JP2021525507A - 直接核酸配列決定方法 - Google Patents
直接核酸配列決定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2021525507A JP2021525507A JP2020565759A JP2020565759A JP2021525507A JP 2021525507 A JP2021525507 A JP 2021525507A JP 2020565759 A JP2020565759 A JP 2020565759A JP 2020565759 A JP2020565759 A JP 2020565759A JP 2021525507 A JP2021525507 A JP 2021525507A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rna
- mass
- ladder
- sequencing
- labeling
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000003203 nucleic acid sequencing method Methods 0.000 title description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 140
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 74
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 claims abstract description 42
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 27
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 24
- 230000026279 RNA modification Effects 0.000 claims abstract description 17
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 161
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 134
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 122
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 120
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 claims description 99
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 92
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 92
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 80
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 70
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 66
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 53
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 53
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 claims description 52
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 48
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 47
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 47
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 28
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 26
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 24
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 claims description 23
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 21
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 18
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 17
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 15
- 239000000126 substance Chemical group 0.000 claims description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 13
- 229930185560 Pseudouridine Natural products 0.000 claims description 13
- PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N Pseudouridine C Natural products OC1C(O)C(CO)OC1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N beta-Pseudouridine Natural products OC1OC(CN2C=CC(=O)NC2=O)C(O)C1O WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 claims description 13
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 claims description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 10
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 10
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 claims description 8
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 claims description 8
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 claims description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 7
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 claims description 5
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 5
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 claims description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 4
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 claims description 4
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 2
- 241000271532 Crotalus Species 0.000 claims description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims description 2
- 108010002700 Exoribonucleases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004678 Exoribonucleases Human genes 0.000 claims description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 2
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 2
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 claims description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 claims 7
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 claims 3
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 claims 1
- 101710135349 Venom phosphodiesterase Proteins 0.000 claims 1
- 238000004141 dimensional analysis Methods 0.000 claims 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 claims 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 claims 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 abstract description 104
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 abstract description 29
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 11
