CN105112503B - 使用微粒和独特探针组筛选结合相互作用的方法 - Google Patents

使用微粒和独特探针组筛选结合相互作用的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及使用多组微粒筛选结合相互作用的方法，其中所述组具有相同的可鉴别特征，并且其中多组中的一组包括微粒亚组，所述亚组呈现至少一种作为生物样品中靶分子结合对象的独特探针。具体来说，本发明提供使用这些多组微粒在供体组织或受体组织中检测组织分型抗原的方法。

Description

使用微粒和独特探针组筛选结合相互作用的方法
本申请是2008年5月1日提交的题为“使用微粒和独特探针组筛选结合相互作用的方法”的国家申请号为200880022471.5(PCT/US2008/062194)的发明专利申请的分案申请。
本申请要求2007年5月3日提交的美国临时专利申请60/915,920的优先权，该专利申请的全文以引用方式并入本文。
发明领域
本发明涉及使用多组微粒筛选结合相互作用的方法，其中所述组具有相同的可鉴别特征并且其中多组中的一组包括微粒亚群，所述亚群呈现至少一种独特的探针，该探针用作生物样品中靶分子的结合对象(partner)。具体来说，本发明提供使用这些多组微粒检测供体组织或受体组织中的组织分型抗原的方法。
发明背景
一种此类组织分型抗原是人白细胞抗原(HLA)。个体可能在怀孕期间或通过输血或之前的器官移植而对HLA抗原敏感。测定对HLA等位基因敏感性的测试涉及组织和器官移植，其中受体中存在抗供体HLA抗原的抗体(供体特异性交叉配血(crossmatch))是高风险移植排斥的前兆。在移植领域中标准的实施方式是测试抗一系列经选择代表人群的HLA抗原的所有可能受体，并检测血清反应性的HLA等位基因的百分比。在这个系列反应性抗体(PRA)中，患者血清抗正常人群中存在的高百分比HLA等位基因的测试反应是高风险移植排斥的前兆。
HLA基因座本质上是高度多态的。如Nomenclature for Factors of the HLASystem 2000(Hum.Immunol.；62(4)：419-68)，2001)中所公开，有124种HLA-A等位基因、258种HLA-B等位基因、74种HLA-C等位基因、221种HLA-DRB1等位基因、19种DRB3等位基因、89种DRB4等位基因、14种DRB5等位基因、19种DQA1等位基因和39种DQB1等位基因，还不断发现新的等位基因。作为这种快速过程的证实，世界卫生组织HLA因子命名委员会(WHOnomenclature Committee for Factors of the HLA System)(www.anthonynolan.com/HIG/)2007年4月的修订本中显示有545种HLA-A等位基因、895种HLA-B等位基因、307种HLA-C等位基因、8种HLA-E等位基因、12种HLA-H等位基因、9种HLA-J等位基因、6种HLA-K等位基因、4种HLA-L等位基因、4种HLA-P等位基因、3种HLA-V等位基因、3种DRA等位基因、494种DRB1等位基因、1种DRB2等位基因、44种DRB3等位基因、13种DRB4等位基因、18种DRB5等位基因、3种DRB6等位基因、2种DRB7等位基因、10种DRB8等位基因、1种DRB9等位基因、34种DQA1等位基因、83种DQB1等位基因、23种DPA1、126种DPB1等位基因、4种DMA等位基因、7种DMB等位基因、12种DOA等位基因和9种DOB等位基因。
所有的HLA-A、-B和-C等位基因都具有类似的序列。对于DRB1、DRB3、DRB4和DRB5序列情况也相同。由于这些相似性，极为通常的情况是当引物对用于实施聚合酶链式反应序列特异性引物(PCR SSP)时，将扩增两种或更多种等位基因，或者在诊断性序列特异性寡核苷酸探针检测(SSO)体系中，两种或多种等位基因将杂交。因此，对于各个等位基因，要具有独特的PCR-SSP或检测-SSO模式，必须使用许多对引物或探针。此外，在HLA分型中诊断杂交SSO探针的使用会被HLA等位基因所具有的高水平的同源性所混淆。因此，许多现有的分型方法(如Bugawan等人，Tissue Antigens 44：137-147(1994)中的那些)缺乏HLA分型和其他应用所需的准确度。
可以使用PCR来鉴定靶DNA模板上的序列。如果发生了扩增，则模板DNA含有与所使用的引物相同的序列。如果扩增没有发生，则模板DNA上的序列与引物序列不同。Newton等人，美国专利5,595,890公开了用于分型的PCR诊断方法，包括使用PCR-SSP的HLA的分子分型。根据这种方法，以多循环PCR的阳性或阴性反应模式为基础来分配未知的等位基因。然而，Newton所公开的方法对于HLA分型的效力有限，这是由于如上所述的HLA中的高度多态性所致。结果，各自具有特定序列的两个引物频繁扩增很多HLA等位基因，从而增加所需的PCR扩增数以分配未知的等位基因。由于类似的原因，在非PCR方法中正确的HLA分型需要多种诊断探针。PCR需要一对引物与DNA模板上要扩增的区域侧面相接。引物退火至所需序列的能力取决于引物的长度和PCR热循环程序中所设置的退火温度。引物越长，则需要越高的退火温度来达到DNA序列的特异性扩增。PCR-SSP使用引物长度和退火温度之间的平衡来达成引物指导的序列扩增的特异性。
在用于HLA分型的PCR-SSP系统的临床应用中，需要使用有限数目的PCR反应来达成尽可能高的分辨率，从而降低引物对所扩增的等位基因数(即，增加引物或探针的特异性)。本发明所关注的是共同拥有的美国专利6,207,379的公开内容(其公开内容以引用方式并入本文)，它教导了诊断PCR引物的用途，其特征在于不连续(缺口)序列用于在HLA分型中获得相关等位基因之间的更大差异。在另一实施方式中，U.S.6,207,379教导了与靶核酸中的不连续序列杂交并通过聚合酶介导的引物延伸扩增该靶的诊断引物用途。尽管U.S.6,207,379方法成功地进行了靶HLA序列更特异地扩增，但仍然需要改良的方法来检测PCR和非PCR方法中的HLA序列。
U.S.6,207,379中所述的PCR发明解决了本领域内的下列需要：改良PCR--SSP--基分子分型方法，从而可增加分型的特异性以便减少每次分型所需要的PCR反应数。然而，本领域内还需要在非PCR方法中探测特定序列的方法。由于基本的热力学原因，探针和模板(包括完全配对的那些)处于杂交和非杂交状态之间的平衡状态中。探针在一个时刻与其靶模板相连，在另一时刻可能不相连。PCR中的聚合酶通过延长(引物延伸)将引物锁定在适当位置而发挥关键的作用。在非PCR方法中，缺乏关键的因子-聚合酶(和随后的延长)，并不必须预期得到靶标短探针的长期稳定的杂交双链。由于这些原因，通常认为杂交探针需要比相应的延伸引物更长以便确保稳定的双链形成。
