JP2013040167A

JP2013040167A - 抗ウイルス剤組成物

Info

Publication number: JP2013040167A
Application number: JP2012159593A
Authority: JP
Inventors: Jun Sato; 惇佐藤; Hiromi Kubota; 浩美久保田; Takehisa Yano; 剛久矢野; Yoshiko Miyahara; 佳子宮原
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2011-07-20
Filing date: 2012-07-18
Publication date: 2013-02-28
Also published as: WO2013012007A1

Abstract

【課題】刺激性、腐食性が少なく、ウイルス不活化効果、特にノロウイルスのような非エンベロープ型ウイルスに対して優れた不活化効果を有する抗ウイルス剤組成物の提供。
【解決手段】次の成分（Ａ）及び（Ｂ）を含有する抗ウイルス剤組成物。
（Ａ）ジアルキルジメチルアンモニウム塩及びアルキルベンジルジメチルアンモニウム塩から選ばれる１種以上の第４級アンモニウム塩０．０５vol％以上０．５vol％以下
（Ｂ）ベンジルアルコール０．５vol％以上２vol％以下
【選択図】なし

Description

本発明は、ウイルス不活化効果を有する抗ウイルス剤組成物に関する。

インフルエンザや風邪等に代表されるウイルス性の感染症は手指や環境の洗浄が重要な予防法の１つと考えられている。その中でも、ウイルス性の急性胃腸炎や下痢症は介護施設や学校、病院等での集団感染として確認されるだけでなく、レストランや調理施設等においても汚染された食品を介した食中毒による集団感染としても数多く報告されている。これらの原因ウイルスとして、非エンベロープウイルスであるノロウイルスやサポウイルス、ロタウイルス等が挙げられ、小児や高齢者への感染は重篤な症状を引き起こすことがある。また、代表的な小児感染症である手足口病や家畜に甚大な被害をもたらす口蹄疫の原因ウイルスも非エンベロープウイルスに分類され、これらの予防法としても手指や環境の衛生対策は非常に重要である。

特に、ノロウイルスは非細菌性の食中毒および急性胃腸炎の原因ウイルスとして日本国内のみならず、世界中で検出されている。食中毒の原因としては、従来、黄色ブドウ球菌やセレウス菌等の細菌が知られているが、近年、急性胃腸炎を引き起こすノロウイルスによる食中毒が、食中毒発生件数の約２５％、患者数では全体の約半分を占め、最も多くなっており、集団感染を引き起こすウイルスとして問題視されている。感染経路は、生カキ等の貝類を食することによる経口感染がよく知られているが、家庭や公共施設等において、汚染食品に触れた人の手指や調理器具上、患者の嘔吐物や糞便中、あるいは患者の周辺環境に存在しているウイルスからの二次感染も数多く報告されている。特にこのような二次感染は、集団感染や感染拡大につながり、患者数の増加の大きな原因となっている。

このようなノロウイルスによる食中毒や感染を防止するためには、集団給食施設や飲食店等の大量調理施設や厨房スペース等の床面や壁面、食品加工機器、調理器具等、あるいは家庭における床面や壁面、調理器具、家具類、繊維製品等、さらには公共施設等の床面や壁面、設備、医療機器等などの除ウイルスやウイルスの不活性、および手指の洗浄などの衛生対策を実施することが非常に重要であり、それらの対策は、人や環境を配慮し、且つ簡便に実施されることが望ましい。

ノロウイルスは、カリシウイルス科、ノロウイルス属に分類されているエンベロープ（膜状構造）を持たないＲＮＡウイルスであり、酸性（胃酸）に対して強い抵抗力を有し、少量（１０〜１００個程度）で感染することが知られている。
現状では、ノロウイルスに対するワクチンや治療薬は存在せず、原因となり得る食品や調理器具、手指の洗浄や消毒等により除ウイルスやウイルス不活性化をすることでノロウイルス感染を予防することが唯一の対処法である。しかしながら、ノロウイルスは、物理化学的抵抗性が強いため、多くの細菌類に対して有効であるエタノールやカチオン界面活性剤を含む消毒剤などもノロウイルスに対しては一般的な使用法において十分な効果を得られない場合がある。そのため、ノロウイルスの不活化には、塩素系漂白剤（次亜塩素酸ナトリウム等）やヨード剤（ポビドンヨード等）、アルデヒド剤（グルタラール等）、過酢酸製剤などの消毒剤が使用されている。しかしながら、斯かる消毒剤は、人に対して刺激が強く、また金属を腐食するという問題がある。また、塩素系漂白剤などでは繊維の色柄などを漂白する作用があり、繊維製品や衣類への使用においては制限が生じる。そのため、使用者の安全や使用する対象物および使用場面を考慮すると、生活環境、手指や調理器具、衣類等にこれらの薬剤を用いることには制限がある。

