JP2012506709A - 質量分析法による核酸分子の配列決定 - Google Patents
質量分析法による核酸分子の配列決定 Download PDFInfo
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Abstract
【選択図】図1
Description
a)アンチセンス核酸分子、触媒的核酸分子、siRNA分子およびマイクロRNA分子の形態でのmRNAへの配列特異的ハイブリダイゼーションおよびmRNAのスイッチオフ(Couzin,2004;Crooke,2004;Harmon,2002;Juliano et al,2008;Scherer & Rossi,2003;Schlosser et al,2006;Usman & Blatt,2000;Weigand et al,2006;Zhang & Farwell,2008);
b)あるいは核酸分子の標的分子への結合および/または核酸分子による標的分子の機能の阻止、ここで、これらの核酸分子は、アプタマー、シュピーゲルマーおよびデコイ核酸を含む(Carothers & Szostak,2006;Cload et al,2006;Eulberg et al,2006;Mann & Dzau,2000;Nimjee et al,2006;Realini et al,2006);
c)あるいは例えば、CpG−DNA(Weiner,2000)およびランダムオリゴヌクレオチドの形態での、免疫系に対するその刺激効果
に基づくことができる。
1970年代、3つの核酸分子配列決定技術が開発されたが、これらは、多くの実験室で実施される一般的でかつ比較的迅速な方法である。
質量分析法(略称、MS)は、化合物の分子質量を分析するための強力なツールである。核酸分子分析に関しては、MSは核酸分子配列決定、核酸分子修飾検出および核酸分子断片の決定に適用可能である。MSによる核酸の分析は、主に、イオン化効率によっておよびいくつかの適用可能な検出方法の分解能によって制限される。
外部反応に依存しないで配列特異的イオンを生成させる質量分析法のアプローチはいずれも直接的な配列決定方法とみなされる。上記のように、ESIおよびMALDIは、核酸分子用に選択されるイオン化方法である(Limbach,1996)。この方法の詳細な概略は、LimbachおよびNordhoffら(Limbach,1996;Nordhoffet al,1996)により示されている。
本明細書で使用されることが好ましい配列決定のための「間接的質量分析法」とは、配列が決定されるべき核酸分子の調製が、試料の気相イオンが生成される前に行なわれることを意味する。
a)少なくとも1つの修飾を有する核酸分子の複数の分子を提供する工程;
b)複数の修飾核酸分子をランダムに切断し、それにより修飾核酸分子断片と非修飾核酸分子断片とを提供する工程;
c)修飾核酸分子断片を非修飾核酸分子断片から分離する工程;
d)修飾核酸分子断片をその長さ、質量および/または電荷によって分離または分別し、そのような分離または分別によって、修飾核酸断片のパターンが生成される工程;
e)任意で修飾核酸断片のパターンを可視化する工程
を含む核酸分子のヌクレオチド配列を決定する方法によって、第1の態様の第1の実施形態でもある、第1の態様において解決される。
f)修飾核酸断片のパターンから核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程
をさらに含む。
fa)最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の質量および/またはヌクレオチド配列を決定する工程;
fb)最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の質量と1ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片n+x、x=1の質量を決定する工程;
fc)修飾核酸分子断片n+x、x=1の質量と最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の質量の質量差を決定する工程;
fd)質量差を個別のヌクレオチド種に帰属させ、個別のヌクレオチド種を最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の配列に付加することにより修飾核酸分子断片n+x、x=1の配列を生成させる工程
を含む。
fa)最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の質量と1ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片n+x、x=1の質量を決定する工程;
fb)修飾核酸分子断片n+x、x=1の質量と最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の質量の質量差を決定する工程;
fc)質量差を個別のヌクレオチド種に帰属させ、個別のヌクレオチド種を最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の配列に付加することにより修飾核酸分子断片n+x、x=1の配列を生成させる工程
を含む。
fa)最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の質量と1ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片n+x、x=1の質量を決定する工程;
fb)修飾核酸分子断片n+x、x=1の質量を、そのヌクレオチド配列が既知である核酸分子の核酸分子断片n+x、x=1の計算質量に帰属させ、かつ個別のヌクレオチド種を最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の配列に付加することにより修飾核酸分子断片n+x、x=1の配列を生成させる工程
を含む。
a)少なくとも1つの修飾を有する核酸分子の複数の分子を提供する工程;
b)複数の修飾核酸分子をランダムに切断し、それにより修飾核酸分子断片を提供する工程;
c)修飾核酸分子断片をその長さ、質量および/または電荷によって分離または分別し、そのような分離または分別が修飾核酸断片のパターンを生成させる工程;ならびに
d)任意で修飾核酸断片のパターンを可視化する工程
を含む、核酸分子のヌクレオチド配列を決定する方法によって、第2の態様の第1の実施形態でもある、第2の態様において解決される。
e)修飾核酸断片のパターンから核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程