以引用方式全文并入本文的美国专利公布US 2003-0165925 A1提供了检测HLA核酸和T细胞受体核酸序列的改良方法，从而增加了诊断探针的特异性。这些方法中特异性增加是因为至少一种探针能够识别靶标的两个或更多个区域并且这能够在不增加靶核酸序列的探针的退火温度的条件下如此进行。探针组的特异性增加降低了所检测的等位基因数目，从而增加了该方法的分辨率，并且在较低的成本下达成。
目前，基于DNA的(DNA-based)组织分型方法是昂贵且耗时的，因为这些方法需要检测许多不同的标签以区分不同的SSO探针，如通过流式细胞术或来自照相机或显微镜的目视图像，如生物阵列(Bioarray)。尽管理论上可以制备无限数目的代表不同寡核苷酸探针的独特标记微粒，但是在使用诸如荧光标记的流式细胞术等单个分析期间可以区分和测量的标签数在实际上是有限的。因此，本领域内需要可以在单个分析中使用有限数目的独特标记微粒检测最大量的寡核苷酸探针。
发明内容
本发明提供从有限的微粒组中获得更多数据的方法。当前可用的微粒组具有有限数目的可鉴别特征(如，荧光标签)。使用常规方法一次可以检测的特征数有限。然而，需要筛选的测试分子数则在持续增加。例如，对于基于DNA的组织分型，HLA抗原数目和多态性在日益增加，供体样品的完整HLA筛选需要数百种探针。使用常规方法，完整的初步HLA筛选需要多个分析。本发明的改良方法使得能够使用较少的不同标记的微粒来筛选更多的靶分子，从而测量较少的特征，最终进行较少的分析运行。
本发明的改良方法采用各自具有不同的可鉴别特征的多组微粒。本发明的改良涉及使微粒组上呈现具有相同可鉴别特征的一种或多种不同探针，如各自经相同的荧光标签包埋的一组微粒。因此，该分析可以在检测相同或更少的可鉴别特征时筛选更多的靶分子。例如，可以使用100种不同标记的微粒来筛选多于100种的靶分子；或者，可以使用少于100种的不同标签来筛选100种靶分子。
本发明方法的探针充当生物样品内靶分子的结合对象。探针可以是任何结合对象，包括核酸，如寡核苷酸、引物或与靶分子核酸互补的任何核酸。结合对象还可以是与靶分子抗体结合的抗原，如肽抗原或蛋白；或与肽抗原或蛋白靶分子结合的抗体。此外，所述结合对象可以是结合靶分子蛋白的任何蛋白，如受体和配体或复合的蛋白。结合相互作用是任何蛋白结合对象之间的结合事件或核酸与SSO探针或引物或任何其他互补核酸的杂交。
这些方法优选使用呈现探针的微粒进行，所述探针与生物样品内的靶分子结合，这种结合相互作用会产生可检测的信号。根据本发明的优选方面，所述探针可以是与DNA样品杂交(结合)的序列特异性寡核苷酸(SSO)探针。或者，所述探针可以是与生物样品中的抗体或另一种蛋白结合的肽、抗体或蛋白抗原。
本发明的靶分子可以是生物样品中所关注的任何分子。本发明的方法是筛选靶分子。在一个实施方式中，本发明的方法用于筛选组织分型等位基因。此方法可以使用任何组织分型等位基因进行。整个说明书都描述HLA组织分型等位基因，但这些方法可以使用任何组织分型抗原进行。
本发明提供使用与具有独特可鉴别特征的微粒(如微球或珠子)结合的探针进行组织分型的改良方法。本发明的方法用有限数目的可检测标记的且不同的可鉴别微粒组产生更多的组织分型信息，这通过使用一组或多组具有相同可检测标签的微粒达成，但是其中相同标记的微粒组包括具有不同探针的多个微粒亚组。
例如，一组可以包括均用相同的荧光染料标记的10个微粒亚组，其中所述微粒亚组具有不同的探针固定到其表面。使用这种方法，可以使用有限数目的不同标记的微粒筛选更多种不同的组织分型抗原。
在一个示例性实施方式中，本发明的改良方法可以通过将1000种不同的探针固定在大量珠子(微粒)上而筛选1000种不同的组织分型。所标记的珠子被分为100组以便各组由具有10种独特探针但用相同的荧光染料或荧光染料的独特组合标记的10个亚组珠子构成。因此，许多相同标记的珠子(发射相同信号)将呈现不同的探针。因此，在示例性筛选中，检测了100种不同的荧光信号或信号的组合，但检测了1000种不同的探针。
相反，可以使用许多较少的独特标记来筛选相同数目的靶分子。因此，此方法使得能够筛选许多组织分型抗原等位基因而仅使用更有限数目的标记珠子。此外，本发明的改良方法更有效且需要较少的人力。改良方法需要较少的人力是因为对较高分辨率测试之前进行低分辨率测试的需求较低。
随后，在促进结合相互作用的条件下，如促进抗体/抗原结合的条件或促进核酸杂交的条件，使生物样品接触多组微粒。可以检测生物样品内靶分子之间的结合相互作用，最优选的是通过产生代表结合的信号的信号体系进行并检测表明生物样品对于靶分子是阳性的信号。
尽管本发明方法的实施通过给定数量的独特标记的珠子增加了所分析的独特靶分子的数量，但是该方法对假阴性报告更敏感，这与现有技术方法的相反，在现有技术方法中所有给定的珠子组都是特定靶分子特异性的。例如，在基于DNA的HLA测试中，通常的情况是很少的SSO在DNA样品中具有杂交对象。因此，对于任何给定组的寡核苷酸探针，少至一个亚组的探针会报告与样品呈阳性反应，如果有的话(if at all)。在这种情况下，在给定探针组中的剩余亚组将不报告阳性反应并且所有给定组的微粒所提供的整体信号，以及平均值和中值信号将会很低。因此，存在报告假阴性的可能(即，没有报告真正的阳性反应)。尽管本发明提供筛选更多数量的靶分子的能力，这些假阴性的可能性将在诸如组织移植领域等领域导致破坏性的后果。
根据本发明的另一方面，假阴性的风险通过选择选定比例的产生阳性信号的组用于进一步评定来降低。此步骤称为“过滤步骤”。所选比例是产生最大强度的代表靶分子结合的信号的一些比例。因为此方法排除了一些真阴性比例，所以真阳性的存在可以更可靠地测定。
在一个实施方式中，本发明提供筛选结合相互作用的方法，该方法包括下列步骤：a)制备多组独特可鉴别微粒，其中在一组中的所述微粒具有相同的独特可鉴别特征，并且其中一组或多个组包括两个或多个微粒亚组，所述亚组呈现至少一种独特的探针，该探针用作生物样品中靶分子的结合对象；b)在生物样品中的靶分子与探针结合的条件下使所述多组微粒与生物样品接触；c)通过产生代表靶分子和探针之间结合相互作用的信号来检测生物样品内靶分子与所述微粒上的探针的结合；d)测量代表所述微粒的结合相互作用的信号；e)测定所述独特可鉴别微粒组代表结合相互作用的信号是否大于所选的阈值，该阈值代表所述生物样品中存在一种或多种靶分子；以及e)测定代表结合相互作用的独特可鉴别微粒组的数目。
