JP2012524894A - 凝固をモニタするための側方流動分析装置及びその方法 - Google Patents
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Abstract
Description
酸素プラズマ及びアルゴンを用いて、基材を事前に処理することと、
プラズマ化学気相成長法(PECVD)によって、基材にSiOxを付着させることと、
を具備する方法が提供される。
i)その液体サンプルの凝固を加速させ、
ii)血液サンプル全体にわたって、より一様に分布した凝血塊を形成し、及び
iii)流量の制御された変化及び/又はその画成された流路ゾーンに沿った、液体サンプルの流動停止を確実にする改良された側方流動分析装置をもたらすことに気付いた。
・異なる材料を、単一の基材表面のいくつかの領域に付着させることができる。例えば、検査チャネル全体、又は初期段階だけは、パターン化して、(必要な試薬物質が付着されて乾燥される)複数の領域に分けることができる。それらの異なる領域は、一旦、乾燥工程が完了すると、あるいは、試薬物質の混合を防ぐための高度の疎水性サブ領域を形成することにより除去される、テープ(例えば、片面粘着性感圧接着剤であるPSA等)からなる層によって互いに分離することができる。
・材料の混合物の傾斜付着、又は、その検査チャネルの始点及び終点からの傾斜付着。
・予混合なしに、材料が付着された後に乾燥される箇所への層の付着も可能である。
側方流動装置の特性は、表面多孔性及び粗面性等を含むいくつかの要因によって大きく影響を受ける可能性がある。そのため、当該装置に対する適切なプラットホーム又は基材の選択が極めて重要である。このようなベース/基材材料は、非特異的相互作用及び好ましくないタンパク質吸着を最小限にするために、化学的に不活性でかつ生体適合性がなければならない。低粗面性及び低多孔性も必要である。良好な光学特性、高耐熱性及び低い製造コストも有益である。
本発明において、側方流動アッセイ基材材料は、血液又は血漿の凝固を加速させる表面改質材又は界面化学剤(すなわち、いわゆる「コーティング材料」)の付着によって改質することができる。このようにして、基材表面の化学的性質を変えるように、添加材料からなる膜、層又はコーティングが基材表面に付着される。
i.本発明の第1の観点において明確にしたように、表面改質された基材は、血液凝固過程を増進又は促進する様々な材料、このましくは、凝固剤フィブリノゲン又はトロンビン、いわゆる以下に挙げる「試薬物質」を用いて、さらに改質してもよい。従って、表面改質それ自体が、血液凝固過程を増進又は促進することができる。このような改質は、表面親水性を向上させ、及び側方流動分析装置内でのフローを容易にすることを目的としている。その結果、そのような試薬は、上記の(i)及び(ii)による改質が行われた後に、その基材表面に付着させることができる。
ii.本発明の第2の観点で明確にしたように、金属酸化物、好ましくは、SiOxからなるコーティングが、側方流動分析装置の表面に付着される。理想的には、金属酸化物、好ましくは、SiOxは、PECVD(プラズマ化学気相成長法)を用いて付着される。
本発明の側方流動分析装置が、活性凝固時間[ACT]、活性化部分トロンボプラスチン時間[aPTT]等の内因性の凝固経路を用いた分析、又はプロトンビン分析[PT]等の外因経路を用いた分析の誘導に適していることは理解されるであろう。
凝固の有用な測定法は、プロトロンビン時間(PT)検査である。PT検査は、血液又は血漿の組織因子誘導性の凝固を測定する。これは、外因性凝固経路の評価を与えることができ、また、因子I、II、V、VII及びXに反応する。この検査は、トロンボプラスチン及びCa2+等の凝固剤を患者のサンプルに添加して、血栓形成の時間を測定することによって行われる。
血液又は血漿の凝固の測定の別の方法は、活性化部分トロンボプラスチン時間検査(APTT)である。この検査は、内因経路が活性化されたときに起きる凝固の時間の測定である。これは、カルシウムイオン及びリン脂質(部分トロンボプラスチン)がある場合のサンプルへの活性化因子(カオリン)の添加によって実現される。APTTは、因子I、II、V、VIII、IX、X、XI及びXIIを含む内因性凝固経路を評価するのに用いられる。リン脂質からなる表面での複雑さの生成は、プロトロンビンをトロンビンに変換できるようにし、そしてそのことが血栓形成をもたらす。
この検査は、APTTに似ており、経皮経管冠動脈形成術(PCTA)及び心肺バイパス手術等の、大量のヘパリンの投薬を伴う手術中に患者の凝固状態をモニタするのに用いられる。ACT検査は、血栓塞栓症の治療を受ける患者にとっての、及び体外循環中の患者にとっての、ヘパリン治療の制御のための最良の臨床検査の1つと考えられている。ヘパリンを摂取している患者の場合、ACTの延長は、血中のヘパリン濃度に直接比例する。モニタは重要であり、ヘパリンの過少摂取又は過剰摂取はそれぞれ、病的血栓形成状態又は重篤な出血状況をもたらす可能性がある。この検査は、セライト、カオリン又はガラス等の凝固活性化因子の添加後に凝固時間を測定する。
この検査は、通常の血漿対照と比較した、フィブリノゲンに対するトロンビンの作用による血漿中のフィブリン血栓形成の速度を測定する。その検査は、血小板が除かれている患者の血漿に、標準的な量のトロンビンを添加して、凝血塊が形成される時間を測定することによって実行される。その検査は、播種性血管内凝固症候群や肝疾患の診断に利用されてきており、また、一般的には、中央検査室で行われる。これは、フィブリノゲンの定性的な測定である。以下に記載されているクラウス法は、フィブリノゲンの存在量の定量的測定である。
凝固分析は、第IX因子欠乏を示す因子Villa等の特定の因子を対象とする凝固分析が開発されている。別の実例は、血友病の検査の構成要素となる因子VIIIの分析である。他の検査は、活性化ペプチド因子IXa、抗トロンビン、プロテインC及びプロテインSのレベル、フィブリノゲン欠損、ループス抗体、又は血液粘性に関連する何らかの病態、病状を測定するための分析を含む。