をさらに含む
fa)最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の質量および/またはヌクレオチド配列を決定する工程;
fb)最小の修飾核酸分子断片n+1、x=0の質量と1ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片n+x、x=1の質量を決定する工程;
fc)修飾核酸分子断片n+x、x=1の質量と最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の質量の質量差を決定する工程;
fd)質量差を個別のヌクレオチド種に帰属させ、個別のヌクレオチド種を最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の配列に付加することにより修飾核酸分子断片n+x、x=1の配列を生成させる工程
を含む。
fa)最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の質量と1ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片n+x、x=1の質量を決定する工程;
fb)修飾核酸分子断片n+x、x=1の質量と最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の質量の質量差を決定する工程;
fc)質量差を個別のヌクレオチド種に帰属させ、個別のヌクレオチド種を最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の配列に付加することにより修飾核酸分子断片n+x、x=1の配列を生成させる工程
を含む。
fa)最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の質量と1ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片n+x、x=1の質量を決定する工程;
fb)修飾核酸分子断片n+x、x=1の質量を、そのヌクレオチド配列が既知である核酸分子の核酸分子断片n+x、x=1の計算質量に帰属させ、かつ個別のヌクレオチド種を最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の配列に付加することにより修飾核酸分子断片n+x、x=1の配列を生成させる工程
を含む。
a)核酸分子の複数の分子を提供する工程;
b)核酸分子の複数の分子をヌクレオ塩基選択的処置に供し、核酸分子を形成する1個または数個のヌクレオ塩基種を選択的に修飾し、そのようなヌクレオ塩基選択的処置の後で、核酸分子の選択的に処置可能なヌクレオ塩基のいくつかを修飾し、核酸分子の選択的に処置可能なヌクレオチドまたはヌクレオ塩基のいくつかを非修飾のままにする工程;
c)修飾ヌクレオ塩基の3’で選択的に核酸リン酸骨格を化学的に切断し、修飾ヌクレオ塩基の全てではない核酸リン酸骨格を切断する工程;
d)核酸分子断片をLC−MSおよび/またはLC−MS−MSにより分析する工程;ならびに
e)インタクトの末端を有する核酸分子断片をサイズが増加する順に同定し、それから核酸分子の配列を生成させ、ここで、好ましくは核酸分子断片が、同じインタクトの末端、より好ましくは同じインタクトの3’末端を有する、工程
を含む、核酸分子のヌクレオチド配列を決定する方法によって、第3の態様の第1の実施形態でもある、第3の態様において解決される。
アミンおよび活性化カルボン酸、
アミン+活性化カルバメート、
アミンおよびイソシアネート/イソチオシアネート、
アミン+ハライド、
アミン+マレイミド部分、
アミン+アルデヒド/ケトン、
ヒドロキシルアミンまたはヒドラジン+ケトン/アルデヒド、
ヒドラジン誘導体および活性化カルボン酸、
ヒドラジンおよびイソシアネート/イソチオシアネート、
ヒドラジン+ハライド、
ヒドラジン+マレイミド部分、
ヒドラジン+アルデヒド/ケトン:
ヒドラジン+アルデヒド/ケトン、それに次ぐ還元アミノ化、
チオール+ハライド、
チオール+マレイミド、
チオール+活性化チオール、
チオール+ビニルスルホンおよび他のマイケル付加反応
アジド+アルキン+Cu塩および他の「クリック化学反応」相互作用パートナー(Kolb et.Al.2001)、
アルキルまたはアリールP(III)部分を用いたシュタウディンガー反応によるアジド+活性化カルボン酸、
アジド+求電子トラップに付着した三価ホスフィン(シュタウディンガーライゲーション)、
アジド+ホスフィノチオールエステル−無痕跡のシュタウディンガーライゲーション、
イミンを形成するアジド+アルデヒド/ケトン+PPh3(シュタウディンガー)、このイミンはその後、任意で対応するアミンに還元することができる、
アミン+カルボキシル基
カルボン酸官能基+アミン、ヒドラジンなどのアミノ官能基、
酸化されてジアルデヒドになるシス−ジオール(例えば、RNA分子の3’末端に見られるもの)、このジアルデヒドは、その後、例えば、ホウ化水素を介する還元の後で、例えば、アミンまたはヒドラジン誘導体のいずれかとともに環状アミンを形成する、
チオエステル+システイン−ネイティブライゲーションおよび誘導体、
ホスホチオエート+α−ハロカルボニル含有結合体(conjugant)、
例えば、ホスフェート活性化を介してホスホロアミデートとなるホスフェート+アミン
例えば、活性化を介してホスホジエステルとなるホスフェート+アルコール、
(ホウ化水素で還元した後)2級アミンを形成するアルデヒド、ヒドラゾンを形成するヒドラジド基、セミカルバゾンを形成するセミカルバジド、
システイン誘導体+チオエステルペプチド
エポキシド+アミン
ディールズ・アルダー反応、および他のペリ環状反応のためのアルケン/アルキン+ジエン/ジイン
アルデヒドとヒドロキシアミンとを反応させることによるオキシム形成
ヒドロキシまたはアミノ+エポキシド。
表1(A)本出願で参照されるオリゴヌクレオチド配列
上記は、本発明に関連して使用された分子に相当するものであることが理解されるであろう。添付の配列表は、その単なるヌクレオチド配列を反映するものであって、上記の表に示すような該分子のさらなる特徴を何ら反映するものではない。
1.1 小規模合成
シュピーゲルマーは、2’TBDMS RNAホスホロアミダイト化学(Damha and Ogilvie,1993)を用いて、ABI394合成器(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)で、固相合成により作製した。L形のrA(N−Bz)−、rC(Ac)−、rG(N−ibu)−、およびrU−ホスホロアミダイトは、ChemGenes,Wilmington,MAから購入した。シュピーゲルマーは、ゲル電気泳動により精製した。