在一个方面，本发明提供的方法中，在至少一个独特可鉴别微粒组中的至少一个微粒亚组以非1∶1的固定数量比存在。示例性的比率为约1∶2、约1∶3、约1∶4、约1∶5、约2∶3、约3∶4、约4∶5、约7∶8、约8∶9、约1∶10、约1∶25、约1∶50、约1∶100。该比例可以是整数比或非整数比。
在本发明的一个实施方式中，探针为SSO探针，靶分子为核酸，生物样品为样品DNA，结合相互作用为样品DNA中的核酸与SSO探针的杂交。在本发明的一个方面，SSO探针是如下组织分型抗原等位基因特异性的：HLA、HNA、血型、KIL或TCR。所述样品DNA可以自任何来源获得，如得自颊拭子或血液。
在本发明的另一个实施方式中，所述探针是肽或蛋白抗原，靶分子是抗体，结合相互作用是抗体与肽或蛋白抗原的结合。在本发明的一个方面，所述靶分子是对HLA、HNA、血型抗原、TCR或KIL特异性的抗体。
筛选结合相互作用的方法还可以包括下列步骤：选择小于100％的展示最大信号的微粒的比例，所述信号代表一组或多组独特可鉴别微粒的相互作用；测定对于所选比例，所述可独特鉴别微粒组代表结合相互作用的信号是否大于所选的阈值，该阈值代表所述生物样品中存在一种或多种靶分子。
可以这样实施这些方法：其中至少一组独特可鉴别微粒中的至少两个微粒亚组以非约1∶1的固定数值比率存在，并且其中该比率决定了该组微粒的所选比例。示例性的比率为约1∶2、约1∶3、约1∶4、约1∶5、约2∶3、约3∶4、约4∶5、约7∶8、约8∶9、约1∶10、约1∶25、约1∶50、约1∶100。比率可以为整数比或非整数比。
微粒组的所选比例可以为小于50％、小于30％、小于20％或小于10％。在优选的实施方式中，微粒组的所选比例为小于或等于呈现所述珠子组的独特探针的微粒亚组的数目的倒数。
在又一实施方式中，本发明提供基于DNA的组织分型方法，该方法包括下列步骤：a)制备多组独特可鉴别微粒，其中在一组内的所述微粒具有相同的独特可鉴别特征，并且其中一组或多个组包括微粒亚组，所述亚组呈现至少一种经选择与组织分型抗原等位基因杂交的独特的序列特异性寡核苷酸(SSO)；b)在杂交条件下使所述多组微粒与样品DNA接触；c)通过产生代表样品DNA与SSO杂交的信号来检测在样品DNA与所述微粒上的SSO的杂交；d)测量代表样品DNA与所述微粒的SSO杂交的信号；e)检测所述独特可鉴别微粒组是否有代表样品DNA/SSO杂交的信号。
在另一实施方式中，本发明提供基于DNA的组织分型方法，该方法包括下列步骤：a)制备多组独特可鉴别微粒，其中在一组内的所述微粒具有相同的独特可鉴别特征，并且其中所述组包括微粒亚组，所述亚组呈现至少一种经选择与组织分型抗原等位基因杂交的独特的序列特异性寡核苷酸(SSO)；b)在杂交条件下使所述多组微粒与样品DNA接触；c)通过产生代表样品DNA与SSO杂交的信号来检测样品DNA与所述微粒上的SSO的杂交；d)测量代表样品DNA与所述微粒的SSO杂交的信号；e)选择小于100％的显示最大信号的微粒比例，所述信号表示至少一组独特可鉴别微粒的样品DNA/SSO杂交；f)测定所述独特可鉴别探针组代表样品DNA/SSO杂交的信号对于所选比例是否大于所选的阈值，该阈值表示在所述样品中存在一种或多种组织分型抗原等位基因；以及g)测定显示DNA/SSO杂交的可独特鉴别微粒组的数目。
DNA组织分型的方法还包括下列步骤：选择小于100％的显示最大信号的微粒的比例，所述信号表示至少一组独特可鉴别微粒的DNA/SSO杂交；以及测定所述独特可鉴别微粒组代表DNA/SSO杂交的信号对于所选比例是否大于所选的阈值，该阈值表示在生物样品中存在一种或多种组织分型等位基因。
可以进行这些基于DNA的组织分型方法，其中在至少一组独特可鉴别微粒中的至少两个微粒亚组以非约1∶1的固定数值比率存在。示例性的比率为约1∶2、约1∶3、约1∶4、约1∶5、约2∶3、约3∶4、约4∶5、约7∶8、约8∶9、约1∶10、约1∶25、约1∶50、约1∶100。该比率可以为整数比或非整数比。
微粒组的所选比例可以小于50％、小于30％、小于20％或小于10％。在一个优选实施方式中，微粒组的所选比例小于或等于呈现所述微粒组的独特SSO探针的微粒亚组数目的倒数。
在本发明的一个方面中，所述SSO探针是诸如HLA、HNA、血型、KIL或TCR等组织分型抗原等位基因特异性的。所述样品DNA可以得自任何来源，如颊拭子或血液。
本发明的这些方法还可以包括报告阳性杂交信号的步骤。这些方法还可以包括为各可鉴别探针组选择具有最强信号的微粒比例的步骤。
在又一实施方式中，本发明提供基于DNA的组织分型方法，该方法包括下列步骤：a)使呈现独特的序列特异性寡核苷酸(SSO)的大量不同微粒组与样品DNA接触以鉴别由样品DNA编码的组织分型抗原等位基因，其中独特地鉴别所述微粒组，并且测定存在于所述可鉴别微粒组的SSO是否与样品DNA内的等位基因杂交；b)改进包括：制备多组具有相同的独特可鉴别特征的独特可鉴别微粒，其中所述组包括微粒亚组，各亚组呈现至少一种经选择与HLA等位基因杂交的独特的序列特异性寡核苷酸(SSO)；c)在杂交条件下使所述多组微粒与样品DNA接触；d)通过产生代表样品DNA与SSO杂交的信号来检测样品DNA与所述微粒上的SSO的杂交；e)测量代表样品DNA与所述微粒的SSO杂交的信号；f)测定所述独特可鉴别微粒组代表样品DNA/SSO杂交的信号是否大于所选的阈值，该阈值表示在所述样品中存在一种或多种HLA等位基因；以及g)测定显示DNA/SSO杂交的独特可鉴别微粒组的数量。
在又一实施方式中，本发明提供用于实施测量结合相互作用的方法的试剂盒，该试剂盒包括：具有相同独特可鉴别特征的多组独特可鉴别微粒，其中所述组包括微粒亚组，所述亚组呈现至少一种独特探针，该探针与生物样品内的靶分子结合。试剂盒的靶分子可以是HLA等位基因、HLA等位基因、HNA抗原、HNA等位基因、血型抗原、TCR或KIL。在一个方面，试剂盒的探针为SSO或引物。在另一方面，试剂盒的探针为肽或蛋白抗原。
在另一实施方式中，本发明提供用于实施基于DNA的组织分型方法的试剂盒，该试剂盒包括：具有相同独特可鉴别特征的多组独特可鉴别微粒，其中所述组包括微粒亚组，所述亚组呈现至少一种经选择与组织分型抗原等位基因杂交的独特的序列特异性寡核苷酸(SSO)。所述试剂盒的组织分型抗原可以是HLA、HNA、血型抗原、TCR或KIL。
实施方式
本发明涉及用于组织分型移植供体和受体的方法，该方法使用结合至具有独特可鉴别特征的微粒或珠子的探针进行。该方法涉及用具有相同可鉴别特征的一组珠子进行筛选，其中不同探针固定在所述珠子上。这些方法包括基于DNA的和基于蛋白的(protein-based)组织分型。
