KR20210063379A - 바코딩된 펩티드-mhc 복합체 및 그의 용도 - Google Patents

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칸다사미 라비
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브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니
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Abstract

특정 실시양태에서, 본 개시내용은 (i) DNA-바코딩된 펩티드-주요 조직적합성 복합체 (pMHC)로 스크리닝하여, 이들 펩티드에 대하여 특이적인 T 림프구를 검출하는 것, 및 (ii) 스크리닝에서 식별된 T 림프구를 단일-세포 서열분석하여, 그의 트랜스크립톰을 분석하는 것을 조합하는 방법을 제공한다.

Description

바코딩된 펩티드-MHC 복합체 및 그의 용도
관련 출원의 상호-참조
본 출원은 2018년 9월 24일에 출원된 미국 가출원 번호 62/735,803의 우선권 이익을 주장하며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 T-세포 에피톰 맵핑 및 트랜스크립톰 분석에 관한 것이다.
T 세포는 바이러스 감염 및 종양에 대항하는데 있어서 필수적인 역할을 한다. T 세포는 T-세포 수용체 (TCR)와 펩티드-주요 조직적합성 복합체 (pMHC) 사이의 상호작용을 통하여 활성화된다. TCR과 pMHC 사이의 상호작용은 시토카인 방출을 포함한 이펙터 표현형의 증식, 발생을 유도할 수 있다. 따라서, 개별 T 세포에 의해 인식되는 펩티드 (항원)의 식별, 및 펩티드-특이적 T 세포의 특징화는 면역-관련 질환을 이해하고 치료하는데 필수적이다.
현재, 질량 세포측정법-기반 (Newell et al. (2013) Nature Biotechnology, 623-629), 형광-기반 (Altman (1996) Science, 94-96) 또는 이중-가닥 DNA 바코드-기반 (Bentzen et al. (2016) Nature Biotechnology, 1037-1045) 접근법은 항원-특이적 T 세포의 제한된 유동-기반 특징화를 사용한 개별 T 세포에 의해 인식되는 항원의 식별로 제한되고 있다. 마찬가지로, DNA 바코드 항체 표지화 전략 (Stoeckius et al. (2017) Nature Methods, 865-868; Peterson et al. (2017) Nature Biotechnology, 936-939)은 유전자 발현과 세포 표면 에피토프 발현의 동시적 측정으로 제한되고 있다.
본 개시내용은 T-세포를 포함하는 샘플에서의 단일 세포 해상도로의 동시적 T-세포 에피토프 맵핑 및/또는 트랜스크립톰 특징화 방법으로서, (a) 고유 바코드를 사용하여 각각의 고유 펩티드-주요 조직적합성 복합체 (pMHC)를 표지화하며, 그에 의해 바코딩된 pMHC 구축물의 집단을 산출하는 단계; (b) T-세포를 포함하는 샘플을 바코딩된 pMHC 구축물의 집단과 접촉시키며, 여기서 적어도 1종의 T-세포 상의 T 세포 수용체가 바코딩된 pMHC 구축물 중 적어도 1종 ("T 세포 수용체 에피토프")에 결합하는 단계; 및 (c) 단일 세포 서열분석을 사용하여 T-세포를 서열분석하는 단계를 포함하며, 여기서 단일 세포 서열분석은 각각의 T-세포에서의 T-세포 수용체 에피토프 및 트랜스크립톰 유전자를 동시에 식별하는 것인 방법을 제공한다.
본 개시내용은 또한 샘플로부터 수득되는 단일 T-세포에서의 동시적 T-세포 에피토프 맵핑 및/또는 트랜스크립톰 특징화 방법으로서, (a) 고유 바코드를 사용하여 각각의 고유 펩티드-주요 조직적합성 복합체 (pMHC)를 표지화하며, 그에 의해 바코딩된 pMHC 구축물의 집단을 산출하는 단계; (b) T-세포를 바코딩된 pMHC 구축물의 집단과 접촉시키며, 여기서 T-세포 상의 T 세포 수용체가 바코딩된 pMHC 구축물 중 적어도 1종 ("T 세포 수용체 에피토프")에 결합하는 단계; 및 (c) 단일 세포 서열분석을 사용하여 T-세포를 서열분석하는 단계를 포함하며, 여기서 단일 세포 서열분석은 T-세포에서의 T-세포 수용체 에피토프 및 트랜스크립톰 유전자를 동시에 식별하는 것인 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 단일 세포 서열분석은 액적-기반 단일 세포 서열분석이다. 일부 측면에서, 서열분석의 각각의 액적은 (i) (b)에서 적어도 1종의 바코딩된 pMHC 구축물에 의해 표지화된 T-세포; 및 (ii) 트랜스크립톰 측정을 위한 프라이머를 포함하는 프라이머 비드를 포함한다.
일부 측면에서, 각각의 바코드는 단일 가닥 핵산이다. 일부 측면에서, 단일 가닥 핵산은 DNA이다. 일부 측면에서, 각각의 바코드는 고유 샘플 식별 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 샘플 식별 서열은 해밍(Hamming) 코드를 기반으로 하여 설계된다. 일부 측면에서, 샘플 식별 영역은 적어도 10 bp, 적어도 11 bp, 적어도 12 bp, 적어도 13 bp, 적어도 14 bp, 적어도 15 bp, 적어도 16 bp, 적어도 17 bp, 적어도 18 bp, 적어도 19 bp, 적어도 20 bp, 적어도 21 bp, 적어도 22 bp, 적어도 23 bp, 적어도 24 bp, 적어도 25 bp, 적어도 26 bp, 적어도 27 bp, 적어도 28 bp, 적어도 29 bp 또는 적어도 30 bp 길이이다. 일부 측면에서, 샘플 식별 영역은 10 bp 내지 30 bp, 11 bp 내지 29 bp, 12 bp 내지 28 bp, 13 내지 27 bp, 14 bp 내지 26 bp, 15 bp 내지 25 bp, 16 bp 내지 24 bp, 17 bp 내지 23 bp, 또는 18 bp 내지 22 bp이다.