シュピーゲルマーは、2’TBDMS RNAホスホロアミダイト化学(Damha & Ogilvie,1993)を用いて、AktaPilot100合成器(Amersham Biosciences;General Electric Healthcare,Freiburg)で、固相合成により作製した。L−rA(N−Bz)−、L−rC(Ac)−、L−rG(N−ibu)−、およびL−rU−ホスホロアミダイトは、ChemGenes(Wilmington,MA,USA)から購入した。5’−アミノ−修飾物質は、American International Chemicals Inc.(Framingham,MA,USA)から購入した。シュピーゲルマーの合成は、それぞれ、L−リボG;L−リボC、L−リボA、L−リボUで修飾されたCPG、細孔径1000Å(Link Technology,Glasgow,UK)の上で開始された。カップリングするために(1サイクルにつき15分間)、アセトニトリル中の0.3Mベンジルチオテトラゾール(American International Chemicals Inc.,Framingham,MA,USA)、および3.5当量のそれぞれのアセトニトリル中の0.2Mホスホロアミダイト溶液を用いた。酸化−キャッピングサイクルを用いた。オリゴヌクレオチド合成用のさらなる標準的な溶媒および試薬は、Biosolve(Valkenswaard,NL)から購入した。シュピーゲルマーを、DMT−ONを用いて合成し;脱保護した後、Source 15RPCミディアム(Amersham,Freiburg,Germany)を用いて、分取RP−HPLC(逆相高速液体クロマトグラフィー)(Wincott et al,1995)で精製した。5’DMT基を80%酢酸(RTで90分)で除去した。その後、2M NaOAc水溶液を添加し、5K再生セルロースカラム(Millipore,Bedford,MA)を用いて、接線流濾過でシュピーゲルマーを脱塩した。
2.1 本方法の原理
核酸分子を固定せずに核酸分子の配列を決定するために、以下の工程を行なった。
1)具体的に選択されたヌクレオ塩基(すなわち、A、C、G、TまたはU)を修飾するための、核酸分子の塩基選択的処理、次いで、核酸リン酸骨格を修飾ヌクレオ塩基の3’で選択的に化学的に切断する第2の工程。この場合、非修飾ヌクレオ塩基を含有する核酸分子の断片がなおも存在する(このことは、修飾および/または化学的切断の核心ではなかった)ように、断片化反応を最後までは促進しない条件を開発する必要がある。
2)LCMSおよびLC/MS/MSで生成される、核酸分子の断片の分析。
記載した方法を試験するために、RNA分子のNOX−E36中間体(配列番号2)を用いた。NOX−E36中間体はシュピーゲルマーであり、NOX−E36中間体は、シュピーゲルマーNOX−E36(配列番号1)の5’−アミノ修飾誘導体である。選択的に修飾するためにウリジンヌクレオ塩基が選ばれた。修飾は、ウリジン部分の後ろでRNA分子を化学的に切断し、RNA分子の断片を生じさせる2工程のヒドラジン−酢酸/アニリン処理を用いて達成される。通常、ヒドラジン−酢酸/アニリン処理後の反応産物は、RNA分子の5’リン酸付加3’断片と、図1および2Bに示すような修飾リボース部分[略称、Umod(ヌクレオ塩基切断部位を強調する)]を担持するRNA分子のアニリン修飾リボース5’断片の反応産物である。このような構造は、Ehresmannら(Ehresmann et al,1987)によって提唱されている(図1参照)。シュピーゲルマーNOX−E36中間体(配列番号2)をヒドラジン−酢酸/アニリン処理に供し、断片化産物を分析することにより、驚くべきことに、3’断片とインタクトの核酸分子(図2A)が、5’断片と内部断片よりも効率的にイオン化され、したがって、生成されるデータの解釈が大いに単純化され、目的の断片が同定されることが明らかになった(図4〜6)。結果として、毎回ウリジンヌクレオチドが出現する後ろの切断に相当する5’リン酸を含有する重なり合う3’断片とインタクトの出発分子NOX−E36中間体(配列番号2)を、各ピークに関する得られた質量データ(例えば、図5参照)のデコンボリューションによって容易に同定することができる(図6)。デコンボリューションは当業者に周知の一般的な技術である。デコンボリューションでは、アルゴリズムを質量スペクトルに適用して、単一種の多価イオンを同定し、それらをこの種の質量とするよう再構成する。この技術は、大きい分子を多価イオンの分布として観測するESIや他のイオン化技術と組み合わせると極めて有用である。適用されるアルゴリズムによって、(精密質量を得るための)同位体分解質量または分子量のいずれかが得られる。通常、オリゴヌクレオチドについて、5ppmで校正される質量分析計は、イオン化効率次第で、約6〜10kDaまでの分解同位体スペクトルを生成させることができる。この質量を超えると、通常、種の分子量(平均分子質量)に対してデコンボリューションするための、Maxentアルゴリズムなどの、アルゴリズムを用いる。
8μl(0.85OD/μl水)シュピーゲルマーNOX−E36中間体(配列番号2)、すなわち、5’アミノリンカーを有するシュピーゲルマーNOX−E36(配列番号1)の誘導体を、500μl微量遠心チューブに入れ、氷上で冷やし、その後すぐに、24μlのヒドラジン水和物50〜60%(22,581−9,Sigma Aldrich,Taufkirchen,Germany)を添加した。45分後、4μlの10M酢酸アンモニウムp.a.(Sigma Aldrich,Taufkirchen,Germany)を添加し、溶液を短くボルテックスし、冷エタノール(300μl)を添加した。この溶液を再度ボルテックスし、冷凍庫の中で−18℃で2時間冷やし、その後すぐに、4℃で15分間遠心分離し(12,000g)、上清をデカントで捨てた。ペレットを300μlの冷エタノールでボルテックスにより洗浄し、5分間遠心分離した(12,000g)。上清を除去し、ペレットをConcentrator 5301(Eppendorf AG,Hamburg,Germany)の中で乾燥させ、その後、反応液から光を排除しながら、65℃で40分間、170μlの水、18μlのアニリン(>99.5%,242284 Sigma Aldrich,Taufkirchen,Germany)、11μlの酢酸(>99% A6283,Sigma Aldrich,Taufkirchen,Germany)の溶液で処理した。その後、溶液をConcentrator 5301(Eppendorf AG,Hamburg,Germany)の中で乾燥させ、滅菌水(70μl)に再懸濁し、LCMS分析に供した。
