CN1847852B - 单核苷酸多态性试纸条快速检测方法及其试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种核酸试纸条检测两种多态碱基SNP的方法。本发明还公开了一种核酸试纸条检测多种多态碱基SNP的检测和分型方法。此外，本发明还公开了上述检测方法在与SNP直接相关的人类遗传性疾病的分子诊断、细菌和病毒等其它病原微生物耐药基因突变的检测、人体药物反应差异性的检测与筛查、人类健康遗传基础的SNP的筛查与分型、人群中某些疾病易感基因的筛查、器官移植中供体和受体间的配对选择和法医学中罪犯身份的鉴别及亲子鉴定中的用途。

Description

单核苷酸多态性试纸条快速检测方法及其试纸条

技术领域

本发明涉及核酸序列中单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism(SNP))的检测方法，特别是SNP的快速检测和分型技术领域的核酸快速诊断技术。更具体地说，本发明涉及利用扩增技术、单核苷酸延伸技术和核酸试纸条检测技术快速检测核酸序列中的单碱基突变的方法。本发明还涉及用于上述单核苷酸多态性快速检测和分型技术领域的核酸快速诊断的试纸条。本发明还涉及了在快速检测核酸序列中单核苷酸多态性的试剂盒方面的用途。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组水平上，特定核苷酸位置上存在两种或两种以上不同的碱基，引起DNA序列的多态性，其中任何一种等位基因在群体中的频率不小于1％。SNP已成为继限制性酶切片断长度多态(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)，短串联重复序列(ShortTandem Repeat，STR)多态标记后的第三代分子遗传标记，随着人类基因组测序工作的完成，SNP的筛选及其检测正成为研究者们广泛关注的焦点。SNP的数量十分庞大，估计人类30亿碱基中约有3×10⁶个SNP位点。自从发现SNP后，研究者们就致力于其检测技术的研究与开发。目前用于SNP检测的方法大多以PCR技术为基础，与荧光、质谱法、基因芯片或直接测序等方法结合，大规模，自动化的检出SNP或进行SNP初筛，已进入SNP检测的高通量时代。但这些方法大都操作复杂、价格昂贵、检测时间长，而且需要大型的仪器设备为前提的检测技术，并不适合于基层医院和医疗条件尚不完备的地区。下面就几种现有SNP检测技术进行概述。

1限制性酶切片断长度多态(RFLP)

利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片断，如果存在SNP位点，酶切片断的长度和数量则会出现差异，根据琼脂糖凝胶电泳的结果就可以判断是否有SNP位点以及出现的碱基替换的类型。该技术应用的前提是SNP位点必须含有该限制内切酶的识别位点，这就在一定程度上限制了RFLP技术在SNP位点筛选和分型中的应用。

2寡核苷酸连接分析(OLA)

OLA技术是通过设计两种能与靶序列DNA精确并列杂交的寡核苷酸来完成的。寡核苷酸杂交后，DNA连接酶可使其正常配对的相邻碱基以共价连接，而错配的相邻碱基可通过调节连接酶和NaCl浓度防止其连接。连接产物可以通过凝胶电泳或固相印迹杂交的方法进行检测，根据这些检测结果就可以进行SNP的分型。由于连接反应的条件很严格，如连接反应体系中盐的浓度及连接酶和DNA的比例等，所以此种分型技术很容易出现假阴性结果，造成SNP位点的漏检或错检。

3基因芯片

基因芯片，又称为DNA微探针阵列(Micro-array)。虽然仅用一张芯片，就可以通过芯片上密集排列的已知序列的探针，与若干靶序列进行互补匹配杂交，从而达到同时检测多个基因的多态性的目的。但这些产品价格昂贵，供货周期长，并需要专用的仪器和设备来完成SNP的检测，费用高和操作复杂，目前国内基因芯片研究生产中用到的试剂、耗材主要依靠进口，这也成为基因芯片研究SNP的瓶颈。

4实时荧光定量PCR(Real-time Quantitive PCR)

根据荧光共振的原理，利用荧光检测装置检测供试者-接受者之间的荧光变化，从而进行SNP的分型。实时荧光PCR法不需要PCR反应后的操作过程来进行基因分型，在PCR完成的同时即可以得到检测结果，将PCR污染的风险降至最低，但是其对反应试剂及反应条件有严格要求，而且需要价格昂贵的特殊的检测装置，如：7900全自动高通量实时荧光定量PCR检测仪或7700荧光PCR检测仪。

5.变性-高压液相色谱法(DHPLC)

