JP2013005791A - RrhJ1IIヌクレアーゼおよびその遺伝子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ロドコッカスロドクロウス(Rhodococcusrhodochrous)J−1株からのニッキング酵素活性を有する新規ヌクレアーゼの単離、該酵素のアミノ酸配列の決定、およびこれをコードする遺伝子の塩基配列の決定。前記新規ヌクレアーゼ遺伝子を発現する組換え菌によるRrhJ1IIヌクレアーゼの製造方法。
【選択図】なし
Description
本発明の新規ヌクレアーゼタンパク質は、以下の(A)、(B)または(C)のタンパク質である。
(A)配列番号2記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
(B)配列番号2記載のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつニッキング酵素活性を有するタンパク質
(C)配列番号2記載のアミノ酸配列と相同性が80%以上のアミノ酸配列からなり、かつニッキング酵素活性を有するタンパク質
具体的には、本発明の新規ヌクレアーゼ遺伝子は、以下の(a)、(b)または(c)のDNAを含む。
(a)配列番号1記載の塩基配列からなるDNA
(b)配列番号1記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつニッキング酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号1記載の塩基配列からなるDNAと相同性が80%以上の塩基配列からなり、かつニッキング酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA
本発明の新規ヌクレアーゼは、ロドコッカス ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)J−1株から、発明者らにより初めて単離された。ロドコッカス ロドクロウスJ−1株(以下、「J1菌」ともいう)はFERM BP−1478として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に寄託されている菌株である。
本発明のRrhJ1IIヌクレアーゼ遺伝子は、上記したRrhJ1IIヌクレアーゼタンパク質をコードする遺伝子である。本発明のRrhJ1IIヌクレアーゼ遺伝子は、例えば配列番号1に記載の塩基配列からなるDNAを含む。
本発明は、RrhJ1IIヌクレアーゼ遺伝子を含む組換えベクターも提供する。本発明の組換えベクターは、上記酵素をコードする遺伝子の上流に転写プロモーター、場合によっては下流にターミネーターを挿入して発現カセットを構築し、このカセットを発現ベクターに挿入することにより作製することができる。あるいは、発現ベクターに転写プロモーターおよび/またはターミネーターがすでに存在する場合には、発現カセットを構築することなく、ベクター中のプロモーターおよび/またはターミネーターを利用して、その間に当該酵素をコードする遺伝子を挿入すればよい。
本明細書において、ターミネーターは、例えば、trpオペロンターミネータをあげることができるが、これに限定されるわけではない。
本発明の組換えベクターを宿主に導入することで、本発明の形質転換体を作製することができる。
5−1 細胞系による製造
本発明のRrhJ1IIヌクレアーゼは、形質転換体を培養して、培養物中よりRrhJ1IIヌクレアーゼの特徴(例えば、ニッキング酵素活性)を有する活性を有するタンパク質を採取することによりRrhJ1IIヌクレアーゼを製造することができる。
本発明においては、無細胞タンパク質合成系を用いて、本発明のRrhJ1IIヌクレアーゼ遺伝子または本発明のベクターから、RrhJ1IIヌクレアーゼを製造することも可能である。
6.1 RrhJ1IIヌクレアーゼの認識配列
RrhJ1IIヌクレアーゼの認識配列を調べるために、たとえば前述のような方法で配列番号1に示される遺伝子を発現可能に組み込んだベクターで宿主細胞を形質転換し、その培養物からRrhJ1IIヌクレアーゼ活性を有するタンパク質を得る。得られたタンパク質を、片方の鎖の5'末端に蛍光標識を持ち、配列内に種々のT/Gミスマッチを持つ二本鎖オリゴDNAを合成して活性測定用の試料と接触させた後、変性剤と加熱によりDNAを一本鎖に変性させてSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、化学発光による検出を行って、切断パターンを解析すると、J1菌ヌクレアーゼの認識配列を決定することができる。本発明のRrhJ1IIヌクレアーゼは、以下の二重鎖デオキシリボ核酸中の下記式1
J1菌染色体DNAの調製