该方法涉及制备多组珠子，其中各组具有独特可鉴别特征。在优选的实施方式中，独特可鉴别特征是一些多种嵌入的可检测标签(如荧光染料)的组合。在一组内的各个珠子呈现至少一种与组织分型抗原(如样品DNA中的HLA)结合的探针。对于基于DNA的组织分型，所述探针是与样品DNA杂交的序列特异性寡核苷酸(SSO)。对于基于蛋白的组织分型，所述探针是与生物样品内的抗体或另一种蛋白结合的肽或蛋白抗原。
对于基于DNA的组织分型，样品DNA可以自来自移植供体或移植受体的生物样品或组织获得，编码所关注组织分型抗原的基因或含有该组织分型抗原的等位基因或多态性的区域通过PCR来扩增。在诸如中度严格的杂交条件或高度严格的杂交条件等杂交条件下使扩增的样品DNA(或PCR产物)接触所述多组珠子。样品DNA和珠子上SSO探针的杂交产生代表杂交的信号，用本领域内的标准方法来检测和测量该信号，如流式细胞术或显微镜和/或照相机产生的视觉图像。在优选的实施方式中，所述信号由如下方法产生：用诸如藻红蛋白(PE)或异氰酸荧光素(FITC)之类的荧光染料和诸如生物素之类的标签标记样品DNA，其中相应的链霉亲和素与荧光染料结合。也可以将与六聚组氨酸结合的荧光染料与用镍标记的样品DNA组合使用。阳性事件是其中SSO探针与样品DNA杂交的事件。所述信号还可以使用固定的SSP引物产生以用标记的核苷酸检测延长事件。
选择阳性珠子亚组的比例。优选地，所选的比例显示最大的信号，该信号代表靶分子和各独特可鉴别珠子组的探针的特异性结合相互作用，如样品DNA/SSO杂交或抗体/抗原结合。对所选比例的阳性珠子所发射的信号进行统计分析以测定可检测标签所发射的信号强度的平均值或中值(或任何其他统计量，如峰值、修剪均数、修剪峰值等)。阳性珠子亚组的比例优选地通过筛选分析中所用的不同的探针数和不同的标记珠子数来确定。阳性珠子是发射的信号大于所选阈值的那些，其中所述阈值代表样品DNA中存在一种或多种组织分型抗原等位基因。用于分析使用流式细胞术的信号的示例性软件得自Luminex，Inc.(Austin，TX)和BD Biosciences(San Jose，CA)。其他软件的实例包括WinMDI(WindowsMultiple Document Interface for Flow Cytometry)、FCS Express(De Novo Software，Thornhill，ON Canada)、FlowJO(Tree Star，Inc.)。阳性珠子亚组将表明样品DNA或生物样品中可能存在的组织分型抗原的数目。可以使用本领域内的标准分析可检测标签强度的软件来分析数据。
检测阳性珠子(在过滤步骤之后)的所选阈值对于任何单独的探针都是相同的。所选阈值通常通过分析已知的阳性样品组和已知的阴性样品组并鉴别两者之间的差异来确定。然后在该差异内设定阈值。
本发明提供利用在珠子上具有相同可鉴别特征的多种探针来进行基于DNA的组织分型或基于蛋白的组织分型的改良方法。使用固定在珠子上的一个亚组的具有相同可鉴别特征的多种探针使得能够检测来自阳性珠子的更强的信号，因为仅检测一个特征或信号。此外，使用本发明的改良方法检测的信号接近由特异性结合相互作用(如DNA/SSO杂交或抗体/抗原结合)产生的实际信号强度的真实值。信号强度的真实值是使用常规方法测量的值，该常规方法使用各自具有不同可鉴别特征的珠子，这些珠子各自具有不同的荧光标记和独特的SSO探针或肽探针。因此使用改良的方法检测的信号与使用常规方法检测的信号类似。
这种基于DNA的组织分型或基于蛋白的组织分型的改良方法的一个优点是初步组织分型筛选提供很多关于样品DNA或生物样品中不存在的组织分型抗原的信息。然而，由于体系固有的模糊性，关于样品DNA或生物样品中一定存在的抗原的信息可能稍欠精确。降低系统模糊性的方法在下文描述。这种方法不太昂贵，因为其涉及了较少的不同的可鉴别珠子，并且明显缩小了样品DNA或生物样品中的可能的阳性抗原总数。而且，该方法降低了人力成本，因为需要较少的测试循环。此外，该方法由于可以使用较多数目的探针的同时使用较少数量的珠子而使得能够测试更多数目的组织分型抗原基因序列。此外，该改良的方法使得能够在较短的时间内具有较高的分型分辨率，由于组织要尽快移植，因而这是有利的。
分析在一组具有相同可鉴别特征的微粒中的多个微粒亚组会导致假阴性数目增加。具体地，如果DNA样品仅与一组中的少量微粒(如一个微粒亚组)杂交，则杂交产生的信号强度将会很低，可能被认为是阴性事件，即假阴性事件。为解决假阴性问题，选择一个产生阳性信号的所选比例用于进一步评定。这个所选比例将小于所有(100％)的阳性组。优选地，阳性组的所选比例小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％或小于10％的阳性微粒组。所选择的比例可以依据组织分型筛选中所用的SSO探针数和总微粒数而定。此外，该比例可以通过检测信号的减少来选择，即，分析曲线的斜率。
其中相同标记的蛋白能够与多种不同靶标结合的体系的固有模糊性可以通过在不同的微粒组和亚组中探针的适当排列来降低。微粒上SSO或基于蛋白的探针的选择使得能够检测特定的等位基因或特定的抗原。例如可以将一组内的SSO类型或不同组之间的类型设计成容许选择性地消除某些等位基因或选择少数等位基因。这些探针类型可以在一组微粒中具有多拷贝的相同探针或者在不同组微粒中具有多拷贝的相同探针。相同探针的数目和不同探针比率的变化使得能够通过较少的分析产生额外的数据。
本发明具体提供在一组微粒中的探针亚组，其中一组的所述微粒具有相同的可鉴别特征，并且探针数目在不同亚组之间不同。亚组之间的探针比率使得能够进行生物样品内靶分子(如HLA等位基因)存在的复杂分析。单个微粒组内亚组之间探针比率的变化使得能够选择较大比例的阳性事件用于进一步的统计分析，或换句话讲，在过滤步骤中将选择较大比例的事件，而降低假阴性事件的可能。
在另一实施方式中，单个组内亚组之间探针比率的变化可以降低体系内的模糊性，这通过容许根据产生某些信号的微粒的百分比鉴别靶分子来达成。
计算机算法的使用将容许阳性探针类型分析或探针比率变化分析以测定特定组织分型或测定罕见等位基因的存在对常见等位基因的存在。更有效的是使用SSO类型或具有相同可鉴别特征的一组微粒的亚组之间不同比例的SSO，而不是使用各自含有不同SSO和不同可鉴别特征的一组100种微粒来进行复杂分析。
本发明的优选实施方式使用呈现用于基于DNA的组织分型的SSO的微粒。然而，本发明还提供使用呈现用于检测生物样品中的抗体的组织分型抗原的微粒的组织分型方法。改良的发明关于基于DNA的组织分型的优点对于基于蛋白的分析(抗原/抗体反应)也是有利的。例如，珠子亚组可以用HLA＊A＊0201抗原、HLA＊A＊0202抗原和/或HLA＊A＊0203抗原标记以检测生物样品中结合这些抗原的抗体的存在。
