、複数回のＰＣＲを実施することで、陽性反応または陰性反応のパターンに基づいて、未知の対立遺伝子が割り振られる。 しかしながら、前述したＨＬＡの多様な多型性が故に、Newtonが開示した方法は、ＨＬＡ適合検査での効率面の改善において限界がある。 二つのプライマーが故に、未知の対立遺伝子を割り振るために、特異的な配列を有する各プライマーは、多くのＨＬＡ対立遺伝子を頻繁に増幅してしまい、それによって、ＰＣＲ増幅の数を増大させてしまう。 同様の理由で、ＨＬＡの適正な適合検査を行うために、非ＰＣＲ状況下では、複数の診断用プローブが必要とされる。 ＰＣＲは、増幅する領域に応じて、ＤＮＡテンプレートでの当該領域のサイドを形成している一対のプライマーを必要とする。 所望の配列にアニーリングするプライマーの性能は、プライマーの長さ、それに、ＰＣＲ熱サイクルプログラムに入力されたアニーリング温度によって変化する。 プライマーが長くなると、ＤＮＡ配列の特異的増幅を達成するためには、アニーリング温度も高めなくてはならない。 ＰＣＲ-ＳＳＰは、プライマー指令配列増幅の特異性を実現するために、プライマーの長さとアニーリング温度との間のバランスを図っている。
ＨＬＡ適合検査のためにＰＣＲ-ＳＳＰシステムを臨床的に使用する場合には、限られた数のＰＣＲ反応を用いて、できる限り多くの解析を行うことで、一対のプライマーによって増幅される対立遺伝子の数を抑える(すなわち、プライマーまたはプローブの特異性を高める)必要があった。 本明細書の一部を構成するものとしてその内容を援用する、共同所有に係る米国特許第6,207,379号の開示は、本願発明において関心のある事項であり、そこでは、ＨＬＡ適合検査において関連する対立遺伝子との間に大きな差異をもたらすために、非近接(gap)配列によって特徴付けられた診断用ＰＣＲプライマーの使用を教示している。 その他の態様として、米国特許第6,207,379号は、標的核酸内の非近接配列にハイブリダイズし、そして、ポリメラーゼが媒介するプライマー伸長によって当該標的を増幅する診断用プライマーの使用を教示している。 米国特許第6,207,379号の方法が、標的ＨＬＡ配列の特異的増幅において、ある程度の成功を収めているにもかかわらず、ＰＣＲおよび非ＰＣＲ状況下でのＨＬＡ配列を検出する方法の改善が、依然として待望されているのである。
米国特許第6,207,379号に記載のＰＣＲ発明は、当該技術分野において、ＰＣＲ-ＳＳＰを利用した分子適合検査法の改善、すなわち、適合検査の特異性を高めることで、各適合検査で必要とされるＰＣＲ反応の数を減らすことの必要性を示すものである。 しかしながら、当該技術分野では、非ＰＣＲ状況下で特異的配列を取得する方法が、依然として待望されている。 基礎熱力学の観点から、プローブとテンプレートは、完全一致するものを含めて、ハイブリダイズ状況下と非ハイブリダイズ状況下との間で平衡状態にある。 あるプローブが、その標的テンプレートに結合していても、ある別の時点には、テンプレートに結合をしていないこともある。 ＰＣＲにおけるポリメラーゼは、伸長工程(プライマーの伸長)において、ある箇所にプライマーを留め置く、という重要な役割を果たすものである。 非ＰＣＲ状況下では、重要な因子、すなわち、ポリメラーゼ(および、その後の伸長工程)は利用されておらず、そして、標的に対してハイブリダイズした短鎖プローブから形成された二本鎖の長期安定性は、必ずしも期待できない。 このような理由から、一般に、安定な二本鎖を形成するためには、ハイブリダイゼーションプローブを、対応する伸長プライマーよりも長くする必要がある、と考えられていた。
本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する米国公開特許公報第2003-0165925号は、診断用プローブの特異性を高めることで、ＨＬＡ核酸、および、Ｔ細胞受容体核酸配列の検出方法を改善している。 少なくとも一つのプローブが、標的内の二つまたはそれ以上の領域を認識することができ、また、標的核酸配列に対するプローブのアニール温度を上げずにそうすることができるので、これら方法にあっては、特異性は高められている。 プローブセットの特異性が高まると、検出される対立遺伝子の数は減り、それにより、この方法の精度は高まり、そして、それら方法は、低コストで行えることとなる。
ＤＮＡを利用した組織適合検査方法は、フローサイトメトリーなどによって異なるＳＳＯプローブを識別したり、あるいは、バイオアレイズのように、カメラまたは顕微鏡から得た視覚映像を識別するために、多くの異なる標識を検出する必要があるため、目下のところ、これら方法は、費用がかかる上に、時間を要する技術でしかない。 異なるオリゴヌクレオチドプローブを提供する標識付けされた無数のユニーク微粒子は、理論的には調製可能ではあるが、蛍光標識を利用したフローサイトメトリーのような方法を用いて、１回の分析を行う間に識別および評価することが可能な標識の数には、実際的には限界がある。 したがって、標識付けされた特定の数のユニーク微粒子を用いて、１回の分析で試験できるオリゴヌクレオチドプローブの数を最大化することが、当該技術分野で待望されているのである。
本願発明は、限られた微粒子の組み合わせからデータをさらに取得するための方法を提供する。 現在入手可能な微粒子の組み合わせにあっては、同定可能な特性は、(蛍光標識など)限られた数のものしかない。 従来の方法を用いて一度に評価することができる特性は、わずかの数しかない。 しかしながら、スクリーニングする必要のある試験分子の数は、増大し続けている。 例えば、ＤＮＡを利用した組織適合検査にあっては、ＨＬＡ抗原や多型の数は、毎日、増え続けており、提供試料の完全なＨＬＡスクリーニングを行うにあたっては、何百ものプローブが必要とされている。 従来の方法を用いると、最初のＨＬＡスクリーニングを完璧に行うためには、多角的な分析が必要となる。 本願発明の改善された方法は、明確に標識付けされたわずかな微粒子を用いて、ごく限られた特性を評価し、そして、結局のところ、最小限の分析回数でもってして、より多くの標的分子をスクリーニングすることを可能にする。
本願発明の改善された方法は、その各々が互いに異なる同定可能な特性を有する微粒子の所定の数の組み合わせを利用する。 本願発明は、その各々が同じ蛍光標識に埋め込まれている微粒子の組み合わせなど、同定可能な同じ特性を有する微粒子の組み合わせに対する一つまたはそれ以上の異なるプローブの提供に関する。 したがって、この分析は、より多くの標的分子をスクリーニングする一方で、同定可能なほぼ同数の特性を検出することができる。 例えば、100通りの標識付けがされた微粒子は、100個以上の標的分子をスクリーニングするために用いることができる。 あるいは、100個の標的分子は、100通り以下の標識を用いてスクリーニングすることができる。
本願発明の方法のプローブは、生体試料に含まれる標的分子に関する結合パートナーとして機能する。 これらプローブとして、オリゴヌクレオチドやプライマーのような核酸を含む結合パートナー、あるいは、標的分子核酸に対して相補的な核酸がある。 この結合パートナーとして、標的分子抗体に結合するペプチド抗原やタンパク質のような抗原、あるいは、ペプチド抗原やタンパク質標的分子に結合する抗体がある。 加えて、この結合パートナーとして、受容体や、リガンドまたは複合体のタンパク質などの標的分子タンパク質に結合するタンパク質がある。 結合相互作用とは、タンパク質結合パートナー間の結合、または、ある核酸と、ＳＳＯプローブ、または、プライマー、または、その他の相補的核酸との間のハイブリダイゼーションとして現れる現象である。
これら方法は、生体試料に含まれる標的分子に結合するプローブを提供する微粒子を用いて好適に実施され、そして、この結合相互作用は、評価可能なシグナルとして出現する。 本願発明の好適な実施態様によれば、これらプローブとして、ＤＮＡ試料にハイブリダイズ(結合)する配列特異的オリゴヌクレオチド(ＳＳＯ)プローブがある。 あるいは、これらプローブとして、生体試料に含まれる抗体やその他のタンパク質に結合するペプチド、抗体、あるいは、タンパク質抗原などがある。
本願発明の標的分子として、生体試料に含まれている関心を寄せた分子がある。 本願発明の方法は、標的分子をスクリーニングするためのものである。 ある実施態様によれば、本願発明の方法は、組織適合検査用対立遺伝子をスクリーニングするために利用される。 この方法は、どのような組織適合検査用対立遺伝子を利用しても、実施することができる。 ＨＬＡ組織適合検査用対立遺伝子についての記載が本明細書でされているが、これら方法は、どのような組織適合検査用抗原を用いても実施することができる。
本願発明は、一意的に同定可能な特性を有するマイクロスフェアやビーズなどの微粒子に結合したプローブを用いた改善された組織適合検査方法を提供する。 本願発明の方法は、検出可能な同じ標識を有する微粒子の一つまたはそれ以上の組み合わせ、すなわち、検出可能に標識付けされ、かつ明確に同定可能な微粒子の限られた数の組み合わせであって、同定可能に標識付けされたそれら微粒子が、異なるプローブで標識付けされた複数の微粒子の一部を含む組み合わせによって、より多くの組織適合検査情報をもたらす。
例えば、その組み合わせは、同じ蛍光染料で標識付けされた10個の微粒子すべての一部を含むことができ、また、当該微粒子の一部は、その表面に固定された異なるプローブを有している。 この方法を用いることで、限られた数の多様に標識付けされた微粒子を利用して、多数の異なる組織適合検査用抗原をスクリーニングすることができる。
ある実施態様によれば、本願発明の改善された方法は、多数のビーズ(微粒子)に1,000個の異なるプローブを固定して、1,000個の異なる組織適合検査用抗原をスクリーニングすることができる。 標識付けされたビーズは、100の組み合わせに分類され、つまり、各組み合わせが、10個のユニークプローブを有する10個のビーズのグループから形成されており、また、当該ビーズは、同じ蛍光染料で標識付けされていてもよく、または、ある特定の組み合わせの蛍光染料で標識付けされていてもよい。 したがって、同定可能に標識付けされた(同じシグナルを発現する)多数のビーズが、異なるプローブを提供することとなる。 よって、このスクリーニングによれば、100通りの異なる蛍光シグナルまたはそれらの組み合わせが検出されるが、1,000個もの異なるプローブが試験できることとなる。
逆に言えば、同じ数の標的分子のスクリーニングについては、数の少ないユニーク標識の大半でもってして、スクリーニングすることができる。 したがって、この方法は、非常に限られた数の標識付けしたビーズしか使用しないにもかかわらず、多くの組織適合検査用抗原対立遺伝子のスクリーニングに利用することができる。 加えて、本願発明の改善された方法は、非常に効率的で、しかも、労力の軽減も図れる。 高精度分解能テストの後に低精度分解能テストを行う必要が無い場合が多いので、この改善された方法にあっては、労力の軽減が自ずと図れる。
