JP2013063979A - ヒト骨髄由来内皮前駆細胞の同定、及び虚血性傷害後の心筋細胞の機能を改善するためのヒト骨髄由来内皮前駆細胞の使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(a)前記患者のある部位から幹細胞を採取することと、(b)前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、(c)前記前駆細胞が前記組織に遊走し、前記組織の新血管新生を刺激するように、工程(b)で得た前記内皮前駆細胞を前記患者の別の部位に導入することとを備えた方法。あるいは、虚血性傷害によって損傷を受けた組織の部位へのヒト骨髄由来内皮細胞前駆体の輸送を選択的に増加させる方法であって、(a)内皮前駆細胞を患者に投与することと、(b)前記患者にケモカインを投与することによって、前記虚血組織に内皮細胞前駆体を誘引することとを備えた方法。さらに、患者の心筋梗塞による損傷を受けた組織の血管形成又は血管新生を刺激する方法であって、患者に同種異系の幹細胞を注入することを備えた方法。
【選択図】なし
Description
(a)前記患者のある部位から幹細胞を採取することと、
(b)工程(a)で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、 (c)患者の虚血によって損傷を受けた前記組織における血管形成を前記内皮前駆細胞が刺激するように、工程(b)で得た前記内皮前駆細胞を前記患者の別の部位に導入することとを備えた方法を提供する。
(a)前記患者に増殖因子を導入して、前記幹細胞を前記患者の血液中に動員する(mobilize)ことと、
(b)前記幹細胞を含有する血液の試料を前記患者から採取することと
を備えた方法によって為される前出の方法も提供する。
(b)工程(a)で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、 (c)前記前駆細胞を増殖因子と接触させることによって、工程(b)で回収した前記内皮前駆細胞を増殖させることと、
(d)前記患者の梗塞周囲組織における血管新生を前記内皮前駆細胞が刺激するように、工程(c)で得た増殖した前記内皮前駆細胞を前記患者の別の部位に導入することとを備えた前出の方法も提供する。
(a)内皮前駆細胞を患者に投与することと、
(b)ケモカインを前記患者に投与することによって、前記虚血によって損傷を受けた組織に前記内皮前駆細胞を誘引することを備えた前出の方法も提供する。
前記異常は、前記患者におけるGATA−2被活性化遺伝子産物の発現によって治療され、
(a)前記患者のある部位から幹細胞を採取することと、
(b)工程(a)で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、 (c)工程(b)で回収した内皮前駆細胞の中からGATA−2を発現している内皮前駆細胞を回収することと、
(d)GATA−2を発現しているとして工程(c)で回収された前記細胞がGATA−2被活性化遺伝子産物を発現するように誘導することと、
(e)前記患者の別の部位に、GATA−2被活性化遺伝子産物を発現している工程(d)で得られた前記細胞を導入して前記異常を治療することとを備えた方法を提供する。
前記異常は、前記患者におけるGATA−2被活性化遺伝子産物の発現によって治療され、
(a)前記患者のある部位から幹細胞を採取することと、
(b)工程(a)で採取した前記幹細胞からマスト前駆細胞を回収することと、
(c)工程(b)で回収したマスト前駆細胞の中からGATA−2を発現しているマスト前駆細胞を回収することと、
(d)GATA−2を発現しているとして工程(c)で回収された前記細胞がGATA−2被活性化遺伝子産物を発現するように誘導することと、
(e)前記患者の別の部位に、GATA−2被活性化遺伝子産物を発現している工程(d)で得られた前記細胞を導入して前記異常を治療することとを備えた方法を提供する。
(b)前記幹細胞からCD117を発現する細胞を回収することと、
(c)前記細胞が前記患者の心筋の機能を改善するように、前記患者の異なる部位に前記回収した細胞を導入することとを備えた方法を提供する。
(a)同種異系(allogeneic)の幹細胞を取得することと、
(b)工程(a)で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、 (c)前記内皮前駆細胞が虚血によって損傷を受けた患者の前記組織における血管形成を刺激するように、工程(b)で回収した前記内皮前駆細胞を前記患者に導入することとを備えた方法も提供する。
(a)同種異系の幹細胞を取得することと、
(b)工程(a)で採取した前記幹細胞中の内皮前駆細胞を回収することと、 (c)前記内皮前駆細胞が虚血によって損傷を受けた患者の前記組織における血管新生を刺激するように、工程(b)で回収した前記内皮前駆細胞を前記患者に導入することとを備えた方法を提供する。
A.細胞の増殖及び成長の過増殖による玉石模様、
B.DiI標識されたアセチル化LDLの均一な取込み、
C.フルオレセインと複合されたmAbを用いた免疫蛍光法によって測定したCD34の発現、
D.ビオチンと複合されたmAbを用いた免疫ペルオキシダーゼ法によって測定した第VIII因子の発現、及び
E.特異的プローブを用いたインサイチューハイブリダイゼーションによって決定されるeNOSの発現、を示す。
(a)前記患者のある部位から幹細胞を採取することと、
(b)工程(a)で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、 (c)患者の虚血によって損傷を受けた前記組織における血管形成を前記内皮前駆細胞が刺激するように、工程(b)で得た前記内皮前駆細胞を前記患者の別の部位に導入することとを備えた方法を提供する。
(a)前記患者に増殖因子を導入して、前記幹細胞を前記患者の血液中に動員することと、
(b)続いて、幹細胞を含有する血液の試料を前記患者から採取することとを備えた方法によって採取される。
(b)工程(a)で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、 (c)前記前駆細胞を増殖因子と接触させることによって、工程(b)で回収した前記内皮前駆細胞を増殖させることと、
(d)前記内皮前駆細胞が前記患者の梗塞周囲組織における血管新生を刺激するように、工程(c)で得た増殖した前記内皮前駆細胞を前記患者の別の部位に導入することとを備えた方法も提供する。
(a)内皮前駆細胞を前記患者に投与することと、
(b)ケモカインを前記患者に投与することによって、前記虚血によって損傷を受けた組織に前記内皮前駆細胞を誘引することを備えた方法も提供する。
前記異常は、前記患者におけるGATA−2被活性化遺伝子産物の発現によって治療され、
