JP2012506709A5

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Publication number: JP2012506709A5
Application number: JP2011533609A
Authority: JP
Filing date: 2009-10-29
Publication date: 2012-05-24
Anticipated expiration: 2029-10-29

Claims

以下の工程：
ａ）少なくとも１つの修飾を有する核酸分子の複数の分子を提供する工程；
ｂ）複数の修飾核酸分子をランダムに切断し、それにより修飾核酸分子断片と非修飾核酸分子断片とを提供する工程；
ｃ）前記修飾核酸分子断片を前記非修飾核酸分子断片から分離する工程；
ｄ）前記修飾核酸分子断片をその長さ、質量および／または電荷によって分離または分別し、そのような分離または分別によって、修飾核酸断片のパターンが生成される工程；ならびに
ｅ）任意で前記修飾核酸断片のパターンを可視化する工程
を含む、核酸分子のヌクレオチド配列を決定するための方法。
前記方法が、
ｆ）前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
複数の分子の個々の核酸分子が、そのヌクレオチド配列が決定される核酸分子の５’末端に、３’末端にまたはヌクレオチド配列内に少なくとも１つの修飾を有する、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
切断する工程が、断片、好ましくは修飾断片の混合物を提供し、そのような断片の混合物が、前記核酸分子の全てのあり得るヌクレオチド配列断片を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
前記混合物が、そのヌクレオチド配列が決定される修飾された全長形態の前記核酸分子を含む、請求項４に記載の方法。
前記修飾核酸分子断片が、修飾と相互作用パートナーとの相互作用によって非修飾核酸分子断片から分離され、そのような相互作用パートナーが支持体に連結される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
前記修飾核酸分子断片が、質量識別、サイズ識別、および／または疎水性識別、電荷識別、イオン識別、水素結合識別、あるいは液相によって仲介される抽出による分離によって、前記非修飾核酸分子から分離され、好ましくは前記非標識核酸分子断片が除去される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
前記修飾核酸断片のパターンが修飾核酸断片のラダーを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
前記核酸分子のヌクレオチド配列が未知である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
前記核酸分子のヌクレオチド配列が既知であり、好ましくは前記方法が、前記核酸分子のヌクレオチド配列を確認するためのものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
前記修飾核酸分子断片が、好ましくは濾過および透析およびクロマトグラフィーおよび質量分析法を含む群から選択される質量またはサイズ識別のための方法によって分離または分別され、好ましくはそのような方法がＭＳ、ＬＣＭＳまたはＥＳＩＭＳである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
前記核酸分子が、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子およびヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子、ＰＮＡ、ＬＮＡならびにそれらの組合せ、好ましくは、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子およびデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含有する核酸分子の群から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
前記核酸分子が、アプタマー、シュピーゲルマー、リボザイム、シュピーゲルザイム、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子およびデコイ分子からなる群、好ましくはシュピーゲルマーから選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
核酸分子の特異的なマスフィンガープリントが決定される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
以下の工程：
ａ）少なくとも１つの修飾を有する核酸分子の複数の分子を提供する工程；
ｂ）複数の修飾核酸分子をランダムに切断し、それにより修飾核酸分子断片を提供する工程；
ｃ）前記修飾核酸分子断片をその長さ、質量および／または電荷によって分離または分別し、そのような分離または分別が修飾核酸断片のパターンを生成させる、工程；ならびに
ｄ）任意で前記修飾核酸断片のパターンを可視化する工程
を含む、核酸分子のヌクレオチド配列を決定するための方法。
前記修飾核酸断片のパターンの可視化が、前記少なくとも１つの修飾を利用し、好ましくは前記修飾が、該修飾を有する核酸分子と該修飾を有さない核酸分子の識別を可能にする、請求項１５に記載の方法。
前記修飾が、質量タグ、核酸分子の親油性部分よりも顕著に大きい所与の波長でのＵＶ吸光度を有する部分、規定の分子質量を有するポリマー、放射性標識およびイオン移動度の変化を与える部分を含む群から選択される、請求項１５又は１６のいずれか１項に記載の方法。
前記方法が、
ｅ）前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程
をさらに含む、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
切断する工程が、断片、好ましくは修飾断片の混合物を提供し、断片のそのような混合物が前記核酸分子の全てのあり得るヌクレオチド配列断片を含む、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
前記混合物が、そのヌクレオチド配列が決定される修飾された全長形態の前記核酸分子を含む、請求項１９に記載の方法。
前記修飾核酸断片のパターンが修飾核酸断片のラダーを含む、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
前記核酸分子のヌクレオチド配列が未知である、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
前記核酸分子のヌクレオチド配列が既知であり、好ましくは、前記方法が前記核酸分子のヌクレオチド配列を確認するためのものである、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
前記核酸分子が、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびそれらの組合せ、好ましくはＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子およびデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含有する核酸分子の群から選択される、請求項１５〜２３のいずれか１項に記載の方法。
前記核酸分子が、アプタマー、シュピーゲルマー、リボザイム、シュピーゲルザイム、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子およびデコイ分子からなる群、好ましくはシュピーゲルマーから選択される、請求項１５〜２４のいずれか１項に記載の方法。
核酸分子の特異的なマスフィンガープリントが決定される、請求項１５〜２５のいずれか１項に記載の方法。
以下の工程：
ａ）核酸分子の複数の分子を提供する工程；
ｂ）前記核酸分子の複数の分子をヌクレオ塩基選択的処置に供し、前記核酸分子を形成する１個または数個のヌクレオ塩基種を選択的に修飾し、そのようなヌクレオ塩基選択的処置の後で、前記核酸分子の選択的に処置可能なヌクレオ塩基のいくつかを修飾し、前記核酸分子の選択的に処置可能なヌクレオチドまたはヌクレオ塩基のいくつかを非修飾のままにする工程；
ｃ）修飾ヌクレオ塩基の３’で選択的に核酸リン酸骨格を化学的に切断し、前記修飾ヌクレオ塩基の全てではない前記核酸リン酸骨格を切断する工程；
ｄ）核酸分子断片をＬＣ−ＭＳおよび／またはＬＣ−ＭＳ−ＭＳにより分析する工程；ならびに
ｅ）インタクトの末端を有する核酸分子断片をサイズが増加する順に同定し、それから核酸分子の配列を生成させ、ここで、好ましくは、前記核酸分子断片が同じインタクトの末端、より好ましくは同じインタクトの３’末端を有する、工程
を含む、核酸分子のヌクレオチド配列を決定する方法。
前記核酸分子が、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子およびヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子、ＰＮＡ、ＬＮＡ、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含む核酸分子、ならびにそれらの組合せ、好ましくはＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子およびヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子の群から選択される、請求項２７に記載の方法。
前記核酸分子が、アプタマー、シュピーゲルマー、リボザイム、シュピーゲルザイム、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子およびデコイ分子からなる群、好ましくはシュピーゲルマーから選択される、請求項２７又は２８のいずれか１項に記載の方法。
前記核酸分子が２５個よりも多いヌクレオチドまたはヌクレオ塩基を含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。