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 abstract description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 abstract description 5
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 399
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 51
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 42
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 38
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 37
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 29
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 26
- YBJHBAHKTGYVGT-ZXFLCMHBSA-N 5-[(3ar,4r,6as)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoic acid Chemical compound N1C(=O)N[C@H]2[C@@H](CCCCC(=O)O)SC[C@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZXFLCMHBSA-N 0.000 description 25
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 24
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 21
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 19
- 101710086015 RNA ligase Proteins 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 18
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000006154 adenylylation Effects 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 12
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 12
- UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N diisopropylamine Chemical compound CC(C)NC(C)C UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 12
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 10
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Chemical class Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- NLTUCYMLOPLUHL-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-[gamma-thio]triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=S)[C@@H](O)[C@H]1O NLTUCYMLOPLUHL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 10
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 9
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 9
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 8
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 8
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 8
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 8
- CIVGYTYIDWRBQU-UFLZEWODSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoic acid;pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1.N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 CIVGYTYIDWRBQU-UFLZEWODSA-N 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 7
- 238000007039 two-step reaction Methods 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 6
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 6
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 5
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 5
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 5
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 229940043279 diisopropylamine Drugs 0.000 description 4
- 238000012172 direct RNA sequencing Methods 0.000 description 4
- 238000000105 evaporative light scattering detection Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 4
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 1,1,1,3,3,3-hexafluoropropan-2-ol Chemical compound FC(F)(F)C(O)C(F)(F)F BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- -1 2-morpholinoethyl Chemical group 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical class C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 3
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 3
- LBLYYCQCTBFVLH-UHFFFAOYSA-M 2-methylbenzenesulfonate Chemical compound CC1=CC=CC=C1S([O-])(=O)=O LBLYYCQCTBFVLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 2
- 238000007596 consolidation process Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000004896 high resolution mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000001254 matrix assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000011451 sequencing strategy Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- HLLSOEKIMZEGFV-UHFFFAOYSA-N 4-(dibutylsulfamoyl)benzoic acid Chemical compound CCCCN(CCCC)S(=O)(=O)C1=CC=C(C(O)=O)C=C1 HLLSOEKIMZEGFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 1
- 238000012563 MS-based analyses Methods 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091012456 T4 RNA ligase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091046869 Telomeric non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 1