此法应用高效液相色谱仪来完成。其核心部分是带正电荷的DNA分离柱，DNA将根据其双链与DNA分离柱的亲和力的强弱而被先后洗脱下来，从而达到分离的目的。目的片断经PCR扩增后，在部分加热变性的条件下，由于错配碱基与正常碱基不能配对，形成异源双链。整个系统温度被维持在接近异源双链DNA片断的Tm值，所以正常配对的DNA片断和异源双链DNA片断在进行液相色谱时，由于异源配对DNA片断含有错配碱基，发生部分解链，单链DNA所带负电荷比双链少，所以异源双链DNA先被洗脱下来。SNP的有无最终表现为色谱峰的峰形或数目差异。

该方法的主要优点是：自动化程度较高，速度快，适合高通量筛查；灵敏度高，尤其适于大片断DNA分析，分辨率高达1bp∶1～1.5kb。其缺点位：只能检测出样品有无突变，而不能测出突变类型，也不能检测出纯合突变；同时DHPLC系统非常精密，对试剂和环境要求较高，易产生误差。

6.毛细管电泳测序分型(CE)

这是现在检测SNP比较准确的方法之一。其主要流程是：PCR扩增目的片断→PCR产物纯化，回收→4种荧光标记(dNTP)测序反应→去除多余的引物，荧光物质及离子→测序仪上电泳并用测序软件分析。DNA遗传分析仪使用4种荧光染料标记引物，进行碱基的DNA合成，经电泳分离后，用激光激发获取片断信息，可以直接测序检测SNP的突变类型及其位置，效率达到100％，所以对一些比较小的，外显子相对较少的基因的SNP检测可以直接测序。但测序检测SNP的方法需要较多的劳力，且花费昂贵，所以对一些较大的，外显子较多的基因不宜用测序法直接检测，也不适用于临床对大量的标本进行检测。

7.DNA序列分析技术

1)直接测序法(Sanger测序法)

如果希望大规模、准确、快速发现SNP，Sanger测序法越来越成为主流技术。由ABI公司推出的DNA遗传分析仪使用4种荧光染料标记引物，取代了原来的手工测序的同位素标记，这就使得测序和分析时间大大缩短。由于最近两年来测序的成本日益降低，而且DNA Sanger测序能够准确、直接反应序列的差异，所以目前国际上应用最为广泛的还是通过直接测序法来进行SNP的研究。但是从操作周期来看，Sanger测序法从样品的处理到给出报告至少需要3-4天，还是不能及时地满足一些研究者和临床医学检测对于时间上的需要，而且价格也比较昂贵。

2)DNA焦磷酸序列分析技术(Pyrosequencing)

DNA焦磷酸序列分析技术是在底物混合物(包括APS和Luciferin)存在的情况下，由DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，通过其特有的计算机软件将发出的可见光信号转变为一个峰值，然后根据峰值的大小和反应中掺入的核苷酸数目进行SNP的分型。Pyrosequencing是一种不依赖平板或毛细管电泳，不依赖DNA的荧光标记/激发/检测的DNA序列分析技术，因此相应的仪器系统无须荧光分子的激发和检测装置，所以操作简便，花费比Sanger测序法要小得多。但是该方法也有它的局限性，它的读序能力小于直接测序法，一次反应只可以达到十几个到几十个碱基。

8单碱基延伸法(SBE)

单碱基延伸法，又称为微测序法(Minisequencing)，是指一个寡核苷酸探针的3’端碱基紧挨于多态性碱基，探针在合适的底物ddNTP存在的情况下，延伸一个碱基，延伸上的碱基就是多态性碱基。由于ddNTP是终止单核苷酸，延伸后的探针将不能再次延伸，因此被称为单碱基延伸法。以这种技术为平台，根据对延伸产物检测方法不同，衍生出很多检测SNP的方法，如：单碱基延伸标签阵列技术(Single Base Extension-Tag，SBE-Tag)，单碱基延伸结合质谱法(Single Base Extension-mass spectrometry，SBE-MS)，单碱基延伸结合基因芯片法等等。上述几种SBE技术，均需要特殊的检测仪器，而且花费高昂，技术条件要求高，不适合于一般的实验室和医院检验室应用。

本发明利用先进的核酸扩增、单核苷酸延伸和核酸试纸条快速检测技术发明的一种操作简单、时间短、价格低廉的检测技术。可以广泛地应用于所有与单核苷酸多态性检测相关的领域。

发明内容概述

随着特定种类生物基因组的全部或部分SNP的发现以及一些特定SNP数据库的建成，SNP的功能研究逐步转为科学家们研究的重点。特定DNA区域的特定SNP在特定群体的序列验证和频率分析以及SNP与特定生理或病理状态关系的研究成为SNP功能研究的主要方面。但上述各种方法大都需要专门的分析仪器，不仅价格昂贵，而且操作复杂，专业性强，所以应用上述技术在一般的分子和细胞生物学实验室和临床检验室进行与SNP有关的研究和检测受到了限制。