(a)前記患者のある部位から幹細胞を採取することと、
(b)工程(a)で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、 (c)工程(b)で採取した内皮前駆細胞の中からGATA−2を発現している内皮前駆細胞を回収することと、
(d)工程(c)でGATA−2を発現しているとして回収された前記細胞がGATA−2被活性化遺伝子産物を発現するように誘導することと、
(e)前記患者の別の部位に、GATA−2被活性化遺伝子産物を発現している工程(d)で得られた前記細胞を導入して前記異常を治療することとを備えた方法を提供する。
前記異常は、前記患者におけるGATA−2被活性化遺伝子産物の発現によって治療され、
(a)前記患者のある部位から幹細胞を採取することと、
(b)工程(a)で採取した前記幹細胞からマスト前駆細胞を回収することと、
(c)工程(b)で回収したマスト前駆細胞の中からGATA−2を発現している内皮前駆細胞を回収することと、
(d)工程(c)でGATA−2を発現しているとして回収された前記細胞がGATA−2被活性化遺伝子産物を発現するように誘導することと、
(e)前記患者の別の部位に、GATA−2被活性化遺伝子産物を発現している工程(d)で得られた前記細胞を導入して前記異常を治療することとを備えた方法を提供する。
(a)前記患者のある部位から幹細胞を採取することと、
(b)前記幹細胞からCD117を発現する細胞を回収することと、
(c)前記細胞が前記患者の心筋の機能を改善するように、前記患者の異なる部位に前記回収した細胞を導入することとを備えた方法を提供する。
(a)同種異系の幹細胞を取得することと、
(b)工程(a)で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、 (c)前記内皮前駆細胞が患者の虚血によって損傷を受けた前記組織における血管形成を刺激するように、工程(b)で回収した前記内皮前駆細胞を前記患者に導入することとを備えた方法も提供する。
(a)同種異系の幹細胞を取得することと、
(b)工程(a)で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、 (c)前記内皮前駆細胞が患者の虚血によって損傷を受けた前記組織における血管新生を刺激するように、工程(b)で回収した前記内皮前駆細胞を前記患者に導入することとを備えた方法を提供する。
実験方法及び結果
1.骨髄由来細胞の動員と同定
G−CSF動員後、高純度ヒトCD34細胞(>90%陽性)の60〜80%が幹細胞因子受容体CD117を同時発現し(図1a)、そのうち15−25%はCD117の発現が明瞭で、75〜85%はCD117の発現が不明瞭であった。4種類のパラメーターに関する解析により、VEGFR−2(Flk−1)を発現する2種類のCD34細胞集団が確認された。1つ目はCDdim細胞の20〜30%を占め、VEGFR−2を高濃度に発現し、2つ目はCD117brightの10〜15%を占め、VEGFR−2発現は低濃度であった(図1b)。CD34+117dim細胞集団中のVEGFR−2陽性細胞であって、CD34+117bright分画中には含まれない細胞は、Tie−2、ecNOS、vWF、E−セレクチン(CD62E)及びICAM(CD54)の高発現を含む成熟血管内皮の表現型特性を示した。一方で、図1cで示すように、CD34+CD117bright細胞分画中に属するものであってCD34+CD117dim細胞分画に属さないVEGFR−2陽性細胞は、マウス及びヒト胚形成中に出現するGATA−2、GATA−3及び低レベルのTie−2を含む原始血管芽細胞に特徴的なマーカーを発現した。さらに、GATA−2及びGATA−3を同時発現したCD117bright細胞はまた、強いAC133陽性であった(AC133は、血管芽細胞になり得る造血細胞集団であることを確定するもう一つのマーカーであることが近年示唆されている(2)(図1d)。しかしながら、AC133発現は、GATA−2及びGATA−3が陰性であるCD117dim細胞の集団においても検出されたので、胚性骨髄由来血管芽細胞(BA)表現型の同定には、AC133に加えてGATA−2、GATA−3及びCD117brightが付随して発現することが必要であると本発明者らは結論する。このように、G−CSF処理によって、成熟骨髄由来内皮細胞(BMEC)の大きな集団、及び胚性血管芽細胞(BA)の表現型特性を有するこれより小さな骨髄由来の集団が末梢循環に動員される。
VEGF(27)又は局所的虚血(10−13)の何れかにより動物モデルで循環する内皮細胞前駆体の出現率が増加することが示されたので、次に、VEGF及び虚血性血清中の因子(28)に対するBA及びBMECの増殖応答を比較した。図2aで示すように、VEGF又は虚血性血清の何れかを添加して96時間培養を行った後、CD117brightGATA−2posBAは、同じドナー由来のCD117dimGATA−2negBMECと比較して有意に高い増殖応答を示した。VEGFを添加した場合、BMECはベースラインを超えて1.2倍の増殖増加を示したのに対し、BAの増殖は2.9倍に増加を示し(p<0.01)、その一方で、心筋梗塞のLewラット由来の虚血性血清を添加した場合は、BMECの増殖は正常血清を超えて1.7倍の増加を示したのに対し、BAの増殖は4.3倍の増加を示した(p<0.01)。VEGF又は虚血性血清の何れかを添加して培養すると、GATA−2、GATA−3、及びCD117brightを含む未成熟マーカーは継続的に発現するが、成熟内皮細胞のマーカーは発現しない大型芽細胞のBA集団が著しく増殖したので(図2b)、芽細胞が分化せずに増殖したことが示唆される。内皮増殖培地を用いてフィブロネクチン上でCD34陽性単層培養を7日間行ったところ(29)、増殖の著しい敷石状パターンが観察され(図3a)、ほとんどの接着単層(>95%)において、アセチル化LDLの一定の取り込み、及びCD34、第VIII因子およびeNOSの同時発現を含む内皮細胞に特徴的な特性が認められた(図3b−e)。BMEC集団はVEGF又は虚血性血清中のサイトカインに対する増殖応答が低いため、培養中に著しく過剰増殖した内皮細胞は、おそらくGATA−2、GATA−3及びCD117brightの細胞表面への発現によって特徴付けられるBA集団が起源であろう。