本发明的方法可以用任何材料的微粒、微珠、珠子或微球进行，所述材料如：二氧化硅、金、乳胶、聚合物，如聚苯乙烯、聚砜和聚乙基或水凝胶。其他的示例性微粒用染料编码，将寡核苷酸固定在编码的微粒上。用于本发明方法的微粒购自诸如Luminex Inc.，Invitrogen(Carlsbad，CA)、Polysciences Inc.(Warrington，PA)和Bangs Laboratories(Fishers，IN)等来源。
本发明的微粒可以包含可检测标签或其他的鉴别特征。所述微粒可包含单种荧光染料或多种荧光染料。在一个实施方式中，所述微粒用荧光染料进行内部标记并且含有与生物分子共价连接的表面羧基基团。在另一个实施方式中，所述微粒用荧光染料进行内部标记并且含有亲和素表面层以便接近生物素和生物素化配体的共价结合。在另一个实施方式中，所述微粒可以包含不同染料的组合，如荧光和非荧光染料。例如所述微粒可以用E)-5-[2-(甲氧基羰基)乙烯基]胞苷标记，其为一种非荧光分子，在经受紫外线(UV)照射时产生单一产物3-β-D-呋核亚硝脲-2，7-二氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶，显示强的荧光信号。在另一个实施方式中，所述微粒可以包含条形码作为可鉴别特征，如美国专利公布US20070037195中所述。
在另一个实施方式中，所述微粒可以是纳米晶体或量子点。这些纳米晶体是吸收光的光子，然后重新发射不同波长的光子(荧光团)的物质。此外，可以将另外的荧光标签或第二抗体结合至纳米晶体。这些纳米晶体购自诸如Invitrogen和Evident Technologies(Troy，NY)等来源。
微粒的可鉴别特征可以是任何纳米粒子基于DNA的检测方法或任何纳米粒子基于蛋白的检测方法。一个实例是生物条形码，这是一种使用由DNA编码的纳米粒子探针检测蛋白的超敏感方法，所述DNA对生物样品中的蛋白靶标是独特的(Nam等人，Science 301，1884-1886，2003)。纳米粒子基于DNA的检测的实例包括基于巯基烷基寡核苷酸改性的金纳米粒子的比色多核苷酸检测方法(Elghanian等人，Science 277，1078-1080，1997)、依赖于光散射或银染的芯片基检测方法(Taton等人Science 289，1757-1760，2000；Taton等人，.J.Am.Chem.Soc.，123，5164-5165，2001)、用于DNA的电检测方法，其中使用夹心分析将靶DNA捕获在两个电极的间隙中(Park等人，Science 295，1503-1506，2002)和使用同时在多个激光波长询问的化学反应性衍射栅进行的DNA检测(Cao等人，J.Am.Chem.Soc.2003)。
本发明可以用检测可鉴别特征或标签的任何体系来进行，如FLOW。荧光标签的检测也可以使用能读出微粒上图像的显微镜或照相机来进行，如Bioarray BeadChip(Bioarray Solutions，Ltd.，Warren，NJ)。BeadChip形式结合了微粒(“珠子”)化学与半导体晶片工艺，其中使用光学显微镜和照相机记录与微粒的结合。
本发明方法中所用的样品DNA由人移植或输血的供体或人移植或输血的受体的生物样品分离或提取。所述样品DNA可以使用本领域内的任何常规方法制备，如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，cold Springs Harbor Laboratories(NewYork，1989)中所教导的那些。所关注的组织分型基因(如HLA)使用本领域内标准的PCR技术扩增。
生物样品包括全血、血液衍生物、红细胞浓缩物、血浆、血清、新鲜的冷冻血浆、全血衍生的血小板浓缩物、机采血小板、混合血小板、静脉内γ-球蛋白、冷沉淀物、脑脊液、组织和细胞，如上皮细胞(如自口腔收集的那些)、干细胞、白细胞、中性粒细胞和粒细胞。所述生物样品可以自要用于移植的组织或细胞的人供体或要用于输血的血液或血液衍生物的人供体获得。所述生物样品可以自健康的骨髓供体或亲子测试的受试者获得。所述生物样品还可以自是预期的移植或输血受体的人受试者或捐献要用于移植或输血的组织或器官的人受试者获得。或者，所述生物样品可以从要用于在人受体中移植的组织或细胞直接获得。此外，所述生物样品可以自要用于在人受体中输血的血液或血液衍生物获得。
SSO探针
为了实施本发明的方法，将SSO探针结合至荧光标记的珠子。所述SSO探针还可以含有标签，如生物素，链霉亲和素、镍、六聚组氨酸、地高辛(DIG)、DNP，或荧光标签，如FITC、PE、6-TAMRA、CR6G、DEAC、德克萨斯红(Texas Red)、Cy3、Cy3.5、CY5、Cy5.5、Cy7、罗丹明绿(Rhodamine Green)X。如本文所用的术语“核苷酸”是指存在于DNA或RNA中的核苷酸，因此包括含有作为碱基的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶、以及作为脱氧核糖或核糖的糖部分的核苷酸。然而，应了解，本发明所采用的诊断探针中可以使用能够与常规碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和鸟嘧啶之一进行碱基配对的其他经修饰的碱基。此类经修饰的碱基包括：例如，8-氮杂鸟嘌呤和次黄嘌呤。如本文所用的术语“寡核苷酸”是指为200个核苷酸或更少的分子，优选的寡核苷酸为100个核苷酸或更少、50个核苷酸或更少或25个核苷酸或更少。
本文在涉及核苷酸时所用的术语“互补”是指核苷酸与另一特定核苷酸碱基配对。因此腺苷一磷酸与尿苷一磷酸或胸苷一磷酸互补，鸟苷一磷酸与胞苷一磷酸互补。应了解尽管胸苷一磷酸与鸟苷一磷酸在某些情况下可能碱基配对，但它们用于本说明书的目的时不认为是互补的。也应了解尽管胞苷一磷酸与腺苷一磷酸在某些情况下可能碱基配对，但它们用于本说明书的目的时不认为是互补的。对于胞苷一磷酸与尿苷一磷酸也同样适用。
选择用于本文方法的SSO探针“基本上”与待检测的各个特异性序列的不同链互补。这意味着SSO探针必须足以与它们各自的样品DNA链互补杂交。因此，所述SSO探针序列不需要反映样品DNA序列的准确序列。因此，探针序列没有必要与靶样品DNA序列严格互补。因此，并非所有探针都会产生与阴性等位基因的阴性对照类似的完全阴性信号。依据错配数和错配类型(G-T错配有时产生与G-C配对大约相同的信号)，1个碱基对错配的等位基因的荧光信号可能产生实质上高于阴性对照的信号。然而，只要真阳性等位基因的信号显著高于那些可能交叉反应的等位基因(通常高10-20％)，便可以设定阈值或临界值以区分阳性和阴性反应。