- 101150110932 US19 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000001369 canonical nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002680 canonical nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002044 canonical ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- RDFLLVCQYHQOBU-ZOTFFYTFSA-O cyanin Chemical class O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC(C(=[O+]C1=CC(O)=C2)C=3C=C(O)C(O)=CC=3)=CC1=C2O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 RDFLLVCQYHQOBU-ZOTFFYTFSA-O 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- MWEQTWJABOLLOS-UHFFFAOYSA-L disodium;[[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-oxidophosphoryl] hydrogen phosphate;trihydrate Chemical compound O.O.O.[Na+].[Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP([O-])(=O)OP(O)([O-])=O)C(O)C1O MWEQTWJABOLLOS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000001906 matrix-assisted laser desorption--ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 230000007171 neuropathology Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 238000005935 nucleophilic addition reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000006863 thiophosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
- C12Q1/6872—Methods for sequencing involving mass spectrometry
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3517—Marker; Tag
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本出願は、2018年5月25日に出願された米国仮特許出願第62/676,703号;2018年9月13日に出願された同第62/730,592号;2019年2月1日に出願された同第62/800,054号;および2019年4月15日に出願された同第62/833,964号の利益および優先権を主張し、それらは全てその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
したがって、例えば、tRNA、siRNA、薬物動態特性を有する治療的合成オリゴリボヌクレオチド、RNA分子の混合物を含む、RNA分子の効率的な配列決定、ならびにそのようなRNA分子の改変の検出を容易にするための方法が必要である。
以下に列挙されるRNAオリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies(Coralville、IA、米国)から得られたものである。RNA鎖の配列は以下の通りである:
アデニル化:RNaseを含有しない薄壁の0.5mL PCRチューブ中、10μLの合計反応容量を用いて、以下の反応を設定した:1xアデニル化反応緩衝液、100μMのATP、5.0μMのMth RNAリガーゼ、10.0μMのpCp−ビオチン、およびヌクレアーゼ非含有脱イオン水(Thermo Fisher Scientific、米国)。反応物を、GeneAmp(商標)PCR System 9700(Thermo Fisher Scientific、米国)中、65℃で1時間インキュベートした後、85℃で5分間、Mth RNAリガーゼ酵素を不活化した。
RNAの5’末端へのビオチンの標識化には、2つのステップが必要である:T4ポリヌクレオチドキナーゼ(NEB、米国)により、ATPγSから標的RNAの5’ヒドロキシル基にチオホスフェートを移す;ビオチンマレイミドの添加後、チオール反応性標識を、標的RNAの5’末端に化学的にカップリングする。実験プロトコールは、以下の通りである。反応液の総量を、ヌクレアーゼ非含有脱イオン水を用いて10μLにしながら、以下のもの:10x反応緩衝液、30μMのRNA(それぞれ、19nt、20nt、または21nt)、0.1mMのATPγS、10ユニットのT4ポリヌクレオチドキナーゼを、RNaseを含まない、薄壁の0.5mL PCRチューブ中で混合した。この試料を混合し、37℃で30分間インキュベートした。次いで、5μLのビオチンマレイミドまたはCy3マレイミド(312μLの無水DMF(無水ジメチルスルホキシド、99.9%、Sigma−Aldrich、米国)に溶解)を添加し、混合し、試料を65℃で30分間インキュベートした。上記手順によると、同様にカラム精製が必要であった。
直接RNA配列決定は、分解性生成物の生成を利用し、単一の切断事象によって産生されるRNA断片を、化合物質量間の質量差の観察によって直接配列決定することができる。酸加水分解は、任意の出発材料からの複数の切断事象によって内部断片を迅速に生成することができ、したがって、特に、ギ酸は沸点が低く、したがって、凍結乾燥によって容易に除去することができるため、それはMSにおいて広く使用されている弱く揮発性の有機酸である。RNA試料は、ある時点でビオチン化されるか、またはそれぞれのRNA試料溶液を3つのより小さいものに等しく分割する。1つは2分間、1つは5分間、および1つは15分間、40℃の50%(v/v)ギ酸を使用する酸分解によってアリコートを分解した後、それらを1回のLC/MS測定のために全て一緒に混合する。反応混合物を、ドライアイス上ですぐに凍結した後、乾燥するまで凍結乾燥し、典型的には、1h以内に完了させた。その後のビオチン/ストレプトアビジン捕捉/放出ステップのために、乾燥した試料を、20μLのヌクレアーゼ非含有脱イオン水中にすぐに懸濁したか、または−20℃で保存した。
ビオチン/ストレプトアビジン捕捉は、ストレプトアビジンで被覆された磁気ビーズを使用して、ビオチン標識RNAに結合させるが、それらはストレプトアビジンで被覆された磁気ビーズ上に固定され、磁石に引き寄せられる。したがって、結合したRNAを、非ビオチン標識RNAおよび不純物から単離するべきであり、後にLC−MS配列決定分析のためにビーズから溶出させることができる。
MicroASオートサンプラーおよびSurveyor MS Pump Plus HPLCシステムを装備したAgilent 1290 Infinity LCシステム(Agilent Technologies、Santa Clara、CA、米国)に連結されたiFunnel Agilent 6550 Q−TOF上で、試料を分離および分析した。全ての分離を、1.7μmの粒径を有する50mm x 2.1mm Xbridge C18カラム(Waters、Milford、MA、米国)をわたる、10mMジイソプロピルアミン(DIPA)(Thermo Fisher Scientific、米国)、pH7.0を含む25mMヘキサフルオロ−2−プロパノール(HFIP)(Thermo Fisher Scientific、米国)としての水性移動相(A)およびメタノールとしての有機移動相(B)を使用して実施した。流量は0.3mL/分であり、全ての分離を、60℃に維持したカラム温度を用いて実施した。注入体積は20μLであり、試料の量は15〜400pmolのRNAであった。データを、負の極性で記録した。試料データを、Agilent Technologies MassHunter LC/MS Acquisitionソフトウェアを使用して獲得した。LC−MS実験から関連するスペクトルおよびクロマトグラフィー情報を抽出するために、MassHunter Qualitative Analysis(Agilent Technologies)中のMolecular Feature Extractionワークフローを使用した。この分子特性抽出アルゴリズムは、質量および保持時間の次元で非標的特性の発見を実行する。原理的には、化合物を同定することができる任意のソフトウェアを使用することができる。ソフトウェアの設定は、実験で使用されたRNAの量に応じて変化した。一般に、できるだけ多くの同定された化合物が含まれていた。プロファイルのスペクトルピークを、低濃度の試料については、5のシグナル対ノイズ比(SNR)閾値、より濃縮された試料については、最大で20のSNR閾値を使用してフィルタリングした。他のアルゴリズム設定は、以下の通りであった:「低分子(クロマトグラフィー)」抽出アルゴリズム、電荷状態−1〜−15、水素(−H)イオンのみ損失、「一般有機分子」アイソトープモデル、最小品質スコア70(0〜100の範囲)、および最小イオン計数500。
結果
RNA断片の2つのラダーの物理的分離に基づくRNA分子の配列を決定するための方法が提供される。この方法は、2つのラダーの物理的分離によって、どの断片がどのラダーに属するかに関していかなる混同も防止するように設計され、出力物は、第1世代の方法における2つのS字形曲線(分析がはるかにより難しい)よりもむしろ、ただ1つのS字形曲線を含有すると予想される。2つのラダーの逐次的分離の別の利益は、ラダー分離後、それぞれの得られたLC/MSデータセットサイズが分離されていない前駆体のデータセットのサイズの半分未満になるため、塩基コール手順の単純化である。これらの2つの好ましい因子の助力を得て、当業者であれば、1つより多い鎖を含むより複雑なRNA試料を、その関連する改変を同時に分析しながら、配列決定することができる。実験を、図1に示されるように設計して、所望の断片を、5’または3’ラダープールのいずれかに物理的に分離した。ビオチンタグを、2ステップ反応によって、RNA試料のそれぞれの末端に付加した:(i)T4ポリヌクレオチドキナーゼと、アデノシン5’−[γ−チオ]三リン酸(ATP−γ−S)とを反応させて、配列決定しようとするRNAの5’ヒドロキシル基にチオホスフェートを付加することによる、チオール含有ホスフェートの5’末端への導入、次いで、(ii)得られたチオールリン酸化されたRNAと、1つまたは複数のチオール基を含有するタンパク質、核酸、または他の分子をビオチン化するために設計される、ビオチン(Long Arm)マレイミド(Vector Laboratories、米国)との間でのコンジュゲーション付加。次いで、得られた5’ビオチン化RNAを、以前の手順(6)と同様、ギ酸で処理する。酸分解の後、ストレプトアビジン結合ビーズ(Thermo Fisher Scientific、米国)を使用して、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を破壊した後、その後のLC/MS分析のために放出されるであろう、5’ラダープールを選抜する。