ロドコッカス ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)J−1株を100mlのMYKG培地中、30℃にて72時間振盪培養した。
RrhJ1IIヌクレアーゼ遺伝子のPCR
RrhJ1IIヌクレアーゼ遺伝子をPCRで増幅するためのプライマーを以下の方法で設計した。
A:DNA mismatch endonuclease Vsr(Rhodococcus equi ATCC33707)
B:NaeI very short patch repair endonuclease(Rhodococcus erythropolis SK121)
C:Very short patch repair protein(Rhodococcus jostii RHA1)
D:DNA mismatch endonuclease (Rhodococcus erythropolis PR4)
E:DNA mismatch endonuclease(Rhodococcus
opacus B4)
鋳型DNA(J1菌染色体DNA,実施例1) 1μl
10×Ex Buffer(タカラバイオ社) 10μl
150μMプライマーDG−01(配列番号3) 1μl
150μMプライマーDG−02(配列番号4) 1μl
2.5mM dNTP 8μl
DMSO 10μl
滅菌水 18μl
ExTaq DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社)1μl
総量 50μl
DG−01:5’−GA(T/C)CCIGCIACITCIGCICGIATG−3’(配列番号3)
DG−02:5’−CCAIACICGIACIACIGTCCA−3’(配列番号4)
RrhJ1IIヌクレアーゼ遺伝子のクローニング
(1)ゲノミックサザンハイブリダイゼーション
ApaLI,BamHI,ClaI,Eco52I,EcoT14I,KpnI,MluI,NcoI,NotI,PvuI,SacI,XbaI,XhoIそれぞれで消化したJ1菌ゲノムDNAに対し、後述の方法で調製したRrhJ1IIのプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、Eco52Iで消化した断片から、約1.2kbの単一シグナルが得られた。
実施例2で調製したPCR産物をGFX PCR DNA band and Gel Band Purification kit(GEヘルスケア バイオサイエンス社)を用いて精製した。精製したPCR産物に対してAlkPhos Direct Labeling kit(GEヘルスケア バイオサイエンス社)を用い、添付のマニュアルにしたがってラベリングを行い、RrhJ1IIのプローブとした。
J1菌ゲノムDNAを制限酵素Eco52Iで分解して0.7%アガロースゲル電気泳動で分離し、ゲルからGFX PCR DNA band and Gel Band Purification kit(GEヘルスケア バイオサイエンス社)を使用して約1.2kbの断片を回収した。得られた断片は、pBluescriptII SK(+)ベクター(Stratagene社製)にDNA ligation kit<Mighty mix>(タカラバイオ社製)を用いて連結した。反応条件は以下の通りである。
ligation mighty mix(タカラバイオ社製) 5μl
J1菌ゲノムDNA/Eco52I切断断片 4μl
pBluescriptII SK(+)/Eco52I切断断片 1μl
総量 10μl
16℃,1時間
大腸菌JM109株をLB培地1mlに接種し、37℃で5時間好気的に前培養した。
次に、前培養液0.4mlをSOB培地40ml(2%バクトトリプトン、0.5%バクトイーストエキス、10mM NaCl,2.5mM KCl,1mM MgSO4,1mM MgCl2)に加え、18℃で20時間培養した。得られた培養物を遠心分離(3,700×g,10分間、4℃)により集菌した後、冷TF溶液(20mM PIPES−KOH(pH6.0),200mM KCl,10mM CaCl2,40mM MnCl2)を13ml加え、0℃で10分間放置し、再度遠心分離(3,700×g,10分間、4℃)して上清を除いた。得られた大腸菌菌体を冷TF溶液3.2mlに懸濁し、0.22mlのジメチルスルホキシドを加え、0℃で10分間放置した後、液体窒素を用いて凍結したものをコンピテントセルとした。
大腸菌組換体によるRrhJ1IIヌクレアーゼの生産
(1)RrhJ1IIヌクレアーゼ発現プラスミドの構築
RrhJ1IIヌクレアーゼを得るために、実施例1で得られたJ1菌染色体DNAを鋳型として使用し、以下に示す反応液組成およびプライマーを用いてPCRを行った。この際、RrhJ1IIヌクレアーゼをHis−tag融合タンパクとして発現させるため、RrhJ1IIヌクレアーゼ遺伝子上流にSD配列とHis−tag配列を付加した。