図3Aは、1つの主要ピークを表示するインタクトの核酸分子シュピーゲルマーNOX−E36中間体(配列番号2)のトータルイオンクロマトグラム(略称、TIC)を示す。このピークのデコンボリューションされた観測質量は12995.84Daである(図3B)。上のプロトコル(第2.3節参照)に記載されたようなシュピーゲルマーNOX−E36中間体(配列番号2)の処理とLCMSを用いた分析とにより、TICで明らかにされ(図4)、その後、断片5、6およびインタクトの核酸分子NOX−E36中間体(配列番号2)に対して示された個々のピークのデコンボリューションされた質量スペクトルから同定される(図5)ように質量分析法と組み合わせた逆相HPLCカラムクロマトグラフィーでまず第1に識別可能な明確に規定された断片が得られた。驚くべきことに、様々な産物(5’断片、3’断片および内部断片)が可能であるにもかかわらず、3’末端に由来する断片が主要な産物であり、5’断片や内部断片などの他の断片が存在するにもかかわらず、明確に区別可能であることが観察されることが分かった。結果的に、予想された3’断片、すなわち、ウリジン部分での3’の鎖切断から得られた断片は全て、質量値を予測された断片から計算される質量値と比較することにより、容易に同定された(図6)。したがって、先に記載したような3’断片に対してタンデムMS/MS実験を行ない、以下のように配列の確認を得ることが可能であろう。
3.1 原理
核酸分子および選択されたその断片を固定せずに核酸分子の配列を決定するために、以下の工程を行なった:(まだ付加されていない場合)親和性標識またはタグによる核酸分子の標識、図7に示すスキームによるランダムな鎖切断物に相当する断片+未切断の全長材料の混合物を生成させるための化学的切断による核酸分子の限定的なランダム切断。このランダムな混合物から、固体支持体に結合しているか、カラム中にあるか、チップ上にあるか、またはビーズフォーマットの、親和性標識を手段として用いて、標識を含有する核酸分子の断片を混合物から抜き出し、他の断片を洗い流す。所望の核酸分子断片の切断または溶出による固相からの放出により、質量分析法で分析される分子が提供される。この例は、核酸分子の配列決定に好適な質量分析技術としてのLCMSの使用を示している。得られる結果は、全てのあり得る核酸分子の断片に相当する、より正確には、核酸分子の全てのヌクレオチドの3’での切断に相当するラダーである。この例で使用される分析方法により、まず液体クロマトグラフィー、すなわち、LCMSのLC部分による、およびその後の質量分析によるこれらの断片の分離が可能になる。この2次元アプローチにより、個々の断片が同定しやすくなり、それにより、容易に分離される断片の2次元同定が可能にある。
この方法を試験するために、核酸分子シュピーゲルマーNOX−E36中間体(配列番号2)を用いた。NOX−E36中間体(配列番号2)は、シュピーゲルマーNOX−E36(配列番号1)の5’−アミノ修飾誘導体である。図8に示すように、NOX−E36中間体(配列番号2)の5’−アミノ部分をビオチン親和性タグで修飾した後、塩基性溶液を用いて、ビオチン化NOX−E36中間体(配列番号63)を化学的にランダムに切断した。切断が最後まで進まないように、切断を注意深く制御した。NOX−E36中間体(配列番号2)の5’断片、3’断片およびランダムな内部断片を生じさせるランダムな断片化が起こることより、NOX−E36中間体の全てのビオチン化5’断片(図8,シリーズ1)と残りのビオチン化NOX−E36中間体(すなわち、全長産物[略称、FLP])が固定用のタグ特異的な固体支持体(この場合、ニュートロアビジンビーズ)を用いて、親和性タグ(この場合、ビオチン)によって混合物から選択的に抜き出された。結合していない断片、すなわち、親和性タグを有さない3’断片およびランダムな内部断片を洗い流すことができる。その後、ビオチン部分とNOX−E36中間体(配列番号2)を接続するリンカー内のジスルフィド結合を還元的に切断することにより、結合したシュピーゲルマーNOX−E36の5’断片とFLP(配列番号63)をビーズから遊離させる。これらの放出された断片は、全てのリボヌクレオシド位置間での鎖切断に対応する(図8および13参照)。鎖切断は、2’,3’−環状リン酸を含有する断片をまず形成させ、この環状リン酸は、2’(3’)リン酸にゆっくりと加水分解される。その後、遊離した断片をLC−(ESI)MSにより分析し、トータルイオンクロマトグラム(略称、TIC)を分析した。試料クロマトグラムは、図11に示すように、生成された全ての5’断片とインタクトの放出されたアシル化NOX−E36中間体(配列番号50)に対応する個別のピークを提示する。その後、各々の個別のピークに関する得られた質量スペクトルのデコンボリューションによって、個別のピークに含まれる質量を得た。
3.3.1 シュピーゲルマーNOX−E36中間体のビオチン化
10mg(250OD)の粗シュピーゲルマーNOX−E36中間体(配列番号2)、すなわち、5’アミノリンカーを有するシュピーゲルマーNOX−E36(配列番号1)の誘導体を反応チューブに入れ、260μlのTheorell and Stenhagenの汎用緩衝液pH8.5(33mMクエン酸ナトリウム、33nMリン酸ナトリウム、57mMホウ酸ナトリウム、pH8.5)に溶解させた。これに、200μlのN,N−ジメチルホルムアミド(略称、DMF)を添加した。この溶液をボルテックスし、スピンダウンし、その後すぐに、50μlのDMFに予め溶解させた2.2mgのビオチンジスルフィドΝ−ヒドロキシ−スクシニミドエステル(Sigma B4531,Taufkirchen,Germany)を添加した。この溶液を室温で60分間インキュベートし、その後すぐに、アリコートを取って、陰イオン交換HPLC(Dionex DNA−Pac 200カラム、緩衝液A:H2O中の100mM Tris;10%ACN 緩衝液B:H2O中の1M NaCl、100mM Tris;25mM NaClO4;10%ACN。勾配は6分で10〜30%B、次いで、35分で30〜70%B、カラム温度80℃)で分析し、これにより、反応が完了したことが明らかにされた。粗反応混合物をNAP25カラム(Amersham Biosciences,Freibug,Germany)を用いて脱塩し、凍結乾燥させた。
20μlのビオチン化シュピーゲルマーNOX−E36中間体(配列番号2)(0.54OD/μl)に、30μlの滅菌水および2.5μlの0.5M K2CO3を室温で添加した。この溶液をボルテックスし、その後、Eppendorf Thermomixer Comfortマシーン(Eppendorf,Hamburg,Germany)にて、70℃、1350rpmで、12.5分間インキュベートし、その後すぐに、液体窒素中で凍結させ、そして解凍させておいた。その後、4μlの1M AcOHを添加して(約pH7)、反応をクエンチし、溶液をボルテックスし、スピンダウンした。