일부 측면에서, 샘플 식별 영역은 2개의 불변 영역 (5' 불변 영역 및 3' 불변 영역)에 의해 플랭킹된다. 일부 측면에서, 5' 불변 영역은 PCR 증폭 및 인덱스 프라이머에의 어닐링에 사용된다. 일부 측면에서, 인덱스 프라이머는 고유 분자 인덱스 (UMI)를 포함한다. 일부 측면에서, UMI는 일루미나(Illumina) i7 UMI를 포함한다. 일부 측면에서, 3' 불변 영역은 액적 기반 단일 세포 서열분석 플랫폼에서 주형-스위치 올리고에 어닐링된다.
일부 측면에서, 주형-스위치 올리고는 10X 세포 바코드 또는 Dropseq 세포 바코드를 포함한다. 일부 측면에서, 각각의 바코딩된 pMHC 구축물은 스캐폴드를 포함한다. 일부 측면에서, 스캐폴드는 뉴트라비딘을 포함한다. 일부 측면에서, 스캐폴드는 덱스트란을 포함한다. 일부 측면에서, 각각의 바코딩된 pMHC 구축물은 뉴트라비딘 스캐폴드에 부착된 4개의 동일한 pMHC 단량체를 포함한다. 일부 측면에서, 각각의 바코딩된 pMHC 구축물은 덱스트란 스캐폴드에 부착된 5개의 동일한 pMHC 단량체를 포함한다.
일부 측면에서, T 림프구를 포함하는 샘플은 말초 혈액, 제대혈, 조직 생검물 또는 액체 생검물이다. 일부 측면에서, 5' 불변 영역은 서열식별번호(SEQ ID NO): 1에 제시된 바와 같은 핵산 서열 (ACCTTAAGAGCCCACGGTTCC)을 포함한다. 일부 측면에서, 3' 불변 영역은 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 핵산 서열 (AAAGAATATACCC)을 포함한다.
본 개시내용은 또한 본원에 개시된 방법 중 어느 하나에 의해 식별되는 T-세포 에피토프를 제공한다. 본원에 개시된 방법 중 어느 것에 의해 식별되는 T 세포의 트랜스크립톰이 또한 제공된다.
본 개시내용은 또한 스캐폴드 분자에 공유 또는 비-공유 부착된 적어도 하나의 pMHC 펩티드 및 스캐폴드에 공유 또는 비-공유 부착된 적어도 하나의 바코드를 포함하는 DNA 바코딩된 pMHC 구축물을 제공한다. 일부 측면에서, 스캐폴드 분자는 뉴트라비딘 또는 덱스트란이다. 일부 측면에서, DNA 바코드는 서열식별번호: 3을 포함한다.
본 개시내용에 따른 DNA 바코딩된 pMHC 구축물의 제조 방법으로서, (1) 4 또는 5개의 pMHC 펩티드를 스캐폴드에 부착시키며, 여기서 스캐폴드는 덱스트란 또는 뉴트라비딘인 단계; 및 (2) 적어도 하나의 DNA 바코드를 스캐폴드에 부착시키며, 여기서 DNA 바코드는 서열식별번호: 3을 포함하는 것인 단계를 포함하는 방법이 또한 제공된다.
도 1은 두 가지 대안적인 DNA 바코드 표지화 전략을 제시한다. pMHC를 포함하는 이러한 DNA-바코딩된 구축물은 단일 세포 서열분석 프로토콜 동안 항원-특이적 T 세포를 식별하는데 사용될 수 있다. 한 가지 전략에서, DNA-바코딩된 pMHC 구축물은 뉴트라비딘 스캐폴드를 포함하는 pMHC 사량체 구축물이다. 대안적인 전략에서, DNA-바코딩된 pMHC 구축물은 덱스트란 스캐폴드를 포함하는 pMHC 다량체 구축물 (예를 들어, 오량체)이다.
도 2는 각각의 DNA 바코드가 고유 pMHC 다량체에 상응하도록 되어 있는 pMHC 다량체의 DNA-바코딩된 라이브러리를 생성하기 위한 전략을 제시한다.
도 3은 T-세포, DNA-바코딩된 pMHC 구축물 (특히, 뉴트라비딘 복합체), 및 트랜스크립톰 분석의 일부로서 증폭될 각각의 유전자에 상응하는 일련의 프라이머를 함유하고 있을 트랜스크립톰 분석용 서열분석 프라이머 비드를 포함하는 서열분석용 액적을 제시하는 개략적 표시이다.
본 개시내용은 단일 세포 수준에서의 동시적 항원-특이적 T 세포의 검출 및 그의 트랜스크립톰의 측정을 가능하게 하는 방법을 제공한다. 개시된 방법은 스캐폴드에 부착된 여러 pMHC 단량체, 뿐만 아니라 DNA 바코드를 포함하는 스캐폴드를 포함하는 펩티드-주요 조직적합성 복합체 (pMHC) 구축물을 사용한다. 각각의 고유 바코드는 고유 pMHC와 일대일 대응으로 관련된다.
단일 세포 서열분석을 특이적 단일-가닥 DNA로 바코딩된 pMHC와 조합하는 것에 의해, 이러한 방법은 세포 표면 상의 특이적 T-세포 수용체의 신속한 동시적 식별 및 정량화 및 T 림프구의 트랜스크립톰 특징화를 가능하게 한다. 이러한 방법은, 예를 들어, 펩티드 특이성의 스크리닝, 단일 세포 수준에서의 다양한 항원-특이적 T 세포의 동시적 트랜스크립톰 특징화, T-세포 수용체 (TCR) 서열분석으로부터의 결과 평가, 진단 시험, 면역 요법의 효능 예측, 또는 백신접종 또는 면역 요법 후의 면역 반응 측정에 사용될 수 있다.
