JP2013040113A - フィラグリン産生促進剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】γ−オリザノールを0.5〜3質量%含有する米糠油を有効成分として含有するフィラグリン産生促進剤。
【選択図】 図1
Description
米糠油の調製:
原料の米糠の抽出油にスチーム混和し、遠心分離によって水相に含まれるガム質を除去した。次いで脱ガム処理後の米糠にn−ヘキサンを加え均一に溶解し、0℃以下の低温で冷却濾過しロウ物質を凝固物として除去した。次いでn−ヘキサンを留去し、真空蒸留することにより脱酸処理した後、活性白土のろ布濾過によって脱色し、さらに真空加熱をして脱臭処理を行って米糠油を得た。得られた米糠油の脂質の組成について、液体クロマトグラフィーにより分析した。結果を表1に示す。市販品(コメヌカ油;築野食品工業株式会社)の組成も表1に併せて示す。
フィラグリン遺伝子の発現強度の評価(リアルタイムPCR法):
製造例1で得られた米糠油によるフィラグリン遺伝子の発現強度への影響を評価した。ヒト表皮角化細胞を1×104個/wellの細胞密度にて、角化細胞増殖培地(TOYOBO)を用いて96 well plateに播種した。24時間培養後、所定の濃度の試料を含む角化細胞基礎培地に交換し48時間培養した(試料は100%エタノールに所定の濃度となるように溶解し、これを角化細胞基礎培地で100倍希釈して調整した)。細胞は、CellAmp Direct RNA Prep kit(TAKARA Bio)を用いてtotal RNAを抽出し、Primescript RT Master mixを用いてcDNAを合成した。Filaggrin (HA127836, TAKARA Bio)およびGAPDH(HA067812,TAKARA Bio)のプライマーを用いて、LightCycler 480 Realtime System(Roche社)によりmRNA発現量を求めた。同様にして、市販品の米糠油(コメヌカ油;築野食品工業株式会社)、イソプロピルパルミテート、トリカプリル・カプリン酸グリセリド、スクワランについても評価した。結果を図1に示す。
フィラグリンタンパク産生量の評価(Dot-blot法):
製造例1で得られた米糠油によるフィラグリンタンパクの産生量への影響を評価した。表皮細胞を1.0×104cells/wellの細胞密度にてKG2培地(クラボウ)を用いて96穴培養プレートに播種した。24時間培養後、所定の濃度の試料を含むウシ脳下垂体抽出物未含有KG2培地に交換し、72時間培養した(試料は100%エタノールに所定の濃度となるように溶解し、これをウシ脳下垂体抽出物未含有KG2培地に100倍希釈して調製した)。細胞はPBS(-)にて洗浄したのち、0.5%TritonX-100(2mMPMSF含有)を加え、超音波処理を行って細胞を破砕した。細胞破砕液をニトロセルロース膜に一定量プロッティングし、一晩乾燥した。乾燥後の転写膜を1%BSAinPBSに浸漬し、室温にて1時間ブロッキングを行った。その後、PBS(-)にて洗浄し、抗ヒトfilaggrin抗体(Anti-Filaggrin(ARGENE))を1:4000の希釈濃度で転写膜上に添加した。室温で1時間反応させた後、PBSにて洗浄した。その後、ヒストファインシンプルステインMAX-PO(M)(ニチレイ)を1:100の希釈濃度で転写膜上に添加し、室温で1時間反応させた。PBS(-)にて洗浄後、Lumi-Light Western Blotting Substrate(Roche)を転写膜上に添加し、1分後にライトキャプチャー(ATTO株式会社)を用いてスポット画像を得た。得られたスポット画像の各スポットの輝度をCS Analyzer Version2.0(ATTO株式会社)を用いて定量した。Filaggrin産生量の変化は、filaggrin由来の発光輝度の定量値を同時に定量したタンパク量にて除することにより補正し、試料未処理細胞(コントロール)の補正値を100とした百分率、Index(%)で表した。それぞれのfilaggrin産生量変化は、Student t検定をもちいて有意差検定を行い、コントロールとの差を評価した。結果を図2に示す。またスポット画像を図3に示す。
ヘアレスマウスを用いたフィラグリン産生の蛍光免疫染色:
8週齢のHos:HR-1マウスを用いて、背部皮膚に製造例1で得られた米糠油150μLを1日1回、2週間反復塗布した。試験終了時に皮膚を採取し、速やかに凍結させ、4%CMC包埋し、凍結切片をFilaggrin polyclonal antibody(Covance Research Products)で蛍光免疫染色を施した。結果を図4に示す。
皮膚外用ローションの調製:
下記処方の皮膚外用ローションを下記製法により製造した。
(処方)
製造例1の米糠油 0.8%
POE(15)セチルエーテル 5%
濃グリセリン 5%
フェノキシエタノール 0.3%
ジプロピレングリコール 1%
ヒアルロン酸ナトリウム 0.01%
精製水 残部
(製法)
精製水以外の成分を加熱混合し、均一溶解後、精製水を溶解原料へゆっくりと撹拌しながら投入し、皮膚外用ローションを得る。
入浴剤の調製:
下記処方の入浴剤を下記製法により製造した。
(処方)
製造例1の米糠油 30%
モノステアリン酸ソルビタン 4%
POE(20)オレイルエーテル 3%
香料 0.9%
1,3−ブチレングリコール 5%
フェノキシエタノール 0.3%
メチルパラベン 0.3%
ブチルパラベン 0.1%
精製水 残部
(製法)
精製水以外の成分を加熱混合し、均一溶解後、加熱された精製水を溶解原料へゆっ
くりと撹拌しながら投入し、乳化物が得られたら冷却をし、入浴剤を得る。
Claims (6)
- γ−オリザノールを0.5〜3質量%含有する米糠油を有効成分として含有するフィラグリン産生促進剤。
- 米糠油が植物ステロールを1〜5質量%含有するものである請求項1記載のフィラグリン産生促進剤。
- 皮膚外用剤である請求項1または2に記載のフィラグリン産生促進剤。
- 入浴剤である請求項3記載のフィラグリン産生促進剤。
- 請求項1または2に記載のフィラグリン産生促進剤を有効成分として含有するアトピー性皮膚炎の予防・治療剤。
- 請求項1または2に記載のフィラグリン産生促進剤を有効成分として含有する尋常性魚鱗癬の予防・治療剤。
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JP2011176494A JP2013040113A (ja) | 2011-08-12 | 2011-08-12 | フィラグリン産生促進剤 |
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Citations (8)
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2011
- 2011-08-12 JP JP2011176494A patent/JP2013040113A/ja active Pending
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