ニュートロアビジンアガロースビーズを以下のように処理した:150μlのニュートロアビジンビーズスラリー(Pierce,Milwaukee,MI,USA)を500μl反応チューブに入れた。ビーズをスピンダウンし、上清を注意深く除去した。その後すぐに、300μlの1M Tris HCl pH8.0(Ambion;Huntindon,UK)を添加した。スラリーをボルテックスし、スピンダウンし、上清を注意深く除去した。その後、ビーズを2×300μlの滅菌H2Oで同じように洗浄した。その後、上記のように調製したクエンチした加水分解混合物をビーズに添加し、得られたスラリーを10℃で2時間激しく(1350rpm)混合した。その後、ビーズを回転微量遠心チューブ(Ultrafree−MC GV,0,22μm,Millipore,Schwalbach,Germany)を用いた濾過により単離し、2×300μlの滅菌H2Oで洗浄した。
NOX−E36中間体(配列番号2)のビオチン標識断片のジスルフィドリンカーを、5μlの1M DTT溶液を含む100μlの0.05Mリン酸Na緩衝液(pH8.5)を用いて切断した。これをEppendorf Thermomixer Comfortマシーンにて、25℃で2時間激しく混合した。スラリーを回転微量遠心チューブ(Ultrafree−MC GV,0,22μm,Millipore,Schwalbach,Germany)を用いて濾過し、ビーズを50μl滅菌水でさらに洗浄した。UV測定を行なって、260nmでの光学密度単位を決定し、そのうち、0.25ODをLCMSで分析した。
上記のプロトコルから生成されたNOX−E36中間体(配列番号2)の5’断片のLCMS分析を、高速分別ポンプを備えた6520 Accurate Mass Q−TOF LCMSシステム(Agilent Technologies,Waldbronn,Germany)とAcuity BEH C18カラム(1.7μm,130 Å孔径,2.1×30mm,Waters,Eschborn,Germany)とを用いて分析した。勾配は22分で0〜20%B、40分で20〜30%Bである。緩衝液A:水中の10mMトリエチルアミン、100mMヘキサフルオロイソプロパノール、10μM EDTA(NH4 +形態)、1%メタノール、緩衝液B:水中の10mMトリエチルアミン、100mMヘキサフルオロイソプロパノール、10μM EDTA(NH4 +形態)、50%メタノール。カラム温度65℃、流速0.2ml/分:各ピークについてTICからの質量スペクトルを得、その後、当業者に公知の標準的な技術に従ってデコンボリューションした。
陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、後から溶出するピーク(30.65分、参考までに、出発材料の溶出時間は28.82分、図9)の出現から明らかにされるように、粗NOX−E36中間体(配列番号2)(図9)は、実験の節で記載された切断可能なビオチン部分(図10)で効率的に標識された。NOX−E36中間体[配列番号2]の固相合成からの破損配列、および他の不純物の存在によって、工程3.3.1〜3.3.5を実施する能力や核酸分子の配列を決定する能力は影響を受けない。粗標識混合物は、サイズ排除精製カラム(NAP25、実験参照)を用いた初歩的な脱塩工程を除いて、精製されなかった。その後、この粗材料を断片化し、標識断片を固定し、洗浄し、その後、記載したような固体支持体から放出させた(第3.3.2節〜第3.3.4節)。その後、得られた反応混合物をLCMSを用いて分析した(第3.3.5節)。トータルイオンクロマトグラム(略称、TIC、図11)は、各々のあり得る5’断片(配列番号11〜50、図13A〜E)に相当するピークパターンを示す。TICで観測される個別のピークの各々について、生の質量データ、およびその後の対応するデコンボリューションされた質量を得た。図12は、断片(質量ピーク値=10237.1897Da)、この場合、断片31(図13D、[配列番号41])のデコンボリューションされた分子量の例を示す。その2’,3’−環状リン酸が加水分解されている(質量ピーク値=9603.77)断片29(図13C、配列番号39)の少量のデコンボリューションされた分子量も検出することができる。
4.1 原理
核酸分子を固定せずに核酸分子の配列を決定するために、以下の工程を行なった:ヌクレオ塩基が吸収しない選択的な波長吸光度を有する標識による核酸の標識、(図7に示すものと同様の)ランダムな鎖切断物に相当する断片とインタクトの全長材料の混合物を生成させるための化学的切断による核酸分子の限定的なランダム切断。粗反応混合物をLCMSで分析する。標識の選択的な波長吸光度では、核酸分子またはその断片に起因するUV吸光度はない。それゆえ、この波長で、核酸分子の全てのヌクレオチドの3’での切断物に相当する全てのあり得る断片を示す質量ラダーが、付着した標識の選択的な波長吸光度によって選択的に観測される。これらの5’断片の保持時間を同定し、かつこれらの5’断片の保持時間における質量スペクトルを得、デコンボリューションすることにより、核酸分子の配列を確認することまたは配列に関する予備知識を持たずにそれを決定することができる。標識断片は単離されないので、非標識断片の存在のために、質量スペクトルは複雑である。すなわち、より小さい断片はカラムで十分に分別され、非標識断片から標識断片を完全に分離する(図19、A〜C)ことができるのに対し、より大きな標識断片は、非標識断片(これもまた、質量シグナルを発生させる)と共溶出し、所望の5’断片の同定を妨害する可能性がある(図25〜27)。しかしながら、標識が親油性であるために、特定の質量値の標識断片は、通常、同様の質量値の非標識断片よりも後に溶出する。(図21、22、26、27)。したがって、この理由により、共溶出する特定の質量を排除し、意図した標識断片を同定することができる。