게다가, 본원에 개시된 방법은 또한 리간드에 대한 그의 친화성을 기반으로 하여 희귀한 세포 유형을 식별하고 특징화하는데 사용될 수 있다.
이에 따라, 본 개시내용은 T-세포를 포함하는 샘플에서의 단일 세포 해상도로의 동시적 T-세포 에피토프 맵핑 및/또는 트랜스크립톰 특징화 방법으로서, (a) 고유 바코드를 사용하여 각각의 고유 펩티드-주요 조직적합성 복합체 (pMHC)를 표지화하며, 그에 의해 바코딩된 pMHC 구축물의 집단을 산출하는 단계; (b) T-세포를 포함하는 샘플을 바코딩된 pMHC 구축물의 집단과 접촉시키며, 여기서 적어도 1종의 T-세포 상의 T 세포 수용체가 바코딩된 pMHC 구축물 중 적어도 1종 ("T 세포 수용체 에피토프")에 결합하는 단계; 및 (c) 단일 세포 서열분석을 사용하여 T-세포를 서열분석하는 단계를 포함하며, 여기서 단일 세포 서열분석은 각각의 T-세포에서의 T-세포 수용체 에피토프 및 트랜스크립톰 유전자를 동시에 식별하는 것인 방법을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, "고유"라는 용어는 DNA 바코드와 바코드에 접합되는 pMHC 사이의 일대일 대응 관계, 또는 바코드를 포함하는 구축물을 지칭한다. 따라서, 고유라는 용어는 특정 DNA 바코드가 특정 pMHC에, 그리고 그 특정 pMHC에만 상응한다는 것, 및 특정 pMHC가 특정 DNA 바코드, 그리고 그 특정 DNA 바코드에만 상응한다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "단일 세포 해상도로" 또는 "단일 세포 수준에서"라는 용어는 샘플이 T 세포의 집단을 포함하고 있지만, 각각의 단일 세포 서열분석 반응에서 수득되는 T 에피토프 맵핑 데이터와 트랜스크립톰 데이터의 각각의 세트가 단일 세포에 상응한다는 것을 의미한다.
일부 측면에서, 단일 세포 서열분석은 액적-기반 단일 세포 서열분석이다. 그러나, 또 다른 구획 (예를 들어, 비드, 어레이 웰 등)에서의 단일 세포의 서열분석을 가능하게 하는 다른 서열분석 방법이 또한 본원에 개시된 방법을 실시하는데 사용될 수 있다. 본원에 개시된 방법은 또한 단일 세포를 서열분석하는 것은 아니나 수많은 세포의 다중화된 서열분석을 가능하게 하며 각각의 세포가 고유하게 식별되는 (예를 들어, 바코딩에 의함) 서열분석 방법을 사용하여 실시될 수 있다.
일부 측면에서, 서열분석의 각각의 액적은 (i) (b)에서 적어도 1종의 바코딩된 pMHC 구축물에 의해 표지화된 T-세포; 및 (ii) 트랜스크립톰 측정을 위한 프라이머를 포함하는 프라이머 비드를 포함한다. 상기에 논의된 바와 같이, 서열분석 반응은, 예를 들어, 어레이 웰, 미세유체 시스템의 모세관 또는 구획, 비드, 리포솜 등으로 반응물이 제한되는 대안적인 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 게다가, 트랜스크립톰 측정을 위한 프라이머는 대안적인 스캐폴드 또는 컨테이너, 예를 들어, 덴드리머, 선형 또는 분지형 중합체, 웰, 액적 등에 결합되어 있을 수 있다.
일부 측면에서, 각각의 바코드는 단일 가닥 핵산이다. 본 개시내용의 다른 측면에서, 핵산은, 예를 들어, 이중 가닥 또는 분지형일 수 있다. 일부 측면에서, 핵산, 예를 들어, 단일 가닥 핵산은 DNA 또는 RNA이다. 일부 측면에서, 핵산은, 예를 들어, 비-자연 핵염기 (예를 들어, LNA) 및/또는 비-자연 백본 연결 (예를 들어, 포스포로티오에이트)을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 바코드는 범용 염기를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 각각의 바코드는 고유 샘플 식별 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 샘플 식별 서열은 해밍 코드를 기반으로 하여 설계된다. 일부 측면에서, 대안적인 코드가 샘플 식별 서열에 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 코드는 오류-보정 코드, 예를 들어, 해시 함수를 포함하는 코드이다. 일부 측면에서, 해시 함수는, 예를 들어, 반복 코드, 패리티 비트 또는 체크섬이다.
일부 측면에서, 샘플 식별 영역은 적어도 10 bp, 적어도 11 bp, 적어도 12 bp, 적어도 13 bp, 적어도 14 bp, 적어도 15 bp, 적어도 16 bp, 적어도 17 bp, 적어도 18 bp, 적어도 19 bp, 적어도 20 bp, 적어도 21 bp, 적어도 22 bp, 적어도 23 bp, 적어도 24 bp, 적어도 25 bp, 적어도 26 bp, 적어도 27 bp, 적어도 28 bp, 적어도 29 bp 또는 적어도 30 bp 길이이다. 일부 측면에서, 샘플 식별 영역은 10 bp 내지 30 bp, 11 bp 내지 29 bp, 12 bp 내지 28 bp, 13 내지 27 bp, 14 bp 내지 26 bp, 15 bp 내지 25 bp, 16 bp 내지 24 bp, 17 bp 내지 23 bp, 또는 18 bp 내지 22 bp이다.