したがって、近年、刺激性や腐食性が少なく、あるいは繊維製品にも使用できるウイルスを不活化できる手段が求められ、例えば、低級アルコール、アルカリ性物質及びカチオン界面活性剤を含む組成物（特許文献１）、過酸化水素、ベンジルアルコール及び銀成分を含有する組成物（特許文献２）、特定のアミン及び／又は第四級アンモニウム塩と、特定のアルカノールアミン類を含む組成物（特許文献３）、第四級アンモニウム塩を有効成分とし、ｐＨが５〜９である組成物（特許文献４）、あるいは天然物タンニンを含有する植物抽出物を有効成分とする組成物（特許文献５）が報告されている。

しかしながら、これらの組成物においても、ウイルスの不活性化効果を発揮するのに時間がかかるために手指の消毒や洗浄作業に用いるには効果が不十分であったり、短時間で効果を発揮することが期待されていてもウイルス感染力価の減少が不十分だったりする等のウイルス不活化効果の点で、未だ充分であるとは云えない。また、アルカリ性である、あるいは特定成分を含むなどその組成上限られた製品処方にのみしか応用できないなどの問題もある。

特開２００８−１８９６４５号公報特開２００９−４０７６０号公報特表２００５−５１４４２７号公報特開２０１０−５３０９１号公報国際公開第２００８／１５３０７７号パンフレット

本発明は、刺激性、腐食性が少なく、ウイルス不活化効果、特にノロウイルスのような非エンベロープ型ウイルスに対して優れた不活化効果を有する抗ウイルス剤組成物を提供することに関する。

本発明者らは、ノロウイルス等の非エンベロープ型ウイルスの感染防止に有効な成分について検討したところ、特定の第４級アンモニウム塩とベンジルアルコールを組み合わせて用いた場合に、当該第４級アンモニウム塩を単独で用いた場合よりもウイルス不活化効果が大きく上昇し、抗ウイルス剤組成物として有用であることを見出した。

本発明は、以下の１）及び２）に係るものである。
１）次の成分（Ａ）及び（Ｂ）を含有する抗ウイルス剤組成物。
（Ａ）ジアルキルジメチルアンモニウム塩及びアルキルベンジルジメチルアンモニウム塩から選ばれる１種以上の第４級アンモニウム塩０．０５vol％以上０．５vol％以下
（Ｂ）ベンジルアルコール０．５vol％以上２vol％以下
２）（Ａ）ジアルキルジメチルアンモニウム塩及びアルキルベンジルジメチルアンモニウム塩から選ばれる１種以上の第４級アンモニウム塩に、（Ｂ）ベンジルアルコールを併用することを特徴とする、前記第４級アンモニウム塩のウイルス不活化効果の増強方法。

本発明の組成物は、ノロウイルス等の非エンベロープ型ウイルスに対して、優れた抗ウイルス作用を有し、且つ刺激性、腐食性が少ないことから、これを用いることにより、安全に、且つ短時間で、大量調理施設、厨房スペース等の床面や壁面、医療機器、食品加工機器、調理器具等に付着した当該ウイルスを不活化できる。さらに、一般家庭における住居内の床面や壁面、家具等に付着したウイルスの不活性化や手指の消毒に有効に使用できる。

ＮｏＶＶＬＰｓのＴＥＭ写真。ａ）コントロール、ｂ）サニゾールC：BA = 0.05%：2.00%, 30秒接触

成分（Ａ）の第４級アンモニウム塩である、ジアルキルジメチルアンモニウム塩及びアルキルベンジルジメチルアンモニウム塩は、抗菌性のカチオン界面活性剤として公知の化合物である。これらは、単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
本発明において、ジアルキルジメチルアンモニウム塩及びアルキルベンジルジメチルアンモニウム塩としては、好ましくは、それぞれ、ジアルキル（Ｃ_8-18）ジメチルアンモニウム塩、アルキル（Ｃ_12-16）ベンジルジメチルアンモニウム塩が挙げられる。