次いで、抗体／抗原結合を促す条件、または、核酸ハイブリダイゼーションを促す条件などの結合相互作用を促す条件下で、生体試料と微粒子の複数の組み合わせとを接触せしめる。 生体試料に含まれる標的分子間の結合相互作用を検出することができ、最も好ましくは、結合の存在を示すシグナルを生成するシグナル系、または、標的分子に対して生体試料が陽性であることを示すシグナルの検出を介して当該結合相互作用を検出することができる。
本願発明の方法を実施することで、特定の数の標識付けした所定のビーズを用いて分析されるユニーク標的分子の数は増大するが、所定のビーズのすべての組み合わせを特定の標的分子に対して特異的にしている従来の方法と比較して、この方法は、疑似陰性に対する感受性も増大している。 例えば、ＤＮＡを利用したＨＬＡ適合検査において、僅かなＳＳＯがＤＮＡ試料においてハイブリダイゼーションパートナーを見つけ出すことはよくあることである。 よって、オリゴヌクレオチドプローブの所定の組み合わせに関して、プローブのわずか一部分でも、試料に対して陽性反応を示したとの報告がされるであろう。 そのような場合、所定の組み合わせのプローブに含まれるその余の部分に関する陽性反応についての報告はされず、そして、所定の組み合わせのすべての微粒子によって示されるシグナル、それに、シグナルの平均値および中央値は小さくなるであろう。 このように、疑似陰性が報告されてしまう可能性(すなわち、真正な陽性反応が報告されない可能性)は、依然として残っているのである。 本願発明は、莫大な数の標的分子をスクリーニングする技術を提供するものであるが、かような疑似陰性の可能性は、組織移植技術のような技術分野では、取り返しのつかない結果を招くことがある。
本願発明のさらに他の実施態様によれば、さらなる評価を行うために、陽性シグナルを生成する組み合わせの選択した部分を選び出すことによって、疑似陰性のリスクを抑えられている。 この工程を、「選別工程」と称する。 この選択した部分は、標的分子との結合を示す最大のシグナルを生成するいくつかの微粒子の部分である。 この方法によって、真性陰性の部分は排除されるので、真性陽性の存在を高精度で決定することができる。
ある実施態様によれば、本願発明は、結合相互作用をスクリーニングする方法、すなわち、(ａ) 一意的に同定可能な微粒子の複数の組み合わせを調製し、すなわち、ある組み合わせに含まれる当該微粒子が、一意的に同定可能な同じ特性を有しており、また、一つまたはそれ以上の組み合わせが、微粒子の一部を含み、そして、当該微粒子の一部が、生体試料に含まれる標的分子に対する結合パートナーとして機能する少なくとも一つのユニークプローブを提供する、一意的に同定可能な微粒子の複数の組み合わせを調製し、 (ｂ) 当該微粒子の複数の組み合わせを、生体試料に含まれる標的分子がプローブに結合できる条件下で、生体試料と接触せしめ、(ｃ) 当該標的分子と当該プローブとの間の結合相互作用を示すシグナルの出現によって、生体試料に含まれる標的分子と当該微粒子上のプローブとの間の結合を検出し、(ｄ) 当該微粒子に関する結合相互作用を示すシグナルを評価し、(ｃ) 当該結合相互作用を示すシグナルが、当該生体試料に含まれる一つまたはそれ以上の標的分子の存在を示す選択した閾値よりも大きい一意的に同定可能な微粒子の組み合わせを決定し、および、(ｅ) 当該結合相互作用を示す一意的に同定可能な微粒子の組み合わせの数を決定する、工程を含む方法を提供する。
ある実施態様によれば、本願発明は、一意的に同定可能な微粒子の少なくとも一つの組み合わせに含まれる少なくとも一つの微粒子の一部が、約１：１以外の一定の数値的比率で存在する方法を提供する。 この比率には、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約２：３、約３：４、約４：５、約７：８、約８：９、約１：10、約１：25、約１：50、約１：100などがある。 これら比率は、整数比、または、非整数比のいずれでもよい。
本願発明のある実施態様によれば、当該プローブは、ＳＳＯプローブであり、当該標的分子は、核酸であり、当該生体試料は、試料ＤＮＡであり、そして、当該結合相互作用は、試料ＤＮＡに含まれる核酸と当該ＳＳＯプローブとの間のハイブリダイゼーションである。 本願発明のある実施態様によれば、当該ＳＳＯプローブは、ＨＬＡ、ＨＮＡ、血液型判定用抗原、ＴＣＲ、または、ＫＩＬなどの組織適合検査用抗原対立遺伝子に特異的である。 この試料ＤＮＡは、頬粘膜拭い液、または、血液などを含むいかなる供給源からも取得できる。
本願発明のある実施態様によれば、当該プローブは、ペプチド、または、タンパク質抗原であり、当該標的分子は、抗体であり、そして、当該結合相互作用は、当該抗体と、当該ペプチド、または、タンパク質抗原との間の結合である。 本願発明のある実施態様によれば、当該標的分子は、ＨＬＡ、ＨＮＡ、血液型判定用抗原、ＴＣＲ、または、ＫＩＬなどに特異的な抗体である。
本願発明の結合相互作用をスクリーニングする方法は、一意的に同定可能な微粒子の一つまたはそれ以上の組み合わせに関する結合相互作用において最大のシグナルを示す微粒子の100％未満の割合を選択し、および、選択した割合において当該結合相互作用を示すシグナルが、当該生体試料に含まれる一つまたはそれ以上の標的分子の存在を示す選択した閾値よりも大きい一意的に同定可能な微粒子の当該組み合わせを決定する、工程をさらに含む。
これら方法は、一意的に同定可能な微粒子の少なくとも一つの組み合わせに含まれる少なくとも二つの微粒子の一部が、約１：１以外の一定の数値的比率で存在し、かつ、当該比率が、微粒子の組み合わせにおいて選択した割合を決定する条件下で実施することができる。 この比率には、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約２：３、約３：４、約４：５、約７：８、約８：９、約１：10、約１：25、約１：50、約１：100などがある。 これら比率は、整数比、または、非整数比のいずれでもよい。
微粒子の組み合わせに関して選択した当該割合は、50％未満、30％未満、20％未満、または、10％未満である。 好適な実施態様にあっては、微粒子の組み合わせに関して選択した当該割合は、微粒子の組み合わせに対する、ビーズの組み合わせのために用いるユニークプローブを提供する微粒子の一部の数の逆数と同等またはそれ未満である。
本願発明のさらに別の実施態様によれば、本願発明は、ＤＮＡを利用した組織適合検査方法、すなわち、(ａ) 一意的に同定可能な微粒子の複数の組み合わせを調製し、すなわち、ある組み合わせに含まれる当該微粒子が、一意的に同定可能な同じ特性を有しており、また、一つまたはそれ以上の組み合わせが、微粒子の一部を含み、そして、当該微粒子の一部が、組織適合検査用抗原対立遺伝子とハイブリダイズするように選択された少なくとも一つのユニーク配列特異的オリゴヌクレオチド(ＳＳＯ)を提供する、一意的に同定可能な微粒子の複数の組み合わせを調製し、(ｂ) 当該微粒子の複数の組み合わせを、ハイブリダイゼーション条件下で、試料ＤＮＡと接触せしめ、(ｃ) 当該試料ＤＮＡとＳＳＯとの間のハイブリダイゼーションを示すシグナルの出現によって、当該微粒子での当該試料ＤＮＡとＳＳＯとの間のハイブリダイゼーションを検出し、(ｄ) 当該微粒子に関する当該試料ＤＮＡとＳＳＯとの間のハイブリダイゼーションを示すシグナルを評価し、(ｅ) 当該試料ＤＮＡ/ＳＳＯハイブリダイゼーションを示すシグナルであるかについて、一意的に同定可能な微粒子の組み合わせを決定する、工程を含む、ＤＮＡを利用した組織適合検査方法を提供する。
本願発明のさらに別の実施態様によれば、本願発明は、ＤＮＡを利用した組織適合検査方法、すなわち、(ａ) 一意的に同定可能な微粒子の複数の組み合わせを調製し、すなわち、ある組み合わせに含まれる当該微粒子が、一意的に同定可能な同じ特性を有しており、また、一つまたはそれ以上の組み合わせが、微粒子の一部を含み、そして、当該微粒子の一部が、組織適合検査用抗原対立遺伝子とハイブリダイズするように選択された少なくとも一つのユニーク配列特異的オリゴヌクレオチド(ＳＳＯ)を提供する、一意的に同定可能な微粒子の複数の組み合わせを調製し、(ｂ) 当該微粒子の複数の組み合わせを、ハイブリダイゼーション条件下で、試料ＤＮＡと接触せしめ、(ｃ) 当該試料ＤＮＡとＳＳＯとの間のハイブリダイゼーションを示すシグナルの出現によって、当該微粒子での当該試料ＤＮＡとＳＳＯとの間のハイブリダイゼーションを検出し、(ｄ) 当該微粒子に関する当該試料ＤＮＡとＳＳＯとの間のハイブリダイゼーションを示すシグナルを評価し、(ｅ) 一意的に同定可能な微粒子の少なくとも一つの組み合わせに関する試料ＤＮＡ/ＳＳＯハイブリダイゼーションにおいて最大のシグナルを示す微粒子の100％未満の割合を選択し、(ｆ) 選択した割合での試料ＤＮＡ/ＳＳＯハイブリダイゼーションを示すシグナルが、当該試料に含まれる一つまたはそれ以上の組織適合検査用抗原対立遺伝子の存在を示す選択した閾値よりも大きい一意的に同定可能なプローブの組み合わせを決定し、および、(ｇ) 当該ＤＮＡ/ＳＳＯハイブリダイゼーションを示す一意的に同定可能な微粒子の組み合わせの数を決定する、工程を含む、ＤＮＡを利用した組織適合検査方法を提供する。
本願発明のＤＮＡを利用した組織適合検査方法は、一意的に同定可能な微粒子の少なくとも一つの組み合わせに関するＤＮＡ/ＳＳＯハイブリダイゼーションにおいて最大のシグナルを示す微粒子の100％未満の割合を選択し、および、選択した割合において当該ＤＮＡ/ＳＳＯハイブリダイゼーションを示すシグナルが、当該生体試料に含まれる一つまたはそれ以上の組織適合検査用対立遺伝子の存在を示す選択した閾値よりも大きい一意的に同定可能な微粒子の当該組み合わせを決定する、工程をさらに含む。
ＤＮＡを利用したこれらの組織適合検査方法は、一意的に同定可能な微粒子の少なくとも一つの組み合わせに含まれる少なくとも二つの微粒子の一部が、約１：１以外の一定の数値的比率で存在する条件下で実施することができる。 この比率には、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約２：３、約３：４、約４：５、約７：８、約８：９、約１：10、約１：25、約１：50、約１：100などがある。 これら比率は、整数比、または、非整数比のいずれでもよい。
微粒子の組み合わせに関して選択した当該割合は、50％未満、30％未満、20％未満、または、10％未満である。 好適な実施態様にあっては、微粒子の組み合わせに関して選択した当該割合は、微粒子の組み合わせに対する、当該微粒子の組み合わせのために用いるユニークＳＳＯプローブを提供する微粒子の一部の数の逆数と同等またはそれ未満である。
本願発明のある実施態様によれば、当該ＳＳＯプローブは、ＨＬＡ、ＨＮＡ、血液型判定用抗原、ＴＣＲ、または、ＫＩＬなどの組織適合検査用対立遺伝子に特異的である。 この試料ＤＮＡは、頬粘膜拭い液、または、血液などを含むいかなる供給源からも取得できる。
本願発明のこれら方法は、ハイブリダイゼーションの陽性シグナルを伝達する工程をさらに含む。 これら方法は、同定可能なプローブの各組み合わせに対して最大のシグナルを示す微粒子の割合を選択する工程をさらに含む。