標識化効率を決定するために、MALDI−TOF MSを適用して、それぞれ、RNAの3’および5’末端でのビオチン化の効率を見積もった(図9および図10、代表データとして21ntのRNA)。標識化反応の効率は、実験セクションに記載のように使用される条件下で、出発材料の質量(m/z)および標識化された生成物の質量(m/z)のピーク強度の算出に基づいて、3’末端および5’末端について、それぞれ44%および91%であると見積もられた。ビオチン標識化された材料は、LC/MSによる直接配列決定のための質量ラダーを生成するための酸分解およびビオチン/ストレプトアビジン捕捉/放出のためにすぐに使用できる。
RNA標識化効率の増強。ビオチンまたは蛍光色素のようなタグを、高収率でRNA上に導入することはいまだ課題である。しかしながら、選択されたタグによるRNAの2つの末端の標識化は、本明細書に開示される直接RNA配列決定方法のステップである。標識化効率は、試料要件の低減をもたらすより高い標識化効率で、MSシグナルを生成するために、どれぐらい多くのRNA試料を使用することができるかと直接関連する。標識化効率を増大させるために、新しい標識化戦略を最適化し続けた。2ステップ反応を用いてRNAの5’末端を標識化した場合、高い標識化効率(約90%)が最近観察された(図14A)。最適化された反応条件としては、(i)水溶解度を増大させるためにCy3をスルホ−Cy3で置き換えること、(ii)溶液のpHを7.5に調整すること、および(iii)一定の撹拌を維持しながら、反応時間を長くすることが挙げられる。RNAの5’末端での標識化効率を改善する努力が続いているが、公開された方法(Cole K (2004) Nucleic Acids Res 32(11):e86-e86.1)によれば3’末端標識化についても同様の高収率を観察することが予想される。この高い効率を達成するために、アデニル化ステップの除去を可能にするであろう、ビオチン化pCpの活性型であるA(5’)pp(5’)Cp−TEG−ビオチン−3’(図14B)を化学的に合成した。当業者であれば、そのような戦略の使用により、両方の末端で標識化効率をほぼ定量的な収率に有意に改善することができる。
複数のRNA鎖を含む混合RNA試料の配列決定を可能にするMSに基づく配列決定方法のスループットおよび堅牢性を増大させるために、本明細書に記載のように、概念実証研究としてカノニカルな塩基と改変塩基との両方を含有する様々な長さの一連の合成RNAオリゴヌクレオチド上で新しい戦略の有効性を試験しながら、配列決定にとって必要とされるラダーを同定するために実験ワークフローを最適化し、2D LC/MSデータ分析を有意に単純化するための新しい戦略が開発された。単一塩基分解能で同時にシュードウリジン(Ψ)および5−メチルシトシン(m5C)を配列決定することができた。記載の末端標識化戦略と一緒に、単一の精製されたRNA鎖だけでなく、12種の異なるRNA配列を含有する試料混合物中でも完全なRNAを正確に配列決定しながら、これらの複数の塩基改変を同定し、位置決定し、定量することができた。
質量分析のための標識RNA分解断片の生成
本明細書に記載の実験手法では、いずれか一方のRNA末端を標識化し、他方の末端は非標識のままにしたか、またはRNAの2つの末端を異なるタグで標識化して、2D LC/MS法においてそれらをより良好に識別した。1つの標識化戦略では、LC/MS分析の前にRNAの3’末端または5’末端のいずれかにビオチンタグを導入して、正確に1つの質量ラダーにRTおよび質量シフトを導入した(14)。この方法は、LC/MSデータ分析を単純化し、混合RNA試料を配列決定する場合にどの断片がどのラダーに属するかに関する混同を防止するのに役立ち得る。それは、末端塩基を同定し、複数に切断された内部断片からモノヌクレオチドおよびジヌクレオチドを区別するのが難しい場合に厄介な低質量領域を回避することができるように、RNAラダーの質量を増加させる;対形成した末端の読み取りデータを必要とするよりもむしろ、1つの単一のラダーから完全な配列を読み取ることによって配列決定の精度を改善する;選択的RTシフトのため、ラダー成分の同定を容易にする塩基コール手順を単純化する;および以前に報告されたもの(5分)よりも長い分解時点(15分)を可能にすることによって試料効率を改善する(14)。これらの改善は、第1世代の方法と比較して、最小RNA試料負荷要件を低減するのに役立ち、稀なRNA改変を含む内因性RNA試料を配列決定する可能性を増大させ得る。
様々なRNA標識化法が報告されたにも関わらず、ビオチンまたは蛍光色素のようなタグを高収率でRNA上に導入することは依然として課題である。しかしながら、選択されたタグによるRNAの2つの末端の標識化は、本明細書に開示される直接RNA配列決定方法のステップである。標識化効率は、試料要件の低減をもたらすより高い標識化効率で、MSシグナルを生成するために、どれぐらい多くのRNA試料を使用することができるかを直接もたらす。標識化効率を増大させるために、新しい標識化戦略が探索され、高い標識化効率が5’末端と3’末端の両方で実証された(図18A)。5’末端標識については、1)タグの水溶解度を増大させるためにCy3の代わりにスルホ−Cy3(図18C)を使用すること、2)溶液のpHを7.5に調整すること、および3)一定の撹拌を維持しながら、反応時間を長くすることを含む、改変された反応プロトコールを使用することによって、完全長RNAの標識化効率は、約60%(図17B)から約90%(図18A)まで改善された。スルホ−Cy3標識化されたRNA#1の酸分解の後でも、非標識断片は軽いフィルタリング後にプロット上に出現しないため、標識化されたラダー成分は、絶対的な強度に関して非標識ラダー成分の数を大きく上回ることが見られる(図23)。3’末端でのより良好な標識化効率のために、アデニル化ステップを除去する、活性型のビオチン化pCpである、A(5’)pp(5’)Cp−TEG−ビオチン−3’(図18C)を合成した(15)。この方法を使用して21ntのRNA(RNA#11)を標識化する場合、3’末端標識化に関する高収率(約95%)が観察された(図18B)。両方の最適化された末端標識化戦略を試料調製プロトコールに組み込むことにより、最少試料負荷量の要件は、ここで全体の配列決定ワークフローにとってはそれほどの障害ではない。
次いで、新しい末端標識化LC/MS配列決定戦略を、改変核酸塩基を含有する合成試料に適用した。シュードウリジン(Ψ)は、RNA中に見出される全ての改変ヌクレオチドのうちで最も豊富であり、普及している。それは、あらゆる種およびコードRNA(mRNA)と非コードRNAとの両方を含む、多くの異なる型のRNAに存在する(16)。しかしながら、ΨとUとをMSによって直接識別することは、それらが同一の質量を有するため、不可能である。CMC−Ψ付加物を形成させるためのN−シクロヘキシル−N’−(2−モルホリノエチル)−カルボジイミドメト−p−トルエンスルホネート(CMC)を用いた求核付加を利用する、確立された化学標識手法が、ΨとUとを識別するために以前に開発された(17)。CMC−Ψ付加物は、逆転写を失速させ、cDNAを、3’末端に向かって1ヌクレオチド下流で終結させ、現在、単一塩基分解能で様々なRNA中のΨ部位を検出するために使用されている(18)。ここで、同じ化学を適応させて、本発明者らのシステムにおいて同じCMC−Ψ付加物を形成させる(図19A)。付加物は、Uの質量よりも大きいユニークな質量252.2076ダルトンを有するだけでなく、Uよりも疎水性であり、RTのシフトももたらす。したがって、CMC−Ψ付加物は、任意のRNA鎖中のΨを同定し、位置を決定するのに役立つであろう、質量−RTプロットにおいて、CMC−Ψ付加物を含有する全てのラダー断片の質量とRTの両方を有意にシフトさせるであろう。
最後に、手持ちの末端標識化およびΨ塩基改変法を用いて、複数の改変を有するRNA鎖を含有する多重RNA試料を配列決定(複数の異なるRNA配列を含有する混合試料の同時的配列決定)するために、方法のスループットを増大させることが次に求められた。11種の非改変RNAと、1個のΨおよび1個のm5Cを含有する1種の多重改変RNAとを含有する、異なる配列を有する12種のRNAを含有する試料混合物を、プロトコールにかけた。最初に、全てのRNA試料の3’末端をビオチンで化学的に標識化したが、5’末端にはスルホ−Cy3を付加した(塩基改変を含有するRNA鎖を除く)。LC/MSによる測定後、MFE設定が最適化されたAgilent MassHunter Qualitative Analysisソフトウェアを使用してデータを分析して、配列生成のためのデータを抽出した。上記の標識化効率の改善があれば、混合物中の全てのRNAの完全な配列を正確に読み取るのに必要とされる全てのラダー断片を検出することができた。多重化された試料の分析では、典型的な塩基コールアルゴリズム(全ての以前の図面において使用されたもの)は使用しなかった。これらの配列を手動で塩基コールを行い、全ての配列を読み取ることができた(図20Aおよび図20B)。その結果、一本鎖RNA試料と混合RNA試料との両方におけるその質量をマッピングすることによって、4つのカノニカルなヌクレオシド(A、C、GおよびU)を配列決定することができるだけでなく、Ψおよびm5Cなどの、単一塩基分解能で複数の改変塩基、または任意の他の改変塩基を再度同定し、位置を決定し、定量することもできることが示された。同様に、Ψを配列決定するために、RNAを前述のようにCMCで処理し、したがって、新しい曲線は、Ψでその対応する非CMC含有ラダー曲線から離れて分岐した(ピンク色)。これらの研究においては、自動化塩基コール適用の使用と反対に、配列を手動で読み取ったが、これらの研究は、システムの試料調製および質量分析の側面で実験的限界も物理的限界もないことを示している;LC/MSから抽出されたMFEファイルにより生成された質量−RTプロットにより、混合物のそれぞれの成分の質量ラダーを、適切に生成し、正確に配列決定し、塩基コールを行うことができる。これらの結果は、本明細書に記載の直接RNA法が、以前に公開(14)されたような1個の非カノニカルな塩基を含有する精製された一本鎖RNAだけに限ったことではなく、改変塩基を含有する複数のRNAを含むより複雑なRNA試料を配列決定することができることを示している。それは、様々な複雑な生体RNA試料のMS配列決定に関する大きな前進である。