本发明人在我们原有的核酸薄膜层析快速检测方法及其试纸条专利技术(申请号CN200610003429.1)的基础上，结合单碱基延伸技术(SBE)发明出一种新的快速SNP检测和分型的方法——单核苷酸多态性(SNP)试纸条快速检测方法及其试纸条。本发明的目的在于为人们提供一种操作简单，价格低廉和检测结果准确的对已知SNP进行检测和分型的方法，从而使得与SNP有关的研究工作在基层科研机构及医院的检验科顺利开展。

上述发明(申请号CN200610003429.1)提供了用于核酸扩增物检测的试纸条，其包括在带有不干胶的衬垫7按顺序有样品垫1、有色颗粒结合物垫2、纤维膜3和吸水滤纸垫4，上述各部分在相邻处部分重叠，纤维膜上还设有检测线5和质控线6，其中有色颗粒结合物垫2上的有色颗粒有抗A抗体包被，检测线5上有抗B抗体包被，质控线6上有抗A抗体。纤维膜通常为硝酸纤维素膜或尼龙膜。

核酸扩增物检测试纸条的基本结构如附图1所示。

因此，一方面，本发明提供核酸试纸条检测两种多态碱基SNP的方法，

其包括：

1)用抗A抗体包被有色颗粒；

2)用抗B抗体包被纤维膜；

3)根据检测的多态位点设计探针寡核苷酸链，探针的3’末端位于待检SNP位点的前一个碱基，探针的5’末端用抗原A标记；

4)扩增上述步骤3)的含有待检SNP的DNA；

5)将5’末端抗原A标记的探针与扩增物杂交，DNA聚合酶在扩增后的探针的3’末端用抗原B标记的双脱氧单核苷酸以待检SNP为模板延伸一个碱基，此时探针已被抗原A和抗原B双重标记；

6)在检测时，上述步骤5)得到的探针所带有的抗原A首先与颗粒表面的抗体A结合，形成探针抗原B-探针抗原A-颗粒抗体A的有色颗粒复合物；

7)上述步骤6)得到的有色颗粒复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向上流动，当复合物遇到固定于膜上的抗体B线条时，待检的探针抗原B-探针抗原A-颗粒抗体A复合物与线条上的抗体B结合，形成线条抗体B-探针抗原B-探针抗原A-颗粒抗体A的有色颗粒复合物，有色的线条抗体B-探针抗原B-探针抗原A-颗粒抗体A的颗粒复合物滞留在线上，形成肉眼可见的有色线条，此为阳性；

8)在步骤5)时，如果加入带有抗原B的双脱氧单核苷酸(ddNTP)与模板上的单核苷酸不形成互补，则不能发生延伸，此时探针只带有抗原A，则在步骤6)中形成的探针抗原A-颗粒抗体A的有色复合物将不能与膜上的抗体B检测线结合而越过此线，不能形成肉眼可见的有色线条。此为阴性；

9)如果被检样品为纯合子，则试纸条显示一条有色线条；如果被检样品为杂合子，则试纸条显示二条有色线条。

另一方面，本发明还提供核酸试纸条检测多种多态碱基SNP的检测和分型方法，其包括：

1)用抗A抗体包被有色颗粒；

2)用抗B抗体包被纤维膜：将两种以上无色特异性抗体B以线条状固定于同一条膜上，形成两条以上的检测线；

3)根据检测的多态位点设计和标记探针寡核苷酸链，探针的3’末端位于待检SNP位点的前一个碱基，探针的5’末端用抗原A标记；

4)扩增含有待检SNP的DNA；

5)将5’末端抗原A标记的探针与扩增物杂交，DNA聚合酶在探针的3’末端用两种以上的抗原B-ddNTP中的一种与多态性碱基配对，以待检SNP为模板延伸一个碱基，此时探针已被抗原A和抗原B双重标记；

6)检测时，上述步骤5)的探针所带有的抗原A首先与颗粒表面的抗体A结合，形成探针抗原B-探针抗原A-颗粒抗体A的有色颗粒复合物；

7)上述步骤6)得到有色颗粒复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向上流动，当复合物遇到固定于膜上的两条以上的抗体B线条时，待检的探针抗原B-探针抗原A-颗粒抗体A复合物与线条上相关的抗体B结合，形成线条抗体B-探针抗原B-探针抗原A-颗粒抗体A的有色颗粒复合物，有色的线条抗体B-探针抗原B-探针抗原A-颗粒抗体A的颗粒复合物滞留在线上，形成肉眼可见的有色线条，不同的有色线条位置代表不同的碱基；