すなわち、ジアルキルジメチルアンモニウム塩におけるアルキル基としては、炭素数８〜１８のアルキル基、好ましくは炭素数８〜１８の直鎖アルキル基が挙げられる。具体的には、例えばオクチル、デシル、ドデシル（ラウリル）、テトラデシル（ミリスチル）、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）が挙げられ、より好ましくはオクチル、デシル、ドデシルである。

また、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩におけるアルキル基としては、炭素数１２〜１６のアルキル基、好ましくは炭素数１２〜１６の直鎖アルキル基が挙げられる。具体的には、例えばドデシル（ラウリル）、テトラデシル（ミリスチル）、ヘキサデシル（セチル）が挙げられる。

好適なジアルキルジメチルアンモニウム塩としては、ジデシルジメチルアンモニウム塩が挙げられ、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩としては、ドデシルベンジルジメチルアンモニウム塩、テトラデシルベンジルジメチルアンモニウム塩、ヘキサデシルベンジルジメチルアンモニウム塩が挙げられる。

アンモニウム塩は、Ｆ^-、Ｃｌ^-、Ｂｒ^-、Ｉ^-等のハロゲン化物イオン、ＮＯ₃ ^-、及びＳＯ₄ ^2-等との塩が挙げられるが、ハロゲン化物イオンとの塩が好ましく、塩化物イオンとの塩がより好ましい。

より好適な第４級アンモニウム塩として、ドデシルベンジルジメチルアンモニウムクロライド、テトラデシルベンジルジメチルアンモニウムクロライド、ヘキサデシルベンジルジメチルアンモニウムクロライド、ジデシルジメチルアンモニウムクロライドを挙げることができる。

上記本発明の第４級アンモニウム塩は、公知の方法を用いて製造することができ、市販品を用いることも可能である。例えば、ジアルキルジメチルアンモニウム塩としてコータミンD10P（花王（株）製）、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩として、サニゾール08、サニゾールC（花王（株）製）等を購入して用いることができる。

上記第４級アンモニウム塩は、単独でも６０分程度の接触時間では、ノロウイルス（ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）による代替実験による）に対して不活化効果を示すが、短時間ではその効果は不十分であり、長時間あるいは高濃度で用いなければ有意な不活化効果が認められない。

成分（Ｂ）のベンジルアルコールは、市販品を購入して用いることができる。例えば、関東化学（株）や東京化成工業（株）の製品を購入して用いることができる。
尚、抗ウイルス作用に影響を及ぼさない範囲で、ベンジルアルコールと共に、他の有機溶剤を混合して用いることができる。

上記（Ａ）第４級アンモニウム塩及び（Ｂ）ベンジルアルコールを含有する本発明の組成物では、第４級アンモニウム塩のノロウイルス（ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）による代替実験による）に対する抗ウイルス活性が格段に向上し、第４級アンモニウム塩を単独で用いた場合には抗菌力を十分に発揮し得ない濃度及び接触時間においても、優れたウイルス不活化効果を発揮する。

本発明の組成物は、ウイルスの感染又は増殖能力を除去又は著しく低下させるウイルス不活化効果を発揮するものであればよく、ウイルス粒子や核酸（ＲＮＡ）を変性させたり、崩壊させたりするものでも、ウイルスや宿主細胞の表面への吸着やウイルスと酵素との結合等により、結果的にウイルスの感染又は増殖能力を低減又は阻害させることができるものでもよい。

ここで、「ウイルス」としては、好適には、非エンベロープ型ウイルス、すなわちエンベロープを持たない一本鎖（＋）ＲＮＡウイルス、一本鎖（−）ＲＮＡウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルス、一本鎖ＤＮＡウイルス、および二本鎖ＤＮＡウイルスが挙げられる。斯かるウイルスとしては、カリシウイルス科、ピコルナウイルス科、パルボウイルス科、パピローマウイルス科、ポリオーマウイルス科、アデノウイルス科に属するウイルスが挙げられる。
本発明の組成物は、上記の中でも、カリシウイルス科ウイルス（一本鎖（＋）ウイルス）に対する不活化効果に優れており、カリシウイルス科ウイルスの中でも、ベシウイルス属、ノロウイルス属及びサポウイルス属に属するウイルスに対する不活化効果に優れ、特にベシウイルス属とノロウイルス属に属するウイルスに対する不活化効果に優れている。