さらに別の実施態様によれば、本願発明は、ＤＮＡを利用した組織適合検査方法、すなわち、(ａ) 試料ＤＮＡがコードする組織適合検査用抗原対立遺伝子を同定するために、ユニーク配列特異的オリゴヌクレオチド(ＳＳＯ)を提供し、かつ一意的に同定可能な微粒子の多様な組み合わせと当該試料ＤＮＡとを接触せしめ、および、同定可能な微粒子の当該組み合わせに対して提供したＳＳＯと、当該試料ＤＮＡに含まれる対立遺伝子とのハイブリダイゼーションの有無を決定し、以下の工程、すなわち、(ｂ) 一意的に同定可能な同じ特性を有している一意的に同定可能な微粒子の複数の組み合わせを調製し、すなわち、当該組み合わせが、微粒子の一部を含み、そして、当該微粒子の一部が、ＨＬＡ対立遺伝子とハイブリダイズするように選択された少なくとも一つのユニーク配列特異的オリゴヌクレオチド(ＳＳＯ)を提供する、一意的に同定可能な微粒子の複数の組み合わせを調製し、(ｃ) 当該微粒子の複数の組み合わせを、ハイブリダイゼーション条件下で、試料ＤＮＡと接触せしめ、(ｄ) 当該試料ＤＮＡとＳＳＯとの間のハイブリダイゼーションを示すシグナルの出現によって、当該微粒子での当該試料ＤＮＡとＳＳＯとの間のハイブリダイゼーションを検出し、(ｅ) 当該微粒子に関する当該試料ＤＮＡとＳＳＯとの間のハイブリダイゼーションを示すシグナルを評価し、(ｆ) 当該試料ＤＮＡ/ＳＳＯハイブリダイゼーションを示すシグナルが、当該試料に含まれる一つまたはそれ以上のＨＬＡ対立遺伝子の存在を示す選択した閾値よりも大きい一意的に同定可能な微粒子の組み合わせを決定し、および、(ｇ) 当該ＤＮＡ/ＳＳＯハイブリダイゼーションを示す一意的に同定可能な微粒子の組み合わせの数を決定する、工程を含む、ＤＮＡを利用した組織適合検査方法を提供する。
さらに別の実施態様によれば、本願発明は、一意的に同定可能な同じ特性を有している一意的に同定可能な微粒子の複数の組み合わせ、すなわち、当該組み合わせが、微粒子の一部を含み、そして、当該微粒子の一部が、生体試料に含まれる標的分子に対して結合する少なくとも一つのユニークプローブを提供する一意的に同定可能な微粒子の複数の組み合わせを含む、結合相互作用を評価する方法を実施するためのキットを提供する。 このキットの標的分子として、ＨＬＡ抗原、ＨＬＡ対立遺伝子、ＨＮＡ抗原、ＨＮＡ対立遺伝子、血液型判定用抗原、ＴＣＲ、または、ＫＩＬなどがある。 ある実施態様によれば、このキットのプローブは、ＳＳＯ、または、プライマーである。 他の実施態様によれば、このキットのプローブは、ペプチド、または、タンパク質抗原である。
さらに別の実施態様によれば、本願発明は、一意的に同定可能な同じ特性を有している一意的に同定可能な微粒子の複数の組み合わせ、すなわち、当該組み合わせが、微粒子の一部を含み、そして、当該微粒子の一部が、組織適合検査用抗原対立遺伝子とハイブリダイズするように選択された少なくとも一つのユニーク配列特異的オリゴヌクレオチド(ＳＳＯ)を提供する一意的に同定可能な微粒子の複数の組み合わせを含む、ＤＮＡを利用した組織適合検査方法を実施するためのキットを提供する。 このキットの組織適合検査用抗原として、ＨＬＡ、ＨＮＡ、血液型判定用抗原、ＴＣＲ、または、ＫＩＬなどがある。
本願発明は、一意的に同定可能な特性を有する微粒子またはビーズに接合したプローブを利用して、移植での提供者と移植者との間の組織適合検査のための改善された方法に関する。 この方法は、一意的に同定可能な特性を有するビーズの組み合わせを用いたスクリーニングを含み、当該ビーズには、異なるプローブが固定されている。 これら方法は、ＤＮＡを利用した組織適合検査法、および、タンパク質を利用した組織適合検査法を含む。
この方法は、複数のビーズの組み合わせの調製を含み、そして、各組み合わせは、一意的に同定可能な特性を有している。 好適な実施態様によれば、一意的に同定可能な特性として、埋め込まれた複数の検出可能な標識、例えば、蛍光染料を組み合わせたものがある。 一つの組み合わせに含まれる各ビーズは、試料ＤＮＡに含まれるＨＬＡのような、組織適合検査用抗原に結合する少なくとも一つのプローブを提供する。 ＤＮＡを利用した組織適合検査では、試料ＤＮＡにハイブリダイズする配列特異的オリゴヌクレオチド(ＳＳＯ)をプローブとする。 タンパク質を利用した組織適合検査では、生体試料に含まれる抗体またはその他のタンパク質に結合するペプチドまたはタンパク質抗原をプローブとする。
ＤＮＡを利用した組織適合検査では、試料ＤＮＡは、移植での提供者または移植者の生体試料または組織から得ることができ、そして、関心のある組織適合検査用抗原、または、組織適合検査用抗原の対立遺伝子または多型を含む領域をコードする遺伝子は、ＰＣＲによって増幅される。 増幅した試料ＤＮＡ(または、ＰＣＲ産物)は、適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、または、非常にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のようなハイブリダイゼーション条件下で、ビーズの複数の組み合わせと接触させる。 ビーズでの試料ＤＮＡとＳＳＯプローブとのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションの存在を示すシグナルを出現させ、そして、このシグナルは、フローサイトメトリーや、顕微鏡および／またはカメラで捕らえた視覚映像のような、当該技術分野で標準的な方法で検出および評価される。 好適な実施態様によれば、フィコエリトリン(ＰＥ)またはフルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)のような蛍光染料、それに、蛍光染料に接合したストレプトアビジンに対応するビオチンのような標識で、それら試料ＤＮＡが標識付けされるので、これにより、シグナルが出現することとなる。 ヘキサヒスチジンに接合した蛍光染料も、ニッケルで標識付けした試料ＤＮＡと組み合わせて使用することができる。 ＳＳＯプローブが、試料ＤＮＡにハイブリダイズした場合に、陽性例となる。 標識したヌクレオチドで伸長反応を検出するための固定化したＳＳＰプライマーを用いて、シグナルを出現させることもできる。
ビーズの陽性部分の割合は選択される。 好ましくは、選択した割合は、一意的に同定可能なビーズの各組み合わせについて、試料ＤＮＡ／ＳＳＯハイブリダイゼーション、または、抗体／抗原結合のような、標的分子とプローブとの間の特異的な結合相互作用を示す最大の強度のシグナルを放つものとする。 選択した割合での陽性ビーズが放つシグナルについては、検出可能な標識によって出現したシグナルの平均強度または強度中央値(または、ピーク、トリム平均、トリムピークなどのその他の統計学的数値)を決定するために、実質的な解析が行われる。 陽性ビーズの部分の割合は、好ましくは、スクリーニング分析で用いた異なるプローブの数、および、標識付けした異なるビーズの数によって決定される。 陽性ビーズとは、選択した閾値を超えるシグナルを放つビーズのことであり、この閾値とは、試料ＤＮＡに含まれる一つまたはそれ以上の組織適合検査用抗原対立遺伝子の存在を示すものである。 フローサイトメーターを用いてシグナルを解析するソフトウェアが、Luminex社(オースチン、テキサス州)、および、BD Biosciences社(サンホセ、カリフォルニア州)から市販されている。 その他のソフトウェアとして、WinMDI(フローサイトメトリー用のウィンドゥズ マルチプル ドキュメント インターフェース)、FCS Express(デノボ ソフトウェア、ソーンヒル、オンタリオ州、カナダ)、FlowJO(Tree Star社)などがある。 一部の陽性ビーズは、試料ＤＮＡまたは生体試料に含まれている組織適合検査抗原の数を示すこととなる。 このデータは、検出可能な標識の強度を解析するソフトウェアを用いて分析することができ、この手法は、当該技術分野において標準的なものである。
陽性ビーズを(選別工程の後に)決定するために選択された閾値は、いずれの単一プローブについても同じとする。 この選択した閾値は、通常は、既知の陽性試料のパネルと既知の陰性試料のパネルとを分析し、そして、両者の間の差異を同定することによって決定される。 そして、その差異の範囲内で閾値を定める。
本願発明は、ＤＮＡを利用した組織適合検査、または、タンパク質を利用した組織適合検査のための改善された方法を提供するものであり、これら方法は、一意的に同定可能な特性を有するビーズに関与する複数のプローブを利用する。 一意的に同定可能な特性を有するビーズに固定された複数のプローブの一部を用いることで、唯一の特性またはシグナルが検出されるので、陽性ビーズから強力なシグナルを検出することが可能となる。 加えて、本願発明の改良された方法を用いて検出されたシグナルは、ＤＮＡ／ＳＳＯハイブリダイゼーション、または、抗体／抗原結合のような特異的結合相互作用によって生成された実際のシグナル強度の実測値とほぼ同様である。 シグナル強度の実測値とは、異なる蛍光標識、それに、ユニークＳＳＯプローブ、または、ペプチドプローブなどの異なる同定可能な特性を有している多様なビーズを利用する従来の方法を用いて評価して得た数値である。 よって、改善された方法を用いて検出されたシグナルは、従来の方法を用いて検出されたシグナルと同様である。
ＤＮＡを利用した組織適合検査、または、タンパク質を利用した組織適合検査のための改善された方法での利点の一つとして、最初の組織適合検査スクリーニングによって、試料ＤＮＡまたは生体試料に、組織適合検査用抗原が含まれているかどうかにかかわる数多くの情報がもたらされる点が挙げられる。 にもかかわらず、試料ＤＮＡまたは生体試料に、当該抗原が当然に含まれているかどうかにかかわる情報は、このシステム特有の曖昧さが故に、正確性に欠ける部分がある。 本願発明の方法は、後述するようにして、このシステムの曖昧さを改善する。 この手法は、ほんの少数の異なる同定可能なビーズを用い、また、試料ＤＮＡまたは生体試料に含まれる潜在的陽性抗原の範囲をかなり狭めるので、この手法に要する費用は、わずかである。 また、この手法では、試験に要する期間も短くなるので、人件費の圧縮を図ることもできる。 加えて、この手法によれば、多数のプローブを用いるにもかかわらず、使用するビーズの数は減少するので、試験に供する組織適合検査抗原遺伝子配列の数は増大することとなる。 さらに、本願発明の改良された方法は、短期間の内に、高精度の組織適合検査を終えるので、組織の移植に迅速さが求められることを鑑みれば、このことは、利点であると言える。
一意的に同定可能な特性を有する微粒子の組み合わせに含まれる微粒子の複数の部分を解析すると、疑似陰性の数が増えてしまうこととなる。 特に、ＤＮＡ試料が、ある組み合わせに含まれる少数の微粒子(微粒子のほんの一部)に対してのみハイブリダイズする場合には、ハイブリダイゼーションによって生成されるシグナルの強度は小さく、そして、陰性であると推定され、つまり、疑似陰性と判断されることとなる。 疑似陰性の問題を解決すべく、陽性シグナルを生成する組み合わせの選択した部分が、さらなる評価を行うために選抜される。 この選択した部分は、陽性の組み合わせの全部(100％)未満とする。 好ましくは、陽性の組み合わせにおいて選択した部分とは、陽性の微粒子の組み合わせの90％未満、80％未満、70％未満、60％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、または、10％未満である。 この選択した割合は、組織適合検査スクリーニングで用いたＳＳＯプローブの数と全微粒子の数に応じて変化させることができる。 加えて、この割合は、シグナルの減衰、すなわち、分析に供する曲線の勾配を検出することによって選択することができる。