全般的な文脈において、本発明の装置は、液体サンプルを所望の手順で処理することのできる少なくとも1つの流路及び機能的手段を備えた基材を具備し、この場合、少なくとも1つの流路は、機能的手段への、その手段を通る、及びその手段からの液体サンプルの輸送のためのパターンを形成するように配置されている。このようにして、流路は、基材から上方へ突出する複数の微小ポストで構成され、それらの微小ポスト間の間隔は、液体サンプルが付けられた箇所から液体サンプルを移動させるために、流路のどこかに付けられた液体サンプル中での毛細管現象を誘導するような間隔になっている。
a.酸素プラズマ及びアルゴンによってその基材を処理することと、
b.プラズマ化学気相成長法(PEVCD)を用いて、その基材にSiOxを付着させることと、を具備する。
(二酸化ケイ素を有する環状ポリオレフィン基材の改質及び特性化のための方法)
(材料)
B2.2 COP Amic(登録商標)チップ(Åmic BV(スウェーデン)により供給されている)
・高さ:65〜70μm、上部直径:ca 50μm、底部直径:ca 70μm、及びcc:185×85μm(列状のピラーの中心間の距離:85μm、行状のピラーの中心間の距離:185μm)。
18.3MΩcm以上の比抵抗を有する、Millipore Milli-Q water purification system(Millipore、米国)からの水;
98%以上のグレードのヘキサメチルジシロキサン(HMDSO)(Sigma-Aldrich);
高純度のアルゴン/酸素(Premier、99.9%)(Air Products Ireland Ltd.);
水性食用色素溶液(Goodall's(商標));
96ウェルの黒い側部で、透明ベースの微量測定用プレート(Greiner Bio-One);
トロンビン比色分析試薬S-2238(Chromogenix);
正常なクエン酸ヒト血漿(Hemosil);
粘着剤(PSA)(AR8890)(Adhesives Research)。
(SiOx付着)
付着プロセスは、Prasad[22,34]によって記載されたPECVDによるステンレス鋼へのSiOx付着のためのプロセス条件下で、13.56MHzの高周波PECVD炉内で行った。しかし、付着プロセス条件は、COP基材上に所望の膜特性を実現できるように変更した。付着プロセスに必要なガス(アルゴン、酸素及びSiOx前駆物質のHMDSO)は、付着チャンバに接続されたマスフローコントローラを介してそのチャンバに供給した。ソースからマニホールド及びチャンバまでつながるHMDSOの供給ラインは、ステンレス鋼で形成し、その前駆物質の凝縮を防ぐように、温度制御された加熱テープを用いて、55℃まで加熱した。サンプルは、SiOx付着の前に、酸素プラズマを用いて処理した。
原子間力顕微鏡法(AFM)イメージングは、10nm以下の曲率半径、40N/mのバネ定数及び300kHzの共振周波数(いずれも公称値)を有する標準的なシリコンカンチレバー(BudgetSensors、Tap300Al)を利用して、(Nanoscope IIIa electronicsを備えた)Dimension 3100を用いて、Tapping Mode(商標)で大気中で行った。トポグラフィーイメージは、1〜2Hzの走査速度で記録した。表面粗度は、AFMの製造会社のソフトウェア(NanoscopeIII,V5.12)を用いて評価した。ナノメートルで計算した二乗平均平方根(Rms)イメージを、平均水準からの高さ偏差の平均として定義した。2〜3個のサンプル上の4〜5箇所を走査して、粗さの値を得た。Rms値(nm)を平均した。また、サンプルは、膜厚に関しても分析した。スライドの一部は、コーティング後に除去できるテープで被覆した。4つのサンプルの走査から得られた値を平均した。
基材の表面エネルギは、ビデオベースの接触角アナライザ(First Ten Angstroms, FTA200)によって測定した。各サンプルに対して、3〜6つのデータ点を採用し、接触角(CA)を、同じサンプルの数箇所で測定した。その表面の経時的な安定性を確認するために、CAは、数週間にわたって定期的に測定した。
PECVDによりシリコンウェーハ上に付着したSiOx膜は、COP基材上に付着させた本発明者等のSiOx膜における化学的結合構造を解明するために適用した減衰全反射(ATR)モードで、窒素雰囲気中でZnSe結晶を用いて、フーリエ変換赤外(FT−IR)分光計(Perkin Elmer Spectrum GX、FT-IR System)を用いた赤外吸収分光法によって分析した。走査は、4cm−1の解像度で実行した。32回の走査を行った。
水性染料溶液又は検量血漿の一定分量15〜20μlを、装置上のマイクロピラーチャネル内の基材サンプルゾーン内に添加した。その液体が流れて、そのチャネルの終端に到達するのに必要な時間を、ビデオ撮影により測定した。また、そのビデオは、フローの品質も記録した。
発色性トロンビン分析は、通常の血漿凝固時間(CT)に対するSiOxコーティングの影響を判断するために行った。その分析は、96ウェルの微量測定用プレートで準備した。そのプレートのベースは、両面PSAからなる層で改質し、各ウェルのベースは、メスで切除した。そして、改質した基材及び改質していない基材、及びガラス対照を、そのプレートの接着ベースに取り付けた。追加的な対照は、標準的なポリスチレンベースに対して行った分析であった。50μlの正常なクエン酸ヒト血漿を、ウェル内に配置した。それらのサンプルを、室温で15分間、培養した。50μlの比色分析試薬(S-2238)をウェルに添加し、最後に、血漿サンプル中のクエン酸の影響に勝る反応を開始する50μlの25mM CaCl2を添加した。吸収度は、Tecan、Infinite M200分光光度計を用いて、37℃で70分間、30秒毎に405nmで測定した。凝固時間は、最大信号の半分における吸収度に対応する時間として採用した。
(SiOxのプラズマ化学気相成長法)