通常在探针序列中间可以接受少量的错配，并容许杂交。一般来说，所接受的错配程度取决于SSO探针区域长度，这继而影响去饱和温度和杂交条件所选的退火温度。如果探针的去饱和温度接近或高于退火温度(略不严格)，则尽管有少量(通常1个或2个或最多3个)错配，但探针仍与靶序列连接。探针区域在序列中间可能能够接受更多的错配，但是其这种能力依赖于探针区域的去饱和温度和所选杂交和检测条件的退火温度。
本文所用的术语“严格的”是指本领域内通常理解为严格的条件。杂交严格性主要取决于温度、离子强度、变性剂(如甲酰胺)的浓度。用于杂交和洗涤的严格条件的实例为：65-68℃下0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠；或在42℃下0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50％甲酰胺。参见Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，(Cold Spring Harbor，N.Y.1989)。
还可以使用更严格的条件(如较高的温度、较低的离子强度、较高的甲酰胺、或其他变性剂)，然而，杂交速率会受影响。在其中涉及脱氧寡核苷酸杂交的情况下，另外的示例性严格杂交条件包括在37℃(对于14个寡核苷酸碱基)、48℃(对于17个寡核苷酸碱基)、55℃(对于20个寡核苷酸碱基)和60℃(对于23个寡核苷酸碱基)下在6×SSC 0.05％焦磷酸钠中洗涤。
为了降低非特异性和/或背景杂交的目的，杂交和洗涤缓冲液中可以包括其他试剂。实例为：0.1％牛血清白蛋白、0.1％聚乙烯-吡咯烷酮、0.1％焦磷酸钠、0.1％十二烷基磺酸钠、NaDodSO4、(SDS)、聚蔗糖、邓哈特溶液(Denhardt’s solution)、超声处理的鲑鱼精液DNA(或其他非互补DNA)和硫酸葡聚糖，然而也可以使用其他合适的试剂。在基本上不影响杂交条件的严格性的条件下，可以改变这些添加剂的浓度和类型。杂交实验通常在pH6.8-7.4下进行，然而，在通常的离子强度条件下，杂交速率几乎不依赖于pH值。参见Anderson等人，Nucleic Acid Hybridisation：A Practical Approach，第4章，IRL PressLimited(Oxford，England)。本领域的技术人员可以调节杂交条件以适应这些变量并容许不同序列亲缘性(relatedness)的DNA形成杂交体。
诊断序列特异性寡核苷酸探针检测(SSO)体系是一种使用诊断探针来分析特定靶核酸序列存在的体系或装置。在此类体系或装置中，可以使用本领域内熟知的连接子将诊断探针连接至支撑体，所述连接子包括多碳和多核苷酸连接子。或者，可以将靶序列固定于诸如硝酸纤维素膜等固体支撑体上，并且诊断探针在溶液中。SSO中的诊断探针包括至少一个探针区域。术语“探针区域”是指诊断探针上的与靶核苷酸序列的一部分基本互补的核苷酸序列。
标记可以在固定于珠子上的探针上或者在扩增的样品DNA上。可以使用直接荧光化合物、生物素、FITC或地高辛(Dig)作为标签。对于间接检测来说，可以将结合亲和素/链霉亲和素的荧光或酶(用于生物素)、抗FITC抗体(用于FITC)、抗Dig抗体(用于Dig)用于检测目的。根据一个实施方式，可以使用经羧基基团修饰的乳胶珠子来固定探针。珠子上的羧基基团首先被1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化，然后EDC-活化的羧基与寡核苷酸探针5’末端的氨基反应。也可以实施使用化学物质连接胺与胺、硫化物与胺和其他化学物质的另一些实施例。
组织分型抗原
本发明提供用于人白细胞抗原(HLA)组织分型筛选的方法。HLA在机体内存在于几乎每个细胞的细胞表面，这些抗原在白细胞上是高浓度的。HLA抗原是免疫系统用于识别和区分自我与非自我的主要决定子之一。如2007年4月，世界卫生组织HLA系统因子命名委员会(WHO nomenclature Committee for Factors of the HLA System)(www.anthonynolan.com/HIG/)，有545种HLA-A等位基因、895种HLA-B等位基因、307种HLA-C等位基因、8种HLA-E等位基因、12种HLA-H等位基因、9种HLA-J等位基因、6种HLA-K等位基因、4种HLA-L等位基因、4种HLA-P等位基因、3种HLA-V等位基因、3种DRA等位基因、494种DRB1等位基因、1种DRB2等位基因、44种DRB3等位基因、13种DRB4等位基因、18种DRB5等位基因、3种DRB6等位基因、2种DRB7等位基因、10种DRB8等位基因、1种DRB9等位基因、34种DQA1等位基因、83种DQB1等位基因、23种DPA1、126种DPB1等位基因、4种DMA等位基因、7种DMB等位基因、12种DOA等位基因和9种DOB等位基因。
本发明不限于包括HLA抗原筛选的组织分型方法。本发明的方法可用于筛选用于组织或血液分型的任何抗原。例如，该方法可筛选杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、人中性粒细胞抗原(HNA)、T细胞受体(TCR)以及它们的片段和血型，如ABO、RH因子。
杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)
杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)是在淋巴细胞亚群中发现的一组调节分子的成员。KIR分子参与了降低患有急性髓系白血病(AML)而接受了错配KIR配体的造血性移植的患者复发的风险。KIR配体不相容性定义为在受体中缺乏供体的I类等位基因，已知I类等位基因为抑制性KIR的配体(3DL1、2DL2/3、2DL1和3DL2)。已知供体-对-受体NK细胞同种异体活性能够消除白血病复发和移植排斥，并且还保护患者防止移植体-对-宿主疾病。
KIR cDNA的序列分析显示大多数KIR基因含有可变的位点，而且一些是相当多态的。等位基因多态性提供了额外的多样性，其程度是两种KIR单倍型都相同的不相关个体不可能被观察到。KIR序列的变化可以在编码影响与I类HLA相互作用的残基的位置处发生。变化往往发生在整个基因，而不像在HLA I和II类基因中所观察到的类型，该类型中核苷酸变化主要限制在一个或两个外显子中。KIR分子参与了降低患有急性髓系白血病(AML)而接受了错配KIR配体的造血性移植的患者复发的风险。KIR配体不相容性定义为在受体中缺乏供体的I类等位基因，已知I类等位基因为抑制性KIR的配体(3DL1、2DL2/3、2DL1和3DL2)。所述数据表明供体-对-受体NK细胞同种异体活性能够消除白血病复发和移植排斥，并且还保护患者防止移植体-对-宿主疾病。