8)如果被检样品为纯合子，则试纸条显示一条有色线条；如果被检样品为杂合子，则试纸条显示二条有色线条；

9)根据核酸检测试纸条的显色判读结果对所检测的SNP进行分析和分型。

另一方面，本发明提供了用于上述检测和分型方法的试纸条。

另一方面，本发明还提供了上述检测和分型方法及其试纸条的用途，尤其是在以下领域中的应用：与SNP直接相关的人类遗传性疾病的分子诊断、细菌和病毒等其它病原微生物耐药基因突变的检测、人体药物反应差异性的检测与筛查、人类健康遗传基础的SNP的筛查与分型、人群中某些疾病易感基因的筛查、器官移植中供体和受体间的配对选择(HLA分型)和法医学中罪犯身份的鉴别及亲子鉴定等。

附图的简要说明

附图1是关于用于本发明的核酸试纸条的基本结构示意图

附图2是关于本发明的核酸试纸条检测两种SNP方法的基本原理示意图；

附图3是关于本发明的核酸试纸条检测多种多态SNP方法的基本原理示意图；

附图4显示实施例1的ACTN3基团R577X的SNP检测和分型结果；

附图5是实施例2的Leber’s病线粒体DNA G11778A的SNP检测图；

发明内容详述

本发明的方法及其试纸条就是在靶核酸扩增物的基础上，利用单碱基延伸技术，以核酸试纸条为检测手段进行SNP的检测和分型。主要原理是根据抗原和其特异性抗体的免疫学特异性结合，将核酸片段固定在核酸检测试纸条上，然后通过可视的呈色乳胶颗粒在试纸条上显色而检测出结果。

因此，本发明提供核酸试纸条检测两种多态碱基SNP的方法，其包括：

1)用抗A抗体包被有色颗粒：将一种特异性抗体(抗A抗体，无色)吸附于有色颗粒，如胶体金颗粒，乳胶颗粒等，在颗粒表面形成抗体包被；

2)用抗B抗体包被纤维膜：将另一特异性抗体(抗B抗体，无色)以线条状固定于膜上，形成检测线，所述膜通常为硝酸纤维膜或尼龙膜)。

3)根据检测的多态位点设计和标记相应的探针寡核苷酸链：探针的3’末端位于待检SNP位点的前一个碱基，探针的5’末端用抗原A标记；

4)扩增含有待检SNP的DNA；采用PCR或其它方法扩增含有待检SNP的DNA片段，PCR反应完成后，在PCR产物加入热敏磷酸酶，直接降解其中未参加反应的脱氧单核苷酸分子(dNTP)，除去dNTP对以后SBE单碱基延伸过程中的干扰；然后加热95℃使热敏磷酸酶热失活，以免其降解SBE反应中的抗原标记的双脱氧单核苷酸分子ddNTP；

5)探针的单碱基延伸和第二次标记：将5’末端抗原A标记的探针与扩增物杂交，DNA聚合酶在探针的3’末端用抗原B标记的双脱氧单核苷酸(抗原B-ddNTP)以待检SNP为模板延伸一个碱基，这时探针的5’和3’末端已分别标记上抗原A和B；

6)形成探针与颗粒的复合物：在检测时，上述步骤5)的探针所带有的抗原A首先与颗粒表面的抗体A结合，形成探针抗原B-探针抗原A-颗粒抗体A的有色颗粒复合物。

7)探针颗粒复合物与检测线的结合：上述步骤6)的有色颗粒复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向上流动，当复合物遇到固定于膜上的抗体B线条时，待检的探针抗原B-探针抗原A-颗粒抗体A复合物与线条上的抗体B结合，形成线条抗体B-探针抗原B-探针抗原A-颗粒抗体A的有色颗粒复合物(双抗体双抗原夹心)。有色的线条抗体B-探针抗原B-探针抗原A-颗粒抗体A的颗粒复合物滞留在线上，形成肉眼可见的有色线条，此为阳性，即突变；

8)在步骤5)的SBE反应时，如果加入带有抗原B的ddNTP(如加入ddATP)与模板上的单核苷酸(如A，G或C)不形成互补，不能发生延伸，此时探针只带有抗原A，在步骤6)中形成的探针抗原A-颗粒抗体A的有色颗粒复合物将不能如步骤7)中所述与膜上的检测线结合而越过此线，不能形成肉眼可见的有色线条，此为阴性，即正常。