高いO2/モノマー比及び高電力は、SiO2状膜の良好な付着のための方策における主要なポイントである。しかし、そのようなプラズマ相の複雑さのため、そのプラズマ相における活性種密度と、付着した膜の化学的組成との相関関係を測定して、そのプロセスを最適化することは非常に困難である。(Creatore,M., Palumbo,F., d'Agostino,R., Fayet,P.(2001)。RF plasma deposition of SiO2-like films: plasma phase diagnostics and gas barrier film properties optimisation, Surface & Coatings Technology, 142 163)ヘキサメチルジシロキサン(HMDSO)は、PECVDによるCOP基材へのSiOx付着のための前駆物質に関する本発明者等の選択である。通常は液剤であり、PECVDで分解されるHMDSOは、コーティングプロセスで必要な活性種のソースとして作用する。
非改質COP表面、酸素/アルゴン前処理済みサンプル及びSiOxで改質された表面のAFM分析の結果を図4に示す。対照のため、高度に研磨したステンレス鋼を、COP(図5)と同じ方法で改質した。また、表面粗度値(Rms)は、図6に示されている。改質していない表面は、粗度値が0.7±0.21nmで、ミクロン長さスケールで極度に円滑であった。このことは、後に続く酸素/アルゴンプラズマ処理を劇的に変化させ、表面構造のレベルは、1.54±0.81nmまでの粗どの増加を伴って、大幅に増加した。SiOx付着後、その表面は、粗度が0.96±0.51nmで、わずかに円滑で、より明確な表面構造に戻り、明白な表面改質の存在を明確に示していた。
AFMは、膜厚を評価するのにも利用した。コーティングの厚さは、その付着時間に大きく依存する。(Sobrinho,A.S.D., Latreche,M., Czeremuszkin,G., Klemberg-Sapieha,J.E., Wertheimer,M.R. (1998). Transparent barrier coatings on polyethylene terephthalate by single- and dual-frequency plasma-enhanced chemical vapor deposition, Journal of Vacuum Science & Technology A, 16(6): 3190; Yang,M.R., Chen,K.S., Hsu,S.T., Wu,T.Z.(2000). Fabrication and characteristics of SiOx films by plasma chemical vapor deposition of tetramethylorthosilicate, Surface & Coatings Technology, 123(2-3): 204)図7は、改質表面と非改質表面との間の境界のAFMイメージを示す。2つの表面の間のステップは、その3次元画像を見てはっきりと分かる。その段差は、44.4nmであると推定された。(0.05%RSD、n=5)
SiOxコーティングをさらに特徴付けるために、非改質基材及びSiOxをコーティングしたCOP基材に対してATR−FTIRを用いて、定性的研究を行った。この方法は、高度に敏感であり、選択的であり、非破壊的であり、また、周囲条件下で実行できる。そのことは、シリコンベースのコーティングを特性化するのにさらに適している。(Weldon 1999, Niwano 1994, Watanabe 1998, Nagai 2001, Mink 1997)
側方流動バイオアッセイに適用できるようにするためには、結果として生じる表面改質は、その装置へのマイクロピラー構造の再現可能で均一な充填を可能にする必要があるであろう。水性染料溶液が、そのストリップの狭い検査チャネル領域(図1を参照)と移動するのにかかる時間を、ビデオキャプチャを利用して測定する充填時間実験を行った。SiOx1及びSiOx2の改質の充填時間を図10に示す。両プロトコルによる改質が、かなり上昇した表面活性からなる基材改質をもたらしたように思われるが、充填時間実験におけるパフォーマンスには、以前として大きな差がある。少ない高周波電力改質方法の場合(SiOx2)、その水性サンプルは、不十分な親水性により、その微小流路を横切ることができなかった。しかし、SiOx1は、その流路を1366±27sで横切るという均一で再現可能な充填特性をもたらした。SiOx1の条件に従って改質され、サンプルの損傷を防ぐために、より多くの酸素によって、及び少ない高周波電力を印加することによって改質された表面は、適切な流体パフォーマンス特性を可能にする十分な湿潤性及び安定性を生じさせるため、側方流動アッセイのさらなる進歩に利用することができるであろう。
SiOxで改質した表面は、本質的にガラスと似た材料物質であるため、原理上、ガラスと同様に作用するはずである。ガラス製表面及びガラス材料は、化学的不活性、機械的強度及び加工性という多くの有益な特性により、長年にわたって幅広く用いられてきた。しかし、ガラスにも、処理する手段及びその脆さを含む多くの欠点がある。ポリマーと、ガラスのような表面特性を組合わせることは、それらの両方の有益な特性を備えたハイブリッド材料を生み出す優れた方法である。確認されているガラスの一つの特性は、血液凝固過程を速める能力を有しているということであった。(Rapaport,S.I., Aas,K., Owren,P.A.(1955). Effect on Glass upon the Activity of the Various Plasma Clotting Factors, Journal of Clinical Investigation, 34(1): 9; Sharma,C.P., Szycher,M. Blood Compatible Materials and Devices: Perspectives Towards the 21st Century, CRC Press, 1991)実際には、ガラス容器内への採血は、クエン酸塩等のカルシウムキレート剤、又は、ヘパリン等のトロンビン阻害剤の添加によって凝固を防がなければならない。大きく負に帯電した二酸化ケイ素表面は、血管損傷の後の露出した血管系(コラーゲン)に似ており、内因性経路を介した凝固カスケードを開始すると思われている。この現象は、多くの血液凝固分析において幅広く活用されており、この場合、凝固を速めるために、ガラス、又は、セライト及びカオリン等の他の同様のケイ酸塩が、血液サンプルに加えられる。従って、ガラス状表面で改質された表面は、内因性経路を介した血液凝固の導入を要するバイオアッセイ、例えば、活性化部分トロンボプラスチン(aPTT)や活性凝固時間(ACT)を含む凝固時間(CT)タイプの分析を実行するのに用いることができるであろう。