以前のMSに基づくRNA配列決定方法は、複数に切断された断片の望ましくない出現(14)とは反対に、配列決定のために単一の切断を含む明確に定義された質量ラダーを生成するための分解条件を制御した。そのため、5分のギ酸処理を実施して、約10%の20nt(RNA#3)試料を、その対応する5’および3’配列決定ラダーに消化して、1つより多い切断を含む内部RNA断片の形成を最小化させた(14)。したがって、出発材料の約90%は、無傷のままであり、いかなる配列情報も得ることができなかった。存在量が少ない現実の生体試料については、試料の約90%が配列決定のために使用できないという事実により、前記方法は、これらの低存在量の試料を正確に配列決定するのに十分なシグナルを生成することができない。使用可能な試料のパーセンテージを増大させるためには、より長い分解ステップが必要である。しかしながら、より長い化学的/酵素的分解ステップにおいて多くの所望のラダー断片を生成するプロセスは、所与の配列上の1つより多い切断部位のため、元のRNA配列に由来する5’または3’末端を有しない大量の内部断片の産生をもたらすであろう(これは確率的に制御されたプロセスである)。以前の方法(14)は、内部断片は塩基配列の決定および改変分析において実際に使用されたRNAラダーの一部ではなかったため、それらを単なる「ノイズ」として無視した。これらの内部断片には依然として固有の情報が存在するが、内部断片に由来する情報を効率的に利用することは、これらの配列が、特に、2000ダルトン(Da)未満の質量を有するより低い質量領域中の断片については、所望のラダー化合物と混合されているため、困難である。この低い質量領域では、所与のRNA鎖の任意の部分に由来するモノマー、ダイマー、およびトリマーヌクレオチドを、LC/MSのLC段階で容易に分離することができず、正確な配列の同定および分析に困難をもたらす。しかしながら、酸分解の前に元の試料の二重末端標識化により内部断片から所望のラダー断片を分離すれば、以前には使用されなかった内部断片を実際に利用することが可能となる。60分の分解ステップにかけられたRNA試料の2−D質量−RTプロットの配列曲線において観察されたように1個より多い塩基が失われた報告された配列中にギャップがある場合(皮肉にも内部断片を生成する同じ長い酸分解ステップから生成される)、配列生成/アラインメントに対して1つより多い切断を有する内部断片から情報を収集し、適用することが提唱される。図25に示されるように、3つの情報:(a)5’ラダー、(b)3’ラダー、および(c)両方の末端がない内部断片を組み合わせることにより、完全に除去することができる可能性がある長い分解時間によって引き起こされる質量−RTラダーにおけるギャップ(割り当てることができない塩基)としてRNA配列決定の精度を有意に増大させることができる。
(1)シュードウリジンの化学的変換を、シュードウリジンとウリジンとを区別するために適用した。(2)最適化された実験手順を用いて、RNA鎖の一方または両方の末端に標識を付加した。(3)単一のRNA鎖またはRNA鎖の混合物を、理想的には、2’−OH支援酸加水分解メカニズムによる、それぞれのRNA鎖の全長にわたるその上のホスホジエステル結合の、無作為の配列状況非依存的な、単一切断によって、一連の短い、明確に定義された断片(配列ラダー)に分解した。(4)必要に応じて、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズを使用して非標識RNAからビオチン化RNAを物理的に分離した。(5)次いで、消化された断片を、LC/MS分析にかけ、デコンボリューションされた質量およびRTを分析して、それぞれのラダー断片を同定した。(6)データプロセッシングおよび配列生成プロセスを自動化するアルゴリズムを適用した。
2ステッププロトコールを使用する。(1)アデニル化:RNaseを含有しない薄壁の0.5mL PCRチューブ中、10μLの合計反応容量を用いて、以下の反応を設定した:1xアデニル化反応緩衝液(5’アデニル化キット)、100μMのATP、5.0μMのMth RNAリガーゼ、10.0μMのpCp−ビオチン、およびヌクレアーゼ非含有脱イオン水(Thermo Fisher Scientific、米国)。反応物を、GeneAmp(商標)PCR System 9700(Thermo Fisher Scientific、米国)中、65℃で1時間インキュベートした後、85℃で5分間、Mth RNAリガーゼ酵素を不活化した。(2)ライゲーション:30μLの反応溶液は、アデニル化ステップに由来する10μLの反応溶液、1x反応緩衝液、5μMの標的RNA試料、10%(v/v)のDMSO(無水ジメチルスルホキシド、99.9%、Sigma−Aldrich、米国)、T4 RNAリガーゼ(10ユニット)、およびヌクレアーゼ非含有脱イオン水を含有していた。反応物を、16℃で一晩インキュベートした後、カラム精製した。
5’末端でのビオチン標識化は、2つのステップを要した。ヌクレアーゼ非含有脱イオン水で合計反応容量を10μLにした、10x反応緩衝液、90μMのRNA、1mMのATPγS、および10ユニットのT4ポリヌクレオチドキナーゼを含有するRNaseを含まない、薄壁のPCRチューブ(0.5mL)中、37℃で30分間にわたってインキュベーションを実行した。次いで、312μLの無水DMF(無水ジメチルスルホキシド、99.9%、Sigma−Aldrich、米国)に溶解した5μLのビオチンマレイミドを添加し、ボルテックスによって混合し、65℃で30分間、試料をインキュベートした。Oligo Clean & Concentratorを使用するカラム精製を、上記のように行った。
別途指示しない限り、質量ラダーを産生するために完全長RNA試料を分解するためにギ酸を適用した30、31。それぞれのRNA試料溶液を、40℃で50%(v/v)のギ酸を使用するギ酸分解のために3つの等量のアリコートに分割し、1つの反応は2分間、1つは5分間、および1つは15分間実行した。内部断片の生成に関する実験のために(図S4)、60分のギ酸処理をRNA#3上で行った。反応混合物を、ドライアイス上ですぐに凍結した後、乾燥するまで凍結乾燥し、典型的には、30分以内に完了させた。乾燥した試料を合わせ、その後のビオチン/ストレプトアビジン捕捉/放出ステップのために20μLのヌクレアーゼ非含有脱イオン水中に懸濁したか、またはLC/MS測定のために−20℃で保存した。図20では、LC/MSに注入する前に、1つは3’−ビオチン標識を用い、1つは5’−スルホ−Cy3標識を用いた、同じ11種の配列(RNA#1〜RNA#11)の2つの別々の試料、および3’−ビオチン標識化されたRNA#12を含有する試料と共に混合されたこれらの試料を用いて、実験を開始した。
ビオチン/ストレプトアビジン捕捉は、ストレプトアビジンで被覆された磁気ビーズを使用して、ビオチン標識RNAに結合させるが、それらはストレプトアビジンで被覆された磁気ビーズ上に選択的に固定され、磁石に引き寄せられる。したがって、結合したRNAを、非ビオチン標識RNAおよび不純物(溶液中に残存し、洗浄除去されるであろう)から単離するべきであり、後にLC−MS配列決定分析のためにビーズから溶出させることができる。図16B中の試料について(他の試料はこのステップを必要としない)、200μLのDynabeads(商標)MyOne(商標)ストレプトアビジンC1ビーズを、最初に等量の1xB&W緩衝液を添加することによって調製した。この溶液をボルテックスし、2分間磁石上に置いた後、上清を廃棄した。ビーズを、200μLの溶液A(DEPC処理された0.1MのNaOHおよびDEPC処理された0.05MのNaCl)で2回、溶液B(DEPC処理された0.1M NaCl)中で1回洗浄した。最後に100μLの2xB&W緩衝液を添加して、ビーズの濃度を20mg/mLにした。次いで、1xB&W緩衝液中の等容量のビオチン化RNAを添加し、試料を、穏やかな回転を使用して室温で15分間インキュベートした後、2分間チューブを磁石上に置き、上清を廃棄した。被覆されたビーズを1xB&W緩衝液中で3回洗浄し、それぞれの洗浄ステップの上清の最終濃度を、回収分析のためにNanodropによって測定して、標的RNA分子がビーズ上に残存していることを確認した。固定されたビオチン化RNAを放出させるために、ビーズを、65℃で5分間、95%ホルムアミド(Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、米国)を含む10mM EDTA(Thermo Fisher Scientific、米国)、pH8.2中でインキュベートした。最後に、この試料チューブを、2分間磁石上に置き、上清(標的RNA分子を含有する)をピペットによって収集した。
Bakin and Ofengand (Bakin, A.; Ofengand, J.. Biochemistry 1993, 32 (37), 9754-62)による報告に従って、シュードウリジンを改変するための実験手法を実施した。それぞれのRNA試料(1nmol)を、90μLの総反応容量中、37℃で20分間50mMビシン、pH8.3、4mM EDTA、および7M尿素中の0.17M CMCで処理した。60μLの1.5M NaOAcおよび0.5mM EDTA、pH5.6(緩衝液A)を用いて、反応を停止させた。Oligo Clean & Concentratorを使用する精製後、60μLの0.1M Na2CO3緩衝液、pH10.4を溶液に添加し、120μLの反応容量にし、37℃で2時間インキュベートした。緩衝液Aを用いて反応を停止させ、Oligo Clean & Concentratorにより精製した。
MicroASオートサンプラーおよびSurveyor MS Pump Plus HPLCシステム(Agilent Technologies、Santa Clara、CA、米国)(Hunter Mass Spectrometry、NY、米国)を装備した1290 Infinity LCシステムに連結された6550 Q−TOF質量分析装置上で、試料を分離および分析した。全ての分離を、1.7μmの粒径を有する50mm x 2.1mm Xbridge C18カラム(Waters、Milford、MA、米国)をわたる、水性移動相(A)、10mMジイソプロピルアミン(DIPA)(Thermo Fisher Scientific、USA)をpH9.0で含む25mMヘキサフルオロ−2−プロパノール(HFIP)(Thermo Fisher Scientific、USA)および有機移動相(B)、メタノールを使用する逆相HPLCで実施した。流量は0.3mL/分であり、全ての分離を、35℃に維持したカラム温度を用いて実施した。注入容量は20μLであり、試料の量は15〜400pmolのRNAであった。データを、負の極性で記録した。MassHunter Acquisitonソフトウェア(Agilent Technologies、米国)を使用して、試料データを獲得した。LC−MS実験から関連するスペクトルおよびクロマトグラフィー情報を抽出するために、MassHunter Qualitative Analysis(Agilent Technologies、米国)中のMolecular Feature Extractionワークフローを使用した。この特許で守られた分子特性抽出アルゴリズムは、質量および保持時間の次元で非標的特性の発見を実行する。原理的には、化合物を同定することができる任意のソフトウェアを使用することができた。ソフトウェアの設定は、実験で使用されたRNAの量に応じて変化した。一般に、目標は、最大で1000までの、できるだけ多くの同定された化合物を含むことであった。プロファイルのスペクトルピークを、低濃度の試料については、5のシグナル対ノイズ比(SNR)閾値、より濃縮された試料については、最大で20のSNR閾値を使用してフィルタリングした。他のアルゴリズム設定は、以下の通りであった:「低分子(クロマトグラフィー)」抽出アルゴリズム、電荷状態−1〜−15、水素(−H)イオンのみ損失、「一般有機分子」アイソトープモデル、最小品質スコア70(0〜100の範囲)、および最小イオン計数500。