일부 측면에서, 샘플 식별 영역은 2개의 불변 영역 (5' 불변 영역 및 3' 불변 영역)에 의해 플랭킹된다. 일부 측면에서, 5' 불변 영역은 PCR 증폭 및 인덱스 프라이머에의 어닐링에 사용된다. 일부 측면에서, 3' 불변 영역은 단일 세포 서열분석 플랫폼, 예를 들어, 액적 기반 단일 세포 서열분석 플랫폼에서 주형-스위치 올리고에 어닐링된다. 일부 측면에서, 플랭킹 불변 영역이 전위되는데, 다시 말하자면 3' 불변 영역이 PCR 증폭 및 인덱스 프라이머에의 어닐링에 사용되며, 5' 불변 영역이 단일 세포 서열분석 플랫폼, 예를 들어, 액적 기반 단일 세포 서열분석 플랫폼에서 주형-스위치 올리고에 어닐링된다.
일부 측면에서, 인덱스 프라이머는 고유 분자 인덱스 (UMI)를 포함한다. 고유 분자 식별자 (UMI)는 일부 차세대 서열분석 프로토콜에서 각각의 리드에 첨가되는 짧은 서열 또는 "바코드"이다. 이들은 검출을 위한 충분한 리드를 얻는데 필요한 cDNA 증폭에 의해 도입되는 양적 바이어스를 감소시키는 역할을 한다. 일부 구체적 측면에서, UMI는 일루미나 i7 UMI를 포함한다.
일부 측면에서, 주형-스위치 올리고는 10X 세포 바코드 또는 Drop-Seq 세포 바코드를 포함한다. 주형-스위칭 폴리머라제 연쇄 반응 (TS-PCR)은 폴리아데닐화 부위의 자연 PCR 프라이머 서열에 의존하며 뮤린 백혈병 바이러스 리버스 트랜스크립타제의 활성을 통하여 제2의 프라이머를 첨가하는 역전사 및 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 증폭 방법이다. 예를 들어, Drop-Seq에서는, 시린지 펌프를 사용하여 단리된 세포 및 고유하게 바코딩된 비드를 안정한 속도로 전달하는 것에 의해, 용해 완충제의 액적 중에 개별 세포 및 비드를 함께 단리하는 것이 가능한데, 이 경우 폴리아데닐화 부위는 고유 식별 서열을 함유하는 비드-특이적 프라이머에 결합한다. 이와 같은 프라이머는 또한 식별자의 상류에 공통 서열을 함유함으로써, 역전사에 의해 그것이 연장된 후, 이어지는 PCR 라운드는 서열분석되는 각각의 단리된 cDNA가 다시 특이적인 기원 비드로 추적되는 것을 가능하게 하는 태그를 도입하게 된다. 이는 많은 개별 세포에서의 전사체의 상대적인 농도가 동시에 분석됨으로써, 예를 들어, 특정한 세포 유형으로의 해당 세포의 분류를 위한 합리적인 근거를 창출하는 것을 가능하게 한다.
일부 측면에서, 각각의 바코딩된 pMHC 구축물은 스캐폴드를 포함한다. 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 본원에 개시된 스캐폴드 이외에도 청구 발명을 실시하는데 사용될 수 있는 관련 기술분야에 알려져 있는 수많은 스캐폴드 분자가 존재한다는 것을 이해하고 있을 것이다 (예를 들어, 덱스트란 대신 다른 중합체가 사용될 수도 있음).
일부 구체적 측면에서, 스캐폴드는 뉴트라비딘을 포함한다. 뉴트라비딘 단백질은 대략 60,000 달톤의 질량을 갖는 아비딘의 탈글리코실화 버전이다. 탄수화물 제거의 결과로서, 렉틴 결합이 검출불가능한 수준까지 감소되지만, 여전히 비오틴 결합 친화성은 유지되는데, 이와 같은 활성에는 탄수화물이 필요하지 않기 때문이다. 아비딘은 높은 pI를 가지지만, 뉴트라비딘은 중성에-가까운 pI (pH 6.3)를 가짐으로써, 음으로-하전된 세포 표면 또는 DNA/RNA와의 비-특이적인 상호작용을 최소화한다. 뉴트라비딘은 유도체화 또는 접합에 가용하게 유지되는 리신 잔기는 계속 보유하고 있다. 아비딘 자체와 마찬가지로, 뉴트라비딘은 비오틴에 대하여 강한 친화성을 갖는 (Kd = 10-15 M) 사량체이다.
일부 구체적 측면에서, 스캐폴드는 덱스트란을 포함한다. 덱스트란은 복잡한 분지형 글루칸 (글루코스의 축합으로부터 유래하는 폴리사카라이드)이다. IUPAC은 "주로 C-1 → C-6인 글리코시드 결합을 갖는 미생물 기원의 분지형 폴리-α-d-글루코시드"로 덱스트란을 정의하고 있다.[1] 덱스트란 쇄는 가변적인 길이 (3 내지 2000 킬로달톤)를 갖는다. 중합체 주쇄는 α-1,3 연결 유래의 분지를 동반하는 글루코스 단량체 사이의 α-1,6 글리코시드 연결로 구성된다.
일부 측면에서, 각각의 바코딩된 pMHC 구축물은 뉴트라비딘 스캐폴드에 부착된 4개의 동일한 pMHC 단량체를 포함한다. 다른 측면에서, 바코딩된 pMHC는 뉴트라비딘 스캐폴드에 부착된 1, 2, 3, 4개의 pMHC 단량체를 포함한다.