次に、局所的虚血誘導後、インビボにおける遊走及び増殖特性について、骨髄由来ヒト細胞と末梢血管由来ヒト細胞との比較を行った。図4a〜cで示すように、冠動脈結紮を行い、梗塞を起こさせたヌードラットに対して、2X106個のDiI−標識ヒトCD34陽性細胞(>95% CD34純度)、CD34陰性細胞(<5% CD34純度)、又は伏在静脈内皮細胞(SVEC)を静脈注射すると、48時間後にラット心筋において同程度の浸潤が観察された(30)。局所的梗塞を伴う心臓の非疾患部位においてはほとんどDiI標識細胞は検出されず(データを示さない)、G−CSF動員CD34+細胞、成熟ヒト内皮細胞いずれも正常心筋部位には浸潤しなかったので(図4d)、細胞輸送は特に梗塞領域へと向けられた。CD34+及びCD34−細胞の虚血性心筋への遊走は同数であったが、正常心筋に対して虚血性心筋におけるヒトGATA−2のmRNA発現の比例増加率(31)は、CD34−細胞の場合と比較してCD34が非常に富む細胞を注射した場合は2.6倍に増加した(p<0.001)(図4e)。さらに、ヒトCD34+細胞を注射して2週間後に、DiI、HLAクラスI、及び第VII因子の同時発現によって定義されるヒト内皮細胞を取り込む血管を検出し得たが、CD34−細胞又はSVEcの注射後には検出されなかった(図4f)。これらの結果を考え合わせると、成人骨髄由来ヒトCD34+細胞には、局所的虚血部位からのインビボのシグナルに選択的に応答して遊走性、局在性、及び内皮分化の増大を示す集団が含有されることが示される。
次に、G−CSF動員ヒトCD34+(>95%)細胞、CD34−(<5%)細胞、末梢伏在静脈細胞、又は生理的食塩水注射による梗塞ラット心筋への機能的影響を比較した。LAD結紮後、それぞれの群の受容動物において、左心室駆出率(LVEF)が25〜43%低下し、左心室収縮終期領域は44〜90%増大し、左心室機能が著しく抑制された(図5a及びb)。驚いたことには、G−CSF動員成人ヒトCD34+細胞を注射して2週間以内に、LVEFが22±6%(p<0.001)回復した(図5a)。この影響は長期間続き、フォローアップ終了時である15週間後までに、34±4%まで増加した。その一方、G−CSF動員ヒトCD34−細胞、伏在静脈内皮細胞、又は生理的食塩水を注射しても、LVEFに対する影響は皆無であった。同様にして、G−CSF動員ヒトCD34+細胞を注射することにより、左心室収縮終期領域が、2週間後までに26±8%、15週間後までに37±6%減少したが、他の受容動物群ではこのような影響は見られなかった(p<0.001%)(図5b)。各群の代表的な心エコー例を図5Cに示す。さらに、15週間後のCD34+細胞を注射したラットの梗塞後の平均心係数は、正常ラットに対して26±8%減少したにすぎなかったが、他の各群の平均心係数は48〜59%減少した(p<0.001)(図5d)。
前記の実験により、ヒト骨髄由来内皮細胞前駆体による梗塞床の新血管新生によって、心筋虚血の齧歯類モデルにおいて、瘢痕発生を予防し、生存能力を有する心筋を維持し、心室機能を向上させることが示される。梗塞後、梗塞部位に接する生存能力を有する心筋組織が有意な程度に肥大を起こす(5、34〜35)。梗塞組織内の新血管新生は組織修復過程において不可欠な要素であると考えられているにも関わらず(36、37)、正常な状態下では、毛細血管ネットワークは組織成長に対応できず、肥大化しているが生存能力を有する心筋によるより大きい要求を支持することが不可能で、その後酸素供給及び栄養供給が不十分となりアポトーシスが引き起こされる。心筋梗塞瘢痕内の新血管新生の進展には、浸潤白血球上で発現しているウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(u−PA)によってプラスミノーゲンを活性化した後、潜在性のコラゲナーゼ及び他のプロテイナーゼを活性化することが必要であると考えられる(38)。u−PA−/−マウスにおいて、欠損している梗塞後心筋血行再建がコンジェニック(cogenic)野生型系統マウスからの骨髄移植により回復したことから、この過程において骨髄由来内皮前駆体が重要であることが示された(38)。ヒト単核細胞及び腫瘍細胞系列において、u−PA mRNA転写及び蛋白質分解活性は、コロニー刺激因子、G−CSF、M−CSF、及びGM−CSFによって有意に促進されるので(39−41)、このことは、治療によって梗塞部位の再血管形成を行うために、これらのサイトカインをインビボ又はエクスビボで使用して多数のヒト成人骨髄由来血管芽細胞を動員し、分化させ得ることの論拠となる。転写因子GATA−2の細胞表面及びRNA発現によって、虚血性部位からのシグナルに応じて増殖して梗塞部位へと移動し、その後新血管新生プロセスに関与するヒト成人骨髄由来血管芽細胞が選択的に同定されると考えられる。特に興味深いことに、GATA−2は、ET−1(強力な血管収縮物質であり、肥大作用を有する自己分泌ペプチドである)の前駆体分子であるプレプロエンドセリン−1(ppET−1)の内皮細胞転写のコファクターである(42)。ppET−1転写は、心筋梗塞後にレニン−アンジオテンシン神経ホルモン系の活性化の結果産生されるアンジオテンシンIIによっても増加するため(43)、アンジオテンシンII細胞表面受容体シグナリングとGATA−2転写活性化との相乗的作用により、梗塞床に浸潤している血管芽細胞は高レベルのET−1を分泌している可能性がある。梗塞瘢痕内に新たに形成された血管が、正常心筋内の血管よりも厚い壁を有し、より強い血管作動物質に対しても低い血管拡張反応を示すという所見(44)は、自己分泌ET−1活性促進による影響と一致し、新血管新生脈管構造が浸潤したGATA−2陽性血管芽細胞由来である可能性を支持する。
方法
1.サイトカインによって動員されたヒトCD34+細胞の精製
10mg/kgの組換えG−CSF(Amgen、CA)を4日間毎日皮下注射(SC)処置したヒトから、単一ドナーの白血球フェレーシス生成物を採取した。単核細胞をフィコール−ハイパック法によって分離し、高度に精製されたCD34+細胞(>98%陽性)を抗CD34モノクロナール抗体(mAb)(Miltenyi Biotech Ltd、CA)で被覆された磁気ビーズを用いて採取した。精製されたCD34細胞を、CD34、CD117、VEGFR−2、Tie−2、GATA−2、GATA−3、AC133、vWF、eNOS、CD54、CD62E、CXCR1、CXCR2、CXCR4に対するフルオレセイン複合mAbで染色し、FACScan(Becton Dickinson, CA)を用いた4パラメーター蛍光によって分析した。
20%の正常ラットの血清、虚血ラットの血清、又は20ng/mlのVEGFの何れかを含むRPMI培地内で、単一ドナーのCD34陽性細胞を96時間培養し、次いで、[3H]チミジン(Amersham Life Science Inc、IL、米国)(1mlCi/ウェル)を適用し、LK Betaplate液体シンチレーションカウンター(Wallace、Inc.、Gaithersburg、MD)で取込みを測定した。各条件で96時間培養した後、CD117brightGATA−2pos細胞 の比率もフローサイトメトリー法によって定量化した。