9)如果被检样品为纯合子(如A/A)，则试纸条显示一条有色线条(A线条)；如果被检样品为杂合子(如A/G)，则试纸条显示二条有色线条(A和G线条)。

本发明的上述核酸试纸条检测两种多态碱基SNP方法的的基本步骤如附图2中所示。

另一方面，本发明还提供了利用核酸试纸条检测多种多态碱基SNP的检测和分型方法，其包括：

1)用抗A抗体包被有色颗粒：将特异性抗体(抗A抗体，无色)吸附于有色颗粒(如胶体金颗粒，乳胶颗粒等)，在颗粒表面形成抗体包被；

2)用抗B抗体包被纤维膜：将两种以上，例如四种特异性抗体(抗B1，抗B2，抗B3，抗B4抗体，无色)以线条状固定于同一条膜上，形成两条以上，例如四条检测线；

3)根据检测的多态位点设计和标记相应探针寡核苷酸链：探针的3’末端位于待检SNP位点的前一个碱基，探针的5’末端用抗原A标记；

4)扩增含有待检SNP的DNA；用PCR或其它方法扩增含有待检SNP的DNA片段，PCR反应完成后，在PCR产物加入热敏磷酸酶，直接降解其中未参加反应的脱氧单核苷酸分子(dNTP)，除去dNTP对以后SBE单碱基延伸过程中的干扰；然后加热95℃使热敏磷酸酶热失活，以免其降解SBE反应中的抗原标记的双脱氧单核苷酸分子ddNTP；

5)探针的单碱基延伸和第二次标记：将5’末端抗原A标记的探针与扩增物杂交；在SBE反应时，根据多态位点的碱基类型加入两种以上，例如四种不同的标记的ddNTP(如抗原B1-ddTTP，抗原B2-ddATP，抗原B3-ddGTP，抗原B4-ddCTP)，DNA聚合酶在探针的3’末端用四种抗原B-ddNTP中的一种与多态性碱基配对，以待检SNP为模板延伸一个碱基，这时探针的5’和3’末端已分别标记上抗原A和B；

6)探针与颗粒复合物的形成：检测时，上述步骤5)的探针所带有的抗原A首先与颗粒表面的抗体A结合，形成探针抗原B-探针抗原A-颗粒抗体A的有色颗粒复合物。

7)探针颗粒复合物与检测线的结合：上述步骤6)的有色颗粒复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向上流动，当复合物遇到固定于膜上的四条抗体B线条时，待检的探针抗原B-探针抗原A-颗粒抗体A复合物与线条上相关的抗体B结合，形成线条抗体B-探针抗原B-探针抗原A-颗粒抗体A的有色颗粒复合物(双抗体双抗原夹心)。有色的线条抗体B-探针抗原B-探针抗原A-颗粒抗体A的颗粒复合物滞留在线上，形成肉眼可见的有色线条。不同的有色线条位置代表不同的碱基(A，T，C或G，见附图3)。

8)如果被检样品为纯合子(如A/A)，则试纸条显示一条有色线条(A线条)。如果被检样品为杂合子(如A/G)，则试纸条显示二条有色线条(A和G线条，见附图3)。

9)根据核酸检测试纸条的显色判读结果对所检测的SNP进行分析和分型。

本发明的上述核酸试纸条检测多种多态碱基SNP的方法的基本步骤示于附图3中。

本发明说明书及权利要求书中所使用的技术术语解释：

引物：DNA合成的起始物。一般为一对单链寡核苷酸，在与模板杂交后，DNA合成从其3’末端开始。

探针：探测靶核酸(DNA或RNA)的单链寡核苷酸。通常有可检测的信号分子标记，如半抗原，荧光等。

标记：将可检测的信号分子(如半抗原，荧光，放射性等)与单链寡核苷酸相偶连的方法。

杂交：特指互补的DNA单链通过碱基配对形成双链结构。

核酸：脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的通称。

抗原和半抗原：具备免疫原性的物质。通常为大分子蛋白质或细胞组分。但有些小分子也具备免疫原性，被称为半抗原(Hapten)。半抗原常被用于标记探针。

抗体：能与抗原或半抗原特异性结合的蛋白质分子。

复合体：由两种或两种以上分子特异性结成的结合物。

免疫试纸条：用于快速检测的医学工具。又称为呈色薄膜层析。

核酸聚合酶：合成核酸长链的酶类。分为DNA聚合酶和RNA聚合酶两大类。

在本发明的上述方法中，所使用的抗A抗体可选自：亲和素、抗地高辛抗体或抗荧光染料抗体，其中抗荧光染料抗体选自：抗Cy3抗体、抗Cy5抗体、抗Tetramethylrhodamine抗体、抗AlexaFluor抗体、抗Rhodamine抗体、抗Fam抗体、抗FitC抗体等。其中优选的抗体为亲和素、抗地高辛抗体或抗FitC抗体。