この実施例は、酸素/アルゴンプラズマ処理後のプラズマ化学気相成長法を用いた、SiOxからなる層を備えた環状ポリオレフィン製のZeonor(登録商標)の改質のための方法を示している。本発明者等は、付着中のガス含有量の制御が、SiOx膜の品質及び安定性を高めることに気付いた。
(側方流動分析装置の試験)
(フィブリノゲンコーティング)
(材料及び方法)
・B2.2 COP Amic(登録商標)チップ
・実施例1のような血液凝固製剤、すなわち、塩化カルシウム(BioData)、フィブリノゲン(Sigma)
・PT試薬(Dade Innovin)
・aPTT試薬(aPTT−SP)
・サンプル
凝固を引き起こすために、血液凝固製剤を乾燥試薬として、その装置の表面に添加すると、検査されるサンプルが、その試薬上を流れるようになる。血液の凝固する能力により、サンプルは、その装置に沿って異なる速度で移動し、凝固がすぐに起きて、急速に凝固し、又は、早い時点で停止してしまう場合には、さらにゆっくりと進む。
テストした溶液は、特に明記しない限り、20μlの容量で適用した。流体の先頭が、B2.2 COP Amicチップのマイクロピラーチャネルに沿って、0、5、10、15、20、23、27mmの7つの段階に達する時間を測定した。使用した凝固剤の種類、塩化カルシウム(BioData)の付着、及びフィブリノゲン(Sigma)の添加を含むいくつかのパラメータを測定した。
テスト:(37℃で3分間、予熱した)血漿+25mM CaCl2(1:1)
対照:(37℃で3分間、予熱した)血漿+NH4Cl(1:1)
フィブリノゲンの効果は、最初に、20μlの50mg/mLフィブリノゲンを付着させて、その表面で乾燥させることによって調べた。以下のテストサンプル及び対照サンプルを用いた。
テスト20μl:(37℃で7分間、予熱した)血漿+25mM CaCl2(1:1)
テスト30μl:(37℃で7分間、予熱した)血漿+25mM CaCl2(1:1)
対照20μl:(37℃で7分間、予熱した)血漿+25mM NH4Cl(1:1)
対照30μl:(37℃で7分間、予熱した)血漿+25mM NH4Cl(1:1)
追加的な試験は、予め凝固剤と混合したサンプルを、PT及びaPTTのかたちで添加した状態で、フィブリノゲン及び塩化カルシウムの付着、あるいは塩化カルシウム単独の付着の複合効果を示すために行った。この場合、20μlの50mg/mLフィブリノゲン+25mMのCaCl2(1:1)を付着させて、一晩、乾燥させた。対照の表面は、10μlの25mMのCaCl2を一晩、乾燥させることによって準備した。
・(混合した直後に適用した)血漿+PT(Dade Innovin)(1:1)
・(37℃で5分間、予熱した)血漿+aPTT(aPTT‐SP)(1:1)
・(37℃まで温めた)血漿+PBS(1:1)(血漿粘度制御)
・(37℃で7分間、予熱した)血漿+25mMのCaCl2(1:1)(凝固の非加速制御)
そのチャネル内に化学的物質が付着されていない、露出したCOPチップに対する外部混合された凝固剤の影響を調べるより詳しい実験を行った。以下のサンプルを使用した。
テスト:Triton X-100の添加を伴う、血漿+(CaCl2を含有する)PT試薬(Dade Innovin)(1:1)
対照:Triton X-100の添加を伴う、血漿+aPTT試薬(CaCl2を含まず)(aPTT‐SP)(1:1)
フィブリノゲン濃度の影響に関するより詳しい研究も行った。何種類かの濃度のフィブリノゲンを用意した。それぞれ20μlを、そのチャネルに加えて、蒸発させるために、室温で一晩、そのままにした。
対照:血漿+aPTT試薬(非凝固)(aPTT‐SP)(1:1)
テスト1:(37℃で7分間、予熱した)血漿+25mMのCaCl2(1:1)
テスト2:(37℃の)血漿+25mMのNH4Cl(1:1)
対照:(37℃の)25mMのCaCl2+トリス塩酸(1:1)
以下の結果は、血液凝固分析用のプラットホームとして使用される側方流動分析システムの効用を示す。
PT及びaPTTの場合の図13a及び図13bに示すように、凝固テストサンプルが、その装置を横切るのに要する時間は、非凝固サンプルよりも長くかかった。
図14は、検査チャネル上に付着したフィブリノゲンの利用の影響と、サンプル容量の影響を示す。20μlでは、テストサンプルと対照サンプルとの間に、移動時間の著しい差があった。この移動時間の差は、30μlの場合には、あまり顕著ではない。しかし、両テストサンプルのフローは、15mmで停止した。適用したサンプル容量の差は、より素早く移動するための制御を引き起こす、サンプル容器からの「プッシュ」効果をもたらす。しかし、この影響は、適用したサンプル容量の低減の影響を弱めることができる。
図15及び図16は、フィブリノゲンをコーティングした装置上の流動速度は、塩化カルシウムだけをコーティングした装置上の流動速度よりもかなり遅いことを示している。しかし、粘性制御に対して起きたこのことは、恐らく、付着したフィブリノゲンの粘性及び界面特性にも関係している。両面で、血漿PTは、減速したか(CaCl2上)、あるいは、早々に停止した(フィブリノゲン及びCaCl2)。血漿aPTTの速度も、フィブリノゲン及び塩化カルシウムに関する対照と比較して低下した。