本発明の組成物において、成分（Ａ）と（Ｂ）の質量比は、（Ａ）／（Ｂ）が３／１〜１／５００、より３／１〜１／４０、更に２／１〜１／１０であるのが好ましい。

本発明の組成物は、成分（Ａ）及び（Ｂ）のみで、或いは必要に応じて、抗ウイルス活性の更なる向上や効果の持続性等を図るために、他の成分、例えば、キレート剤、水溶性溶剤、その他の界面活性剤等と共に、大量調理施設、厨房スペース等の床面や壁面、医療機器、食品加工機器、調理器具等の洗浄等に使用される製品や製剤および各種住環境に使用される製品や製剤（例えば、台所用洗剤、蛇口ケア剤、風呂用洗剤、トイレ用洗剤、床や家具の掃除用品等）や衣類や繊維製品に使用される製剤に抗ウイルス活性を付与するための素材として使用することができる。

ここで、キレート剤としては（１）トリポリリン酸、ピロリン酸、オルソリン酸、ヘキサメタリン酸及びこれらのアルカリ金属塩、（２）エチレンジアミン四酢酸、ヒドロキシイミノ二酢酸、ジヒドロキシエチルグリシン、ニトリロ三酢酸、ヒドロキシエチレンジアミン三酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、トリエチレンテトラミン六酢酸及びこれらのアルカリ金属塩もしくはアルカリ土類金属塩、（３）アミノトリメチレンホスホン酸、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸、アミノトリメチレンホスホン酸のＮ−オキサイド及びこれらのアルカリ金属塩もしくはアルカリ土類金属塩、（４）アクリル酸及びメタクリル酸から選ばれるモノマーの単一重合体又は共重合体、アクリル酸−マレイン酸共重合体、ポリα−ヒドロキアクリル酸及びそのアルカリ金属塩、（５）クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸、マロン酸、マレイン酸から選ばれる多価カルボン酸及びそれらのアルカリ金属塩から選ばれる１種以上、（６）アルキルグリシン−Ｎ，Ｎ−ジ酢酸、アスパラギン酸−Ｎ，Ｎ−ジ酢酸、セリン−Ｎ，Ｎ−ジ酢酸、グルタミン酸二酢酸、エチレンジアミンジコハク酸又はこれらの塩等が挙げられる。

また、本発明の組成物には、さらに、例えば、油分、高級脂肪酸、シリコーン類、ｐＨ調整剤、増粘剤、懸濁剤、粉末成分、天然抽出物、色素、香料等の添加剤を適宜配合し、撹拌混合して分散又は溶解させる、抗ウイルス剤組成物を製造するために使用することができる。

ここで、ｐＨ調整剤としては塩酸や硫酸など無機酸や、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸、マロン酸、マレイン酸などの有機酸などの酸剤や、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム、アンモニアやその誘導体、モノエタノールアミンやジエタノールアミン、トリエタノールアミンなどのアミン塩など、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどのアルカリ剤を、単独もしくは複合して用いても構わない。また、これらの酸剤とアルカリ剤を組み合わせて緩衝剤系として用いても構わない。
上記組成物は、上記のｐＨ調整剤により、２０℃におけるｐＨが２〜１２になるように調整することが好ましく、特にｐＨ４〜１１になるようにすることがヒトや基材への影響の点から好ましい。

本発明組成物中の成分（Ａ）の第４級アンモニウム塩の含有量は、０．０５vol％以上０．５vol％以下であるが、抗ウイルス活性の観点から、より好ましくは０．１vol％以上、更に好ましくは０．２vol％以上であり、製品等への配合の観点から、０．５vol％以下、０．２vol％以下、０．１vol％以下が挙げられる。例えば０．０５〜０．５vol％、０．１〜０．５vol％、０．２〜０．５vol％、０．０５〜０．２vol％、０．０５〜０．１vol％、０．１〜０．２vol％等が挙げられる。
成分（Ｂ）のベンジルアルコールの含有量は、０．５〜２vol％であるが、抗ウイルス活性の点から、より好ましくは１vol％以上、更に好ましくは１．５vol％以上であり、基材損傷性や配合の観点から２vol％以下、１．５vol％以下、１．０vol％以下が挙げられる。例えば、０．５〜２vol％、０．５〜１vol％、０．５〜１．５vol％、１〜２vol％等が挙げられる。

本発明の組成物は、ウイルスの付着のおそれがある箇所、例えば、台所（厨房の床、壁等の厨房スペース等）、流し台、冷蔵庫等の食品を取り扱う場所、包丁、鍋等の調理器具、皿等の食器類、冷蔵庫、トイレ、バス、洗面所、居室、寝室等の居住空間、ソファー、クッション、寝具、カーテン等の繊維製品等に対して、これらに接触させることにより用いることができる。ここで、接触は、特に限定するものではなく、組成物を対象面へ直接かけること、トリガーやエアゾール等の噴霧装置に充填し噴霧することなどが挙げられる。