在本发明的检测方法中，所使用的另一种标准的通用抗体，无色的抗B抗体可选自上述标准的通用抗体，但应选用与抗A抗体不同的抗体。

在本发明的上述方法中，所使用的抗原A和抗原B可以是标准的通用抗原或半抗原。尤其适用于本发明方法的用于标记探针的抗原或半抗原选自：生物素、地高辛或荧光染料，其中所述荧光染料选自：Cy3、Cy5、Tetramethylrhodamine、AlexaFluor、Rhodamine、Fam、FitC，等。优选的抗原或半抗原为生物素、地高辛或FitC。探针的5’末端和3’末端应选用不同的抗原或半抗原标记。

用于吸附抗A抗体的有色颗粒可以是，如胶体金颗粒、乳胶颗粒等。所述膜通常为硝酸纤维素膜或尼龙膜。在本发明的上述方法中，所使用的DNA聚合酶可选自Klenow DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶，Vent DNA聚合酶，Bst DNA聚合酶，或Thermo sequenase。这些DNA聚合酶在商业上可由例如美国的NewEngland Biolabs，获得。

本发明的突出的有益效果是以核酸检测试纸条为检测平台，从样品提取开始到给出确定SNP分析和分型结果，整个操作周期短，只需要2-3个小时。判读简单同时又不需要任何特殊仪器，使得这种检测方法的操作复杂性和SNP检测成本大大降低。SNP检测试纸条对于实验的条件和环境要求不高，所以在一般的分子实验室和医院检验科即可以完成全部实验。SNP检测试纸条与基因芯片，基因测序的比较：

比较项目	基因芯片	基因测序	荧光定量PCR	SBE SNP试纸条
					纯合子/杂合子检测	能	能	能	能
一次性测定的基因	多个	多个	一个	一个
					操作周期	一天	三天	2-3小时	2-3小时
操作复杂性	较高	高	较高	低
					对实验条件的要求	高	很高	高	低
费用	高	高	较高	低

SNP检试纸条以其特异、简单、快捷的特性可以获得很广泛的应用，如：

1.与SNP直接相关的人类遗传性疾病的分子诊断；

2.人群中可以确定人类健康遗传基础的SNP的筛查与分型

3.人体药物反应差异性检测与筛查；

4.人群中某种疾病易感基因的筛查；

5.病原体已知耐药基因的检测；

6.器官移植中供体和受体间的配对选择

7.法医研究中罪犯身份的鉴别及亲子鉴定

8.运动员基因型的筛选

如下实施例仅用于举例说明本发明，并不构成对本发明的保护范围的任何限制。

实施例

实施例1.ACTN3基因R577X单核苷酸多态性的检测与分型

ACTN3基因是第一个被证实与人体健康和运动能力表型有关的骨骼肌结构性基因，其编码的产物为α-辅肌动蛋白-3(ACTN3)。ACTN3的577位密码子发生了突变：由野生型577R(CGA)突变为577X(TGA)，使该基因的终止密码子提前出现，导致人体内α-辅肌动蛋白-3缺乏。有证据证明ACTN3基因的577R等位基因型对于要求有力量和速度性的活动有益，R等位基因使得机体内表达出功能性α-辅肌动蛋白-3蛋白，有利于肌肉进行快速有力的收缩；而X等位基因则在某种程度上对慢速和持久性肌肉收缩提供了一个良好的分子基础。

鉴于以上ACTN3基因R577X这个SNP分型的意义，本申请专利发明的SNP试纸条对ACTN3第577位点多态性进行检测。具体实施如下：

1)取样：棉拭子取检测者的口腔脱落细胞，然后应用杭州优思达生物技术有限公司所生产的微量DNA快速提取试剂盒进行核酸提取。

2)聚合酶链反应(PCR)：

模板：被检者基因组DNA

引物：0.2微摩

正向引物：ACTN3PF：5’GAGTGCTGGGCTGGAAGA 3’

反向引物：ACTN3PR：5’CGGGCTGAGGGTGATGTA 3’

dNTP：0.2毫摩

缓冲液：

MgCl2            3毫摩

KCl              50毫摩

Tris-HCL(pH 9.0) 10毫摩

Triton-100       1％

Taq DNA聚合酶：  0.8单位

                                 

PCR反应总体积微20微升。

PCR反应程序如下：

PCR产物大小：302bp

3)降解PCR反应正剩余的dNTP：

PCR产物            20微升

缓冲液：

Bis Tris-Propane   50毫摩

MgCl₂              1毫摩

ZnCl₂              0.1毫摩

热敏磷酸酶：       1单位

                                       

总体积微30微升

反应程序：37℃，15分钟

热敏磷酸酶灭活：80℃，20分钟

4)单碱基延伸(检测C、T和A)