チャネル内に化学的物質が付着されていない露出したCOPチップに対する外部混合された凝固剤の影響を調べるためのより詳しい実験を行った。Dade Innovinを伴う血漿は、そのPT試薬がカルシウムを含有しているため、すぐに凝固し始めた。aPTT‐SP試薬中には、血漿中のクエン酸塩の影響に打ち克つためのカルシウムがないため、対照は凝固しなかった。aPTT試薬は、活性化因子と混合された血漿の粘性及び挙動を模倣する対照として使用した。テストサンプル及び対照サンプルは共に、チャネルの終端部(27mm)に到達した。しかし、テストサンプルは、特に、そのチャネルの終端部に向かってかなり遅くなり、また、形成された凝血塊は、図17に示すように、サンプルゾーン内に見ることができた。(n=6)
フィブリノゲン濃度の影響に関しても、より詳しい研究を行った。いくつかの濃度のフィブリノゲンを用意した。各濃度の20μlを、そのチャネルに加えて、蒸発させるために室温で一晩、放置した。
50mg/mL‐13mmで停止
20mg/mL‐23〜27mmで停止
10mg/mL‐液体からなる薄い層のみが23〜27mmを移動;終端部には到達せず
5mg/mL‐液体血清からなる薄い層のみが23〜27mmを移動;終端部に到達
2.5mg/mL‐終端部に到達
1.25mg/mL‐終端部に到達
(高分子電解質改質)
(材料及び方法)
COPベースの微小流体プラットホーム基材である、4castchip(登録商標)(Åmic AB、スウェーデン)を基材として使用した。
図22〜図26は、PE処理の場合の結果を示す。
(比較データ‐シクロオレフィンポリマー微小流体装置上での側方流動分析能力の向上のための様々な表面改質の評価)
(材料及び方法)
COPベースの微小流体プラットホーム基材である、4castchip(登録商標)(Åmic AB、スウェーデン)を、以下の処理によって改質した。
・酸素プラズマ処理単独
・PACコーティング単独
・(実施例3で説明したような)高分子電解質処理
・(実施例1で説明したような)SiOx付着単独
・高分子電解質で処理したSiOxコーティングポリマー
異なる表面コーティングは、いくつかの方法によって特性化され、それらの結果を実施例22〜実施例26に示す。
4castchip(登録商標)(Åmic AB、スウェーデン)等のシクロオレフィンポリマー(COP)は、いくつかの方法で改質することができる。しかし、表面湿潤性、粗度及び液体フロー特性の著しい違いが指摘されている。SiOxコーティングは特に、親水性を与える最も安定的な表面改質であり、比較的滑らかな表面での素早くかつ再現可能なフローをもたらすと思われた。また、高分子電解質処理も良好な結果を示すことを発見した。(図24)
(トロンビンコーティング)
(一般的な材料及び方法)
4Castchip(登録商標)、model B2.2は、フィブリノゲンレベル測定用のオープン型の側方流動装置の開発のためのプラットホームとして使用した。これらのチップは、熱エンボス加工されたマイクロピラー構造によって改質されており、Åmic BV(Uppsala、スウェーデン)によって提供された。(図1c)マイクロピラーの高さは、65〜70μmであり、上部直径は、ca50μmであり、底部直径は、ca70μmであり、列状のピラーの中心間の距離は、85μmであり、行状のピラーの中心間の距離は、185μmであった。
血栓形成及びその後の粘性変化を直接誘導する精製トロンビンの使用は、以下の凝固モニタ分析の開発に利用した。精製トロンビンの供給は、凝固因子活性化のカスケードの迂回及びトロンビン生成の正のフィードバックを可能にするものと考えられた。
TCTは、フィブリノゲン濃度の測定にも用いることができる。フィブリノゲンは、濃度が2〜4g/Lであり、血漿及び全血の粘性の主な決定因子であり、フィブリンメッシュを形成する不溶性フィブリンモノマーの直接前駆体である主要な血漿タンパクとして知られている。高濃度で存在するトロンビンは、急速に作用して、利用可能なフィブリノゲンを開裂し、及び薄いフィブリン線維から成る濃くて堅い凝血塊の形成を可能にする。このような血塊形成は、粘性、及びこのフロー時間及び移動距離の全体の変化をもたらすのに適しているであろう。従って、以下の研究は、血漿及び全血中のフィブリノゲン含有量の測定のためのトロンビンで改質したプラットホームの利用に関する。従来、フィブリノゲン測定に用いられている方法は、Clauss分析である。それは、医療活動において、最も信頼性があり、かつ一般的に用いられているので、臨床的に推奨されている。このテストは、正常な血漿対照と比較して、トロンビンのフィブリノゲンに対する作用により、血漿中でのフィブリン血栓形成の速度を測定する。そのテストは、標準的な量の外因性トロンビンを、乏血小板血漿に添加して、凝血塊が形成される時間を測定することによって行われる。これは、播種性血管内凝固症候群及び肝疾患の診断に用いられており、一般的には、中央検査室で行われる。
外因性トロンビンベースの試薬の、急速な血栓形成及びその結果として生じる、サンプルのフローに対する抵抗性の変化を誘導する原理を、混合血漿サンプル中のフィブリノゲンの高いレベルを測定するのに適するように実証した。フィブリノゲン測定のための側方流動アッセイのさらなる進展は、好ましくは、全血及び血漿に関する検査室基準に対して適切なレベルの正確さ、精度及び相関を有する様々な臨床関連のフィブリノゲン濃度に対応するチップによって決まる距離範囲内でのサンプルフローの停止をもたらす分析の確立を要するであろう。