LC/MSデータ分析の第1のステップは、データの予備プロセッシングおよびデータ整理を行うことであり、LC/MSデータが低ノイズになり、その結果、次のステップにおいてデータからRNA配列を読み取ることがより容易になる。多次元LC/MSデータから、保持時間(RT)、強度(体積)、および品質スコア(QS)などの、データを予備プロセッシングし、その容量を低減させるために使用することができるいくつかの次元が存在する。データプロセッシングおよび配列決定アルゴリズムに対する改変に関する詳細については、補足情報を参照されたい。修正アルゴリズムのソースコードは利用可能である。当業者であれば、アルゴリズムのさらなる改善により、より複雑な細胞性RNAを配列決定する場合に塩基コールおよび改変同定を自動化することができる。
塩基改変は細胞または試料中の全ての同一のRNA配列の100%に存在するわけではないため、細胞性RNA改変の動力学の理解(20、21)には、部位特異的改変を有するRNAの、そのカノニカルな対応物RNAに対する化学量論/パーセンテージを定量する方法が必要である。上記定量戦略を他の配列にも適用すると、この方法により、当業者であれば、任意の質量が変更された改変を有するRNAの、その対応する非改変対応物に対するパーセンテージを正確に決定することができる。図21に示されるように、改変RNAと非改変RNAとの両方を含有する混合物から、m5Cを含む完全な配列を正確に読み取ることができるだけでなく(図21A)、抽出されたイオンクロマトグラフからの情報に基づいて、m5C改変RNA(20%)の、その非改変対応物(80%)に対する相対パーセンテージを定量することもできる(図21B)(21)。3’−ビオチン標識化されたメチル化RNAおよび非改変RNAの抽出イオン電流(EIC)ピークを、そのギ酸分解前に積分することによって、異なる生成物種の相対量を定量した。配列決定に加えて、他の異なる比を有するRNA混合物も同様に定量した(図21B)。これらの相対パーセンテージは、5%未満の差でRNA標識化のために最初に使用されるRNAの絶対量の比と良好に一致するが、これは、EICに基づく積分が、同じ配列を有する全てのRNAが改変されなかった場合の改変RNAの相対的定量のための正確な方法であることを示している。この考えをΨに拡張すると、この方法により、当業者であれば、Ψを含むCMC化学の収率で因数分解できる場合、Ψ含有RNAの非Ψ含有RNAに対するパーセンテージを見積もることができる。
A10−非改変MSピークの一覧
A10−5’−Cy3標識化されたMSピークの一覧
ppm=10−6×(質量理論−質量観測)/質量理論
表S1. ストレプトアビジンビーズによる単離、次いで、化学的分解後の3'ビオチン標識化されたRNA#1(3'標識質量ラダー成分、RNA#1)のLC/MS分析。
表S2. ストレプトアビジンビーズによる単離、次いで、化学的分解後の3'ビオチン標識化されたRNA#1(5'非標識質量ラダー成分、RNA#1)のLC/MS分析。
*NA:分析せず。溶出緩衝液に由来するバックグラウンドイオンを最小化するために、350Daの閾値を設定した。そうでなければ、HFIPおよびDPAイオンが主に検出されるであろう。したがって、350Da未満の質量は検出されなかった。
表S3. 5'ビオチン標識化されたRNA#1(5'標識質量ラダー成分、RNA#1)のLC/MS分析
表S4. 5'ビオチン標識化されたRNA#2(5'標識質量ラダー成分、RNA#2)のLC/MS分析。
表S5. 3'ビオチン標識化されたRNA#1(3'標識質量ラダー成分、RNA#1)のLC/MS分析。
表S6. 5'Cy3標識化されたRNA#1(5'標識質量ラダー成分、RNA#1)のLC/MS分析。
表S7. 1個のΨを含有するRNA#12(5'から3'までのΨ非変換質量ラダー成分、RNA#12)のLC/MS分析。
表S8. 1個のΨを含有するRNA#12(3'から5'までのΨ非変換質量ラダー成分、RNA#12)のLC/MS分析。
表S9. 1個のΨを含有するRNA#12(5'から3'までのCMC変換されたΨを含む質量ラダー成分、20ntのRNA)のLC/MS分析
表S10. 1個のΨを含有するRNA#12(3'から5'までのCMC変換されたΨを含む質量ラダー成分、RNA#12)のLC/MS分析
表S11. 2個のΨを含有するRNA#13(5'から3'までのΨ非変換質量ラダー成分、RNA#13)のLC/MS分析。
表S12. 2個のΨを含有するRNA#13(5'から3'までの1個のCMC変換されたΨを含む質量ラダー成分、20ntのRNA#13)のLC/MS分析。
表S13 .2個のΨを含有するRNA#13(5'から3'までの1個のCMC変換されたΨを含む質量ラダー成分、RNA#13)のLC/MS分析。
表S14. 2個のΨを含有するRNA#13(5'からの2個のCMC変換されたΨを含む質量ラダー成分、RNA#13)のLC/MS分析。
表S15. その質量ラダー成分を示す、3'ビオチン標識化されたRNA#1のLC/MS分析。
表S16. その質量ラダー成分を示す、3'ビオチン標識化されたRNA#2のLC/MS分析。
表S17. その質量ラダー成分を示す、3'ビオチン標識化されたRNA#3のLC/MS分析。
表S18. その質量ラダー成分を示す、3'ビオチン標識化されたRNA#4のLC/MS分析。
表S19. その質量ラダー成分を示す、3'ビオチン標識化されたRNA#5のLC/MS分析。
表S20. その質量ラダー成分を示す、3'ビオチン標識化されたRNA#6のLC/MS分析。
表S22. その質量ラダー成分を示す、3'ビオチン標識化されたRNA#8のLC/MS分析。
表S23. その質量ラダー成分を示す、3'ビオチン標識化されたRNA#9のLC/MS分析。
表S24. その質量ラダー成分を示す、3'ビオチン標識化されたRNA#10のLC/MS分析。
表S25. その質量ラダー成分を示す、3'ビオチン標識化されたRNA#11のLC/MS分析。
表S26. その質量ラダー成分を示す、5'スルホ-Cy3標識化されたRNA#1のLC/MS分析。
表S27. その質量ラダー成分を示す、5'スルホ-Cy3標識化されたRNA#2のLC/MS分析。
表S28. その質量ラダー成分を示す、5'スルホ-Cy3標識化されたRNA#3のLC/MS分析。
表S29. その質量ラダー成分を示す、5'スルホ-Cy3標識化されたRNA#4のLC/MS分析。
表S30. その質量ラダー成分を示す、5'スルホ-Cy3標識化されたRNA#5のLC/MS分析。
表S31. その質量ラダー成分を示す、5'スルホ-Cy3標識化されたRNA#6のLC/MS分析。
表S32. その質量ラダー成分を示す、5'スルホ-Cy3標識化されたRNA#7のLC/MS分析。
表S33. その質量ラダー成分を示す、5'スルホ-Cy3標識化されたRNA#8のLC/MS分析。
表S34. その質量ラダー成分を示す、5'スルホ-Cy3標識化されたRNA#9のLC/MS分析。
表S35. その質量ラダー成分を示す、5'スルホ-Cy3標識化されたRNA#10のLC/MS分析。
表S36. その質量ラダー成分を示す、5'スルホ-Cy3標識化されたRNA#11のLC/MS分析。
表S37. そのΨ-CMC変換された質量ラダー成分を示す、3'ビオチン標識化されたRNA#12のLC/MS分析。
表S38. そのΨ非変換質量ラダー成分を示す、3'ビオチン標識化されたRNA#12のLC/MS分析。
データを、以下のようにプロセッシングした:
図16Bについて:最大プロッティングウィンドウRT、20に設定:ax.set_ylim(min_time、15);最大質量<7000。体積で上位500を取る(3486を含むそれより上)。
図16C:プロッティングウィンドウRT、5.5〜12に設定:ax.set_ylim(5.5、12)。
最大質量<7500。
体積で上位500を取る(1219を含むそれより上)。
図17B:最大質量<7000。
体積で上位1000を取る(33693を含むそれより上)。
図19A:最大質量<8000。
体積で上位500を取る(241698を含むそれより上)。
図19B:最大質量<8000。
CMC標識化効率がある程度低かったため、体積で上位1000を取る(63110を含むそれより上)。
図S2:最大質量<8000。
体積で上位300を取る(121230を含むそれより上)。
第2のステップは、LC/MSデータを分析し、RNA配列を自動的に認識することである。[JACS 2015]からのアルゴリズムの改変バージョンを使用した。
最初に、デフォルトのcfgファイルに改変を加えた:
前
後
1)厳密に単調に増加または減少する配列プロットの要件を削除した
コメントアウト:
2)質量フィルタリングステップを無効にした:
3)図16C以降について、コードの以下の領域を、標識を除去するためのプロッティングを容易にするためにコメントアウトした。
特定の図面に関するさらなる変更を、以下に従って行った:
図16Bについて:最大プロッティングウィンドウRT、20に設定:ax.set_ylim(min_time、20)。
最大質量<7000。
体積で上位500を取る(3486を含むそれより上)。
プロッティングの方向もフリップした(変更は太字):
Claims (41)
- 一次RNA配列およびRNA改変の存在/同定/位置を決定するためのRNA配列決定方法であって、(i)RNAの5’および/または3’末端の標識化ステップ;(ii)前記RNAの無作為分解ステップ;(iii)必要に応じて、5’および3’末端標識化に基づく得られたRNA断片の物理的分離ステップ;(iv)得られたRNA断片特性の分離および検出ステップ;ならびに(v)配列/改変同定をもたらすデータ分析ステップを含む、方法。
- 前記ステップ(iv)の得られたRNA断片の分離が、高速液体クロマトグラフィーによって達成される、請求項1に記載の方法。
- 前記高速液体クロマトグラフィーが、逆相高速液体クロマトグラフィーである、請求項2に記載の方法。
- 前記ステップ(iv)の得られたRNA断片の分離が、キャピラリー電気泳動によって達成される、請求項1に記載の方法。
- 前記ステップ(iv)の得られたRNA断片特性の検出が、質量分析によって達成される、請求項1に記載の方法。
- RNA分子の5’および/または3’末端の親和性標識化が、ビオチンのような疎水性標識またはCY3もしくはCY5などの蛍光色素によるものである、請求項1に記載のRNA配列決定方法。
- RNA分子の5’および/または3’末端の親和性標識化が、チオール基によるものである、請求項1に記載のRNA配列決定方法。
- RNA分子の5’および/または3’末端の親和性標識化が、任意のビオチン化pCpによるものである、請求項1に記載のRNA配列決定方法。
- RNA分子の5’および/または3’末端の親和性標識化が、DNAアダプターによるものである、請求項1に記載のRNA配列決定方法。