模板：上述dNTP降解后的PCR产物     30微升

延伸引物：                        0.1微摩

5’FITC-AGCCACTGCCCGAGGCTGAC  3’(正向)

生物素-ddCTP，/生物素-ddTTP/生物素-ddATP 0.5微摩

缓冲液：

Tris-HCl(pH 9.5)        26毫摩

MgCl₂                   6.5毫摩

热测序酶：              0.5单位

                                              

总体积微40微升

SBE反应程序如下：

95℃          60秒；

72℃          90秒

5)检测结果：将延伸产物全部滴于核酸试纸条上，在10分钟判读结果。

核酸试纸条检测SNP和测序结果见附图4，由附图4的检测结果可以看出，被检者ACTN3577(C/T)位多态位点基因型为杂合型。SNP核酸试纸条检测结果与测序结果一致。

实施例2.Leber’s病线粒体DNA G11778A单核苷酸多态性的检测与分型

Leber’s遗传性视神经病(Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON)是一种母性遗传的双眼视神经疾病。1988年W.allace等人首先报告线粒体DNA(mtDNA)第11778核苷酸位点原发性突变(G→A)可引起LHON。迄今发现和本病相关的mtDNA位点突变已有25个，在近年的报告中3460或14484等原发性位点突变的LHON及原发和继发突变并存的LHON患者，其临床表现类似11778位点突变者，临床医生很难根据其临床表现进行鉴别，因此分子生物学基因检查成为鉴别不同病因的Leber’s病的首选方法。鉴于对于线粒体G11778A位点分型对于Leber’s遗传性视神经病的诊断意义，应用本专利新发明的SNP检测试纸条对G11778A位点多态性进行检测。具体实施如下：

1)取样

被检者外周静脉抗凝血(冻存)5μl，应用杭州优思达生物技术有限公司所生产的微量DNA快速提取试剂盒进行核酸提取，用以基因扩增。

2)聚合酶链反应(PCR)

为排除基因组中假基因对线粒体基因扩增的干扰，需要进行两次扩增，以第一扩增产物为模板进行二次扩增，然后利用第二次扩增产物进行SBE。

引物：0.2微摩

第一次扩增引物：

Nd4P_out_F    5’TCACTCTCACTGCCCAAAA 3’

Nd4P_out_R    5’GGAGAATGGGGGATAGGTGT 3’

第二次扩增引物：

Nd4P_in_F    5’CTTCACCGGCGCAGTCATTC 3’

Nd4P_in_R    5’AGGCGAGGTTAGCGAGGCTT 3’

dNTP：0.2毫摩

缓冲液：

MgCl₂             3微摩

KCl               50微摩

Tris-HCl(PH 9.0)  10微摩

氚核-100          1.0％

Taq DNA聚合酶：   0.8单位

                                          

总体积为20微升

PCR反应程序如下：

第一对引物：

第二对引物：

产物大小：801bp(第一对引物)

          182bp(第二对引物)

3)降解第二次PCR反应中剩余的dNTP

模板：上述PCR产物      20微升

缓冲液：

Bis Tris-Propane    50毫摩

MgCl₂               1毫摩

ZnCl₂               0.1毫摩

热敏磷酸酶：1单位

                                         

总体积为30微升

反应程序：37℃，15分钟

热敏磷酸酶灭活：80℃，20分钟.

4)单碱基延伸(检测G和A)

模板：上述dNTP降解后的PCR产物       30微升

延伸引物：                          0.1微摩

5’FITC-TCAAACTACGAACGCACTCACAGTC 3’(正向)

生物素-ddGTP/生物素-ddATP           0.5微摩

缓冲液：

Tris-HCL(pH 9.5)            26毫摩

MgCl₂                       6.5毫摩

热测序酶：                  0.5单位

                                                         

总体积为40微升

SBE反应程序如下：

95℃       60秒

72℃       90秒

5)检测结果：将延伸产物全部滴于核酸试纸条上，在10分钟判读结果。核酸试纸条检测SNP结果见附图5，由附图5的结果可以看出，在被检者线粒体ND4基因11778位点发生突变，由G转变为A，与测序结果一致。

Claims (7)

1.一种核酸试纸条检测两种多态碱基SNP的方法，其包括：

1)用抗A抗体包被有色颗粒；

2)用抗B抗体包被纤维膜；

3)根据检测的多态位点设计探针寡核苷酸链，探针的3’末端位于待检SNP位点的前一个碱基，探针的5’末端用抗原A标记；

4)扩增含有待检SNP的DNA；

5)将5’末端抗原A标记的探针与扩增物杂交，DNA聚合酶在扩增后的探针的3’末端用抗原B标记的双脱氧单核苷酸以待检SNP为模板延伸一个碱基，此时探针已被抗原A和抗原B双重标记；