この方法の実行可能性を示すために、フルオレセイン−5−イソチオシアネート(FITC異性体I)標識をNOX−E36中間体(配列番号2)に付加した。その後、標識されたNOX−E36中間体を、塩基を介する限定的なランダム切断に供し、試料をLCMSで分析した。標識は、495nmでの選択的な波長吸光度を有する(供給業者によって提供されたデータ)。それゆえ、495nmでは、インタクトの5’末端を含有する核酸分子(核酸分子の5’断片および全長産物[略称、FLP])だけが観測される。図19Aから分かるように、このクロマトグラムは、実施例3(図11)の観測されたクロマトグラムによく似ている。しかしながら、495nmで抽出されるUVクロマトグラム(図19A)と、260nmで抽出される対応するUVクロマトグラム(図19、B)とを比較すると、核酸分子の5’断片ではない多くの断片が存在することがはっきりと分かる。260nmで抽出されるUVクロマトグラムとトータルイオンクロマトグラム(略称、TIC)(図19、C)とを比較することにより、2つのクロマトグラムBとCがよく似ていることが示される。これは、標識があるまたは標識がない全ての断片が質量データを生成させることを示す。495nmで抽出されるクロマトグラムから決定されるように、第1の5’断片(この例では、FITC−NH−(CH2)6−OP(O)(OH)−Gcp、図23A、断片1、配列番号51に相当する)は、6.31分で溶出する断片であると容易に同定することができる(図19Aおよび引き伸ばした図20B)。図19Aと19Bとを比較することにより(また、拡大図の図20Aと20Bを用いてより容易に)、このピークよりも早く溶出する非標識断片がたくさんあることもはっきりと分かるが、これらは、その観測質量によって推定したとき長さ8〜14ヌクレオチドの断片に相当する。それゆえ、標識断片に与えられた親油性のために、特定の断片サイズに対して予想された質量との相当な質量差(約2000〜6000Da大きい)によって、標識断片と共溶出する任意の非標識断片を排除することができる。この説明を図25に示す。ここで、図25Aは、抽出される波長が495nmなので、FITC標識核酸断片を表し、図25Bは、抽出される波長が260nmなので、TIC(図25C)と同様に、全ての核酸断片を表す。標識断片の質量スペクトルを取得し、このスペクトルをデコンボリューションするための典型的なイオンウインドウを表す2つの点線(図26)でマークされた範囲内のイオンについての質量スペクトルを得ることによって、2以上のピークを観測することが可能となる。しかしながら、ピークの質量値は非常に様々であり、したがって、1つの、この場合、平均分子質量のデコンボリューションされた値4666.205Daだけを標識断片の候補とする。偽の質量を無視するこの能力、または言い換えれば、非標識断片と共溶出する場合に標識断片の質量を決定する能力によって、この方法による核酸分子の配列確認(図24)と配列決定(図28A〜C)の両方が可能になる。それゆえ、断片間の個別の質量差から配列を決定する原理が実施例3で適用される原理と類似しているので、実施例3と同じような方法で、配列に関する予備知識を持たない配列の確認または決定(図28A〜C参照)のための類似の配列確認表または類似のフローチャートを作成することができる(図23および図24参照)。
4.3.1 シュピーゲルマーNOX−E36中間体のフルオレセイン−5−イソチオシアネート標識
848ODの粗シュピーゲルマーNOX−E36中間体(配列番号2)、すなわち、5’アミノリンカーを有するシュピーゲルマーNOX−E36(配列番号1)の誘導体を反応チューブに入れ、250μlのH2Oに溶解させた。これに、250μlのN,N−ジメチルホルムアミド(略称、DMF)に予め溶解させた3mgのフルオレセイン−5−イソチオシアネート(FITC異性体I)(Sigma,Taufkirchen,Germany)を添加した。この溶液をボルテックスし、スピンダウンし、その後すぐに、6mgの重炭酸ナトリウム(Merck,Darmstadt,Germany)を添加した。この溶液を室温で6時間インキュベートし、その後すぐに、粗混合物を、NAP2カラム(Amersham Biosciences,Freiburg,Germany)を用いたサイズ排除クロマトグラフィーで脱塩し、凍結乾燥させた。凍結乾燥物を水に再溶解させ、Source 15RPCミディアム(Amersham,Freiburg,Germany)を用いた分取RP−HPLC(逆相高速液体クロマトグラフィー)(Wincott et al,1995)で精製し、NAP25カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーを用いて脱塩した。
13.5μl(1OD)のFITC標識シュピーゲルマーNOX−E36中間体(配列番号2)に、室温で1.5μlの0.5 M K2CO3を添加した。この溶液をボルテックスし、その後、Eppendorf Thermomixer Comfortマシーン(Eppendorf,Hamburg,Germany)にて、70℃、1350rpmで、5分間インキュベートし、その後すぐに、液体窒素中で凍結させ、そして解凍させておいた。その後、2.5μlの1M AcOHを添加して(最終pH約7)、反応をクエンチし、溶液をボルテックスし、スピンダウンし、LCMSで分析した。
上記のプロトコルから生成されたNOX−E36中間体(配列番号2)の5’断片のLCMS分析を、高速分別ポンプを備えた6520 Accurate Mass Q−TOF LCMSシステム(Agilent Technologies,Waldbronn,Germany)とAcuity BEH C18カラム(1.7μm,130 Å孔径,2.1×30mm,Waters,Eschborn,Germany)とを用いて分析した。勾配は22分で0−20%のB、40分で20−30%のBである。緩衝液A:水中の10mMトリエチルアミン、100mMヘキサフルオロイソプロパノール、10μM EDTA(NH4 +形態)、1%メタノール、緩衝液B:水中の10mMトリエチルアミン、100mMヘキサフルオロイソプロパノール、10μM EDTA(NH4 +形態)、50%メタノール。カラム温度65℃、流速1.2ml/分。495nmで抽出されたUVクロマトグラムからの各ピークについてTICからの質量スペクトルを得、その後、デコンボリューションした。
NOX−E36中間体(配列番号2)を工程4.3.1〜4.3.3に示す配列決定プロトコルに供して、図19A〜Cに示すように以下のデータを得た:
A)495nmで抽出されたUVクロマトグラム。
B)260nmで抽出されたUVクロマトグラム。
C)トータルイオンクロマトグラム(TIC)。
5.1 原理
核酸分子および選択されたその断片の固定を伴う核酸分子の配列決定については、その原理が、これまでに実施例3で記載されている。この追加の実施例では、異なる核酸配列である、NOX−A12(配列番号64)の核酸配列を用いる。この追加の実施例は、オリゴヌクレオチドの凝集特性のために標識断片と共固定され得る(第5.3.3節参照)非標識断片の完全な除去を確実にするために修正された洗浄工程も有する。これを達成するために、カオトロピック溶液、本実施例では、8M尿素を用いる。