このシステムに特有の曖昧さ、すなわち、等しく標識付けをしたタンパク質が、複数の異なる標的に結合することができるという現象は、異なる微粒子の組み合わせ、および、その一部を適切に調整することによって緩和することができる。 微粒子に対して使用するＳＳＯまたはタンパク質を利用したプローブを選択することで、特定の対立遺伝子、または、特定の抗原の検出が可能となる。 例えば、ある組み合わせに含まれるＳＳＯのパターン、または、異なる組み合わせの間で生じるパターンをデザインすることで、特定の対立遺伝子の選択的削除や、稀少な対立遺伝子の選択などが可能となる。 かようなプローブのパターンとして、一つの微粒子の組み合わせに含まれる同じプローブの複数のコピーや、異なる微粒子の組み合わせに含まれる同じプローブの複数のコピーなどがある。 同一のプローブの数と異なるプローブの比率とを変化させることで、ほんの僅かな分析を行うことで、さらなるデータを得ることが可能となる。
本願発明は、特に、一つの微粒子の組み合わせに含まれるプローブの一部、すなわち、一組の微粒子が、同定可能な同じ特性を有しており、また、プローブの一部同士の間でそれらのプローブの数が互いに相違してなるプローブの一部を提供する。 プローブの一部同士の間でのプローブの比率は、生体試料に含まれるＨＬＡ対立遺伝子のような標的分子の存在についての複素解析を可能にする。 微粒子についての単一の組み合わせに含まれるプローブの一部同士の間でのそれらのプローブの比率が変化することで、陽性事例の大部分を選択して、さらなる統計学的解析に供することが可能となり、換言すれば、陽性事例の大部分が、選別工程で選択され、その一方で、疑似陰性が発生する可能性が抑えられることとなる。
本願発明のさらに他の実施態様によれば、単一の組み合わせに含まれるプローブの一部同士の間でのそれらのプローブの比率の変化は、ある特定のシグナルを出現させる微粒子のパーセンテージに基づいて、標的分子の同定を可能にすることで、システムの曖昧さを改善することができる。
コンピューターアルゴリズムを使用することで、特異的組織適合性を決定したり、あるいは、稀少な対立遺伝子の存在と一般的な対立遺伝子の存在と関係を決定するために、陽性プローブのパターンの解析や、プローブの比率の変化の解析を行うことが可能となる。
その各々が異なるＳＳＯと同定可能な異なる特性を有している100個の微粒子についての単一の組み合わせよりもむしろ、ＳＳＯのパターン、あるいは、同定可能な同じ特性を有する微粒子の一つの組み合わせにおけるプローブの一部同士の間において異なるＳＳＯの比率を用いることで、より効率的に複素解析を行うことができる。
本願発明の好適な実施態様では、ＤＮＡを利用した組織適合検査のためのＳＳＯを提供する微粒子を用いている。 しかしながら、本願発明は、生体試料に含まれる抗体を検出するための組織適合検査用抗原を提供する微粒子を用いた組織適合検査のための方法も提供する。 ＤＮＡを利用した組織適合検査の観点から本願発明の利点として挙げられる事項は、タンパク質を利用した検査(抗原／抗体反応)においても、その利点として挙げることができる。 例えば、ビーズの一部を、HLA*A*0201抗原、HLA*A*0202抗原、および／または、HLA*A*0203抗原で標識付けし、そして、それらを、生体試料に含まれるこれら抗原に結合する抗体の存在を検出するために用いることができる。
本願発明の方法は、どのような物質であれ、それら物質から形成された微粒子、マイクロビーズ、ビーズ、または、マイクロスフェアを利用して実施することが可能であり、例えば、そのような物質として、シリカ、金、ラテックス、それに、ポリスチレン、ポリスルホン、および、ポリエチルなどのポリマー、または、ヒドロゲルなどがある。 その他に、染料によってコードされた微粒子が利用可能であり、オリゴヌクレオチドは、コードされた微粒子上に固定される。 本願発明の方法で用いた微粒子は、Luminex社、Invtrogen(カールズバッド、カリフォルニア州)、Polysciences社(ウォリントン、ペンシルベニア州)、および、Bangs Laboratories社(フィッシャーズ、インディアナ州)などから市販されているが、これらは、ごく一部でしかない。
本願発明の微粒子は、検出可能な標識、または、その他の同定可能な特性を含むことができる。 この微粒子は、単一の蛍光染料、または、複数の蛍光染料を含むことができる。 ある実施態様によれば、この微粒子は、その内部に蛍光染料が標識付けされており、そして、生体分子に共有結合するためのカルボキシル基をその表面に有している。 本願発明の他の実施態様によれば、この微粒子は、その内部に蛍光染料が標識付けされており、そして、ビオチンおよびビオチン化リガンドに対する共有結合を形成するためのアビジンの表面層を有している。 本願発明の他の実施態様によれば、この微粒子は、蛍光染料や非蛍光染料などの、異なる染料の組み合わせを含むことができる。 例えば、この微粒子は、紫外線(ＵＶ)照射をすることで強力な蛍光シグナルを発する非蛍光分子の３-β-Ｄ-リボフラノシル-２,７-ジオキソピリド[２,３-ｄ]ピリミジンの単一物質を生成する、Ｅ)-５-[２-(メトキシカルボニル)エテニル]シチジンで、標識付けすることができる。 本願発明の他の実施態様によれば、この微粒子は、米国特許公開公報第20070037195号に記載されたような、同定情報を具備したバーコードを含むことができる。
本願発明の他の実施態様によれば、この微粒子を、ナノ結晶、または、量子ドットとすることができる。 これらナノ結晶とは、光の粒子を吸収し、そして、異なる波長で、その粒子(蛍光色素分子)を再放出する。 加えて、その他の蛍光標識、または、二次抗体を、これらナノ結晶に対して接合することができる。 これらナノ結晶は、インビトロジェン社やエビデントテクノロジーズ社(トロイ、ニューヨーク州)などから市販されている。
微粒子の同定可能な特性として、ナノ粒子ＤＮＡを利用した検出方法、または、ナノ粒子タンパク質を利用した検出方法で検出できるものがある。 その一例が、生体バーコードであり、この技術は、生体試料に含まれる標的タンパク質に対してユニークなＤＮＡでコードされるナノ粒子プローブを用いてタンパク質を検出する超高感度の方法である(Nam et al., Science 301, 1884-1886, 2003)。 ナノ粒子ＤＮＡを利用した検出方法として、メルカプトアルキルオリゴヌクレオチドで修飾した金ナノ粒子を利用する比色分析ポリヌクレオチド検出方法(Elghanian et al., Science 277, 1078-1080, 1997)、光散乱または銀染色のいずれかを利用するチップを用いた検出方法(Taton et al. Science 289, 1757- 1760, 2000; Taton et al., J. Am. Chem. Soc, 123, 5164-5165, 2001)、サンドウィッチ分析法を用いて二つの電極の間に生じた隙間に標的ＤＮＡを捕捉するＤＮＡの電気的検出方法(Park et al., Science 295, 1503-1506, 2002)、それに、複数のレーザー波長で同時に試みた化学物質反応性回折格子を用いるＤＮＡ検出方法(Cao et al., J. Am. Chem. Soc. 2003)などがある。
本願発明は、同定可能な特性、または、FLOWのような標識を検出するシステムを用いて実施することができる。 蛍光標識の検出は、Bioarray BeadChip(Bioarray Solutions社、ウォレン、ニュージャージー州)のような、微粒子に関する画像を読み取る顕微鏡やカメラを用いて実施することもできる。 BeadChipフォーマットは、微粒子に対する結合を光学顕微鏡およびカメラを用いて記録する半導体ウェハの加工工程に対して、微粒子(「ビーズ」)を化学的に組み合わせている。
本願発明の方法で用いた試料ＤＮＡは、移植者、または、血液提供者、または、移植者、または、輸血受血者から得た生体試料から単離または抽出される。 この試料ＤＮＡは、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratories (New York, 1989)で教示されているような、当該技術分野で周知の従来の方法を用いて調製することができる。 ＨＬＡのような関心のある組織適合検査用遺伝子は、当該技術分野で標準技術であるＰＣＲ法を用いて増幅される。
生体試料として、全血、血液誘導物、赤血球濃縮物、血漿、血清、新鮮凍結血漿、全血由来血小板濃縮物、アフェレーシス血小板、プールした血小板、静脈内ガンマグロブリン、寒冷沈殿物、脳脊髄液、組織、それに、口腔から回収した細胞などの上皮細胞、そして、幹細胞、白血球、好中球、および、顆粒球などの細胞がある。 これら生体試料は、移植を申し出たヒト提供者の組織または細胞、あるいは、輸血を申し出たヒト提供者の血液または血液誘導物から取得することができる。 これら生体試料は、健康な骨髄提供者、あるいは、実父確定検査の対象者から取得することができる。 これら生体試料は、移植または輸血を受けるヒト、あるいは、移植または輸血のために組織または臓器の提供を申し出たヒトから取得することができる。 あるいは、これら生体試料は、移植希望者に移植される移植物の組織または細胞から直接に取得することができる。 加えて、これら生体試料は、輸血希望者に輸血される血液または血液誘導物から取得することができる。
ＳＳＯプローブ
本願発明の方法を実施するために、ＳＳＯプローブを、蛍光標識を付けたビーズに接合する。 このＳＳＯプローブには、ビオチン、ストレプトアビジン、ニッケル、ヘキサヒスチジン、ジゴキシゲニン(ＤＩＧ)、ＤＮＰなどの標識や、ＦＩＴＣ、ＰＥ、６-TAMRA、CR6G、DEAC、テキサスレッド、Cy３、Cy3.5、CY５、Cy5.5、Cy７、ローダミングリーンＸのような蛍光標識なども含めることができる。 本明細書で使用する「ヌクレオチド」の用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかに含まれるヌクレオチドを指し、よって、ヌクレオチドとしては、塩基のアデニン、シトシン、グアニン、チミン、および、ウラシル、それに、糖部分のデオキシリボース、または、リボースを含む。 しかしながら、周知の塩基であるアデニン、シトシン、グアニン、チミン、および、ウラシルの一つと塩基対を形成できるその他の修飾塩基も、本願発明で用いる診断用プローブにおいて利用することができる。 かような修飾をした塩基として、例えば、８-アザグアニンやヒポキサンチンなどがある。 本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」の用語は、200個またはそれ以下のヌクレオチドの分子を指し、好ましいオリゴヌクレオチドは、100個またはそれ以下のヌクレオチド、50個またはそれ以下のヌクレオチド、または、25個またはそれ以下のヌクレオチドである。