本発明の組成物を接触させるに際しての使用形態に特に制限はない。例えば、液状、ゲル状、又はペースト状とすることができる。
液状の場合には、特にスプレー、ローション等として用いることができる。例えば、トリガースプレー容器（直圧又は蓄圧型）やディスペンサータイプのポンプスプレー容器等の公知のスプレー容器に充填し、噴霧量を調整して、ウイルスが存在する、又は存在すると考えられる場所に噴霧できるようにしたもの等が挙げられる。

また、ウェット拭取り用品（ぬれナプキン等）として使用することもできる。例えば、天然繊維、レーヨン等の再生繊維、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル等の合成繊維、又は天然繊維と合成繊維との混合物の織布又は不織布ウェブを含む基材に、本発明の組成物、可溶化キャリア、及び必要に応じて各種添加剤を含ませて使用することができる。具体的には、皮膚コンディショナーや、ペットの手入れ用品、家庭の台所やバスルーム等の表面、運動器具等の表面の殺菌等に使用することができる。

水溶性ゲルや油性ゲルを用いてゲル状にしたり、ペースト状とした場合には、医療用品として、人体、ペット等に直接塗布して使用したり、紙や不織布等に担持させたものを、空気清浄器のフィルターとして用いることもできる。

さらに、本発明の組成物を樹脂に混練して使用することもできる。混練しうる樹脂としては、天然系、石油系、合成系のワックス、ロジン系樹脂、エチレン−酢酸ビニル共重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリエステル、ポリオレフィン、アクリル系樹脂等の合成樹脂等が挙げられる。
上記の混練物は、そのまま用いることもできるし、多孔質担体に担持させたり、シート状にしたり、該シート状物を積層体にして用いることもできる。多孔質担体としては、例えば、セルロース、キトサン等の天然高分子、上記の合成樹脂、ケイ酸カルシウム等の無機多孔性物質等を、粒状、シート状等の任意の形状にしたものが挙げられる。上記の混練物や積層体は、例えば、空調設備、トイレ、浴室、居間、病室、病院の待合室、ダストボックス等に設置して、抗ウイルス剤組成物を徐々に揮散させながら利用することもできる。

上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞次の成分（Ａ）及び（Ｂ）を含有する抗ウイルス剤組成物。
（Ａ）ジアルキルジメチルアンモニウム塩及びアルキルベンジルジメチルアンモニウム塩から選ばれる１種以上の第４級アンモニウム塩０．０５vol％以上０．５vol％以下
（Ｂ）ベンジルアルコール０．５vol％以上２vol％以下
＜２＞（Ａ）ジアルキルジメチルアンモニウム塩及びアルキルベンジルジメチルアンモニウム塩から選ばれる１種以上の第４級アンモニウム塩に、（Ｂ）ベンジルアルコールを併用することを特徴とする、前記第４級アンモニウム塩のウイルス不活化効果の増強方法。
＜３＞次の成分（Ａ）及び（Ｂ）を含有する組成物を用いるウイルス不活化方法。
（Ａ）ジアルキルジメチルアンモニウム塩及びアルキルベンジルジメチルアンモニウム塩から選ばれる１種以上の第４級アンモニウム塩０．０５vol％以上０．５vol％以下
（Ｂ）ベンジルアルコール０．５vol％以上２vol％以下
＜４＞ウイルスの付着のおそれがある箇所に前記組成物を接触させる＜２＞の方法。
＜５＞ウイルス不活化のための、次の成分（Ａ）及び（Ｂ）を含有する組成物の使用。
（Ａ）ジアルキルジメチルアンモニウム塩及びアルキルベンジルジメチルアンモニウム塩から選ばれる１種以上の第４級アンモニウム塩０．０５vol％以上０．５vol％以下
（Ｂ）ベンジルアルコール０．５vol％以上２vol％以下
＜６＞（Ａ）ジアルキルジメチルアンモニウム塩及びアルキルベンジルジメチルアンモニウム塩から選ばれる１種以上の第４級アンモニウム塩のウイルス不活化効果を増強するための、前記（Ａ）の第４級アンモニウム塩と併用する（Ｂ）ベンジルアルコールの使用。
＜７＞上記＜１＞〜＜６＞において、成分（Ａ）は、より好ましくは０．１vol％以上、より好ましくは０．２vol％以上であり、そして０．５％以下、０．２vol％以下、０．１vol％以下である。
＜８＞上記＜１＞〜＜６＞において、成分（Ｂ）は、より好ましくは１vol％以上、より好ましくは１．５vol％以上であり、そして２vol％以下、１．５vol％以下、又は１．０vol％以下である。
＜９＞上記＜１＞〜＜６＞において、成分（Ａ）と（Ｂ）の質量比は、好適には（Ａ）／（Ｂ）が３／１〜１／５００であり、より好適には３／１〜１／４０であり、更に好適には２／１〜１／１０である。
＜１０＞上記＜１＞〜＜９＞において、（Ａ）の第４級アンモニウム塩は、好適にはオクチルベンジルジメチルアンモニウムクロライド、ドデシルベンジルジメチルアンモニウムクロライド及びジデシルジメチルアンモニウムクロライドから選ばれる１種以上である。
＜１１＞上記＜１＞〜＜９＞において、好適に適用されるウイルスは非エンベロープ型ウイルスである。
＜１２＞上記＜１＞〜＜９＞において、好適に適用されるウイルスはノロウイルス属に属するウイルスである。