この方法を試験するために、核酸分子シュピーゲルマーNOX−A12中間体(配列番号65)を用いた。NOX−A12中間体(配列番号65)は、シュピーゲルマーNOX−A12(配列番号64)の5’−アミノ修飾誘導体である。NOX−E36について図8で示したように、ビオチン親和性タグで5’−アミノ部分を修飾した後、塩基性溶液を用いて、ビオチン化シュピーゲルマーを化学的にランダムに切断する。切断が最後まで進まないように、切断を注意深く制御した。5’断片、3’断片およびランダムな内部断片を生じさせるランダムな断片化が起こることより、NOX−A12中間体の全てのビオチン化5’断片と残りのビオチン化NOX−A12中間体(すなわち、全長産物[略称、FLP])が固定用のタグ特異的な固体支持体(この場合、ニュートロアビジンビーズ)を用いて、親和性タグ(この場合、ビオチン)によって混合物から選択的に抜き出される。結合していない断片、すなわち、親和性タグを有さない3’断片およびランダムな内部断片を洗い流すことができる。いくつかの配列、特に、自己凝集する傾向のある配列の場合、固定された標識断片に結合するので、非標識断片が共固定されることがあり得る。その除去を確実にするために、結合断片をカオトロピック剤で洗浄する。その後、ビオチン部分とNOX−A12中間体(配列番号65)を接続するリンカー内のジスルフィド結合を還元的に切断することにより、結合したシュピーゲルマーNOX−A12の5’断片とFLP(配列番号63)をビーズから遊離させて、断片(101〜145)を提供する。これらの断片は、全てのリボヌクレオシド位置間の鎖切断に対応する(NOX−E36の例については、図8参照)。鎖切断は、2’,3’−環状リン酸を含有する断片をまず形成させ、この環状リン酸は、2’(3’)リン酸にゆっくりと加水分解される。その後、遊離した断片をLC−(ESI)MSにより分析し、トータルイオンクロマトグラム(略称、TIC)を分析する。見出されるのは、生成された全ての5’断片とインタクトの放出されたアシル化NOX−A12中間体(配列番号101〜145)に対応する個別のピークである(試料クロマトグラムについては図31参照)。その後、各々の個別のピークに関する得られた質量スペクトルのデコンボリューションによって、個別のピークに含まれる質量を得る(例えば、図32参照)。デコンボリューションは当業者に周知の一般的な技術である。デコンボリューションでは、アルゴリズムを質量スペクトルに適用して、単一種の多価イオンを同定し、それらをこの種の質量とするよう再構成する。この技術は、大きい分子を多価イオンの分布として観測するESIや他のイオン化技術と組み合わせると極めて有用である。適用されるアルゴリズムによって、(精密質量を得るための)同位体分解質量または分子量のいずれかが得られる。通常、オリゴヌクレオチドについて、5ppmで校正される質量分析計は、約6〜10kDaまでの分解同位体スペクトルを生成させることができる。この質量を超えると、通常、種の分子量に対してデコンボリューションするMaxentアルゴリズムなどのアルゴリズムを用いる。
5.3.1 シュピーゲルマーNOX−A12中間体のビオチン化
10mg(250OD)の粗シュピーゲルマーNOX−A12中間体(配列番号65)、すなわち、5’アミノリンカーを有するシュピーゲルマーNOX−A12(配列番号64)の誘導体を反応チューブに入れ、260μlのTheorell and Stenhagenの汎用緩衝液pH8.5(33mMクエン酸ナトリウム、33nMリン酸ナトリウム、57mMホウ酸ナトリウム、pH8.5)に溶解させた。これに、200μlのN,N−ジメチルホルムアミド(略称、DMF)を添加した。この溶液をボルテックスし、スピンダウンし、その後すぐに、50μlのDMFに予め溶解させた2.2mgのビオチンジスルフィドΝ−ヒドロキシ−スクシニミドエステル(Sigma B4531,Taufkirchen,Germany)を添加した。この溶液を室温で60分間インキュベートし、その後すぐに、アリコートを取って、陰イオン交換HPLC(Dionex DNA−Pac 200カラム、緩衝液A:H2O中の100mM Tris;10%ACN。緩衝液B:H2O中の1M NaCl、100mM Tris;25mM NaClO4;10%ACN。勾配は6分で10〜30%B、次いで、35分で30〜70%B、カラム温度80℃)で分析し、これにより、反応が完了したことが明らかにされた。粗反応混合物をNAP25カラム(Amersham Biosciences,Freibug,Germany)を用いて脱塩し、凍結乾燥させた。
20μlのビオチン化シュピーゲルマーNOX−A12中間体(配列番号65)(0.5OD/μl)に、30μlの滅菌水および2.5μlの0.5M K2CO3を室温で添加した。この溶液をボルテックスし、その後、Eppendorf Thermomixer Comfortマシーン(Eppendorf,Hamburg,Germany)にて、70℃、1350rpmで、20分間インキュベートした。その後すぐに、これを液体窒素中で凍結させ、そして解凍させておいた。その後、4μlの1M AcOHを添加して(約pH7)、反応をクエンチし、溶液をボルテックスし、スピンダウンした。
ニュートロアビジンアガロースビーズを以下のように処理した:150μlのニュートロアビジンビーズスラリー(Pierce,Milwaukee,MI,USA)を500μl反応チューブに入れた。ビーズをスピンダウンし、上清を注意深く除去した。その後すぐに、300μlの1M Tris HCl pH8.0(Ambion;Huntindon,UK)を添加した。スラリーをボルテックスし、スピンダウンし、上清を注意深く除去した。その後、ビーズを2×300μlの滅菌H2Oで同じように洗浄した。その後、上記のように調製したクエンチした加水分解混合物をビーズに添加し、得られたスラリーを10℃で2時間激しく(1350rpm)混合した。その後、ビーズをスピンダウンし、上清を除去した。1×300μlの8M尿素を添加し、混合物をボルテックスし、スピンダウンした。上清を注意深く除去し、ビーズを滅菌水でさらに4回洗浄した。
NOX−A12中間体(配列番号65)のビオチン標識断片のジスルフィドリンカーを、5μlの1M DTT溶液を含む100μlの0.05Mリン酸Na緩衝液(pH8.5)を用いて切断した。これをEppendorf Thermomixer Comfortマシーンにて、25℃で2時間激しく混合した。スラリーを回転微量遠心チューブ(Ultrafree−MC GV,0,22μm,Millipore,Schwalbach,Germany)を用いて濾過し、ビーズを50μl滅菌水でさらに洗浄した。UV測定を行なって、260nmでの光学密度単位を決定し、そのうち、0.25ODをLCMSで分析した。