일부 측면에서, 각각의 바코딩된 pMHC 구축물은 덱스트란 스캐폴드에 부착된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 pMHC 단량체를 포함한다. 일부 측면에서, 각각의 바코딩된 pMHC 구축물은 덱스트란 스캐폴드에 부착된 5개의 동일한 pMHC 단량체를 포함한다.
일부 측면에서, T 림프구를 포함하는 샘플은, 예를 들어, 말초 혈액 샘플, 제대혈 샘플, 조직 생검물 샘플, 액체 생검물 샘플 또는 이들의 조합이다. 일부 측면에서, 샘플은 정제되거나 또는 부분적으로 정제된 T 림프구를 포함한다. 일부 측면에서, 샘플은 풀링된 샘플이다. 일부 측면에서, 풀링된 샘플은 동일 개체 유래의 다중 샘플을 포함한다. 일부 측면에서, 풀링된 샘플은 다수의 개체로부터의 다중 샘플을 포함한다. 일부 측면에서, 다수의 개체로부터 풀링되는 모든 샘플은 동일 유형의 샘플이다.
일부 측면에서, 샘플 또는 샘플들은 인간 대상체로부터 수득된다. 다른 측면에서, 샘플 또는 샘플들은 동물로부터 수득된다. 일부 측면에서, 샘플 또는 샘플들은 동물 모델, 예를 들어, 마우스, 래트 또는 비-인간 영장류로부터 수득된다. 일부 측면에서, 샘플 또는 샘플들은 세포주로부터 수득된다.
일부 측면에서, PCR 증폭 및 인덱스 프라이머에의 어닐링에 사용되는 5' 불변 영역 서열은 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 핵산 서열 (ACCTTAAGAGCCCACGGTTCC)을 포함한다. 일부 측면에서, 단일 세포 서열분석 플랫폼에서 주형-스위치 올리고에 어닐링되는 3' 불변 영역 서열은 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 핵산 서열 (AAAGAATATACCC)을 포함한다.
본 개시내용에서는 또한 본원에 개시된 방법 중 어느 것에 의해 식별되는 T 세포 에피토프를 제공한다. 본원에 개시된 방법 중 어느 것에 의해 식별되는 T 세포의 트랜스크립톰이 또한 제공된다.
본 개시내용의 일부 측면에서, T 세포 에피토프의 식별은 정성적일 수 있다. 다른 측면에서, T 세포 에피토프의 식별은 정량적일 수 있다. 일부 측면에서, 트랜스크립톰 분석에서 식별되는 유전자는 정성적으로 결정된다. 일부 측면에서, 트랜스크립톰 분석에서 식별되는 유전자는 정량적으로 결정된다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 방법을 적용할 때 수득되는 T 세포 에피토프 데이터 및/또는 트랜스크립톰 데이터는 바이오마커로서 사용될 수 있다. 바이오마커의 존재 또는 부재, 1종 이상 임계치와 관련된 그의 양, 1종 이상의 조절과 관련된 그의 증가 또는 감소, 또는 이들의 조합은, 예를 들어, 하기에 사용될 수 있다:
(i) 대상체의 집단을 계층화하는 것,
(ii) 대상체의 예후를 결정하는 것,
(iii) 특정 치료제를 사용하여 대상체를 치료하는 것,
(iv) 특정 치료제를 사용한 대상체의 치료를 중단하는 것,
(v) 특정 치료제를 사용한 대상체에서의 치료를 변형시키는 것,
(vi) 치료제 또는 그의 부재에 대한 대상체의 반응을 결정하는 것,
(vii) 치료제를 사용한 치료를 위한 환자를 선택하는 것,
(viii) 치료제의 효능을 결정하는 것,
(ix) 치료제를 스크리닝하여 질환 또는 이상을 치료하는 그의 효능을 결정하는 것, 또는
(x) 이들의 임의의 조합.
본 개시내용은 또한 상기에 개시된 방법을 실시하는데 사용될 수 있는 바코딩된 펩티드 구축물을 제공한다. 이러한 바코딩된 펩티드 구축물은 (a) 스캐폴드 (예를 들어, 뉴트라비딘 또는 덱스트란 스캐폴드), (b) 스캐폴드에 공유 또는 비-공유 부착된 펩티드 (예를 들어, pMHC)의 집단, 및 (c) 스캐폴드에 공유 또는 비-공유 부착된 적어도 1종의 핵산 바코드 (예를 들어, DNA 바코드)를 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 바코딩된 펩티드 구축물은 적어도 하나의 pMHC, 및 적어도 하나의 샘플 식별 서열 및 적어도 하나의 PCR 증폭 프라이머를 포함하는 적어도 하나의 DNA 바코드를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 바코딩된 펩티드 구축물은 pMHC가 아닌 다른 펩티드, 예를 들어, TCR이 아닌 T 림프구 표면 수용체에 결합하는 비-pMHC 펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 일부 측면에서, 본 개시내용의 바코딩된 펩티드 구축물은 T 림프구가 아닌 다른 림프구, 또는 심지어는 림프구가 아닌 세포를 표적으로 할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 바코딩된 펩티드 구축물은 일반적으로 수용체에 결합하는 펩티드 또는 특정 세포 표면 상의 수용체를 포함하는 바코딩된 라이브러리를 생성하는데 사용될 수 있으며, 여기서 세포 표면 상의 특정 수용체 분자에 대한 특정 바코딩된 펩티드 구축물의 결합은 특정 유형 수용체의 존재를 식별하는데, 또는 특정 리간드 또는 리간드 변이에 대한 수용체의 특이성을 식별하거나 또는 특징화하는데 사용될 수 있다. 상기에 개시된 바와 같이, 본 개시내용의 바코딩된 펩티드 구축물을 사용한 특정 표면 수용체의 식별 및 특징화는 정량적이고/거나 정성적일 수 있다.