以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１
（１）抗ウイルス剤の調製
（ａ）の第４級アンモニウム塩としてアルキルベンジルジメチルアンモニウムクロライド（サニゾールＣ（花王製）、直鎖アルキル（炭素数１２〜１６の混合物）ベンジルジメチルアンモニウムクロライド）およびジデシルジメチルアンモニウムクロライド（花王製）を、（ｂ）としてベンジルアルコール（ＢＡ、(WAKO)）を用い、滅菌水にて希釈して、下記表１〜表３に示した濃度になるように調製した。

（２）試験ウイルス及びウイルス浮遊液の調製
試験ウイルスは、Feline calicivirus F-9 ATCC VR-782（ネコカリシウイルス（FCV））を用いた。ノロウイルスは培養系が確立されていないため、ノロウイルスの代替ウイルスとして、形態および遺伝子情報から同じカリシウイルス科に分類されているネコカリシウイルスが用いられており、ウイルス感染力を確認する方法が一般的に採用されている（Journal of Hospital Infection, 41, p51-57, 1999）。
使用細胞はＣＲＦＫ (Crandell Rees feline kidney) 細胞（大日本住友製薬）を用いた。使用培地は細胞増殖培地としてイーグルＭＥＭ「ニッスイ」（１）（日水製薬）に１０％牛胎仔血清を添加したものを用いた。細胞維持培地としてイーグルＭＥＭ「ニッスイ」（１）に２％牛胎仔血清を添加したものを用いた。

細胞増殖培地を用い、ＣＲＦＫ細胞を組織培養用フラスコ内に単層培養した。単層培養後にフラスコ内から細胞増殖培地を除き、試験ウイルスを接種した。次に、細胞維持培地を加えて３７℃±１℃の炭酸ガスインキュベーター（ＣＯ₂濃度：５％）内で１〜５日間培養した。培養後、倒立位相差顕微鏡を用いて細胞の形態を観察し、細胞変性効果（cytopathic effect; CPE）が起こっていることを確認した。次に、培養液を遠心分離（３，０００ｒｐｍ，１０分間）し、得られた上澄み液をウイルス浮遊液とした。

（３）ウイルス不活化試験
表１〜表３に記載したそれぞれの検体１ｍｌにウイルス浮遊液０．１ｍｌを添加、混合し、作用液とした。室温で作用させ、試験１は５，１０，２０及び３０分後に細胞維持培地を用いて希釈した。また、試験２は０．５，１及び５分後に同様に希釈した。ただし、希釈は予備試験により確認した希釈濃度で行った。なお、対照として精製水を用いて同様に試験し、開始時にウイルス感染力価の測定を行った。

（４）ウイルス感染力価の測定方法
細胞増殖培地を用い、使用細胞を組織培養用マイクロプレート（９６ｗｅｌｌ）内で単層培養した後、細胞増殖培地を除き細胞維持培地を０．１ｍｌずつ加えた。次に、作用液を細胞維持培地を用いて１０倍段階希釈した。各作用液の希釈液０．１ｍｌを４ｗｅｌｌずつに接種し、３７℃±１℃の炭酸ガスインキュベーター（ＣＯ₂濃度：５％）内で４〜７日間培養した。培養後、倒立位相差顕微鏡を用いてＣＰＥの有無を観察し、Reed-Muench法（The American journal of hygiene, 27, 493-497, 1938）により50%組織培養感染量（Tissue Culture Infectious Dose; TCID50）を算出して作用液１ｍｌ当たりのウイルス感染価に換算した。