メンブレン(8mm孔)(Neuro Probe、MD)を装着した48穴の走化性チャンバー内に、高度に精製したCD34+細胞(>98%陽性)を播種した。37℃にて2時間インキュベートした後、チャンバーを反転させ、0.2、1.0、及び5.0mg/mlのIL−8、1.0mg/mlのSDF−1α/β、VEGF、及びSCFを含有する培地中で3時間にわたり細胞を培養した。前記メンブレンをメタノールを用いて固定し、Leukostat(Fischer Scientific、Ill)で染色した。10高倍率視野内で遊走する細胞を数えて化学走性を計算した。
Rowett(rnu/rnu)胸腺欠損ヌードラット(Harlan Sprague Dawley、Indianapolis、Indiana)を、「Columbia University Institute for Animal Care and Use Committee」によって承認された研究に使用した。麻酔後、左開胸を施行し、心膜を開き、左前下行(LAD)冠動脈を結紮した。擬似手術したラットには、冠動脈の周囲を縫合しないで同様の外科的処置を施行した。LAD結紮から48時間後に、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CD34、ラットIL−8(ImmunoLaboratories、日本)及びラットSDF−1(R)&D Systems、MN)、又はアイソタイプ対照抗体に対して既知の阻害活性を有するmAbの存在下又は不在下で、G−CSF動員後に単一ドナーから取り出したDiI標識された2.0×106のヒトCD34+細胞(純度>95%、40%、<2%)を尾静脈に注入した。対照動物にはLAD結紮後に生理食塩水を与えた。各グループは6〜10匹のラットからなる。注入後2日して屠殺したラットの心臓内のDiI蛍光を評価することによって、ヒト細胞を注入した後の心筋の浸潤の定量化を実施した(1高倍率視野当たりのDiI陽性な細胞の数として表され、1サンプル当たり最低5視野を調べた)。12匹のラットにおいて、基準日、2、7、及び14日目に、ラット骨髄の総集団に対するHLAクラスI陽性細胞の比率を、フローサイトメトリー法及びRT−PCR法を用いて分析することによってラット骨髄のヒト細胞による浸潤の定量化を実施した。
細胞又は生理食塩水の注入後2、6、及び15週で、高周波線形配列の変換器(SONOS 5500、Hewlett Packard、Andover、MA)を用いて、基準時間(LAD結紮から48時間後)に心臓エコー検査を実施した。乳頭の中間と頂端のレベルで2D画像を撮影した。2方向の面積長さ法(bi−plane area−length method)によって、弛緩期末期(EDV)及び収縮期末期(ESV)の左心室容積を測定し、左心室駆出率%(LVEF)を[(EDV−ESV)/EDV]×100として計算した。収縮期末期における左心室面積(LVAs)を、僧帽弁のレベルで心臓エコー検査法によって測定した。LVEFの回復及びLVAsの減少は、LAD結紮後の異なる時刻でのLVEF又はLVAsのそれぞれの数値の梗塞前数値に対する平均改善度として計算した。
ヒト細胞又は生理食塩水を注入後2週及び15週に、外植されたラットの心臓に対して組織学の研究を実施した。切除後、各実験動物からの左心室を頂端から底部まで10〜15の横断切片にスライスした。代表的な切片を組織検査のためにホルマリンに入れ、免疫ペルオキシダーゼ法を用いて抗第VIII因子mAbで新たに染色して、毛細血管の密度を定量し、又はマッソントリクロームで染色して検鏡板にのせた。デジタルプラニメーター画像解析装置を用いて、心外膜及び心内膜の両領域を含めた梗塞された表面の長さを測定し、心室総外周に対する百分率で表した。各心臓からの全切片の平均値として、最終的な梗塞サイズを計算した。
3匹の正常なラット及び12匹のLAD結紮したラットの心臓から、標準的な方法でPoly(A)+mRNAを抽出した。RT−PCR法を使用して、基準時間、LAD結紮してから6、12、24、及び48時間のラットIL−8及びGro−αのmRNAの心筋での発現を、GAPDHの発現によって測定されるラットの全RNAに対して規格化した後に数量化した。オリゴ(dT)15マー及びランダムヘキサマーでプライミングし、Monoleyマウスのリンパ増殖性ウイルス逆転写酵素(Invitrogen、Carlsbad、CA、米国)で逆転写した後、Taqポリメラーゼ(Invitrogen、Carlsbad、CA、米国)、放射標識ジデオキシヌクレオチド([α32p]−ddATP:3、000Ci/mmol、Amersham、Arlington Heights、IL)、並びにラットIL−8、Gro−α及びGAPDHに対するプライマー(Fisher Genosys、CA)を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法でcDNAを増幅した。ラットのIL−8、Gro−α及びGAPDHに対するプライマーペア(センス/アンチセンス)は、それぞれ、gaagatagattgcaccgatg(配列番号1)/catagcctctcacatttc(配列番号2)、gcgcccgtccgccaatgagctgcgc(配列番号3)/cttggggacacccttcagcatcttttgg(配列番号4)、及びctctacccacggcaagttcaa(配列番号5)/gggatgaccttgcccacagc(配列番号6)であった。2%アガロースゲルに標識された試料を加え、電気泳動法によって分離し、X線撮影のために−70℃で6時間にわたり露光した。ラットIL−8/GroホモログCINC(ImmunoLaboratories、日本)に対するポリクロナール抗体を用いた市販のELISA法によって、基準時間、LAD結紮後6、12、24、及び48時間目に、4匹のラットにおいて、ラットIL−8/Gro−αの血清量を測定した。ラットIL−8/Gro−αタンパク質の既知の量に対して作成された光学濃度(OD)値の標準曲線に従って、各血清試料中のタンパク質の量を計算した。
1.内皮前駆細胞の選択的輸送
98%を超える純度になるように、G−CSFによって動員されたヒトCD34細胞に免疫的選択を施した後、60〜80%が幹細胞因子受容体CD117を同時発現した。四重パラメーター解析によって(図7a)、CD117bright細胞の10〜15%が胚血管芽細胞の表現型特性を示し、転写因子GATA−2とGATA−3、及び内皮前駆細胞の指標となることが最近示された(79)AC133と同様に、VEGFR−2及びTie−2の低レベルの表面発現を伴うことが見出された。これらの細胞は、vWF、eNOS及びE−セレクチンなどの成熟内皮細胞のマーカーを発現していなかったが、CXCケモカイン受容体1、2、及び4に対しては陽性であった。DiI標識された2.0×106のヒトCD34+細胞(純度>98%、40%、及び2%)をLAD結紮したRowettヌードラットに静脈内注入すると、48時間でラット心筋の稠密な浸潤を伴った(図7b)。心臓の局所梗塞に影響されない部位にはDiI標識細胞はほとんど検出されず(図示せず)、DiI標識細胞は擬似手術したラットからの心筋には浸潤しなかった(図7b)ことから、これらのDiI標識細胞は特に梗塞部位に向けて輸送されていた。98%を超える純度のヒトCD34+細胞を与えたラットは、注入後2週間までに、梗塞床の微小血管分布が増加し、マトリックス沈着及び繊維症が減少することを示した(図7c)。98%を超える純度のCD34+を含む2.0×106の細胞を与えたラットの梗塞床においては、2%又は40%の何れかの純度のCD34+を含む2.0×106の細胞を与えたラットの類似の領域においてよりも、1高倍率視野当たりの第VIII因子陽性な毛細血管の数が3倍以上多くなった(p<0.01、図7c)。さらに、これらの毛細血管の大多数は、HLAクラスI分子を発現したことからヒト由来であった(図示せず)。このように、ヒト骨髄由来の様々な細胞集団が梗塞床に遊走するが、血管形成には臨界数の内皮前駆細胞が選択的に輸送されることが必要であると考えられる。