본 개시내용은 본원에 개시된 바코딩된 펩티드 구축물의 제조 방법을 또한 제공한다. 일부 측면에서, 제조 방법은 스캐폴드 분자 (예를 들어, 뉴트라비딘)에 적어도 하나의 펩티드 (예를 들어, pMHC)를 공유 또는 비-공유 부착시키는 것, 및 스캐폴드에 적어도 하나의 바코드 (예를 들어, 본원에 개시된 DNA 바코드)를 공유 또는 비-공유 부착시키는 것을 포함한다.
구체적 측면에서, 제조 방법은 뉴트라비딘 스캐폴드에 서열식별번호: 3의 DNA 바코드를 공유 부착시키는 것, 및 뉴트라비딘 스캐폴드에 4개의 동일한 pMHC 단량체를 비-공유 부착시키는 것을 포함한다.
또 다른 구체적 측면에서, 제조 방법은 덱스트란 스캐폴드에 서열식별번호: 3의 DNA 바코드를 비-공유 부착시키는 것, 및 덱스트란 스캐폴드에 5개의 동일한 pMHC 단량체를 비-공유 부착시키는 것을 포함한다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 추가적인 제한으로 해석되어서는 안된다. 본 출원 전체에 걸쳐 언급되는 모든 도면 및 모든 참고문헌, 특허 및 공개 특허 출원의 내용은 명시적으로 본원에 참조로 포함된다.
실시예 1
DNA 바코드 및 뉴트라비딘 또는 덱스트란 접합체의 생성
본원에 개시된 방법은 액적-기반 서열분석 방법론을 사용한 단일 세포 수준에서의 동시적 항원-특이적 T 림프구 식별 및 그의 트랜스크립톰 특징화를 가능하게 하는 특정 DNA 바코드를 사용한다.
상기 DNA 바코드는 5' 비오틴 태그 또는 5' 티올 변형인자 중 어느 하나를 가지도록 합성되어, 각각 스트렙타비딘-덱스트란 또는 뉴트라비딘의 표면에 부착될 수 있다 (도 1). 스트렙타비딘-덱스트란과의 접합에 있어서, 적정량의 5' 수식된 DNA 바코드는 추정 덱스트란 백본당 하나의 DNA 바코드를 가능하게 한다. DNA 바코드는 하기 2개의 불변 영역과 플랭킹되는, 해밍 코드를 기반으로 설계된 12 bp 샘플 식별 서열로 구성된다:
5'ACCTTAAGAGCCCACGGTTCC 3' (서열식별번호: 1) (DNA 바코드의 5' 말단, PCR 증폭 및 일루미나 i7 인덱스 프라이머에의 어닐링에 사용됨).
5'AAAGAATATACCC 3' (서열식별번호: 2) (DNA 바코드의 3' 말단, 10X 단일 세포 또는 다른 액적 기반 단일 세포 플랫폼에서 주형-스위치 올리고에의 어닐링에 사용됨).
바코드의 중앙 12개 뉴클레오티드 ("nnnnnnnnnnnn"으로 표시됨)는 각각의 에피토프에 대하여 특이적인 사량체 DNA 바코드를 나타낸다. 이와 같은 서열은 서열분석 후 리드를 디컨볼루션하는데 사용될 수 있다. 다중 에피토프 식별의 경우, 풀링될 수 있는 각각의 해당 에피토프에 대하여 특정 바코드를 설계함으로써, 단일 세포 현탁액을 사용한 인큐베이션 동안의 다중화를 가능하게 할 수 있다. 이에 따라, 완전한 DNA 바코드는 하기가 되게 된다:
5'-비오틴/5'-티올-ACCTTAAGAGCCCACGGTTCCnnnnnnnnnnnnAAAGAATATACCC-3' (서열식별번호: 3).
실시예 2
DNA- 바코딩된 pMHC 다량체의 라이브러리의 구축
화학적으로 합성되거나 또는 상업적으로 입수가능한 펩티드를 사용하여 문헌 [Garboczi et al. (1992) PNAS, 3429-3433]에 기재된 바와 같이 비오티닐화된 MHC/펩티드 복합체를 합성한다. 4 또는 5개의 비오티닐화된 pMHC 단량체를 DNA 바코딩된-덱스트란 또는 DNA 바코딩된-뉴트라비딘 상의 비점유 SA-결합 부위에 접합시킨다. 각각의 DNA 바코드가 서로 다른 pMHC 다량체를 코딩하도록 되어 있는 DNA-바코딩된 pMHC 다량체 ("pMHC 구축물")를 풀링한다. 도 2에 과정을 개략적으로 기재하고 있다.
pMHC 사량체에 대하여 스트렙타비딘보다는 DNA 바코드 표지화된-뉴트라비딘을 코어로서 사용하는 전략은 공지의 비오틴-결합 단백질 중에서도 최소의 비특이적 결합이라는 장점을 제공한다.
최종 라이브러리는 그 각각의 것이 고유 DNA 바코드에 의해 코딩되어 있는 서로 다른 pMHC-다량체 ("pMHC 구축물")로 구성된다. 이와 같은 접근법에서, DNA 바코드는 특정한 pMHC 다량체에 대하여 특이적인 T 림프구를 식별하기 위한 표지로 이용된다. 각각의 특이적 사량체 리드는 세포 표면 상에서의 특정 에피토프의 발현을 표시하게 된다.
실시예 3
DNA로 바코딩된 pMHC 다량체를 사용한 항원-특이적 T 세포의 염색
DNA로 바코딩된 pMHC 다량체를 사용한 항원-특이적 T 세포의 염색은 액적 기반 서열분석 기술을 사용한 항원-특이적 T 세포의 동시적 검출 및 특징화를 위한 것이다.