本明細書でヌクレオチドに関して用いている「〜に対して相補的」との用語は、その他の特定のヌクレオチドと共に塩基対を形成するヌクレオチドを指すものである。 よって、アデノシン一リン酸は、ウリジン一リン酸またはチミジン一リン酸に対して相補的であり、また、グアノシン一リン酸は、シチジン一リン酸に対して相補的である。 ところで、チミジン一リン酸とグアノシン一リン酸は、ある一定の条件下で、塩基対を形成することがあるが、本明細書では、両者の間に相補性は認められない、ものとみなしている。 さらに、シトシン一リン酸とアデノシン一リン酸も、ある一定の条件下で、塩基対を形成することがあるが、本明細書では、両者の間に相補性は認められない、ものとみなしている。 同じことが、シトシン一リン酸や、ウラシル一リン酸についても言える。
本願発明の方法で使用されているＳＳＯプローブとしては、検出される各特異的配列での異なる鎖に対して「実質的に」相補性を示すものが選択されている。 このことは、ＳＳＯプローブが、試料ＤＮＡの各鎖とハイブリダイズするために十分な相補性を具備していなければならない、ことを意味している。 したがって、ＳＳＯプローブ配列は、試料ＤＮＡ配列の正確な配列を反映する必要がないといえる。 よって、プローブ配列が、標的試料ＤＮＡ配列に対して正確な相補性を示す必要もないといえる。 したがって、すべてのプローブが、陰性対立遺伝子のための陰性コントロールのシグナルと同様に、公正なネガティブシグナルを出現させるわけではない。 不適合事例の数と不適合事例のタイプ(Ｇ-Ｔ不適合時に、Ｇ-Ｃ適合時とほとんど同じシグナルを出すことが時折ある)に応じて、一つの塩基対が不適合であった対立遺伝子に関する蛍光シグナルが、陰性コントロールのシグナルよりも実質的に大きなシグナルを出す可能性がある。 しかしながら、真正な陽性対立遺伝子のシグナルが、潜在的に適合している対立遺伝子のシグナルよりも十分に大きく、通常は、10〜20％増しの大きさのシグナルを出している限りは、陽性反応と陰性反応との間の識別を明確にするために、閾値やカットオフ値を設定することができる。
一般的に、少数の不適合箇所は、プローブ配列の中央部で受け入れられてしまい、その結果、ハイブリダイゼーションを形成するに至る。 概して、許容可能な不適合の程度は、ＳＳＯプローブ領域の長さに依存しており、また、その不適合の度合いは、ハイブリダイゼーション条件において選択した変性温度とアニーリング温度に対して順次に影響を及ぼすこととなる。 プローブの変性温度が、アニーリング温度と近接しているか、それよりも高い(ややストリンジェントでない)場合には、少数(一般的には、一つ、または、二つ、または、多くとも三つ)の不適合箇所があるにもかかわらず、プローブは、依然として標的配列に接着するであろう。 プローブ領域は、より多くの不適合箇所を、配列の中央部で受け入れることができてしまうが、そうなる性質は、選択したハイブリダイゼーション条件および検出条件下での、プローブ領域の変性温度とアニーリング温度の支配を受けることとなる。
本明細書で使用する「ストリンジェント」の用語は、当該技術分野でストリンジェントであるとして一般的に理解されている条件を指す。 ハイブリダイゼーションのストリンジェントの程度は、主として、温度、イオン強度、それに、ホルムアミドなどの変性剤の濃度によって決定される。 ハイブリダイゼーションと洗浄のためのストリンジェントな条件の例として、65〜68℃で、0.015M 塩化ナトリウム、0.0015M クエン酸ナトリウム、または、42℃で、0.015M 塩化ナトリウム、0.0015M クエン酸ナトリウム、および、50％ ホルムアミドなどがある。 Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989)を参照されたい。
さらにストリンジェントな条件(高い温度、低いイオン強度、高濃度のホルムアミド、または、その他の変性剤など)も利用可能であるが、その場合、ハイブリダイゼーションの速度に影響が及ぶこととなる。 デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが関係する場合、その際のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例として、37℃(14塩基のオリゴのための温度)、48℃(17塩基のオリゴのための温度)、55℃(20塩基のオリゴのための温度)、および、60℃(23塩基のオリゴのための温度)で、６×ＳＳＣ、0.05％ピロリン酸ナトリウムを用いて行う洗浄が挙げられる。
非特異的および／またはバックグラウンドハイブリダイゼーションを抑制するためのハイブリダイゼーション緩衝剤および洗浄用緩衝剤に、その他の薬剤を取り込むことも可能である。 その例として、0.1％ ウシ血清アルブミン、0.1％ ポリビニルピロリドン、0.1％ ピロリン酸ナトリウム、0.1％ ドデシル硫酸ナトリウム、NaDodSO4、(ＳＤＳ)、フィコール、デンハルト溶液、超音波分解したサケ精子ＤＮＡ(または、他の非相補的ＤＮＡ)、および、硫酸デキストランなどがあるが、その他の好適な薬剤も使用することができる。 ハイブリダイゼーション条件のストリンジェントの程度に実質的な影響を及ぼさない範囲で、これら添加物の濃度と種類を変更することができる。 通常、ハイブリダイゼーション実験は、pH 6.8〜7.4で実施されているが、典型的なイオン強度条件下では、ハイブリダイゼーションの速度は、pHとは、ほとんど無関係である。 Anderson et al., Nucleic Acis Hybridisation: A Practical Approach, Ch. 4, IRL Press Limited (Oxford, England)を参照されたい。 当業者であれば、これら変数に対応し、そして、ハイブリッドの形成に関連すると思われる異なる配列のＤＮＡを利用するために、ハイブリダイゼーション条件を調整することができる。
診断用配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ検出(ＳＳＯ)システムは、特定の標的核酸配列の存在を分析するための診断用プローブを用いるシステムまたは装置である。 かようなシステムまたは装置では、ポリカーボンやポリヌクレオチドリンカーなどの当該技術分野で周知のリンカーを用いて、診断用プローブを支持体に装着することができる。 あるいは、標的配列を、ニトロセルロース膜のような固相支持体に固定し、そして、診断用プローブを溶液に入れておくことができる。 ＳＳＯに含まれる診断用プローブは、少なくとも一つのプローブ領域を有している。 本明細書で使用する「プローブ領域」の用語は、標的ヌクレオチド配列の一部に対して実質的に相補性を示す診断用プローブのヌクレオチド配列を指す。
ビーズに固定されたプローブ、または、増幅した試料ＤＮＡに対して、標識付けを行うことができる。 直接蛍光化合物、ビオチン、ＦＩＴＣ、または、ジゴキシゲニン(Dig)を、タグとして使用することができる。 間接検出を行うにあたって、蛍光または酵素を接合したアビジン／ストレプトアビジン(ビオチンに対するもの)、抗ＦＩＴＣ抗体(ＦＩＴＣに対するもの)、抗Dig抗体(Digに対するもの)などが、この検出目的を実現するために使用することができる。 本願発明のある実施態様によれば、カルボキシル基で修飾したラテックスビーズは、プローブを固定するために使用することができる。 ビーズ上のカルボキシル基は、まず、１-エチル-３-(３-ジメチルアミノプロピル)塩酸カルボジイミド(ＥＤＣ)で活性化され、そして、ＥＤＣで活性化されたカルボキシル基は、オリゴプローブの５'端で、アミノ基と反応する。 あるいは、アミン−アミン、スルフィド−アミンの結合をもたらす化学物質、および、その他の化学物質を用いる実施態様も実施可能である。
組織適合検査用抗原
本願発明は、ヒト白血球抗原(ＨＬＡ)をスクリーニングするための組織適合検査法を提供する。 ＨＬＡ抗原は、生体のほぼ全部の細胞の細胞表面に存在しており、また、これら抗原は、白血球内に高濃度で含まれている。 ＨＬＡ抗原は、主要な決定因子の一つであり、免疫系は、非自己から自己を認識および差別化するために利用している。 ＷＨＯに属するＨＬＡ系因子の命名委員会(www.anthonynolan.com/HIG/)は、2007年４月の時点で、545個のＨＬＡ-Ａ対立遺伝子、895個のＨＬＡ-Ｂ対立遺伝子、307個のＨＬＡ-Ｃ対立遺伝子、８個のＨＬＡ-Ｅ対立遺伝子、12個のＨＬＡ-Ｈ対立遺伝子、９個のＨＬＡ-Ｊ対立遺伝子、６個のＨＬＡ-Ｋ対立遺伝子、４個のＨＬＡ-Ｌ対立遺伝子、４個のＨＬＡ-Ｐ対立遺伝子、３個のＨＬＡ-Ｖ対立遺伝子、３個のDRA対立遺伝子、494個のDRB１対立遺伝子、１個のDRB２対立遺伝子、44個のDRB３対立遺伝子、13個のDRB４対立遺伝子、18個のDRB５対立遺伝子、３個のDRB６対立遺伝子、２個のDRB７対立遺伝子、10個のDRB８対立遺伝子、１個のDRB９対立遺伝子、34個のDQA１対立遺伝子、83個のDQB１対立遺伝子、23個のDPA１、126個のDPB１対立遺伝子、４個のDMA対立遺伝子、７個のDMB対立遺伝子、12個のDOA対立遺伝子、および、９個のDOB対立遺伝子を明らかにしている。
本願発明は、ＨＬＡ抗原をスクリーニングすることを含む組織適合検査法に限定されない。 本願発明の方法は、組織適合検査または血液型判定のために用いられる抗原をスクリーニングするために用いることができる。 例えば、これら方法は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲ)、ヒト好中球抗原(ＨＮＡ)、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)、および、これらの断片、それに、ＡＢＯやＲＨ因子などの血液型をスクリーニングすることができる。
キラー細胞免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲ)
キラー細胞免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲ)は、リンパ球細胞の一部に認められる調節分子のグループに属する。 ＫＩＲ分子は、ＫＩＲリガンドと適合しない造血細胞移植を受けた急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)患者の再発リスクの抑制に関与している。 ＫＩＲリガンドと適合しないとの定義は、ＫＩＲ(3DLl、2DL2/3、2DLl、および、3DL2)を阻害するリガンドとして知られている提供者のクラスＩ対立遺伝子グループが、移植者に欠けていること、とされている。 提供者対移植者ＮＫ細胞同種反応性は、白血病の再発と移植片拒絶を解消し、また、移植片対宿主病から患者を保護するすることも知られている。