ヒト白血球の化学走性及び組織の浸潤は、特異的なケモカインとCXC細胞表面受容体との相互作用によって制御されるため、本発明者らは次に、梗塞されたラット心筋によって産生されるCXCケモカインへの虚血の影響を検討した。図8a〜cに見られるように、梗塞された心筋では、CXCR1/2に結合したELR陽性のケモカインであるIL−8及びGro−αのmRNA発現が時間に依存した増加を示し、LAD結紮後6〜12時間で発現が最大となった。非梗塞の心筋と比較して、LAD結紮後の組織は、mRNAの総含量に対して規格化した後で、これらのELR陽性の血管新生誘発性ケモカインの7.2〜7.5倍高いmRNA量を発現した(p<0.001)。さらに、血清のIL−8のレベルは、LAD結紮後6〜12時間以内に8〜10倍増加し(p<0.001)、48時間でもなお増加したままであった(図8d)。IL−8又はGro−αの何れかに対する、又はこれらの血管新生誘発性ケモカインの表面受容体(CXCR1又はCXCR2)に対する遮断mAbを同時投与すると、ヒト血管芽細胞の心筋での輸送を対照抗体に比較して40〜60%低下させた(p<0.01、図8E)。
その後の実験で、本発明者らはヒト骨髄由来CD34+血管芽細胞のIL−8に対するインビトロ及びインビボでの化学走性応答を直接測定した。図9aに示すように、ヒトCD34+細胞のインビトロでの化学走性は、濃度0.2〜5μ/mlのIL−8によって、用量に依存して誘導された。骨髄間質細胞によって恒常的に産生されるELR−ケモカインであるSDF−1は、IL−8と類似の濃度にて、ほぼ同程度のCD34+細胞の化学走性を誘導した(図9b)。これに対して、増殖因子VEGF又は幹細胞因子(SCF)によっては、化学走性は誘導されなかった。さらに、IL−8を1μg/mlだけ非梗塞の心臓内に注入すると、CD34+細胞のインビボでの化学走性を誘導したが(図9c)、対照として用いたVEGF及びSCFは何れもインビボでの化学走性に何ら効果がなかった(図9d)。これらの結果を総合すると、ELR陽性なケモカインの組織発現が亢進されると、骨髄由来の内皮前駆細胞の組織虚血部位への化学走性を誘導することによって、インビボでの血管形成が増強されることが示唆される。
LAD結紮したラットからの虚血性の血清は、静脈内に注入したヒトCD34+血管芽細胞が損傷した心筋へ輸送されるのを増強するうえに、CD34+CD117bright血管芽細胞集団の循環を急速に増大させ、同時にこれらの細胞の骨髄への輸送を増加させた。図10aに示すように、VEGF又は虚血の血清の何れかを2日間培養すると、CD34+CD117bright血管芽細胞の増殖を、それぞれ2.8倍及び4.3倍に増加させた(p<0.01)。さらに、図10bに示すように、2×106のヒトCD34陽性細胞(純度>95%)を静脈内に注入後2〜14日で、LAD結紮後の虚血ラットから得た骨髄は、正常なラットの骨髄と比較して、5〜8倍高いレベルのヒトCD34+CD117bright血管芽細胞を含有していた(p<0.001)。SDF−1は骨髄間質細胞によって恒常的に発現され、活発に循環している循環CD34+細胞の骨髄での遊走を優先的に促進するため(80)、本発明者らは、ヒトCD34+CD117bright血管芽細胞の虚血ラット骨髄へのホーミングの増加が、SDF−1/CXCR4相互作用の増大のためかどうかを検討した。図10cに示すように、ヒトCXCR4又はラットSDF−1に対するmAbの同時投与は、抗CD34対照抗体と比較して、静脈内投与されたCD34+ヒト血管芽細胞の虚血ラット骨髄への遊走を著しく阻害した(いずれもp<0.001)。さらに、ヒトCXCR4又はラットSDF−1に対するmAbの同時投与は、CD34+ヒト血管芽細胞の虚血ラット心筋への輸送を、それぞれ平均24%及び17%増加させた(いずれもp<0.001、図10d)。2週までには、ヒトCD34+細胞を抗CXCR4mAbと組合せて与えたラットの心筋梗塞床は、CD34+細胞をアイソタイプの対照抗体と組合せて与えたラットの心筋梗塞床と比較して、微小血管分布が3倍超の増加を示した。これらの結果から、静脈内注入したCD34+血管芽細胞は梗塞心筋へ輸送され、ELR+のケモカインの産生が増大するのに応答して血管形成を誘導するが、このプロセスの効率は、血管芽細胞の骨髄へのSDF−1応答性の遊走が伴うことによって著しく低下することが示唆される。CXCR4/SDF−1相互作用を遮断すると、梗塞後に、拡大され循環するヒトCD34陽性細胞集団の骨髄から心筋への輸送を再誘導し、その結果、梗塞床の新血管新生を増強させる。
LAD結紮後、左心室機能は極度に低下するが、98%を超える純度のCD34+細胞を注入すると2週間以内に左心室の大きさと機能に顕著な回復を伴い、これらの効果は経過観察した15週の全期間にわたり持続した(図11a及びb)。98%を超える純度のCD34+細胞を与えたラットでは、左心室の収縮期末期の面積が梗塞直後に比べて15週までに平均37±6%だけ減少し(図11a)、左心室駆出率(LVEF)は、15週までに平均34±4%だけ回復した(図11b、p<0.001)。純度2%又は40%のCD34+を含む、G−CSFによって動員された2×106のヒト細胞の静脈内注入が、虚血心筋へのほぼ同程度の輸送にもかかわらず心筋機能を顕著には改善しなかったことから、これらのパラメーターの改善は、注入されたCD34+細胞の数に依存する(図11a及びb)。しかし、純度40%のCD34+を含む、G−CSFによって動員されたヒト骨髄由来の細胞と共に、抗CXCR4mAbを同時投与すると、98%を超える純度のCD34+で観察されるレベルまで、LVEFの回復が顕著に改善しLVAsが顕著に減少した。トリクローム染色によって、左心室の塊及びコラーゲン沈着における顕著な差異がこれらのグループ間に観察された(図11c)。純度2%のCD34を含む2×106のヒト細胞を与えたラットでは、左心室の前壁が繊維組織によって完全に入れ替わり、中隔の著しい代償性肥大が存在した。