말초 혈액, 제대혈, 조직 생검물, 액체 생검물, 또는 T 림프구로 구성되는 임의의 다른 세포로부터 유래하는 단일 세포 현탁액을 수집하고, 포스페이트 완충 염수 중에서 2회 세척할 수 있다. 이후, 빙냉 차단 완충제 (2% BSA, 0.01% 트윈-20 또는 또 다른 저이온성 시약, 및 10% FBS)를 사용하여 세포를 세척한다. 상업적으로 입수가능한 Fc 수용체 차단 완충제를 사용하여 얼음 상에서 10분 동안 세포를 인큐베이션함으로써, 비-특이적 상호작용을 차단한다. 차단 후, DNA 바코드에 의해 코딩되어 있는 pMHC 다량체 라이브러리를 사용하여 얼음 상에서 30-분 동안 그를 인큐베이션하는 것에 의해, 세포를 염색한다.
염색 후, 빙냉 차단 완충제 중에서 5회 세포를 세척하는 것에 의해, T 세포 수용체와 MHC 다량체, 뿐만 아니라 자유-부유 MHC 다량체 사이의 비-특이적인 상호작용을 제거한다. 적절한 수의 세포를 포스페이트 완충제 염수 중에 재현탁하여, 10X 유전체학 단일 세포 플랫폼 또는 다른 액적-기반 시스템에 로딩한다. 오일 액적 중에 봉입되어 있는 각각의 세포를 코딩하는 고유 세포 바코드의 첨가를 동반하여, cDNA를 합성한다.
cDNA 합성 후, 10X 프라이머, 또는 맞춤 액적-기반 서열분석의 경우 맞춤 프라이머를 사용하여 산물을 증폭시킨다. pMHC 다량체와 연결된 바코드의 충분한 증폭을 보장하기 위하여, 맞춤 프라이머 (ACCTTAAGAGCCCACGGTTCC)를 또한 첨가한다. 유전자 발현 cDNA 라이브러리 및 pMHC 다량체 DNA 바코드 라이브러리 둘 다를 증폭시키고, 차세대 서열분석 기술을 사용한 서열분석용으로 인덱싱한다.
서열분석된 리드는 fastq 파일을 수득하기 위하여 역다중화될 것이다. 그로부터 하기의 특색이 추출될 것이다:
1. 10X 또는 Dropseq 세포 바코드 - 리드가 유래한 세포를 식별하는데 사용됨.
2. 고유 분자 인덱스 (UMI) - PCR 증폭으로부터 유래하는 리드를 식별하기 위한 것.
3. 서열분석 리드 - 유전자로부터 유래하는 리드.
4. pMHC-다량체로부터의 DNA 바코드 - pMHC 다량체로부터의 리드를 식별하기 위한 것.
fastq 파일로부터 추출되는 정보는 행이 pMHC 다량체와 연결된 유전자 또는 바코드에 상응하는 행렬을 구축하는데 사용된다. 이러한 행렬 내의 열은 세포 바코드에 상응한다. 여기에서 제시되는 전략은 항원의 대형 풀을 스크리닝하는 것 뿐만 아니라, T 림프구 표면 상의 수용체를 식별하고, 항원-특이적 T 림프구를 식별하며, 단일 세포 수준에서 그의 트랜스크립톰을 연구하는 것을 가능하게 한다.
개요 및 요약 부문이 아닌 상세한 설명 부문은 청구범위를 해석하는데 사용하고자 한 것임을 알아야 한다. 개요 및 요약 부문은 발명자(들)가 생각하는 바와 같은 본 발명의 전체가 아닌 하나 이상의 대표적인 실시양태를 제시하는 것일 수 있으며, 그에 따라 어떠한 방식으로도 본 발명 및 첨부된 청구범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
상기에서는, 구체적인 기능의 실시 및 그들의 관계를 예시하는 기능적인 빌딩 블록의 도움으로 본 발명을 기재하였다. 본원에서, 이러한 기능적 빌딩 블록의 경계는 설명상의 편의를 위하여 임의로 한정되어 있다. 구체적인 기능 및 그들의 관계가 적절하게 수행되는 한, 대안적인 경계가 한정될 수 있다.
구체적인 실시양태에 대한 전기한 상세한 설명은 관련 기술분야의 기술에 속하는 지식을 적용하는 것에 의해, 본 발명의 일반적인 개념에서 벗어나지 않고도 과도한 실험 없이, 해당하는 구체적인 실시양태를 다양한 적용분야용으로 용이하게 변형시키고/거나 적합화할 수 있다는 본 발명의 일반적인 특성을 전적으로 완전히 밝힐 것이다. 따라서, 그와 같은 적합화 및 변형은 본원에서 제시된 교시 및 지침을 바탕으로 개시된 실시양태에 대한 등가물의 의미 및 범위 내에 속하는 것으로 하고자 한다. 본원의 표현 또는 용어는 제한이 아니라 설명을 목적으로 한다는 것이 이해되어야 하는 바, 그에 따라 본 명세서의 용어 또는 표현은 통상의 기술자에 의해 교시 및 지침에 비추어 해석되어야 한다.
본 발명의 범위 및 범주는 상기한 어떠한 예시적인 실시양태에 의해서도 제한되어서는 안되며, 대신 하기 청구범위 및 그의 등가물에 따라서만 한정되어야 한다.
본 출원의 청구범위는 모 출원 또는 다른 관련 출원의 것들과 상이하다. 따라서, 본 출원인은 본 출원과 관련된 모 출원 또는 임의의 선행 출원에서 이루어진 청구범위 범주의 어떠한 포기도 철회한다. 따라서, 어떠한 그와 같은 이전의 포기, 및 취소되었던 인용 참고문헌도 재고할 필요가 있을 수 있다는 것을 심사관에게 알리는 바이다. 또한, 본 출원에서 이루어진 어떠한 포기도 모 출원으로, 또는 그에 대항하여 해독되어서는 안된다는 것을 또한 심사관에게 상기시키는 바이다.