ＫＩＲのｃＤＮＡについて配列分析を行ったところ、ほとんどのＫＩＲ遺伝子が、可変部位を含んでおり、また、その内の幾つかが、まさしく多型性のものである、ことが明らかになっている。 対立遺伝子の多型は、双方のＫＩＲハプロタイプが同一である関連性の無い個体が観察できそうにもない程度の新たな多様性をもたらす。 ＨＬＡクラスＩとの相互作用に影響を及ぼす残基をコードする位置において、ＫＩＲ配列での変化を起こすことができる。 ヌクレオチドの変化が、主として、一つまたは二つのエクソンに限定されているＨＬＡクラスＩおよびII遺伝子で認められるパターンとは違って、前述した変化は、遺伝子のいたるところで起こる傾向がある。 ＫＩＲ分子は、ＫＩＲリガンドと適合しない造血細胞移植を受けた急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)患者の再発リスクの抑制に関与している。 ＫＩＲリガンドと適合しないとの定義は、ＫＩＲ(3DLl、2DL2/3、2DLl、および、3DL2)を阻害するリガンドとして知られている提供者のクラスＩ対立遺伝子グループが、移植者に欠けていること、とされている。 これらデータは、提供者対移植者ＮＫ細胞同種反応性が、白血病の再発と移植片拒絶を解消し、また、移植片対宿主病から患者を保護するすることを示している。
ＫＩＲ遺伝子型決定は、遺伝子座または対立遺伝子に対して特異的に行うことができる。 遺伝子座は、対象となる個体での各遺伝子の有無を検出し、そして、ＫＩＲ性能についての分析結果(ＫＩＲプロフィル)を提供するにすぎない。 ＫＩＲ遺伝子型決定のためのＰＣＲ配列特異的プライミング(ＰＣＲ-ＳＳＰ)法は、新たに発見された遺伝子座や未検出の対立遺伝子を取り込むために、データ更新を行っている。 ＰＣＲ配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ(ＰＣＲ-ＳＳＯＰ)法も開発されている。 研究機関相互の協同作業は、ＫＩＲ遺伝子座(100)の分子遺伝子型の試験結果を確認する上で役立っている。
目下のところ、100を超えるＫＩＲ遺伝子型プロフィルが作成されている。
中精度から高精度の対立遺伝子特異的反応(ＰＣＲ-ＳＳＰ)は、2DLl、2DL3、3DLl、および、3DL2(25、55)に関して報告されており、また、一本鎖立体配座多型(ＳＳＣＰ)分析を、2DL4の遺伝子型を決定するために用いた。 二つの相同性遺伝子座、2DL5Aおよび2DL5Bを識別するために、2DL5については、包括的分析法の確立が必要とされている。 ＰＣＲ-ＳＳＰを利用した逆転写酵素ＰＣＲ(ＲＴ-ＰＣＲ)は、アロタイプＮＫ細胞を選択するための方法であり、また、その大半は、前述したものと大差がない。 この目的を実現するために、様々なモノクローナル抗体を利用することが可能であるが、ＫＩＲアイソタイプの間の高い相同性が故に、その特異性は自ずと限定されてしまう。
血液型
現在では、血液型を判定するための多数のシステムが存在している。 輸血された赤血球に含まれる馴染みのない抗原の存在や、提供された血漿に含まれる抗体の存在は、提供された血液細胞を攻撃する有害な免疫応答を引き起こし、提供された赤血球の破壊に至ることとなる。 このことは、腎不全やショック症状などの重篤な症状を引き起こすこともある。 白血球細胞、血小板、それに、血漿タンパク質などのその他の血液成分に、抗原が現れることがある。
現在利用されている血液型判定システムの一つに、ＡＢＯ法がある。 この方法によれば、赤血球に関する、Ａ抗原の存在(AA、AO)、Ｂ抗原の存在(BBまたはBO)、Ａ抗原およびＢ抗原の双方の存在(AB)、または、Ａ抗原およびＢ抗原の双方の非存在(O)に基づいて、血液型が判定される。 赤血球に関するその他の抗原として、ＭＮＳ系(抗原Ｍ、Ｎ、Ｓおよびｓ)、Ｐ系(抗原Ｐ１)、ルーテル系(Lu(a)およびLu(b))、ケル系(Ｋ(ケル)およびｋ(セラノ)、および、KpaおよびKpb)、ルイス系(Le aおよびLe b)、ダフィー系(Fy aおよびFy b)、それに、キッド(JK)系(JkaおよびJkb)などがある。
前述したもの以外に、RH(リーサス)系を用いた血液型の判定もある。 三つの遺伝子、すなわち、第１染色体に認められるＣ、ＤおよびＥの遺伝子が、リーサス抗原の形成に関与している。 ｃまたはＣ、ｄまたはＤ、それに、ｅまたはＥの各遺伝子座には、二つの対立遺伝子があてがわれる可能性がある。 ｃ/Ｃ、ｄ/Ｄ、ｅ/Ｅからなる一つのハプロタイプは、両親の一方から遺伝したものであって、各個体で認められるリーサス型は、受け継いだ遺伝子型に依存している。 ハプロタイプには、次のようなコードが割り振られている。 すなわち、ＣＤｅは、Ｒ１として知られており、ｃＤＥは、Ｒ２として知られており、ＣＤＥは、Ｒｚとして知られており、ｃＤｅは、Ｒｏとして知られており、Ｃｄｅは、ｒ’として知られており、ｃｄＥは、Ｒ’’として知られており、ＣｄＥは、Ｒｙとして知られており、そして、ｃｄｅは、ｒとして知られている。
ヒト好中球抗原
ヒト好中球に特異的な抗原(ＨＮＡ)に対する抗体は、輸血を行った後の肺輸血反応の他に、場合によっては、輸血関連急性肺損傷(ＴＲＡＬＩ)や新生児同種免疫性好中球減少(ＮＡＩＮ)などの臨床的合併症を引き起こすことがある(Bux, et al. Transfus. Med. 2(2): 143-9, 1992)。 したがって、ＨＮＡ特異的抗原または抗体の検出は、臨床応用をする上で重要である。
ヒト好中球抗原は、好中球特異的抗原またはＨＮＡとしても知られている。 目下のところ、五つのＨＮＡ抗原系、すなわち、HNA-１、HNA-２、HNA-３、HNA-４、および、HNA-５がある。 HNA-１、HNA-２、HNA-４、および、HNA-５に対する対立遺伝子は同定されており、また、対応する糖タンパク質の特性も決定されているが、HNA-３に対する対立遺伝子については不明なままである(Stroncek, ASHI Quarterly 2004の概説)。 好中球のみにおいて発現し、かつ、低親和性Fc-γ受容体IIIbに存在する、三つのHNA-１抗原(HNA-1a、HNA-1b、および、HNA-1c)がある。 HNA-２系は、確立された一つの抗原(HNA-2a)を含んでいる。 HNA-２は、好中球、および、好中球前駆体のみにおいて発現し、糖タンパク質CD 177(NBl gp)に存在する。 HNA-３系は、一つの抗原、HNA-3aを含んでおり、このものは、5bとしても知られている。 HNA-３は、好中球、リンパ球、血小板、内皮細胞、腎臓、脾臓、および、胎盤細胞において発現し、そして、70〜95kDの好中球糖タンパク質に存在することが知られている。 HNA-４およびHNA-５は、β2インテグリンに存在する。
HNA-４は、顆粒球、単球、および、リンパ球において発現する。 (Stroncek, ASHI Quarterly 2004を参照されたい)
Ｔ細胞受容体
主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)細胞表面糖タンパク質によって提供される抗原ペプチドは、Ｔ細胞受容体およびＣＤ３鎖から構成されたマルチサブユニット経膜表面複合体であるＴ細胞受容体(ＴＣＲ)複合体を介して、Ｔ細胞によって認識される。 ＴＣＲは、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対して直接に結合し、そして、ＣＤ３とＴＣＲのその他の成分との間の相互作用を介してＴ細胞を活性化する。 つまり、ＴＣＲは、自己組織認識および外来組織認識に関与しており、そして、ＴＣＲ発現に関する組織を分析することは、移植提供者と移植者との間の組織適合検査において有用である。
キット
本願発明は、本願発明の方法を実施するためのキットも提供する。 特に、本願発明は、(ａ) 同定可能な特性を有する微粒子の複数の組み合わせ、すなわち、当該微粒子の各組み合わせが、一意的に同定可能な特性を有している、当該微粒子の複数の組み合わせ、および、(ｂ) ＳＳＯプローブ、すなわち、ある組み合わせに含まれる微粒子に固定される異なるＳＳＯプローブを含む、ＤＮＡを利用した組織適合検査法を実施するためのキットを提供する。
以下の実施例の内容を参酌することで、本願発明のその他の態様および利点について、理解されるであろう。
実施例１
従来の方法と本願発明の方法との比較
ビーズ、プローブ、および、試料ＤＮＡの調製
後述するＤＮＡ組織適合検査のために、ＬＡＢＴＹＰＥ(登録商標)ＳＳＯ ＤＲＢ１遺伝子座(ワン ラムダ社、カノーガ パーク、カリフォルニア州)を使用した。 Luminex ｘＭＡＰマイクロスフェア(オースチン、テキサス州)には、二つの蛍光染料が埋め込まれていた。 各マイクロスフェア(または、ビーズ)には、濃度の異なる各蛍光染料が、埋め込まれていた。
ＳＳＯプローブを、アミンで標識付けし、そして、ビーズに接合した。 ビオチン化したプライマーを用いたＰＣＲで、生物試料または組織試料から単離したＤＮＡからＨＬＡ ＤＲＢ１ エクソン２を増幅した。 得られたＰＣＲ産物(「試料ＤＮＡ」と称する)の５'-末端を、ビオチンで標識付けした。 この試料ＤＮＡを、ビーズに接触せしめ、そして、試料ＤＮＡとビーズ上に固定したＳＳＯプローブとのハイブリダイゼーションを行ったところ、蛍光染料フィコエリトリン(ＰＥ)を接合したストレプトアビジンと共にインキュベーションをした後に、試料ＤＮＡとＳＳＯプローブとの間のハイブリダイゼーションを示す蛍光シグナルを発した。 この蛍光シグナルは検出され、そして、フローサイトメトリー評価に供された。 (ＤＮＡの供給源は限定されないが、血液または頬粘膜拭い液から取得したものが好ましい。)
試料ＤＮＡに含まれる増幅したＨＬＡ遺伝子と、微粒子上に固定されたＳＳＯプローブとの間のＤＮＡハイブリダイゼーション反応を、次のようにして行った。 約１ng/mlのゲノムＤＮＡと10マイクロモルの対応する配列特異的ビオチン化プライマーとを含んだ標準的な遺伝子増幅反応を、予め最適化した熱サイクルプログラムを用いて準備した。 そうして取得できた増幅したDRB1 * 0814を含んだ５mlの混合物を、変性し、中和し、そして、所望のプローブが結合した微粒子(1,000個の微粒子/プローブ/試験)を、１M 塩化ナトリウムおよび70mM リン酸ナトリウムの緩衝液に混合した。 このハイブリダイゼーション反応物を、6O℃で、15分間、インキュベーションした。 そして、２容量の5OnM 塩化ナトリウム溶液(6O℃で予め加熱したもの)を、混合物に添加し、 次いで、試験管を、５分間、遠心分離に供した。 ペレット化した微粒子に触れないように注意しながら、上清を除去した。 この洗浄工程を、２回以上は行った。
そして、３容量の５mg/mlのフィコエリトリン-ストレプトアビジン接合物を加えることで、ハイブリダイズしたＤＮＡに標識付けを行った。 標識付けした混合物は、前述したように、6O℃で、５分間、インキュベーションし、そして、洗浄をした。 50nM 塩化ナトリウムを用いて、洗浄した微粒子を、80mlの体積で再懸濁した。 機器に注入された各微粒子を、励起し、検出し、そして、580nmでの蛍光シグナルを記録するLuminex 100流動性測定装置を用いて、ハイブリダイゼーションシグナルを検出した。 各プローブに関するトリム平均蛍光強度(ＭＦＩ)を算出するために、約500個の微粒子／試験を分析した。
次いで、試験で用いた各プローブに関して得られたＭＦＩは、陽性コントロールプローブから得たＭＦＩを用いて、相対ハイブリダイゼーションシグナルを算出するために利用した。