（５）試験結果
ＢＡ単独では、５分間の接触でＦＣＶの感染力価を減少させないことを確認した（表１）。アルキルベンジルジメチルアンモニウムクロライド単独（０．０５％）では、ＦＣＶの５分間の接触で感染価を２．２ｌｏｇＴＣＩＤ₅₀しか減少しないのに対し、アルキルベンジルジメチルアンモニウムクロライド（０．０５％）に１．０％および２．０％のＢＡを添加することでそれぞれ５分および０．５分の接触で４ｌｏｇＴＣＩＤ₅₀感染価が減少し、アルキルベンジルジメチルアンモニウムクロライドとＢＡの併用により短時間で高い抗ウイルス効果を発揮することが確認された（表２）。同様にジデシルジメチルアンモニウムクロライド単独（０．０５％）では５分で２．４ｌｏｇＴＣＩＤ₅₀しか感染価が減少しないのに対して、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド（０．０５％）に０．５％ＢＡを添加すると５分で、２％ＢＡを添加したときは０．５分で４ｌｏｇＴＣＩＤ₅₀の減少が確認された（表３）。このことから、本発明のカチオン性界面活性剤とＢＡは併用することで高いＦＣＶ不活化効果（ノロウイルス不活化効果）を短時間で発揮できることが示された。

実施例２
（１）試験液の調製
（ａ）の第４級アンモニウム塩としてアルキルベンジルジメチルアンモニウムクロライド（サニゾールＣ（花王製）、直鎖アルキル（炭素数１２〜１６の混合物）ベンジルジメチルアンモニウムクロライド）およびジデシルジメチルアンモニウムクロライド（ＤＤＡＣ；花王製）を、（ｂ）としてベンジルアルコール（BA, (WAKO)）を用いた。
（２）Novirus virus-like particles (NoV VLPs) 形状に対する評価試験方法
ＮｏＶＶＬＰｓはノロウイルスを構成するカプシドタンパク質を大量に発現させ、精製したものであり、カプシドタンパク質が自己集合することで、粒子構造をとっている。遺伝因子であるＲＮＡを有していない以外は、形態学的にも免疫学的にもノロウイルスと同様であることが確認されている（Hansman, G. S., et al. Genetic and antigenic diversity among noroviruses. J. Gen. Virol. 87:909-919, 2006）。
ＮｏＶＶＬＰｓは、上記Hansman, G. S.らの方法に従い、バキュロウイルスを用いた組換えタンパク質の大量発現系を用いて作製した（非特許文献１）。即ち、バキュロウイルスのゲノムにＮｏＶＶＬＰｓを構成する構造タンパク質をコードする遺伝子（accession No. AB365435）の構造タンパク質をコードする遺伝子領域をベクターに組み換え、組換えバキュロウイルスを作製し、昆虫細胞に感染させることで組換えタンパク質を大量に発現させ、ＮｏＶＶＬＰｓを回収・精製した。
表４、５、６に示した値の２倍濃度の試験液を作製し、ＮｏＶＶＬＰｓ溶液と等量混合した。０．５，１，５分間接触させた後、３０μＬを抜き取り、試験液の除去操作を行った。即ち、抜き取った３０μＬをマイクロチューブに分取した３６０μＬのＳＭ−２Ｂｉｏ−ｂｅａｄｓ懸濁液（５０％ｗ／ｖ）に接触させ、２分間攪拌した後、上清１０μＬをＴＥＭ観察に供した。ＳＭ−２ｂｉｏｂｅａｄｓは５０（ｗ／ｖ）％になるように１０ｍＭＨＥＰＥＳに懸濁し、オートクレーブ滅菌したものを使用した。
接触試験後のＮｏＶＶＬＰｓはＴＥＭ（Transmission Electron Microscope;透過型電子顕微鏡）観察に供試し、その粒子構造の変化を捉えることで各試験液の抗ノロウイルス効果を予想した。