一般論として、フィブリノゲン測定分析は、クラウス法と同じ原理に基づいており、この場合、内因性トロンビン濃度によって凝固時間(CT)が制限されないこと、及び凝血が現れるのに必要な時間(CT)にフィブリノゲンレベルが反比例することを確実にするために、血漿は、余分なトロンビンによって凝固する。クラウス法は、試薬のソース及び組成によって大幅に変わる。テストプラットホーム上で乾燥させた適切な濃度のトロンビンを、血漿及び全血の両方に対して確立しなければならない。タンパク質表面コーティングの特性によるフロー特性に対する阻害を伴わない急速な凝固を確実にするトロンビン濃度を決めなければならない。赤血球の存在、及びその結果としての、血漿と比較して増加した全血の粘性により、サンプルの動きは、一般的に全血の方が遅く、そのため、より多くのサンプルの動きに対応するために、より低いトロンビン濃度を用いた。一定分量15μlの正常なクエン酸血漿のサンプル、5g/Lのフィブリノゲンを添加したクエン酸血漿サンプル及び正常な全血を、それぞれ血漿テスト及び全血テストに対して、10μlの25〜100U/mL又は0〜25U/mLのトロンビンでコーティングしたチャネル内でテストした。それらのフロー特性は、サンプル希釈によっても操ることができ、このことは、サンプル粘性の変化及び利用可能なフィブリノゲンの濃度の変化をもたらした。このアプローチも研究した(表2)。血漿の場合、最も高い濃度の付着トロンビン(100U/mL、これは、ストリップ当たり1Uに等しい)は、サンプル適用ゾーン内で即時の血栓形成を生じた(図35A)。高密度のフィブリンメッシュは、凝血塊内の全サンプルを急速に捕らえ、流体動を阻止した。これは、正常の及び高いフィブリノゲンレベルの両方のサンプルの場合であった。水で倍数希釈したサンプルは、正常なサンプルと、(5g/Lのフィブリノゲンを添加した)高濃度のサンプルとで移動距離の違いが7.4mmある、100U/mLでコーティングしたチャネルの充填を可能にした。急速な流動停止は、希釈していないサンプルの場合に起きるため、希釈したサンプルから形成されたフィブリン線維メッシュは、急速な流動停止を可能にせず、その結果として、希釈したサンプルは、より長い距離を移動した。サンプル希釈は、追加的な事前分析工程となるであろう。しかし、トロンビン濃度の低下は、血栓形成の遅延を引き起こし、サンプルが停止する前にさらに移動することを可能にした。理想的には、正常なサンプルは、フローがその場合に、そのチャネルの最初の数mm以内(0〜11mmの予想横断距離)で停止するであろう高いフィブリノゲンレベルのサンプル、及び低いフィブリノゲンレベル(21〜27mm)のサンプルの検出を可能にするために、約12〜20mmの距離を移動すべきである。正常な血漿及びフィブリノゲンを添加した血漿が移動した距離の差は、25及び50U/mLの乾燥トロンビンに対して、約7mmであった。
トロンビンの酵素活性は、ソース、バッチによって、あるいは同じロット内でも変化する可能性がある。また、それは、保管時間及び状態を含むいくつかの要因に影響を受ける可能性もある。一定のトロンビン活性の付着は、十分な再現性を得るために、及びフィブリノゲン含有量を確実に測定できるようにするために維持されなければならない。そのため、トロンビン活性の迅速な測定を可能にするであろう方法を開発する必要があった。分析検量に使用したトロンビン(Hyphen BioMed)の活性は、再構成後に100U/mLであり、メーカーが主張するように、これを標準として採用した。未使用の試薬という理想的な条件下で、傾斜管テストを用いて測定した、正常な対照血漿のCTは、10及び20U/mLのトロンビンに対してそれぞれ、35±1s及び19±1sであった。そして、活性テストは、未知の活性の何らかのトロンビン溶液を用いて実行できる。一旦、それらのCT値が得られると、それに応じて、(それぞれ、血漿及び全血のフィブリノゲン測定に最適な)25及び5U/mLの溶液を調製して、テストチップ上に付着させることができる。(注記:それらのCT値及びトロンビン活性値は、分析化学標準化のためだけに用いた。上述したトロンビン濃度は、必ずしも文献のトロンビン活性値又は対応する血漿のCTに相関する必要はない。)正確な酵素活性は分からなかったため、35s又は19sというCTの実現は、トロンビン溶液を標準化する1つの方法であり、そのためここでは、10及び20U/mLに一致すると仮定した。代替的な方法は、未知の活性のトロンビンでコーティングしたチャネル内での正常な血漿の移動距離を測定して、既知の活性と比較することであった。(検量曲線に示す)正常なサンプルの移動距離と同じ移動距離を生じるトロンビン濃度を用いることができる。トロンビン活性の標準化のどちらの方法も、実行可能であることが分かった。第1の「優れた標準的な」傾斜管トロンビン時間測定は、特に、正常な対照血漿の容量に制限がない(測定当たり、少なくとも300μlの血漿)場合に有用である。その方法は、迅速であり、トロンビン濃度を数分以内に見つけることができた。第2の方法は、実際のフィブリノゲン測定分析システムを使用した。この方法は、テスト当たり、たったの15μlの血漿サンプルを要した。しかし、乾燥した化学テストストリップの準備に、検量曲線を参照して、少なくとも数時間必要であった。以下の研究においては、トロンビン活性は、傾斜管テストを用いて測定し、その後、一定のトロンビン濃度でコーティングしたチャネル内での正常な対照血漿の移動距離の概算値と照合した。
分析検量は、幅広いフィブリノゲンレベルを含有する血漿サンプル及び全血サンプルを用いて行った。高濃度のフィブリノゲンサンプルを得るために、健常者から採った対照血漿及び正常な全血に、凍結乾燥フィブリノゲンを加えた。低いフィブリノゲン含有量の対照血漿は、Hemosilから購入し、一方、低いフィブリノゲン含有量の全血は、遠心分離、及びHemosilからの同容量の低フィブリノゲン含有量の対照血漿との部分又は全置換によって調製した。正確なフィブリノゲン含有量は、クラウスアッセイ、ACLtop(登録商標)凝固システム(Instrumentation Laboratory)及びFibrinogen-C 試薬(Hemosil)に基づく臨床検査法を利用して測定した。表3及び表4は、それぞれ、低レベル、正常レベル及び高レベルのフィブリノゲンを有する血漿サンプル及び全血サンプルが移動した距離を示す。それぞれ、25及び5U/mLのトロンビンの10μlで改質したプラットホーム上でテストした19の血漿サンプル及び13の全血サンプルに基づいて、別々の検量曲線が生成された。