陽性コントロールプローブとは、特定のプライマーセットで増幅することができるすべての対立遺伝子の非多型領域を認識するプローブである。 本願発明での標的核酸鎖は、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を用いて増幅された対立遺伝子領域を含む。 陽性コントロールプローブは、参照シグナルを得るために用いることができ、これにより、増幅したＤＮＡ(単位複製配列)の量の変化を見積もることが可能となる。 診断用プローブシグナルは、陽性コントロールシグナルのパーセントとして表現されるため、この陽性コントロールシグナルは、すべての診断用プローブの相対シグナルを算出するために用いられる。
従来の分析法
ＤＮＡを利用した従来の組織適合検査方法については、上記したようにして、100個の異なる蛍光標識付けしたビーズの各々を、異なるＨＬＡ特異的ＳＳＯプローブに対して接合した。 これらビーズを、試料ＤＮＡに接触せしめた。 各ビーズに対する試料ＤＮＡのハイブリダイゼーションを、Luminex 100 流動性測定装置を用いて評価した。
フローサイトメトリーデータを、Luminex 100 流動性測定用ソフトウェアを用いて、統計学的に解析した。 関心をもったビーズ(ビーズ37)のトリム平均蛍光強度値は、1707であった。 このトリム平均値は、高い異常値と低い異常値が関わる特定のパーセンテージを削除して算出された平均値である。
本願発明の方法を用いた分析
ＤＮＡを利用した本願発明の組織適合検査方法を用いて、多数のビーズ37(750個のビーズ)を、表１に記載の５つのＨＬＡ特異的ＳＳＯプローブの一つと接合した。 これらビーズを、試料ＤＮＡに接触せしめた。 各ビーズに対する試料ＤＮＡのハイブリダイゼーションを、Luminex 100 流動性測定装置を用いて評価した。 ５つのプローブについて試験を行ったので、陽性ビーズの20％については、さらに分析をした。
Figure 2013116106
 フローサイトメトリーデータを、Luminex 100 流動性測定用ソフトウェアを用いて、統計学的に解析した。 この解析では、分析したビーズの大きさと、ビーズに埋め込まれた各蛍光染料の蛍光強度の決定、それに、その蛍光強度が所望の範囲内に収まっているかどうかの判断も行った。 各染料に関する蛍光強度は、ＲＰＩを決定するために解析をした。 ＲＰＩは、ビーズにハイブリダイズした試料ＤＮＡが呈する蛍光強度を示す。 本実施例の場合、ＲＰＩは、試料ＤＮＡに標識付けされたＰＥの正確な蛍光強度を示している。 この数値は、試料ＤＮＡが、ビーズ37が接合したＳＳＯプローブにハイブリダイズしていることを示すものである。
ビーズ37については、574個の事例でＲＰＩ＜216であったので陰性である、と考えられる。 すなわち、この試料ＤＮＡは、ＳＳＯプローブに対してハイブリダイズしなかった、と考えられる。 加えて、この試料ＤＮＡが、ＳＳＯプローブに対してハイブリダイズしたことを示す151個の陽性事例(ＲＰＩ＞5650)も認められた。 陽性：陰性の比率は、151：574であり、これは、約１：４に相当する。 したがって、５つのプローブの内の一つは、この試料ＤＮＡに対して陽性であった。 陽性ビーズに対する平均ＲＰＩは、8152であった。 この数値は、強いシグナルを示すものであり、また、従来の方法で算出した平均ＲＰＩの実測値(1707)よりも大きな数値を示すシグナルである。
この実験で利用したＤＮＡ試料は、DRB1*O814 (プローブ OLR4916にハイブリダイズしている；表１を参照されたい)に対してのみ陽性を示すことが知られている。 陽性事例の20％だけについて行った分析は、ビーズ37が陽性を示し、そして、検出された平均シグナル(8152)が、従来の方法(一つのビーズ／一つのプローブ)で認められた強度と同様の強度である、ことを示すものであった。 この実験は、本願発明の方法での選択工程が、陽性シグナルを強めることを実証している。 加えて、本実施例は、同数または少数のビーズを用いて、さらに多くの標的がスクリーニングできるであろうこと、そして、そこで得られるシグナルが、従来の方法を用いて得られるシグナルと同程度のものになることをも実証している。
実施例２
従来の方法と本願発明の方法との別の比較
実施例１に記載の手順にしたがって、ＤＮＡを利用したＨＬＡ対立遺伝子抗原に関する従来の組織適合検査方法と本願発明の改善された方法との間のさらなる比較を行った。 これら方法で用いた試料ＤＮＡは、増幅したＨＬＡ抗原対立遺伝子DRB1*O416を含んでいた。
実施例１に記載の手順にしたがって、Luminex 100 流動性測定装置を用いて、ハイブリダイゼーションシグナルを検出した。 試験で用いた各プローブに関して得られたＭＦＩは、適切な陽性コントロールプローブから得たＭＦＩを用いて、相対ハイブリダイゼーションシグナルを算出するために利用した。 特定のプライマーセットで増幅することが可能なすべての対立遺伝子での非多型領域を認識する陽性コントロールプローブも使用した。
従来の方法
ＤＮＡを利用した従来の組織適合検査方法については、上記したようにして、100個の異なる蛍光標識付けしたビーズの各々を、異なるＨＬＡ特異的ＳＳＯプローブに対して接合した。 これらビーズを、試料ＤＮＡに接触せしめた。 各ビーズに対する試料ＤＮＡのハイブリダイゼーションを、Luminex 100 流動性測定装置を用いて評価した。
フローサイトメトリーデータを、Luminex 100 流動性測定用ソフトウェアを用いて、統計学的に解析した。 関心をもったビーズ(ビーズ73)のトリム平均蛍光強度値は、400であった。
本願発明の方法を用いた分析
ＤＮＡを利用した本願発明の組織適合検査方法を用いて、多数のビーズ73(838個のビーズ)を、表２に記載の５つのＨＬＡ特異的ＳＳＯプローブの一つと接合した。 これらビーズを、試料ＤＮＡに接触せしめた。 各ビーズに対する試料ＤＮＡのハイブリダイゼーションを、Luminex 100 流動性測定装置を用いて評価した。 ５つのプローブについて試験を行ったので、陽性ビーズの20％については、さらに分析をした。
Figure 2013116106
 フローサイトメトリーデータを、実施例１に記載の手順に従って、Luminex 100 流動性測定用ソフトウェアを用いて、統計学的に解析した。 ビーズ73については、672個の事例でＲＰＩ＜48(平均＝16)であったので陰性である、と考えられる。 すなわち、この試料ＤＮＡは、ＳＳＯプローブに対してハイブリダイズしなかった、と考えられる。 加えて、この試料ＤＮＡが、ＳＳＯプローブに対してハイブリダイズしたことを示す166個の陽性事例(ＲＰＩ＞1457)も認められた。 陽性：陰性の比率は、166：672であり、これは、約１：４に相当する。 したがって、５つのプローブの内の一つは、この試料ＤＮＡに対して陽性であった。 陽性ビーズに対する平均ＲＰＩは、2510であった。 この数値は、強いシグナルを示すものであり、また、従来の方法で算出した平均ＲＰＩの実測値(400)よりも大きな数値を示すシグナルである。
この実験で利用したＤＮＡ試料は、DRB1*O416 (プローブ DR148にハイブリダイズしている；表２を参照されたい)に対してのみ陽性を示すことが知られている。 陽性事例の20％だけについて行った分析は、ビーズ73が陽性を示し、そして、検出された平均シグナル(2510)が、従来の方法(従来の方法での平均値は400)で認められた強度と同様の強度である、ことを示すものであった。 本実施例は、実施例１に記載の分析結果を実証するものである。
これまでに説明してきた本願発明の好適な実施態様を考慮すれば、当業者であれば、本願発明を実施するに際して、本願発明に対して多くの修正や変更を加えることが可能であることは自明である。 従って、特許請求の範囲の欄に記載の限定事項のみが本願発明に付加されるべきである。

Claims (48)

  1. 結合相互作用をスクリーニングする方法であって、当該方法が；
    一意的に同定可能な微粒子の複数の組み合わせを調製し、すなわち、ある組み合わせに含まれる当該微粒子が、一意的に同定可能な同じ特性を有しており、また、一つまたはそれ以上の組み合わせが、微粒子の一部を含み、そして、当該微粒子の一部が、生体試料に含まれる標的分子に対する結合パートナーとして機能する少なくとも一つのユニークプローブを提供する、一意的に同定可能な微粒子の複数の組み合わせを調製し、
    当該微粒子の複数の組み合わせを、生体試料に含まれる標的分子がプローブに結合できる条件下で、生体試料と接触せしめ、
    当該標的分子と当該プローブとの間の結合相互作用を示すシグナルの出現によって、生体試料に含まれる標的分子と当該微粒子上のプローブとの間の結合を検出し、
    当該微粒子に関する結合相互作用を示すシグナルを評価し、
    当該結合相互作用を示すシグナルが、当該生体試料に含まれる一つまたはそれ以上の標的分子の存在を示す選択した閾値よりも大きい一意的に同定可能な微粒子の組み合わせを決定し、および
    当該結合相互作用を示す一意的に同定可能な微粒子の組み合わせの数を決定する、
    工程を含む、結合相互作用をスクリーニングする方法。
  2. 前記プローブが、配列特異的オリゴヌクレオチド(ＳＳＯ)プローブまたはプライマーである請求項１に記載の方法。
  3. 前記生体試料が、試料ＤＮＡであり、また、前記結合相互作用が、当該試料ＤＮＡと前記ＳＳＯプローブとの間のハイブリダイゼーションである請求項２に記載の方法。
  4. 前記試料ＤＮＡが、頬粘膜拭い液、または、血液から得たものである請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記プローブが、ペプチド、または、タンパク質抗原である請求項４に記載の方法。
  6. 前記プローブに結合する前記生体試料に含まれる標的分子が、抗体である請求項５に記載の方法。
  7. 前記プローブが、ＨＬＡ抗原、ＨＮＡ抗原、血液型判定用抗原、ＴＣＲ抗原、および、ＫＩＬ抗原からなるグループから選択された組織適合検査用抗原である請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
  8. 一意的に同定可能な微粒子の少なくとも一つの組み合わせに含まれる少なくとも二つの前記微粒子の一部が、約１：１以外の一定の数値的比率で存在する請求項１乃至７のいずれかに記載の方法。
  9. 以下の工程、すなわち；
    一意的に同定可能な微粒子の一つまたはそれ以上の組み合わせに関する結合相互作用において最大のシグナルを示す微粒子の１００％未満の割合を選択し、および
    選択した割合において当該結合相互作用を示すシグナルが、前記生体試料に含まれる一つまたはそれ以上の標的分子の存在を示す選択した閾値よりも大きい一意的に同定可能な微粒子の当該組み合わせを決定する、
    工程をさらに含む請求項１乃至８のいずれかに記載の方法。
  10. 一意的に同定可能な微粒子の少なくとも一つの組み合わせに含まれる少なくとも二つの微粒子の一部が、約１：１以外の一定の数値的比率で存在する請求項９に記載の方法。
  11. 微粒子の組み合わせに関して選択した前記割合が、５０％未満である請求項９に記載の方法。