- RNA分子の5’および/または3’末端の親和性標識化が、ポリ(A)オリゴヌクレオチドによるものである、請求項1に記載のRNA配列決定方法。
- 前記RNAの化学的分解が、化学的分解によって行われる、請求項1に記載のRNA配列決定方法。
- 前記化学的分解が、ギ酸またはアルカリ加水分解を用いて行われる、請求項11に記載のRNA配列決定方法。
- 前記RNAの分解が、酵素的分解によって行われる、請求項1に記載のRNA配列決定方法。
- 前記酵素的分解が、Crotalus adamanteus毒のホスホジエステラーゼI、ウシ脾臓ホスホジエステラーゼII、およびXRN−1エキソリボヌクレアーゼからなる群からの酵素を使用して行われる、請求項13に記載のRNA配列決定方法。
- 化学的分解が、RNA分子の5’および3’末端の親和性標識化の前に行われる、請求項1に記載のRNA配列決定方法。
- 化学的分解が、RNA分子の5’および3’末端の親和性標識化の後に行われる、請求項1に記載のRNA配列決定方法。
- RNA試料が、限られた多様性の精製されたRNA試料を含む、請求項1に記載のRNA配列決定方法。
- RNA試料が、RNAの混合物を含む、請求項1に記載のRNA配列決定方法。
- RNA試料が、治療的RNA分子を含む、請求項1に記載のRNA配列決定方法。
- RNAヌクレオチド配列が、MSデータ出力と、既知および/または未知のリボヌクレオチドの質量との相関によって決定される、請求項1に記載のRNA配列決定方法。
- 改変リボヌクレオチドの存在が、MSデータ出力と、既知および/または未知の改変リボヌクレオチドの質量との相関によって決定される、請求項1に記載のRNA配列決定方法。
- (i)RNA断片の疎水性を増大させることによって、分解されたRNA断片の保持時間を増加させる部分を用いた、RNAの5’および/または3’末端の標識化ステップ;(ii)前記RNAの無作為分解ステップ;(iii)得られたRNA断片特性の分離および検出ステップ;ならびに(iv)配列/改変同定をもたらすデータ分析ステップを含む、RNA配列決定方法。
- 前記ステップ(iv)の得られたRNA断片の分離が、高速液体クロマトグラフィーによって達成される、請求項22に記載の方法。
- 前記高速液体クロマトグラフィーが、逆相高速液体クロマトグラフィーである、請求項22に記載の方法。
- 前記ステップ(iv)の得られたRNA断片の分離が、キャピラリー電気泳動によって達成される、請求項22に記載の方法。
- 前記ステップ(iv)の得られたRNA断片特性の検出が、質量分析によって達成される、請求項22に記載の方法。
- (i)前記RNAの3’末端がビオチン部分で標識化され、前記RNAの5’末端が疎水性Cy3タグで標識化されるか、または(ii)前記RNAの5’末端がビオチン部分で標識化され、前記RNAの3’末端が疎水性Cy3タグで標識化される、請求項22に記載の方法。
- (i)DNAの5’および/または3’末端の親和性標識化ステップ;(ii)前記DNAの質量ラダーへの無作為分解ステップ;(iii)必要に応じて、親和性相互作用に基づく得られたDNA断片の物理的分離ステップ;(iv)質量分析とカップリングした、逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)またはキャピラリー電気泳動(CE)または他の分離方法を使用する得られたDNA断片の測定ステップ;ならびに(v)配列/改変同定をもたらすMSデータ分析ステップを含む、DNA配列決定方法。
- DNA分子の5’および/または3’末端の前記親和性標識化が、ビオチン標識によるものである、請求項28に記載のDNA配列決定方法。
- 前記DNAの分解が、酵素的分解によって行われる、請求項28に記載のDNA配列決定方法。
- 前記酵素的分解が、DNA制限エンドヌクレアーゼを使用して行われる、請求項30に記載のDNA配列決定方法。
- データ分析が、質量および保持時間に依拠した2次元分析である、請求項1に記載のDNA配列決定方法。
- データ分析が、前記RNA配列から得られたRNA断片のユニークな特性に基づいて行われる、請求項1に記載のDNA配列決定方法。
- RNA断片の前記ユニークな特性が、電気シグナルまたは光学的シグネチャシグナルである、請求項33に記載のDNA配列決定方法。
- 改変ヌクレオシドであるシュードウリジン(Ψ)を含有するRNAが、ウリジン(U)と比較してΨと優先的に反応し、CMC−Ψ付加物の形成をもたらすCMCで処理され、前記付加物が2−D質量−RTプロットにおいてUを含むCMC変換されていないΨと比較して質量およびRTのシフトをもたらす、請求項1または28に記載のRNA配列決定方法。
- RNAがΨ含有RNAであるRNA配列決定方法であって、(i)配列決定しようとするRNAのCMCによる処理ステップ;(ii)前記RNAの5’および3’末端の親和性標識化ステップ;(iii)前記RNAの無作為分解ステップ;(iv)必要に応じて、親和性相互作用に基づく得られたRNA断片の物理的分離ステップ;(v)質量分析とカップリングした、逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)またはキャピラリー電気泳動(CE)または他の分離方法を使用する得られたRNA断片の測定ステップ;ならびに(v)配列/改変同定をもたらすMSデータ分析ステップを含む、方法。
- 前記RTおよび質量のシフトが、Uと比較してΨと優先的に反応することができるCMCまたは化学部分によって引き起こされ得る、請求項35に記載の方法。
- 改変核酸塩基を含むRNA配列が、改変RNAと非改変RNAとの両方を含有する混合物から決定され、改変核酸塩基の非改変核酸塩基に対する相対パーセンテージを定量することができる、請求項1または28に記載のRNA配列決定方法。
- 改変核酸塩基の非改変核酸塩基に対する前記相対パーセンテージの定量を、抽出イオンクロマトグラフに基づく部分改変RNA試料中で定量することができる、請求項38に記載の方法。
- RNA試料が、RNA分子のアナログを含む、請求項1に記載のRNA配列決定方法。
- 前記RNA分子の前記アナログが、N3’−P5’結合ホスホロアミデートDNAまたはRNAである、請求項40に記載のRNA配列決定方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2023192920A JP2024010243A (ja) | 2018-05-25 | 2023-11-13 | 直接核酸配列決定方法 |
Applications Claiming Priority (9)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201862676703P | 2018-05-25 | 2018-05-25 | |
US62/676,703 | 2018-05-25 | ||
US201862730592P | 2018-09-13 | 2018-09-13 | |
US62/730,592 | 2018-09-13 | ||
US201962800054P | 2019-02-01 | 2019-02-01 | |
US62/800,054 | 2019-02-01 | ||
US201962833964P | 2019-04-15 | 2019-04-15 | |
US62/833,964 | 2019-04-15 | ||
PCT/US2019/033920 WO2019226990A1 (en) | 2018-05-25 | 2019-05-24 | Direct nucleic acid sequencing method |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023192920A Division JP2024010243A (ja) | 2018-05-25 | 2023-11-13 | 直接核酸配列決定方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2021525507A true JP2021525507A (ja) | 2021-09-27 |
Family
ID=68617230
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020565759A Pending JP2021525507A (ja) | 2018-05-25 | 2019-05-24 | 直接核酸配列決定方法 |
JP2023192920A Pending JP2024010243A (ja) | 2018-05-25 | 2023-11-13 | 直接核酸配列決定方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023192920A Pending JP2024010243A (ja) | 2018-05-25 | 2023-11-13 | 直接核酸配列決定方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210198734A1 (ja) |
EP (1) | EP3802821A4 (ja) |
JP (2) | JP2021525507A (ja) |
WO (1) | WO2019226990A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2021216593A1 (en) * | 2020-04-20 | 2021-10-28 | New York Institute Of Technology | Methods for direct sequencing of rna |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008512129A (ja) * | 2004-09-10 | 2008-04-24 | セクエノム,インコーポレイティド | 核酸の広範囲配列分析法 |
US20170253911A1 (en) * | 2013-12-05 | 2017-09-07 | New England Biolabs, Inc. | Methods for Enriching for a Population of RNA Molecules |
WO2017149139A1 (en) * | 2016-03-03 | 2017-09-08 | Curevac Ag | Rna analysis by total hydrolysis |