（３）ネガティブ染色方法
ＴＥＭ観察用のグリッドは、銅製コロジオン膜貼り付け４００メッシュ（カーボン蒸着補強）（日新ＥＭ）を用い、使用直前にイオンスパッタ（E-1030:日立）にてクリーニングモードでグロー放電（１ｍＡ，３０ｓｅｃ）を行い、グリッド表面野を親水化した。サンプル上清１０μＬを速やかにグリット上に滴下し、約３分後にキムタオルを用いてグリッド上の余分な水分をゆっくりと吸い取った。約１分間乾燥させ、次に、パラフィルム上に滴下しておいた染色液（２％リンタングステン酸溶液：ｐＨ６．８）にサンプル上清を吸着させたグリッド面を接触させ、約１分後にキムタオルを用いてグリッド上の余分な染色液をゆっくりと吸い取った。その後、０．４５μｍフィルターを通したイオン交換水１０μＬをグリッド上に滴下し、３０秒間洗浄後、キムタオルを用いてグリッド上の余分な水分吸い取り、十分に乾燥させた。

（４）ＴＥＭ観察方法
染色した試料は、透過型電子顕微鏡Ｈ７６５０（日立）を用いて、加圧電圧１０ｋＶ、ＥｍｉｓｓｉｏｎＣｕｒｒｅｎｔ１０μＡ、コンデンサーレンズ目盛りＮｏ．２、対物レンズ目盛りＮｏ．３の条件で速やかに観察した。

（５）ＴＥＭ観察による粒子形状評価結果
− ：効果が全く期待できない（粒子構造に変化無）
−／＋：効果がほとんど期待できない（わずかに変形した粒子有）
＋：効果がわずかに期待できる（半数程度の粒子が変形）
＋＋：効果が期待できる（変形した粒子形状が大多数）
＋＋＋：顕著な効果が期待できる（変形した粒子のみ）

ＢＡ単独で５分間の接触ではＮｏＶＶＬＰｓの粒子構造が全く変化しないことが確認された（表４）。アルキルベンジルジメチルアンモニウムクロライド単独（０．０５％）では５分間の接触でわずかにＮｏＶＶＬＰｓの粒子構造の変形が確認されるのに対し、アルキルベンジルジメチルアンモニウムクロライド（０．０５％）に０．５％，１．０％，２．０％のＢＡを添加することで各々５，１，０．５分の接触で効果が期待できる程度の粒子形状の変化が確認され、抗菌剤／溶剤の併用によりノロウイルスに対しても短時間で抗ウイルス効果を発揮することが示唆された（表５）。同様にジデシルジメチルアンモニウムクロライド（ＤＤＡＣ）単独（０．０５％）では効果がわずかに期待できる程度しか粒子形状の変化が観察されなかったのに対して、ＤＤＡＣ（０．０５％）にＢＡを０．５％を添加すると１分で、さらに２．０％のＢＡを添加したときは０．５分で効果が期待できる程度の粒子形状の変化が観察された（表６）。このことから、カチオン性界面活性剤とＢＡは併用することで抗ノロウイルス効果を短時間で発揮できることが示唆された。
サニゾールC （0.05%）及びBA（2.00%）を0.5分添加した場合のＴＥＭ写真を図１に示した。図１より、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩及びベンジルアルコールを併用して作用させたことで、ノロウイルスの構造タンパク質のみで構成されたNorovirus virus like particles (NoV VLPs) の粒子構造が変形した状態が確認された。

Claims

次の成分（Ａ）及び（Ｂ）を含有する抗ウイルス剤組成物。
（Ａ）ジアルキルジメチルアンモニウム塩及びアルキルベンジルジメチルアンモニウム塩から選ばれる１種以上の第４級アンモニウム塩０．０５vol％以上０．５vol％以下
（Ｂ）ベンジルアルコール０．５vol％以上２vol％以下
（Ａ）の第４級アンモニウム塩が、ドデシルベンジルジメチルアンモニウムクロライド、テトラデシルベンジルジメチルアンモニウムクロライド、ヘキサデシルベンジルジメチルアンモニウムクロライド及びジデシルジメチルアンモニウムクロライドから選ばれる１種以上である請求項１に記載の組成物。
ウイルスが非エンベロープ型ウイルスである請求項１又は２に記載の組成物。
ウイルスがノロウイルス属に属するウイルスである請求項１又は２に記載の組成物。
（Ａ）ジアルキルジメチルアンモニウム塩及びアルキルベンジルジメチルアンモニウム塩から選ばれる１種以上の第４級アンモニウム塩に、（Ｂ）ベンジルアルコールを併用することを特徴とする、前記第４級アンモニウム塩のウイルス不活化効果の増強方法。