  12. 微粒子の組み合わせに関して選択した前記割合が、３０％未満である請求項９に記載の方法。
  13. 微粒子の組み合わせに関して選択した前記割合が、２０％未満である請求項９に記載の方法。
  14. 微粒子の組み合わせに関して選択した前記割合が、１０％未満である請求項９に記載の方法。
  15. 微粒子の組み合わせに関して選択した前記割合が、微粒子の組み合わせに対するユニークプローブを提供する微粒子の一部の数の逆数と同等またはそれ未満である請求項９に記載の方法。
  16. ＤＮＡを利用した組織適合検査方法であって、当該方法が；
    一意的に同定可能な微粒子の複数の組み合わせを調製し、すなわち、ある組み合わせに含まれる当該微粒子が、一意的に同定可能な同じ特性を有しており、また、一つまたはそれ以上の組み合わせが、微粒子の一部を含み、そして、当該微粒子の一部が、組織適合検査用抗原対立遺伝子とハイブリダイズするように選択された少なくとも一つのユニーク配列特異的オリゴヌクレオチド(ＳＳＯ)を提供する、一意的に同定可能な微粒子の複数の組み合わせを調製し、
    当該微粒子の複数の組み合わせを、ハイブリダイゼーション条件下で、試料ＤＮＡと接触せしめ、
    当該試料ＤＮＡとＳＳＯとの間のハイブリダイゼーションを示すシグナルの出現によって、当該微粒子での当該試料ＤＮＡとＳＳＯとの間のハイブリダイゼーションを検出し、
    当該微粒子に関する当該試料ＤＮＡとＳＳＯとの間のハイブリダイゼーションを示すシグナルを評価し、
    当該試料ＤＮＡ/ＳＳＯハイブリダイゼーションを示すシグナルが、当該試料に含まれる一つまたはそれ以上の組織適合検査用抗原対立遺伝子の存在を示す選択した閾値よりも大きい一意的に同定可能な微粒子の組み合わせを決定し、および
    当該ＤＮＡ/ＳＳＯハイブリダイゼーションを示す一意的に同定可能な微粒子の組み合わせの数を決定する、
    工程を含む、ＤＮＡを利用した組織適合検査方法。
  17. 一意的に同定可能な微粒子の少なくとも一つの組み合わせに含まれる少なくとも二つの微粒子の一部が、約１：１以外の一定の数値的比率で存在する請求項１６に記載の方法。
  18. 以下の工程、すなわち；
    一意的に同定可能な微粒子の少なくとも一つの組み合わせに関するＤＮＡ/ＳＳＯハイブリダイゼーションにおいて最大のシグナルを示す微粒子の１００％未満の割合を選択し、および
    選択した割合において当該ＤＮＡ/ＳＳＯハイブリダイゼーションを示すシグナルが、前記生体試料に含まれる一つまたはそれ以上の組織適合検査用抗原の存在を示す選択した閾値よりも大きい一意的に同定可能な微粒子の当該組み合わせを決定する、
    工程をさらに含む請求項１６または１７に記載の方法。
  19. 一意的に同定可能な微粒子の少なくとも一つの組み合わせに含まれる少なくとも二つの微粒子の一部が、約１：１以外の一定の数値的比率で存在し、かつ、当該比率が、微粒子の組み合わせにおいて選択した割合を決定する請求項１６に記載の方法。
  20. 微粒子の組み合わせに関して選択した前記割合が、５０％未満である請求項１８に記載の方法。
  21. 微粒子の組み合わせに関して選択した前記割合が、３０％未満である請求項１８に記載の方法。
  22. 微粒子の組み合わせに関して選択した前記割合が、２０％未満である請求項１８に記載の方法。
  23. 微粒子の組み合わせに関して選択した前記割合が、１０％未満である請求項１８に記載の方法。
  24. 微粒子の組み合わせに関して選択した前記割合が、微粒子の組み合わせに対するユニークＳＳＯを提供する微粒子の一部の数の逆数と同等またはそれ未満である請求項１８に記載の方法。
  25. 前記組織適合検査用抗原が、ＨＬＡ抗原、ＨＮＡ抗原、血液型判定用抗原、ＴＣＲ抗原、および、ＫＩＬ抗原からなるグループから選択される請求項１６乃至２４のいずれかに記載の方法。
  26. 前記組織適合検査用抗原が、ＨＬＡ抗原である請求項２５に記載の方法。
  27. ＤＮＡを利用した組織適合検査方法であって、当該方法が；
    一意的に同定可能な微粒子の複数の組み合わせを調製し、すなわち、ある組み合わせに含まれる当該微粒子が、一意的に同定可能な同じ特性を有しており、また、一つまたはそれ以上の組み合わせが、微粒子の一部を含み、そして、当該微粒子の一部が、組織適合検査用抗原対立遺伝子とハイブリダイズするように選択された少なくとも一つのユニーク配列特異的オリゴヌクレオチド(ＳＳＯ)を提供する、一意的に同定可能な微粒子の複数の組み合わせを調製し、
    当該微粒子の複数の組み合わせを、ハイブリダイゼーション条件下で、試料ＤＮＡと接触せしめ、
    当該試料ＤＮＡとＳＳＯとの間のハイブリダイゼーションを示すシグナルの出現によって、当該微粒子での当該試料ＤＮＡとＳＳＯとの間のハイブリダイゼーションを検出し、
    当該微粒子に関する当該試料ＤＮＡとＳＳＯとの間のハイブリダイゼーションを示すシグナルを評価し、
    一意的に同定可能な微粒子の当該組み合わせに関する試料ＤＮＡ/ＳＳＯハイブリダイゼーションにおいて最大のシグナルを示す微粒子の１００％未満の割合を選択し、
    当該試料ＤＮＡ/ＳＳＯハイブリダイゼーションを示すシグナルが、当該試料に含まれる一つまたはそれ以上の組織適合検査用抗原対立遺伝子の存在を示す選択した閾値よりも大きい一意的に同定可能な微粒子の組み合わせを決定し、および
    当該ＤＮＡ/ＳＳＯハイブリダイゼーションを示す一意的に同定可能な微粒子の組み合わせの数を決定する、
    工程を含む、ＤＮＡを利用した組織適合検査方法。
  28. 一意的に同定可能な微粒子の少なくとも一つの組み合わせに含まれる少なくとも二つの微粒子の一部が、約１：１以外の一定の数値的比率で存在し、かつ、当該比率が、微粒子の組み合わせにおいて選択した割合を決定する請求項２７に記載の方法。
  29. 微粒子の組み合わせに関して選択した前記割合が、５０％未満である請求項２６または２７に記載の方法。
  30. 微粒子の組み合わせに関して選択した前記割合が、３０％未満である請求項２９に記載の方法。
  31. 微粒子の組み合わせに関して選択した前記割合が、２０％未満である請求項２９に記載の方法。
  32. 微粒子の組み合わせに関して選択した前記割合が、１０％未満である請求項２９に記載の方法。
  33. 微粒子の組み合わせに関して選択した前記割合が、微粒子の組み合わせに対するユニークＳＳＯを提供する微粒子の一部の数の逆数と同等またはそれ未満である請求項２７乃至３２のいずれかに記載の方法。
  34. 前記組織適合検査用抗原が、ＨＬＡ抗原、ＨＮＡ抗原、血液型判定用抗原、ＴＣＲ抗原、および、ＫＩＬ抗原からなるグループから選択される請求項２７乃至３２のいずれかに記載の方法。
  35. ＤＮＡを利用した組織適合検査方法、すなわち、試料ＤＮＡがコードする組織適合検査用抗原対立遺伝子を同定するために、ユニーク配列特異的オリゴヌクレオチド(ＳＳＯ)を提供し、かつ一意的に同定可能な微粒子の多様な組み合わせと当該試料ＤＮＡとを接触せしめ、および、同定可能な微粒子の当該組み合わせに対して提供したＳＳＯと、当該試料ＤＮＡに含まれる対立遺伝子とのハイブリダイゼーションの有無を決定する、工程を含むＤＮＡを利用した組織適合検査方法において、以下の工程、すなわち；
    一意的に同定可能な同じ特性を有している一意的に同定可能な微粒子の複数の組み合わせを調製し、すなわち、当該組み合わせが、微粒子の一部を含み、そして、当該微粒子の一部が、ＨＬＡ対立遺伝子とハイブリダイズするように選択された少なくとも一つのユニーク配列特異的オリゴヌクレオチド(ＳＳＯ)を提供する、一意的に同定可能な微粒子の複数の組み合わせを調製し、
    当該微粒子の複数の組み合わせを、ハイブリダイゼーション条件下で、試料ＤＮＡと接触せしめ、
    当該試料ＤＮＡとＳＳＯとの間のハイブリダイゼーションを示すシグナルの出現によって、当該微粒子での当該試料ＤＮＡとＳＳＯとの間のハイブリダイゼーションを検出し、
    当該微粒子に関する当該試料ＤＮＡとＳＳＯとの間のハイブリダイゼーションを示すシグナルを評価し、
    当該試料ＤＮＡ/ＳＳＯハイブリダイゼーションを示すシグナルが、当該試料に含まれる一つまたはそれ以上のＨＬＡ対立遺伝子の存在を示す選択した閾値よりも大きい一意的に同定可能な微粒子の組み合わせを決定し、および
    当該ＤＮＡ/ＳＳＯハイブリダイゼーションを示す一意的に同定可能な微粒子の組み合わせの数を決定する、
    工程を含む、ＤＮＡを利用した組織適合検査方法。
  36. ハイブリダイゼーションの陽性シグナルを伝達する工程をさらに含む請求項３５に記載の方法。
  37. 前記同定可能なプローブの組み合わせに対して最大のシグナルを示す微粒子の割合を選択する工程をさらに含む請求項３５または３６に記載の方法。
  38. 微粒子の組み合わせに関して選択した前記割合が、５０％未満である請求項３５または３６に記載の方法。
  39. 微粒子の組み合わせに関して選択した前記割合が、３０％未満である請求項３８に記載の方法。
  40. 微粒子の組み合わせに関して選択した前記割合が、２０％未満である請求項３８に記載の方法。
  41. 微粒子の組み合わせに関して選択した前記割合が、１０％未満である請求項３８に記載の方法。
  42. 微粒子の組み合わせに関して選択した前記割合が、微粒子の組み合わせに対するユニークＳＳＯを提供する微粒子の一部の数の逆数と同等またはそれ未満である請求項３５乃至４０のいずれかに記載の方法。
  43. 結合相互作用を評価する方法を実施するためのキットであって、一意的に同定可能な同じ特性を有している一意的に同定可能な微粒子の複数の組み合わせ、すなわち、当該組み合わせが、微粒子の一部を含み、そして、当該微粒子の一部が、生体試料に含まれる標的分子に対して結合する少なくとも一つのユニークプローブを提供する一意的に同定可能な微粒子の複数の組み合わせを含むキット。
  44. 前記標的分子が、ＨＬＡ抗原、ＨＬＡ対立遺伝子、ＨＮＡ抗原、ＨＮＡ対立遺伝子、血液型判定用抗原、ＴＣＲ、または、ＫＩＬからなるグループから選択される請求項４３に記載のキット。
  45. 前記プローブが、配列特異的オリゴヌクレオチド、または、プライマーである請求項４３または４４に記載のキット。
  46. 前記プローブが、ペプチド、または、タンパク質抗原である請求項４３または４４に記載のキット。
  47. ＤＮＡを利用した組織適合検査方法を実施するためのキットであって、一意的に同定可能な同じ特性を有している一意的に同定可能な微粒子の複数の組み合わせ、すなわち、当該組み合わせが、微粒子の一部を含み、そして、当該微粒子の一部が、組織適合検査用抗原対立遺伝子とハイブリダイズするように選択された少なくとも一つのユニーク配列特異的オリゴヌクレオチド(ＳＳＯ)を提供する一意的に同定可能な微粒子の複数の組み合わせを含むキット。
  48. 前記組織適合検査用抗原が、ＨＬＡ、ＨＮＡ、血液型判定用抗原、ＴＣＲ、または、ＫＩＬからなるグループから選択される請求項４７に記載のキット。
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