KIR基因分型可以是基因座或等位基因特异性的。仅基因座分型检测各基因在给定个体中的存在或不存在，因此提供KIR整体特征(KIR特征)。KIR分型的序列特异性引物PCR(PCR-SSP)方法已经更新至能解决新发现的基因座和先前未检测的等位基因。还开发了PCR序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP)方法。实验室的相互协作有助于鉴别KIR基因座(100)的分子基因分型分析。迄今为止已经发现了100余种不同的KIR基因型特征。
已经描述了用于2DL1、2DL3、3DL1和3DL2(25，55)的中至高分辨率等位基因特异性反应(PCR-SSP)；以及用于基因型2DL4的单链构象多态性(SSCP)分析。需要开发用于2DL5的精密分析以分辨两种高度同源的基因座2DL5A和2DL5B。基于PCR-SSP的反转录酶PCR(RT-PCR)是选择用于同种异型NK细胞克隆的方法，其在很大程度上仍未改变之前所述的方法。为此目的可以使用多种单克隆抗体，但是特异性受KIR同种型之间的高度同源性限制。
血型
目前，有很多血型鉴定体系。输入的红细胞上不熟悉的抗原的存在或供体血浆中抗体的存在可能引起有害的免疫反应，这种免疫反应会袭击供体血细胞，引起供体红细胞破裂。这还可能引起严重的症状，包括肾衰竭和休克。抗原还在其他血液组分上出现，包括白细胞、血小板和血浆蛋白。
目前血型分型体系鉴定的一个实例是ABO体系，其中血液根据红细胞上下列抗原的存在来分型：A抗原(AA，AO)、B抗原(BB或BO)、A和B两种抗原(AB)或A和B均无(O)。红细胞上的其他抗原包括MNS体系(抗原M、N、S和s)、P体系(抗原P1)、Lutheran体系(Lu(a)和Lu(b)、Kell体系(K(Kell)和k(塞拉诺因子(cellano))、和Kpa和Kpb)、Lewis体系(Le a和Leb)、Duffy体系(Fy a和Fy b)和Kidd(JK)体系(Jka和Jkb)。
除了上述所列的那些，血液还使用RH(恒河猴(Rhesus))体系分型。三个基因组成了恒河猴抗原：1号染色体上发现的C、D和E。各基因座上有两种可能的等位基因：c或C；d或D；e或E。一种由c/C、d/D、e/E构成的单体型分别遗传自父母，所得的个体恒河猴类型取决于它们继承的基因型。给定单体型如下的编码：CDe称为R1、cDE称为R2、CDE称为Rz、cDe称为Ro、Cde称为r’、cdE称为R”、CdE称为Ry并且cde称为r。
人中性粒细胞抗原
据显示人中性粒细胞特异性抗原(HNA)的抗体会在输血后引起临床并发症，如肺部输血反应和一些情况下输血相关的急性肺损伤(TRALI)或引起新生儿同种免疫中性白细胞减少(NAIN)(Bux等人.Transfus.Med.2(2)：143-9，1992)。因此，HNA特异性抗原或抗体的检测具有重要的临床应用。
人中性粒细胞抗原还称为中性粒细胞特异性抗原或HNA。目前有5中HNA抗原体系：HNA-1、HNA-2、HNA-3、HNA-4和HNA-5。已鉴别了HNA-1、2、4和5的等位基因并鉴定了相应的糖蛋白；然而，HNA-3的等位基因仍然未知(Stroncek的综述，ASHI Quarterly 2004)。有三种HNA-1抗原(HNA-1a、HNA-1b和HNA-1c)仅在中性粒细胞上表达，并位于低亲和力Fc-γ受体IIIb上。HNA-2体系具有一种已充分确定的抗原(HNA-2a)。HNA-2仅在中性粒细胞和中性粒细胞前体上表达，其位于糖蛋白CD177(NB1gp)上。HNA-3具有一个抗原HNA-3a，也称为5b。HNA-3在中性粒细胞、淋巴细胞、血小板、内皮细胞、肾、脾和胎盘细胞上表达，已知它位于70至95kD中性粒细胞糖蛋白上。HNA-4和HNA-5位于β2整联蛋白上。HNA-4在粒细胞、单核细胞和淋巴细胞上表达。(参见Stroncek，ASHI QuarterIy 2004)。
T细胞受体
主要组织相容性复合体(MHC)细胞表面糖蛋白呈递的抗原肽由T细胞通过T细胞受体(TCR)复合体识别，T细胞受体复合体是由T细胞受体和CD3链构成的多亚基跨膜表面复合体。TCR直接结合肽/MHC复合体，并通过与CD3和TCR的其他组分的相互作用激活T细胞。因此，TCR参与了自我和外来组织识别，并分析组织的TCR表达，该表达可能有助于组织分型移植供体和受体。
试剂盒
本发明还提供实施本发明方法的试剂盒。具体来说，本发明提供用于实施基于DNA的组织分型方法的试剂盒，该试剂盒包括：a)具有可鉴别特征的多组微粒，其中在各组中，每个微粒具有相同的鉴别特征；和b)SSO探针，其中不同SSO探针固定在一组内的微粒上。
本发明的其他方面和优点将通过参考下列示例性实施例来理解。
实施例1
常规方法与本发明方法的比较
珠子、探针和样品DNA制备
使用SSO DRB1 Locus(One Lambda Inc.，Canoga Park，CA)进行下述DNA组织分型分析。Luminex×MAP微球(Austin，TX)具有两种荧光染料包埋在其中。使用具有不同浓度的各种包埋荧光染料的各种微球(或珠子)。
用胺标记SSO探针，将其结合到珠子上。HLA DRB1外显子2由使用生物素化引物的PCR从分离自生物或组织样品的DNA扩增。在5’端用生物素标记所得PCR产物(本文称为“样品DNA”)。使样品DNA接触珠子，样品DNA与固定于珠子上的SSO探针的杂交在用结合有荧光染料藻红蛋白(PE)的链霉亲和素孵育后产生代表样品DNA和SSO探针杂交的荧光信号。用流式细胞术检测并测量该荧光信号。(DNA可以来自任何来源，优选血液或颊试子)。
在样品DNA内扩增的HLA基因和固定于微粒上的SSO探针之间的DNA杂交反应如下进行。使用预优化的热循环程序设定标准基因扩增反应物，该扩增反应物包含：约1ng/μl基因组DNA和10微摩尔相应的序列特异性生物素化引物。将5微升的含有扩增的DRB1＊0814的所得混合物变性、中和并与结合所需探针的微粒(1000个微粒/探针/测试)在1M NaCl和70mM磷酸钠缓冲液中混合。将杂交反应物在60℃下孵育15分钟。然后将2体积的50nM NaCl溶液(在60℃预热)添加到混合物中，离心试管5分钟。在不打乱沉淀微粒的情况下移除上清液。将此洗涤步骤重复多于两次。