6)在检测时，上述步骤5)得到的探针所带有的抗原A首先与颗粒表面的抗体A结合，形成探针抗原B-探针抗原A-颗粒抗体A的有色颗粒复合物；

7)上述步骤6)得到的有色颗粒复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向上流动，当复合物遇到固定于膜上的抗体B线条时，待检的探针抗原B-探针抗原A-颗粒抗体A复合物与线条上的抗体B结合，形成线条抗体B-探针抗原B-探针抗原A-颗粒抗体A的有色颗粒复合物，有色的线条抗体B-探针抗原B-探针抗原A-颗粒抗体A的颗粒复合物滞留在线上，形成肉眼可见的有色线条，此为阳性；

8)在步骤5)时，如果加入带有抗原B的双脱氧单核苷酸(ddNTP)与模板上的单核苷酸不形成互补，则不能发生延伸，此时探针只带有抗原A，则在步骤6)中形成的探针抗原A-颗粒抗体A的有色复合物将不能与膜上的抗体B检测线结合而越过此线，不能形成肉眼可见的有色线条，此为阴性；

9)如果被检样品为纯合子，则试纸条显示一条有色线条；如果被检样品为杂合子，则试纸条显示二条有色线条。

2.一种核酸试纸条检测多种多态碱基SNP的检测和分型方法，其包括：

1)用抗A抗体包被有色颗粒；

2)用抗B抗体包被纤维膜：将两种以上无色特异性抗体B以线条状固定于同一条膜上，形成两条以上的检测线；

3)根据检测的多态位点设计和标记探针寡核苷酸链，探针的3’末端位于待检SNP位点的前一个碱基，探针的5’末端用抗原A标记；

4)扩增含有待检SNP的DNA；

5)将5’末端抗原A标记的探针与扩增物杂交，DNA聚合酶在探针的3’末端用两种以上的抗原B-ddNTP中的一种与多态性碱基配对，以待检SNP为模板延伸一个碱基，此时探针已被抗原A和抗原B双重标记；

6)检测时，上述步骤5)的探针所带有的抗原A首先与颗粒表面的抗体A结合，形成探针抗原B-探针抗原A-颗粒抗体A的有色颗粒复合物；

7)上述步骤6)得到有色颗粒复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向上流动，当复合物遇到固定于膜上的两条以上的抗体B线条时，待检的探针抗原B-探针抗原A-颗粒抗体A复合物与线条上相关的抗体B结合，形成线条抗体B-探针抗原B-探针抗原A-颗粒抗体A的有色颗粒复合物，有色的线条抗体B-探针抗原B-探针抗原A-颗粒抗体A的颗粒复合物滞留在线上，形成肉眼可见的有色线条，不同的有色线条位置代表不同的碱基；

8)如果被检样品为纯合子，则试纸条显示一条有色线条；如果被检样品为杂合子，则试纸条显示二条有色线条；

9)根据核酸检测试纸条的显色判读结果对所检测的SNP进行分析和分型。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中用于标记探针的抗原A和抗原B是标准的通用抗原、半抗原或可以与亲和素特异结合的生物素，抗原A和抗原B可以选自：地高辛、荧光染料或生物素，其中所述荧光染料选自Cy3、Cy5、四甲基罗丹名(Tetramethylrhodamine)、若丹明(Rhodamine)、Fam或FitC；探针的5’末端和3’末端应选用不同的抗原或半抗原标记；所使用的抗A抗体和无色的抗B抗体是标准通用抗体或可以与生物素特异结合的亲和素，抗A抗体和抗B抗体可选自：抗地高辛抗体、抗荧光染料抗体或亲和素，所述抗荧光染料抗体选自Cy3抗体、抗Cy5抗体、抗四甲基罗丹名抗体、抗若丹明抗体、抗Fam抗体、抗FitC抗体；抗B抗体应选用与抗A抗体不同的抗体。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述抗原A或抗原B为地高辛、FitC或生物素；所述抗体为抗地高辛抗体、抗FitC抗体或亲和素。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述DNA聚合酶可选自Klenow DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、BstDNA聚合酶或耐热型测序酶(Thermo Sequenase)。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中用于吸附抗A抗体的有色颗粒是胶体金颗粒或乳胶颗粒，所述的膜为硝酸纤维素膜或尼龙膜。

7.权利要求1-6之一所述的方法在病原微生物耐药基因突变的检测、器官移植中供体和受体间的配对选择和法医学中罪犯身份的鉴别及亲子鉴定中的用途。

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