純度40%のCD34を含む2×106のヒト細胞を与えたラットの心臓でも同様の変化が見られた。これに対して、98%を超える純度のCD34+を含む2×106のヒト細胞を与えたラットの心臓では、これより著しく大きな前壁の塊が維持され、中隔の大きさは正常であり、コラーゲンの沈着は最小限であった。特に興味深いことには、純度40%のCD34を含む2×106のヒト細胞を抗CXCR4mAbと共に与えたラットの心臓も、同様に、心筋前壁の塊の増加、中隔肥大の減少、及びコラーゲン沈着の減少を示した。総合すると、繊維性瘢痕/正常左心室心筋の平均比率は、純度2%及び40%のCD34+細胞を与えたラットが36〜45%であるのに対して、98%を超える純度のCD34+細胞を与えたラット、又は純度40%のCD34+細胞を抗CXCR4mAbと共に注入したラットでは、それぞれ、13%及び21%であった(p<0.01、図11d)。したがって、臨界数の内皮前駆細胞の選択的な輸送を増大することによって梗塞床の血管形成が増強されると、組織修復のプロセスがさらに抑制され、生存可能な心筋を救出し、心臓機能を改善することになる。
本研究は、虚血組織によって産生されるELR+ケモカインが、骨髄由来の内皮細胞前駆細胞に対して化学遊走物質の濃度勾配を生じることによって、虚血部位での代償的な血管形成の進展を制御することを実証するものである。ELR+CXCケモカインであるIL−8とELR−CXCケモカインであるSDF−1は何れも、CD34+内皮前駆細胞の化学走性、並びに成熟内皮に対して同様の効果を示すが(73)、異なる血管外の部位で発現すると、内皮前駆細胞の方向性の出現に対してそれらは生物学的に相反する影響を及ぼし、その結果、組織の新血管新生に対してもそれらは生物学的に相反する影響を及ぼす。これらの相互作用を理解することで、本発明者らは、心筋での輸送を増加させ、梗塞床の血管形成を誘導し、虚血後の心室の組織修復を抑制し、心筋機能を改善するために、ヒト骨髄由来のCD34+細胞の特異的なサブセットの化学走性特性を操作し増強することができた。
実験方法と結果
1.心筋虚血は、CCケモカイン産生を誘導してヒトCD34+血管芽細胞のCCケモカイン受容体の発現を増加させる
ヒト単核細胞の化学走性及び組織浸潤は細胞表面受容体と特定のケモカインリガンドとの相互作用によって制御されるので、血管芽細胞のCCケモカイン受容体発現及び梗塞ラット心筋によるCCケモカイン産生の速度論に対する虚血の影響を研究した。図12に示したように、LAD結紮ラットの血清と共にCD34+CD117bright血管芽細胞を培養すると、CCR1及びCCR2の表面発現は増加したが、CCR3及びCCR5の表面発現に変化はなかった。
次に、虚血性心筋へのヒトの血管芽細胞の輸送が、前記で確認したCCケモカインの誘導発現と関連するかどうかについて研究した。MCP−1、MCP−3、及びRANTESに対する遮断mAb、又はエオタキシンに対する遮断mAbを同時投与すると、ヒトの血管芽細胞の心筋への輸送が対照抗体と比較して40−60%減少した(p<0.01)、(図14)。CCケモカインが血管芽細胞の虚血性心筋への化学走性を媒介することを証明するために、エオタキシンに応じた血管芽細胞の化学走性をインビボで測定した。図15に示したように、心臓の非梗塞部にエオタキシンを心臓内注射すると、CD34+血管芽細胞輸送の1.5−1.7倍の増加が誘導されたが、成長因子VEGF及び幹細胞因子を注射しても、血管芽細胞増殖は増加するものの化学走性に何ら影響はなかった(図示せず)。
筋細胞の大きさの決定。正常なラットの心臓及び梗塞組織切片の梗塞部位並びに梗塞周囲縁、遠位部の筋細胞をトリクローム染色して、大きさを測定した。10−15倍の高倍率視野の各々について100〜200個の筋細胞の横径及び縦径(mm)をイメージプロプラスソフトウェアを用いて400xで測定した。
単一細胞レベルにおけるアポトーシスをin situで検出するために、デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)によるDNA末端標識、TUNEL法を用いた(ベーリンガーマンハイム、ドイツ・マンハイム)。生理食塩液又はCD34+ヒト細胞のいずれかを注射して2週間後のLAD結紮ラット及び陰性対照として健康なラットから、ラットの心筋組織切片を切除した。簡単に説明すると、組織を脱パラフィン化してプロティナーゼKで消化し、37℃で60分間、浸潤雰囲気中でTdT及びフルオレセイン標識dUTPとインキュベートした。フルオレセイン特異的抗体複合アルカリホスファターゼで30分間インキュベーションした後、DNAが断片化された核を青色に染色して、TUNEL染色を視覚化した。
新血管新生を誘導して心臓機能の改善をもたらす機構を研究した。LAD結紮後2週間経つと、生理食塩水対照群の梗塞周囲縁の筋細胞の外観はゆがんで形が不規則となり、筋細胞の直径は梗塞のないラットと同様となることが(0.020mm+/−0.002 対 0.019mm+/−0.001)結果から示された。一方、CD34+細胞を投与したラットの梗塞周囲縁の筋細胞の形は規則正しい楕円形をしており、対照群ラットの筋細胞より有意に大きかった(直径0.036mm+/−0.004 対 0.019mm+/−0.001、p<0.01)。筋細胞特異的マーカーであるデスミンの染色及びDNA末端標識を同時に行うと、CD34+細胞を注射したラットの梗塞した左心室では、生理食塩液対照群と比較すると、検出されたアポトーシスした筋細胞の数は6分の1であった(アポトーシス指数1.2+0.6対7.1+0.7、p<0.01)。これらの差は梗塞周囲縁内において特に顕著で、生理食塩水処理対照群の形状の不規則な小筋細胞は、アポトーシス核指数が最高であった。また、生理食塩水対照群では左心室壁の75〜80%に筋細胞のアポトーシスが広がっていたが、CD34+細胞を注射したラットでは、筋細胞のアポトーシスは梗塞部から遠位の左心室の最大20〜25%に検出されたにすぎなかった。これらの結果を総合すると、CD34+細胞注射によって誘導された梗塞領域の血管形成及び梗塞周囲の血管新生は、生理食塩水対照群において明らかな遠心性に広がるアポトーシス誘発プロセスを阻止して、梗塞周囲領域内の肥大した心筋の生存を可能にし、心筋機能を改善する。