然后通过添加3体积的5微克/微升的藻红蛋白-链霉亲和素结合物标记杂交的DNA。将标记混合物在60℃下孵育5分钟，如上所述洗涤。用50nM NaCl将洗涤的微粒重悬至80微升体积。使用Luminex 100流式分析仪激发、检测和记录注入仪器的各个微粒在580nm处的荧光信号来检测杂交信号。每次测试分析约500个微粒用来分析计算各探针的修剪均数荧光强度(MFI)。然后使用用于测试的各探针的所得MFI和来自适当阳性对照探针的MFI来计算相对杂交信号。
阳性对照探针是识别可以由特异性引物组扩增的所有等位基因的非多态性区域的探针。用于本发明的靶核酸链包括已经使用聚合酶链式反应(PCR)扩增的等位基因区域。使用阳性对照探针来提供参考信号以便可以估计扩增DNA(扩增子)量的变化。使用阳性对照信号来计算所有诊断探针的相对信号，诊断探针信号表示为阳性对照信号百分比。
常规分析
对于常规基于DNA的组织分型方法，如上所述将100种不同荧光标记的珠子各自与不同的HLA特异性探针结合。使珠子接触样品DNA。使用Luminex 100流式分析仪测量样品DNA与任何珠子的杂交。
使用Luminex 100流式分析仪软件统计分析流式细胞术数据。所关注珠子(珠子37)的荧光强度的修剪均值为1707。修剪均值是当去除某一百分比的高和低例外值时计算的平均值。
使用本发明方法的分析
使用本发明的基于DNA的组织分型方法，将一些珠子37(750种珠子)与表1中所列的5种HLA特异性SSO探针中的一种结合。使珠子与样品DNA接触。使用Luminex 100流式分析仪测量样品DNA与任何珠子的杂交。由于测试了5种探针，所以进一步分析20％的阳性珠子。
表1
表1
使用Luminex 100流式分析仪软件统计分析流式细胞术数据。这种分析包括测定所分析珠子的大小、包埋在珠子中的各荧光染料的荧光强度、以及荧光强度是否在所需范围内的测定。分析各染料的荧光强度以测定RPI。RPI代表样品DNA与珠子杂交所产生的荧光强度。在此实施例中，RP1代表样品DNA上标记的PE的真实荧光强度。这个值表示样品DNA已与结合到珠子37的SSO探针杂交。
对于珠子37，574个事件的RPI小于216，它们被认为是阴性，即样品DNA不与SSO探针杂交。此外，有151个阳性事件(ROI＞5650)，阳性事件表示样品DNA与SSO探针杂交。阳性与阴性事件的比率为151∶574，其约为1∶4。因此五分之一的探针对于样品DNA是阳性的。阳性珠子的平均RPI为8152。这个值是较强的信号并且是大于用常规方法计算的平均RPI(1707)的真实值的增强信号。
已知此实验中所用的DNA样品仅对于DRB1＊0814(与探针OLR4916杂交，参见表1)为阳性的。仅20％的阳性事件的分析表明珠子37是阳性的，所检测的平均信号(8152)强度与通过实施常规方法产生的强度类似(1个珠子/1种探针)。此实验证明了本发明方法的选择步骤增强了阳性信号。此外，此实施例证明了可以使用相同或较少数目的珠子筛选较多的靶标，并且所产生的信号与使用常规方法产生的信号类似。
实施例2
常规方法与本发明方法的另外比较
用于HLA等位基因抗原的基于DNA的组织分型的常规方法与本发明改良方法的另外比较如实施例1所述进行。这些方法中所用的样品DNA含有扩增的HLA抗原等位基因DRB1＊0416。
使用实施例1中所述的Luminex 100流式分析仪检测杂交信号。使用用于测试的各探针的所得MFI和来自适当阳性对照探针的MFI来计算相对杂交信号。同样使用识别可以由特异性引物组扩增的所有等位基因上的非多态性区域的阳性对照探针。
常规方法
对于常规基于DNA的组织分型方法，如上所述将100个不同荧光标记的珠子各自与不同的HLA特异性SSO探针结合。使珠子与样品DNA接触。使用Luminex 100流式分析仪测量样品DNA与任一珠子的杂交。
使用Luminex 100流式分析仪软件统计分析流式细胞术数据。所关注珠子(珠子73)的荧光强度的修剪均值为400。
使用本发明方法的分析
使用本发明的基于DNA的组织分型方法，使一些珠子73(838个珠子)与表2中所列的5种HLA特异性SSO探针中的一种结合。使珠子与样品DNA接触。使用Luminex 100流式分析仪测量样品DNA与任一珠子的杂交。由于测试了5种探针，所以进一步分析20％的阳性珠子。
表2
表2
珠子
如实施例1所述使用Luminex 100流式分析仪软件统计分析流式细胞术数据。对于珠子73，672个事件的RPI小于48(平均值＝16)，它们被认为是阴性，即样品DNA不与SSO探针杂交。此外，有166个阳性事件(ROI＞1457)，阳性事件表示样品DNA与SSO探针杂交。阳性与阴性事件的比率为166∶672，其约为1∶4。因此五分之一的探针对于样品DNA是阳性的。阳性珠子的平均RPI为2510。这个值是较强的信号并且是用常规方法计算的平均RPI的更真实值(400)。
已知此实验中所用的DNA样品仅对于DRB1＊0416(与探针DR148杂交，参见表2)为阳性的。仅20％的阳性事件的分析表明珠子73是阳性的，所检测的平均信号(2510)强度与通过实施常规方法产生的强度类似(对于常规方法平均值为400)。此实验证实了实施例1中所述的分析。
本领域的那些技术人员参考本发明所列的优选实施方式可以预期本发明实施中的多种修改和变化。因此，对本发明范围的仅有的限制是所附权利要求中所出现的那些。

Claims (4)

1.一种用于实施筛选方法的试剂盒，所述试剂盒包括：
i)多组独特可鉴别微粒，其中在一组中的所述微粒具有相同独特可鉴别特征，并且其中一组或多组包括两个或更多个微粒亚组，每个所述亚组呈现至少一种独特的序列特异性寡核苷酸(SSO)，其经选择在生物样品中与组织分型抗原等位基因杂交，以及其中在与所述组织分型抗原等位基因杂交时所述SSO形成结合复合体，和
ii)用可检测标签标记所述结合复合体的标签试剂，当存在杂交时产生可测量的信号，并且其中所述信号的强度变化使得仅展示最大信号强度的微粒经选择以用于分析，所述微粒包含小于100％的微粒的比例。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述序列特异性寡核苷酸(SSO)是探针或引物。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述组织分型抗原等位基因选自：HLA抗原、HLA等位基因、HNA抗原、HNA等位基因、血型抗原、TCR或KIR。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中一组独特可鉴别微粒包含以不同于1:1的固定数值比例呈现的至少两个微粒亚组。
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