US20180080018A1 (en) * | 2010-06-18 | 2018-03-22 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and Compositions for Synthetic RNA Endonucleases |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU738237B2 (en) * | 1997-07-22 | 2001-09-13 | Qiagen Genomics, Inc. | Methods and compositions for analyzing nucleic acid molecules utilizing sizing techniques |
KR100858465B1 (ko) * | 1999-09-10 | 2008-09-16 | 제론 코포레이션 | 올리고뉴클레오티드 엔3'→피5' 티오포스포라미데이트,이의 합성 및 용도 |
JP2008512084A (ja) * | 2004-05-25 | 2008-04-24 | ヘリコス バイオサイエンシーズ コーポレイション | 核酸の配列決定のための方法およびデバイス |
EP2350313B1 (en) * | 2008-10-29 | 2014-06-04 | Noxxon Pharma AG | Sequencing of nucleic acid molecules by mass spectrometry |
WO2013016712A2 (en) * | 2011-07-27 | 2013-01-31 | The Rockefeller University | Methods for fixing and detecting rna |
WO2013017853A2 (en) * | 2011-07-29 | 2013-02-07 | Cambridge Epigenetix Limited | Methods for detection of nucleotide modification |
-
2019
- 2019-05-24 US US17/058,167 patent/US20210198734A1/en active Pending
- 2019-05-24 JP JP2020565759A patent/JP2021525507A/ja active Pending
- 2019-05-24 WO PCT/US2019/033920 patent/WO2019226990A1/en unknown
- 2019-05-24 EP EP19808515.1A patent/EP3802821A4/en active Pending
-
2023
- 2023-11-13 JP JP2023192920A patent/JP2024010243A/ja active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008512129A (ja) * | 2004-09-10 | 2008-04-24 | セクエノム,インコーポレイティド | 核酸の広範囲配列分析法 |
US20180080018A1 (en) * | 2010-06-18 | 2018-03-22 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and Compositions for Synthetic RNA Endonucleases |
US20170253911A1 (en) * | 2013-12-05 | 2017-09-07 | New England Biolabs, Inc. | Methods for Enriching for a Population of RNA Molecules |
WO2017149139A1 (en) * | 2016-03-03 | 2017-09-08 | Curevac Ag | Rna analysis by total hydrolysis |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
J. AM. CHEM. SOC., vol. 137, JPN6023019101, 2015, pages 14430 - 14438, ISSN: 0005056679 * |
NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 29, no. 10, JPN6023019102, 2001, pages 1 - 7, ISSN: 0005056680 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2024010243A (ja) | 2024-01-23 |
EP3802821A4 (en) | 2022-06-08 |
WO2019226990A1 (en) | 2019-11-28 |
EP3802821A1 (en) | 2021-04-14 |
US20210198734A1 (en) | 2021-07-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Pourshahian | Therapeutic oligonucleotides, impurities, degradants, and their characterization by mass spectrometry | |
Grozhik et al. | Antibody cross-reactivity accounts for widespread appearance of m1A in 5’UTRs | |
Jora et al. | Detection of ribonucleoside modifications by liquid chromatography coupled with mass spectrometry | |
Baronti et al. | A guide to large-scale RNA sample preparation | |
Ross et al. | Sequence mapping of transfer RNA chemical modifications by liquid chromatography tandem mass spectrometry | |
Yoluç et al. | Instrumental analysis of RNA modifications | |
Beverly et al. | Label-free analysis of mRNA capping efficiency using RNase H probes and LC-MS | |
Wetzel et al. | Mass spectrometry of modified RNAs: recent developments | |
Schmidt et al. | Investigation of protein–RNA interactions by mass spectrometry—Techniques and applications | |
Giessing et al. | Mass spectrometry in the biology of RNA and its modifications | |
JP5382802B2 (ja) | 質量分析法を用いた生体分子の検出および定量 | |
EP3083957B1 (en) | Production of encoded chemical libraries | |
Zhang et al. | A general LC-MS-based RNA sequencing method for direct analysis of multiple-base modifications in RNA mixtures | |
WO2016145416A2 (en) | Proteomic analysis with nucleic acid identifiers | |
JP2001524808A (ja) | 放出可能な不揮発性の質量標識分子 | |
JP5766610B2 (ja) | 質量分析法による核酸分子の配列決定 | |
KR20160078989A (ko) | 시티딘-5-카르복스아미드 변형된 뉴클레오티드 조성물 및 그와 관련된 방법들 | |
EP3387150A1 (en) | Label-free analysis of rna capping efficiency using rnase h, probes and liquid chromatography/mass spectrometry | |
EA032438B1 (ru) | Способы мечения днк-кодированных библиотек | |
Beverly | Applications of mass spectrometry to the study of siRNA | |
JP2024010243A (ja) | 直接核酸配列決定方法 | |
Banoub et al. | Mass spectrometry of nucleosides and nucleic acids | |
Fourmy et al. | Protein–RNA footprinting: an evolving tool | |
Martella et al. | Simultaneous RNA and DNA Adductomics Using Single Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry Analysis | |
Lenz et al. | Detection of protein-RNA crosslinks by NanoLC-ESI-MS/MS using precursor ion scanning and multiple reaction monitoring (MRM) experiments |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220427 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230512 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20230810 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20231005 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231113 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20240110 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20240404 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20240606 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20240730 |