最後の実験群によって、対照群および実験群(生理食塩液対CD34+細胞)における2週間後の梗塞周囲縁の筋細胞のアポトーシスの程度と、その後4ヶ月にわたる心筋の組織修復の進行との比較を明らかにした。LVEFが初期に減少し、LVASが増加することは同じであるが、2週間後のコラーゲン沈着又は瘢痕組織/正常な左心室心筋の平均比率は、マッソントリクローム染色によって確認したところ、生理食塩水を投与したラットでは12%であったのに対しCD34+細胞を投与されたラットでは3%であった。梗塞して15週間後では、瘢痕/正常な左心室心筋の平均比率は、CD34+細胞を投与したラットでは13%であったのに対して、それ以外の実験群(生理食塩水、CD34−、SVEC)ではいずれも36−45%であった(p<0.01)。CD34+細胞を投与したラットでは、ラット由来の筋細胞のみを含む前自由壁内に、生存可能な心筋量の有意な増加が示され、ヒトではなくラットのMHC分子を発現していることから、筋細胞はヒト幹細胞前駆体から再分化するのではなく本来の筋細胞を再利用することが確かめられた。対照群では、左心室壁厚のほとんど全体に渡ってコラーゲン沈着および瘢痕形成が広がっており、動脈瘤性拡張および典型的なEKG異常をともなっているが、CD34+細胞を投与したラットでは、左心室壁の壁厚の20〜50%のみに広がっていた。さらに、非梗塞領域における病的なコラーゲン沈着は、CD34+細胞を投与したラットでは著しく減少した。これらの結果を考え合わせると、2週間後に梗塞周囲の筋細胞においてアポトーシスの減少が観察されたことによって、肥大しているが生存可能な筋細胞の生存が延長され、15週間後までに心筋とコラーゲン及び線維組織との置換が阻止されることが示された。
梗塞周囲縁および筋細胞間で増殖した毛細血管がラット由来であることが観察され、血管形成に加えて、ヒトの血管芽細胞又は同時投与したその他の骨髄由来因子は、血管新生誘発因子の豊富な発生源となることが可能で、既存の脈管系からさらに血管新生を誘導することを可能にすることを示している。
Claims (68)
- 患者の虚血によって損傷を受けた組織における血管形成を刺激する方法であって、
(a)前記患者のある部位から幹細胞を採取することと、
(b)工程(a)で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、
(c)患者の虚血によって損傷を受けた前記組織における血管形成を前記内皮前駆細胞が刺激するように、工程(b)で得た前記内皮前駆細胞を前記患者の別の部位に導入することとを備えた方法。 - 工程(b)の後であり且つ工程(c)の前に、前記内皮前駆細胞を増殖因子と接触させることによって、前記内皮前駆細胞を増殖させる請求項1の方法。
- 前記増殖因子がサイトカインである請求項2の方法。
- 前記サイトカインがVEGF、FGF、G−CSF、IGF、M−CSF、又はGM−CSFである請求項3の方法。
- 前記増殖因子がケモカインである請求項2の方法。
- 前記ケモカインがインターロイキン−8である請求項2の方法。
- 前記内皮前駆細胞が、増殖の前に、他の幹細胞から分離される請求項3の方法。
- 前記虚血によって損傷を受けた組織が心筋である請求項1の方法。
- 前記虚血によって損傷を受けた組織が神経系組織である請求項1の方法。
- 前記幹細胞が前記患者の骨髄から採取される請求項1の方法。
- 前記骨髄からの前記幹細胞の採取が、前記患者の骨髄からの吸引によって為される請求項10の方法。
- 前記患者からの前記幹細胞の採取が、
(a)前記患者に増殖因子を導入して、前記幹細胞を前記患者の血液中に動員することと、
(b)前記幹細胞を含有する血液の試料を前記患者から採取することと
を備えた方法によって為される請求項1の方法。 - 前記増殖因子が、皮下、経口、静脈内、又は筋肉内から患者に導入される請求項12の方法。
- 前記増殖因子が動員を誘導するケモカインである請求項12の方法。
- 前記ケモカインがインターロイキン−8である請求項14の方法。
- 前記増殖因子がサイトカインである請求項12の方法。
- 前記サイトカインがG−CSF、M−CSF、又はGM−CSFである請求項16の方法。
- 前記内皮前駆細胞が、CD117の発現に基づいて回収される請求項1の方法。
- 前記内皮前駆細胞が、GATA−2被活性化遺伝子産物の発現に基づいて回収される請求項1の方法。
- 前記内皮前駆細胞が、CD34、VEGF−R、Tie−2,GATA−3、又はAC133のうちの1以上の発現に基づいて回収される請求項1の方法。
- 前記患者が、以下のうちの1以上:心筋梗塞、慢性心不全、虚血性心疾患、冠動脈疾患、糖尿病性心疾患、出血性卒中、血栓性卒中、塞栓性卒中、虚血肢、又は組織が虚血になるその他の疾病に罹患したことがある、又は罹患している請求項1の方法。
- 前記患者が虚血によって損傷を受けた組織を患う前に工程(a)が行われ、前記患者が虚血によって損傷を受けた組織を患った後に工程(c)が行われる請求項1の方法。
- 工程(b)と(c)の間の一期間に、記内皮前駆細胞が凍結される請求項1の方法。
- 増殖された後、工程(c)が行われる前の一期間に、前記内皮前駆細胞が凍結される請求項3の方法。
- 末梢循環、心筋、左心室、右心室、冠動脈、脳脊髄液、神経組織、虚血性組織、又は虚血後組織中に直接注入することによって、前記内皮前駆細胞が前記患者に導入される請求項1の方法。
- 以下のもの:プラスミノーゲン活性化因子阻害剤の阻害剤、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、又はβ−遮断薬のうちの1以上を患者に投与することをさらに備え、工程(c)の前、同時、又は後に、このような投与を行う請求項1の方法。
- 患者の梗塞周囲組織における血管新生を刺激する方法であって、
(a)前記患者のある部位から幹細胞を採取することと、
(b)工程(a)で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、 (c)前記前駆細胞を増殖因子と接触させることによって、工程(b)で回収した前記内皮前駆細胞を増殖させることと、
(d)前記患者の梗塞周囲組織における血管新生を前記内皮前駆細胞が刺激するように、工程(c)で得た増殖した前記内皮前駆細胞を前記患者の別の部位に導入することとを備えた方法。 - 患者の虚血によって損傷を受けた組織における内皮前駆細胞を増加する方法であって、
(a)前記患者に内皮前駆細胞を投与することと、
(b)前記患者にケモカインを投与し、損傷を受けた組織における内皮前駆細胞を引き付けることとを備えた方法。 - 前記ケモカインが、内皮前駆細胞を投与する前に患者に投与される請求項28の方法。
- 前記ケモカインが、内皮前駆細胞と同時に患者に投与される請求項28の方法。
- 前記ケモカインが、内皮前駆細胞を投与する後に患者に投与される請求項28の方法。
- 前記ケモカインがCXCケモカインである請求項28の方法。
- 前記CXCケモカインがインターロイキン−8、Gro−α、又は間質由来因子−1である請求項28の方法。
- 前記ケモカインがCCケモカインである請求項28の方法。
- 前記CCケモカインがRANTES、EOTAXIN、MCP−1、MCP−2、MCP−3、又はMCP−4である請求項34の方法。
- 患者の末梢循環、心筋、左心室、右心室、冠動脈、脊髄液、神経組織、虚血性組織、又は虚血後組織への注入によって、前記ケモカインが前記患者に投与される請求項28の方法。