上記のことは、乾燥させたトロンビンベースの薬剤を備えたチップが、対照血漿サンプル及び全血サンプルにおけるフィブリノゲン濃度の測定のための実行可能な方法であることを示している。その分析をさらに有効にするために、様々なフィブリノゲン濃度を含む患者のサンプルを、上述した臨床検査法と並行して、最適化したアッセイプラットホーム上でテストした。表5は、ACLtop(登録商標)によって測定した31の患者サンプルの場合のフィブリノゲン濃度、開発したシステムにおける移動距離、及び上記で確立された検量曲線に基づく導出フィブリノゲン値をまとめたものである。それらのサンプルの正確なフィブリノゲン含有量は分かっているので、移動距離と直接関連付けること、及び開発した方法を用いて、フィブリノゲン測定の精度を評価することが可能であった(図29)。以下の表5は、トロンビンでコーティングしたチップ内での移動距離を、確認されているフィブリノゲン含有量(ACLtop(登録商標))を有する31の患者サンプルの場合に測定したことを示している。検量曲線方程式及び移動距離を用いて、フィブリノゲン濃度を再計算した(n=3)。斜字体の値を有するサンプル(9.3g/Lのフィブリノゲン)は、間違った結果を示している。
最適化したトロンビンベースの試薬でコーティングしたプラットホームを、4℃で、最長で21日間、保管した。異なるフィブリノゲン濃度を有する血漿サンプルが移動した距離を、1日、3日、7日、14日及び21日目に測定した(図33)。異常に低いフィブリノゲン濃度(1.41g/L)のサンプルが移動した距離(25〜27mm)には、著しい差はなく、そのことは、検量曲線方程式:y=−3.8674x+28.967を用いて算出した予想移動距離23.5mmよりもわずかに大きかった。得られた移動距離は、フィブリノゲンレベルの減少の認識を可能にした。正常なフィブリノゲン含有量のサンプル(3.04g/L)は、最初の2週間で、15.7〜16.7mm移動し、3週間後の古くなったプラットホームでは18.7mm移動した。その検量曲線方程式を用いることで、15.7〜16.7mm移動したサンプルが、正常な血漿対照に対して予測した正常な範囲内である3.2〜3.4g/Lのフィブリノゲンを含有することを推測することができ、一方、18.7mmは、(その検量曲線に基づいて算出した)低下したフィブリノゲンレベルの2.6g/Lの指標となるであろう。このことは、21日後の古くなったプラットホームは、間違った結果を取込む可能性があるため、使用できないことを意味している。わずかに及びかなり高いフィブリノゲン含有量、すなわち、4.66、5.39及び6.97g/Lの3つのサンプルもテストした。これらの3つのサンプルに対して、1〜14日の古くなったプラットホーム上で、それぞれ次の移動距離、すなわち、10.0〜10.3mm、7.7〜9.7mm及び3.0〜3.7mmが得られ、また、21日後のプラットホームでは、11.3mm、11.0mm及び6.0mmの延びた移動距離が得られた。この結果は、14日間の保管中にサンプルが移動した距離には、統計的差異はほとんどないため、固定化されたトロンビンを含む装置は、特別な扱いを要することなく、4℃で14日間まで容易に保管することができることを示唆している。トロンビン酵素活性は、3週間の保管の後には、わずかに低下したように思われる。その結果、その移動距離は、全てのテストサンプルの場合でわずかに増加した。2週間以上保管したチップの使用は、フィブリノゲンレベルの過小な推定をもたらす可能性がある。そのため、2週間以上経ったチップは、テストに使用しなかった。特別な保管条件、すなわち、低下されかつ制御された湿度、真空状態、又は防腐剤の添加及び/又はチップに固定化されたトロンビンの凍結乾燥を、装置安定性を向上させるために容易に利用することができるであろう。
生理学的に意味のあるレベルで、全血及び血漿中のフィブリノゲンを測定することが可能な分析装置を開発した。その装置は、単純であるが信頼性の高い側方流動原理に基づいており、この場合、フィブリノゲンは、凝固の結果としての流動停止の前に移動した距離によって測定される。その分析装置は、少ない所要サンプル容量(15μl)、希釈又は分離を含む何らかの事前分析工程がないこと、及び結果が5分以内に得られるという測定の速度を含む、従来の方法に優るいくつかの利点を有していた。そのアッセイは、検査業務で日常的に用いられ、凝固可能な活性フィブリノゲン含有量測定のための最も信頼性の高い方法と称されているクラウス法の改良である。高いレベル及び低いレベルの両方のフィブリノゲンを、同じテストプラットホームを用いて検出することができた。そのアッセイは、1〜7g/Lの範囲でのフィブリノゲン測定が可能であった。
Claims (30)
- 液体サンプル中の凝固をモニタ及び/又は測定するための側方毛細管流動装置であって、当該装置が、
前記液体サンプルを受け入れるためのゾーンを備えた非多孔質基材と、
前記液体サンプルの凝固を加速させ、画成された流路ゾーンに沿った一様に分布した凝血塊の形成を可能にし、及び前記画成された流路ゾーンに沿って、前記液体サンプルの流速の変化又は流動停止を生じるように、前記画成された流路ゾーンの少なくとも一部に、凝固剤フィブリノゲン又はトロンビンあるいはそれらの誘導体が付着されている前記画成された流路ゾーンと、を具備するオープン型の側方流動装置である、側方毛細管流動装置。 - 前記オープン型の側方流動装置は、前記液体サンプルを前記流路ゾーンに沿って案内する毛細管力に依存し、且つ、前記液体サンプルと、前記装置の画成された流路との表面積対容積比が改善又は増加される、請求項1に記載の側方毛細管流動装置。
- 前記流路ゾーンは、前記画成された流路に沿って、前記液体サンプル中で毛細管現象を誘導する複数の規則的に離間した突起部又はくぼみを備えた平坦面を具備する、請求項2に記載の側方毛細管流動装置。
- 前記非多孔質基材の流路ゾーンは、前記非多孔質基材に沿って前記流路ゾーンを画成する、前記基材の表面から突出する複数の垂直方向の突起部又はマイクロピラーを具備する、請求項1乃至3のいずれか一つに記載の側方毛細管流動装置。
- 前記垂直方向の突起部は、前記表面に対して略垂直であり、及び前記流路内での液体サンプルの側方毛細管流動が実現されるような高さ(H)、直径(D)及び相互間隔を有する突起部からなる領域で構成される、請求項4に記載の側方毛細管流動装置。