鋳型DNA(J1菌染色体DNA) 1μl
2×PCR Buffer KOD FX(東洋紡) 25μl
10μMプライマーN(配列番号7) 1.5μl
10μMプライマーC(配列番号8) 1.5μl
2mM dNTP 10μl
KOD FX DNAポリメラーゼ(東洋紡) 1μl
総量 50μl
N:5'−AGTGAATTCCTTTAAGAAGGAGATATACCATGCATCATCATCATCATCACATGGCGTCGTCGGAT−3'(配列番号7)
C:5'−GCCAAGCTTTCACCCCCGCGCCGGTTT−3'(配列番号8)
(1)で作製したRrhJ1IIヌクレアーゼ発現ベクターを含む大腸菌組換体(JM109/pRR01)を、100μg/mlアンピシリンを含むLB液体培地10mlで37℃,5時間培養した後、1mlを100μg/mlアンピシリン、1mM IPTGを含むLB液体培地100ml×1本に植菌し、37℃,18時間培養した。培養液を遠心分離によって回収し、回収した菌体を破砕用緩衝液(組成 20mM Sodium Phosphate,0.5M NaCl,20mM イミダゾール、10% グリセロール、pH7.4)に懸濁した後4℃で10分間超音波による破砕を行った。破砕液を遠心分離し、得られた上清を無細胞抽出液とした。この無細胞抽出液をHis−tag精製カラム(His Trap HP:GE Healthcare)を用いて精製した。精製タンパク質はElution Buffer(0.5M NaCl,0.5M イミダゾール、20mM Sodium Phosphate,10%グリセロール、pH7.4)にて溶出し、2つのフラクションに分画してフラクション1,フラクション2とした。
(2)で調製した精製酵素を用いて、RrhJ1IIヌクレアーゼ活性を調べた。活性は片方の鎖の5'末端にビオチン標識を持ち、配列内にT/Gミスマッチを1箇所持つ二本鎖オリゴDNAを用いてそのニッキング活性を測定した。
1.5μM基質DNA(配列番号9〜18) 2μl
100mM Tris−HCl(pH7.5) 2μl
100mM MgCl2 2μl
1mg/ml BSA 2μl
総量 20μl
配列番号4:プライマーDG−02
配列番号7:プライマーN
配列番号8:プライマーC
配列番号9:二本鎖オリゴDNA01
配列番号10:二本鎖オリゴDNA02
配列番号11:二本鎖オリゴDNA03
配列番号12:二本鎖オリゴDNA04
配列番号13:二本鎖オリゴDNA05
配列番号14:二本鎖オリゴDNA06
配列番号15:二本鎖オリゴDNA07
配列番号16:二本鎖オリゴDNA08
配列番号17:二本鎖オリゴDNA09
配列番号18:二本鎖オリゴDNA10
Claims (8)
- 以下の(A)、(B)または(C)のタンパク質。
(A)配列番号2記載のアミノ酸配列を含むタンパク質
(B)配列番号2記載のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつニッキング酵素活性を有するタンパク質
(C)配列番号2記載のアミノ酸配列と相同性が80%以上のアミノ酸配列からなり、かつニッキング酵素活性を有するタンパク質 - 請求項1に記載のニッキング酵素活性が、二重鎖デオキシリボ核酸中の下記式1:
- 請求項1または2に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
- 以下の(a)、(b)または(c)のDNAを含む遺伝子。
(a)配列番号1記載の塩基配列からなるDNA
(b)配列番号1記載の塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつニッキング酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号1記載の塩基配列からなるDNAと相同性が80%以上の塩基配列からなり、かつニッキング酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA - 請求項3または4に記載の遺伝子を含む組換ベクター。
- 請求項5記載の組換ベクターを含む形質転換体。
- 請求項6記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からニッキング酵素活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
- 請求項1または2記載のニッキング酵素活性を有するタンパク質を、無細胞タンパク質合成法を用いて合成し、反応液より該ニッキング酵素活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
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