- 患者の虚血によって損傷を受けた組織への内皮前駆細胞又は血管芽細胞の輸送を増加させる方法であって、間質由来因子−1とCXCR4との何らかの相互作用を阻害することを備えた方法。
- 間質由来因子−1(SDF−1)とCXCR4との相互作用が、前記患者に抗SDF−1又は抗CXCR4モノクローナル抗体を投与することによって阻害される請求項37の方法。
- アンギオテンシン変換酵素阻害剤、AT1−受容体遮断薬、又はβ遮断薬を前記患者に投与することをさらに備えた請求項38の方法。
- 患者の骨髄への内皮前駆細胞の輸送を減少させる方法であって、前記患者の骨髄での間質由来因子−1の産生を阻害することを備えた方法。
- SDF−1の産生が、患者に抗SDF−1又は抗CXCR4モノクローナル抗体を投与することによって阻害される請求項40の方法。
- 患者の癌を治療する方法であって、前記癌に伴って増殖している細胞によって産生された特異的ケモカインのエピトープに対して誘導されたモノクローナル抗体を前記患者に投与して、このような増殖している細胞への内皮前駆細胞の輸送を減少させることによって前記患者の前記癌を治療することを備えた方法。
- 患者の癌を治療する方法であって、前記癌に伴って増殖している細胞によって産生された特異的ケモカインに対する特異的受容体であり、内皮前駆細胞上に位置する特異的受容体のエピトープに対して誘導されたモノクローナル抗体を前記患者に投与して、このような増殖している細胞への内皮前駆細胞の輸送を減少させることにより、前記患者の前記癌を治療することを備えた方法。
- 患者の腫瘍を治療する方法であって、内皮前駆細胞上の特異的な受容体に対するアンタゴニストを前記患者に投与して、前記患者の腫瘍における血管形成を誘導する前記前駆細胞の能力を減弱せしめることにより、前記腫瘍を治療することを備えた方法。
- 患者の腫瘍を治療する方法であって、内皮前駆細胞上の特異的な受容体に対するアンタゴニストを前記患者に投与して、前記患者の腫瘍における血管新生を誘導する前記前駆細胞の能力を減弱せしめることにより、前記腫瘍を治療することを備えた方法。
- 前記受容体がCD117である請求項57又は58の方法。
- 内皮前駆細胞又はマスト前駆細胞中に存在する目的の遺伝子を発現させる方法であって、GATA−2モチーフを含有するプロモーターと前記目的の遺伝子とを含むベクターを前記細胞中に挿入することを備えた方法。
- 前記ベクターがトランスフェクションによって前記細胞中に挿入される請求項47の方法。
- 前記プロモーターがプレプロエンドセリン−1プロモーターである請求項62の方法。
- 前記プロモーターが哺乳動物起源である請求項64の方法。
- 前記プロモーターがヒト起源である請求項65の方法。
- 癌によって産生される特異的なケモカインのエピトープに対して誘導されたモノクローナル抗体であって、前記癌への内皮前駆細胞の輸送を低減させる効果を有する一定量のモノクローナル抗体と、薬学的に許容される担体とを備えた組成物。
- 患者の異常を治療する方法であって、
前記異常は、前記患者におけるGATA−2被活性化遺伝子産物の発現によって治療され、
(a)前記患者のある部位から幹細胞を採取することと、
(b)工程(a)で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、 (c)工程(b)で採取した内皮前駆細胞の中からGATA−2を発現している内皮前駆細胞を回収することと、
(d)工程(c)でGATA−2を発現しているとして回収された前記細胞がGATA−2被活性化遺伝子産物を発現するように誘導することと、
(e)前記患者の別の部位に、GATA−2被活性化遺伝子産物を発現している工程(d)で得られた前記細胞を導入して前記異常を治療することとを備えた方法。 - 患者の異常を治療する方法であって、
前記異常は、前記患者におけるGATA−2被活性化遺伝子産物の発現によって治療され、
(a)前記患者のある部位から幹細胞を採取することと、
(b)工程(a)で採取した前記幹細胞からマスト前駆細胞を回収することと、
(c)工程(b)で採取したマスト前駆細胞の中からGATA−2を発現しているものを回収することと、
(d)工程(c)でGATA−2を発現しているとして回収された前記細胞がGATA−2被活性化遺伝子産物を発現するように誘導することと、
(e)前記患者の別の部位に、GATA−2被活性化遺伝子産物を発現している工程(d)で得られた前記細胞を導入して前記異常を治療することとを備えた方法。 - 前記異常が虚血によって損傷を受けた組織である請求項53又は54の方法。
- 前記遺伝子産物がプロエンドセリンである請求項53又は54の方法。
- 前記遺伝子産物がエンドセリンである請求項53又は54の方法。
- 心筋梗塞に罹患した患者の心筋の機能を改善させる方法であって、
(a)前記患者中のある部位から幹細胞を採取することと、
(b)前記幹細胞からCD117を発現する細胞を回収することと、
(c)前記細胞が前記患者の心筋の機能を改善するように、前記患者の異なる部位に前記回収した細胞を導入することとを備えた方法。 - 前記患者が哺乳動物起源である請求項42、43、44又は45の何れかに記載の方法。
- 前記哺乳動物がヒト起源である請求項59の方法。
- 患者の虚血によって損傷を受けた組織における血管形成を刺激する方法であって、
(a)同種異系の幹細胞を取得することと、
(b)工程(a)で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、 (c)前記内皮前駆細胞が患者の虚血によって損傷を受けた前記組織における血管形成を刺激するように、工程(b)で回収した前記内皮前駆細胞を前記患者に導入することとを備えた方法。 - 前記同種異系の幹細胞が、胚、胎児、又は臍帯血を起源として得られる請求項61の方法。
- 患者の虚血によって損傷を受けた組織における血管新生を刺激する方法であって、
(a)同種異系の幹細胞を取得することと、
(b)工程(a)で採取した前記幹細胞から内皮前駆細胞を回収することと、
(c)前記内皮前駆細胞が患者の虚血によって損傷を受けた前記組織における血管新生を刺激するように、工程(b)で回収した前記内皮前駆細胞を前記患者に導入することとを備えた方法。 - 前記同種異系の幹細胞が、胚、胎児、又は臍帯血を起源として得られる請求項63の方法。
- 心筋梗塞に罹患した患者の心筋の機能を改善する方法であって、前記患者にG−CSFを注入して内皮前駆細胞を動員することを備えた方法。
- 心筋梗塞に罹患した患者の心筋の機能を改善する方法であって、前記患者に抗CXCR4抗体を注入することを備えた方法。
- 内皮前駆細胞を前記患者に導入することをさらに備えた請求項66の方法。
- 前記患者にG−CSFを導入して内皮前駆細胞を動員することをさらに備えた請求項67の方法。
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