- 前記凝固剤は、前記画成された流路ゾーンの表面全体に付着される、請求項1乃至5のいずれか一つに記載の側方毛細管流動装置。
- 前記凝固剤は、ポリエチレングリコール(PEG)、糖類及び/又は非イオン界面活性剤を含有する支持試薬物質も具備する、請求項1乃至7のいずれか一つに記載の側方毛細管流動装置。
- 血液凝固が、モニタ及び/又は測定される、請求項1乃至7のいずれか一つに記載の側方毛細管流動装置。
- 前記非多孔質基材は、プラスチック材料であり、好ましくは、熱可塑性材料であり、より好ましくは、環状ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート(ポリエステル)(PET)又はポリメチルメタクリレート(PMMA)である、請求項1乃至8のいずれか一つに記載の側方毛細管流動装置。
- 前記非多孔質基材は、シリコン又はガラス基材である、請求項1乃至9のいずれか一つに記載の側方毛細管流動装置。
- 前記非多孔質基材の表面に付着されたSiOxからなるコーティングを具備する、請求項1乃至10のいずれか一つに記載の側方毛細管流動装置。
- 前記非多孔質基材の表面は、高分子電解質を用いて改質される、請求項1乃至11のいずれか一つに記載の側方毛細管流動装置。
- 1つ以上の試薬物質からなる追加的な層を具備する、請求項1乃至12のいずれか一つに記載の側方毛細管流動装置。
- 前記試薬物質は、次のうちの1つ以上、すなわち、組織因子、リン脂質、凝固因子及び/又は凝血促進剤を含む、凝固を誘導及び/又は加速させることのできる追加的な物質、ガラス繊維、すりガラス及びガラス微小粒子を含有する微粒シリカ物質、及び/又はカオリン、セライト、エラグ酸及び/又は塩化カルシウムを含有する凝固表面活性剤から選択される、請求項13に記載の側方毛細管流動装置。
- 前記非多孔質基材の一方の表面から垂直方向に延在するマイクロピラー突起部を具備する環状ポリオレフィンであって、当該環状ポリオレフィン基材が、SiOxからなる層を具備する、請求項1乃至14のいずれか一つに記載の側方毛細管流動装置。
- 請求項1乃至15のいずれか一つに記載された側方毛細管流動装置を用いて、液体サンプル中の凝固をモニタ及び/又は測定するための方法であって、前記液体サンプルは、前記非多孔質基材上の受容ゾーンに添加されて、前記液体サンプルの側方毛細管流動が実現されるように、毛細管現象によって、前記受容ゾーンから流路を通って輸送される方法であって、
前記液体サンプルの凝固を加速させるように、前記流路ゾーンに沿って、均一に分布した凝血塊を形成するように、及び流速を変更するように又は前記画成された流路ゾーンに沿った前記液体サンプルの流動を止めるように、前記液体サンプルを添加する前に、前記凝固剤フィブリノゲン又はトロンビンが、前記画成された流路ゾーンの表面の少なくとも一部に付着されることを特徴とする方法。 - 前記凝固剤は、前記画成された流路ゾーンの表面全体に付着される、請求項16に記載の方法。
- 前記凝固剤は、ポリエチレングリコール(PEG)、糖類及び/又は非イオン界面活性剤を含有する支持試薬物質も具備する、請求項16又は17に記載の方法。
- 血液凝固が、モニタ及び/又は測定される、請求項16乃至18のいずれか一つに記載の方法。
- 前記液体サンプルが、血液又は血漿である、請求項16乃至19のいずれか一つに記載の方法。
- 次の凝固分析、すなわち、活性凝固時間[ACT]、活性化部分トロンボプラスチン時間[aPTT]、プロトロンビン分析[PT]、トロンビン凝固時間[TCT]及び/又はフィブリノゲン分析のうちの1つを実行するのに適している、請求項16乃至20のいずれか一つに記載の方法。
- 使用する前に、前記非多孔質基材の表面が、前記側方毛細管流動装置を流れる改良された液体流動を容易にするために、表面活性及び親水性が向上するように改質されている請求項16乃至21のいずれか一つに記載の方法であって、
前記非多孔質基材の表面に、SiOxからなるコーティングを付着させるステップ、及び/又は、
前記非多孔質基材の表面を、高分子電解質を用いて改質するステップを具備する方法。 - 液体サンプル中の凝固のモニタ及び/又は測定のための側方毛細管流動装置であって、前記液体サンプルを受け入れるためのゾーンを備えた非多孔質基材と、前記非多孔質基材の表面が、前記非多孔質基材の表面にSiOxからなるコーティングを付着することにより、前記液体サンプルの凝固を加速させるように改質されている画成された流路ゾーンとを具備する、側方毛細管流動装置。
- 前記非多孔質基材の表面は、高分子電解質を用いて改質される、請求項23に記載の側方毛細管流動装置。
- 前記非多孔質基材の流路ゾーンは、前記非多孔質基材に沿った流動を規定する、前記非多孔質基材の表面から突出する複数の垂直方向の突起部又はマイクロピラーを具備する、請求項23又は24に記載の側方毛細管流動装置。
- 前記垂直方向の突起部は、前記表面に対して略垂直であり、及び前記流路内での液体サンプルの側方毛細管流動が実現されるような高さ(H)、直径(D)及び相互間隔を有する突起部からなる領域で構成される、請求項23乃至25のいずれか一つに記載の側方毛細管流動装置。
- 側方毛細管流動装置の表面にSiOxを付着させるための方法であって、前記側方毛細管流動装置は、液体サンプルを受け入れるためのゾーンを備えた非多孔質基材と、前記非多孔質基材の表面が、前記液体サンプルの凝固を加速させるように改質されている画成された流路ゾーンと、を具備する方法であって、
酸素プラズマ及びアルゴンを用いて前記非多孔質基材を事前に処理することと、
プラズマ化学気相成長法(PECVD)を用いて、前記非多孔質基材にSiOxを付着させることと、を具備する方法。 - 前記非多孔質基材は、熱可塑性材料、好ましくは、環状ポリオレフィンである、請求項27に記載の方法。
- 前記非多孔質基材は、高分子電解質による改質を受ける、請求項27又は28に記載の方法。
- 前記高分子電解質による改質は、高分子電解質を用いた浸漬被覆の前に、酸素プラズマ処理を具備する、請求項29に記載の方法。
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