SEQUENCE LISTING <110> BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY <120> BARCODED PEPTIDE-MHC COMPLEXES AND USES THEREOF <130> 13205-WO-PCT <150> 62/735803 <151> 2018-09-24 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 1 accttaagag cccacggttc c 21 <210> 2 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 2 aaagaatata ccc 13 <210> 3 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (22)..(33) <223> n is a, c, g, or t <400> 3 accttaagag cccacggttc cnnnnnnnnn nnnaaagaat ataccc 46

Claims (28)

  1. T-세포를 포함하는 샘플에서의 단일 세포 해상도로의 동시적 T-세포 에피토프 맵핑 및/또는 트랜스크립톰 특징화 방법으로서:
    (a) 고유 바코드를 사용하여 각각의 고유 펩티드-주요 조직적합성 복합체 (pMHC)를 표지화하며, 그에 의해 바코딩된 pMHC 구축물의 집단을 산출하는 단계;
    (b) T-세포를 포함하는 샘플을 바코딩된 pMHC 구축물의 집단과 접촉시키며, 여기서 적어도 1종의 T-세포 상의 T 세포 수용체가 바코딩된 pMHC 구축물 중 적어도 1종 ("T 세포 수용체 에피토프")에 결합하는 단계; 및
    (c) 단일 세포 서열분석을 사용하여 T-세포를 서열분석하는 단계
    를 포함하며,
    여기서 단일 세포 서열분석은 각각의 T-세포에서의 T-세포 수용체 에피토프 및 트랜스크립톰 유전자를 동시에 식별하는 것인
    방법.
  2. 제1항에 있어서, 단일 세포 서열분석이 액적-기반 단일 세포 서열분석인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 서열분석의 각각의 액적이 하기를 포함하는 방법:
    a) (b)에서 적어도 1종의 바코딩된 pMHC 구축물에 의해 표지화된 T-세포; 및
    b) 트랜스크립톰 측정을 위한 프라이머를 포함하는 프라이머 비드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 바코드가 단일 가닥 핵산인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 단일 가닥 핵산이 DNA인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 바코드가 고유 샘플 식별 서열을 포함하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 샘플 식별 서열이 해밍 코드를 기반으로 하여 설계되는 것인 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 샘플 식별 영역이 적어도 10 bp, 적어도 11 bp, 적어도 12 bp, 적어도 13 bp, 적어도 14 bp, 적어도 15 bp, 적어도 16 bp, 적어도 17 bp, 적어도 18 bp, 적어도 19 bp, 적어도 20 bp, 적어도 21 bp, 적어도 22 bp, 적어도 23 bp, 적어도 24 bp, 적어도 25 bp, 적어도 26 bp, 적어도 27 bp, 적어도 28 bp, 적어도 29 bp 또는 적어도 30 bp 길이인 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 샘플 식별 영역이 2개의 불변 영역 (5' 불변 영역 및 3' 불변 영역)에 의해 플랭킹되는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 5' 불변 영역이 PCR 증폭 및 인덱스 프라이머에의 어닐링에 사용되는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 인덱스 프라이머가 고유 분자 인덱스 (UMI)를 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, UMI가 일루미나 i7 UMI를 포함하는 것인 방법.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 3' 불변 영역이 액적 기반 단일 세포 서열분석 플랫폼에서 주형-스위치 올리고에 어닐링되는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 주형-스위치 올리고가 10X 세포 바코드 또는 Dropseq 세포 바코드를 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 바코딩된 pMHC 구축물이 스캐폴드를 포함하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 스캐폴드가 뉴트라비딘을 포함하는 것인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 스캐폴드가 덱스트란을 포함하는 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 각각의 바코딩된 pMHC 구축물이 뉴트라비딘 스캐폴드에 부착된 4개의 동일한 pMHC 단량체를 포함하는 것인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 각각의 바코딩된 pMHC 구축물이 덱스트란 스캐폴드에 부착된 5개의 동일한 pMHC 단량체를 포함하는 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, T 림프구를 포함하는 샘플이 말초 혈액, 제대혈, 조직 생검물 또는 액체 생검물인 방법.
  21. 제9항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 불변 영역이 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같은 핵산 서열 (ACCTTAAGAGCCCACGGTTCC)을 포함하는 것인 방법.
  22. 제9항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 3' 불변 영역이 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 핵산 서열 (AAAGAATATACCC)을 포함하는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 식별되는 T 세포 에피토프.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 식별되는 T 세포의 트랜스크립톰.
  25. 스캐폴드 분자에 공유 또는 비-공유 부착된 적어도 하나의 pMHC 펩티드 및 스캐폴드에 공유 또는 비-공유 부착된 적어도 하나의 바코드를 포함하는 DNA 바코딩된 pMHC 구축물.
  26. 제25항에 있어서, 스캐폴드 분자가 뉴트라비딘 또는 덱스트란인 DNA 바코딩된 pMHC 구축물.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, DNA 바코드가 서열식별번호: 3을 포함하는 것인 DNA 바코딩된 pMHC 구축물.
  28. 하기 단계를 포함하는, 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 DNA 바코딩된 pMHC 구축물을 제조하는 방법:
    (a) 4 또는 5개의 pMHC 펩티드를 스캐폴드에 부착시키며, 여기서 스캐폴드는 덱스트란 또는 뉴트라비딘인 단계; 및
    (b) 적어도 하나의 DNA 바코드를 스캐폴드에 부착시키며, 여기서 DNA 바코드는 서열식별번호: 3을 포함하는 것인 단계.
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