上記のプロトコルから生成されたNOX−A12中間体(配列番号65)の5’断片のLCMS分析を、高速分別ポンプを備えた6520 Accurate Mass Q−TOF LCMSシステム(Agilent Technologies,Waldbronn,Germany)とAcuity BEH C18カラム(1.7μm,130Å孔径,2.1×30mm,Waters,Eschborn,Germany)とを用いて分析した。勾配は22分で0〜20%B、40分で20〜30%Bである。緩衝液A:水中の10mMトリエチルアミン、100mMヘキサフルオロイソプロパノール、10μM EDTA(NH4 +形態)、1%メタノール、緩衝液B:水中の10mMトリエチルアミン、100mMヘキサフルオロイソプロパノール、10μM EDTA(NH4 +形態)、50%メタノール。カラム温度65℃、流速0.2ml/分:各ピークについてTICからの質量スペクトルを得、その後、デコンボリューションした。
陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、出発材料(図29、28.21分)と比較して粗反応混合物中の後から溶出するピーク(図30、29.82分)の出現から明らかにされるように、粗NOX−A12中間体(配列番号65)は、実験の節で記載された切断可能なビオチン部分で効率的に標識された。NOX−A12中間体[配列番号65]の固相合成からの破損配列、および他の不純物の存在によって、標識またはその後の工程5.3.2〜5.3.5を実施する能力や核酸分子の配列を決定する能力は影響を受けない。粗標識混合物は、サイズ排除精製カラム(NAP25、実験参照)を用いた初歩的な脱塩工程を除いて、精製されなかった。その後、この粗材料を断片化し、標識断片を固定し、洗浄し、その後、記載したような固体支持体から放出させた(第5.3.2節〜第5.3.4節)。その後、得られた反応混合物をLCMSを用いて分析した(第5.3.5節)。得られたトータルイオンクロマトグラム(略称、TIC、図31)は、各々のあり得る5’断片(配列番号101〜145、図34)に相当するピークパターンを示す。TICで観測される個別のピークの各々について、生の質量データ、およびその後の対応するデコンボリューションされた質量を得た。図32は、断片(質量ピーク値=10910.65Da)、この場合、断片33(図34A、[配列番号133])のデコンボリューションされた分子量の例を示す。図16に記載のフローチャートに従って、観測質量を用いてNOX−A12(図33A〜C)の配列を一義的に決定した。図34A+Bは対応する配列確認表を示し、図35は注釈付きTICを示し、ピークは、配列決定表(図33A〜C)と配列確認表(図34A+B)中の対応する断片番号に帰属させられる。
本明細書に列挙された文書の完全な書誌データは、それとは矛盾することが示されない限り、以下の通りである。該参考文献の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
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Claims (126)
- 以下の工程:
a)少なくとも1つの修飾を有する前記核酸分子の複数の分子を提供する工程;
b)複数の修飾核酸分子をランダムに切断し、それにより修飾核酸分子断片と非修飾核酸分子断片とを提供する工程;
c)前記修飾核酸分子断片を前記非修飾核酸分子断片から分離する工程;
d)前記修飾核酸分子断片をその長さ、質量および/または電荷によって分離または分別し、そのような分離または分別によって、修飾核酸断片のパターンが生成される工程;ならびに
e)任意で前記修飾核酸断片のパターンを可視化する工程
を含む、核酸分子のヌクレオチド配列を決定するための方法。 - 前記方法が、
f)前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 複数の分子の個々の核酸分子が、そのヌクレオチド配列が決定される核酸分子の5’末端に、3’末端にまたはヌクレオチド配列内に少なくとも1つの修飾を有する、請求項1〜2のいずれかに記載の方法。
- 前記切断が、化学的切断、酵素的切断、熱による切断および/または二価カチオンの使用による切断によって行なわれる、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記切断が、化学的切断、好ましくはヌクレオチド非特異的切断である、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 前記切断が限定的切断である、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記切断が、限定的なランダム切断、好ましくは限定的で化学的なランダム切断である、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 切断する工程が、断片、好ましくは修飾断片の混合物を提供し、そのような断片の混合物が、前記核酸分子の全てのあり得るヌクレオチド配列断片を含む、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記混合物が、そのヌクレオチド配列が決定される修飾された全長形態の前記核酸分子を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記修飾核酸分子断片が、修飾と相互作用パートナーとの相互作用によって非修飾核酸分子断片から分離され、そのような相互作用パートナーが支持体に連結される、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 前記支持体が固体支持体である、請求項10に記載の方法。
- 前記非修飾核酸分子断片が、好ましくは洗浄によって、前記相互作用パートナーと相互作用する前記修飾核酸分子断片から除去される、請求項10〜11のいずれかに記載の方法。
- 前記修飾核酸分子断片が、好ましくは前記相互作用パートナーからの前記修飾の放出によるか、前記支持体からの前記相互作用パートナーからの放出によるか、あるいは前記核酸分子断片から前記修飾またはその一部もしくは部分を切断することによって、前記支持体から放出される、請求項10〜12のいずれかに記載の方法。
- 前記修飾核酸分子断片が、質量識別、サイズ識別、および/または疎水性識別、電荷識別、イオン識別、水素結合識別、あるいは液相によって仲介される抽出による分離によって、前記非修飾核酸分子から分離され、好ましくは前記非標識核酸分子断片が除去される、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 前記修飾核酸断片のパターンが修飾核酸断片のラダーを含む、請求項1〜14のいずれかに記載の方法。
- 前記修飾核酸断片のパターンが質量分析法によって生成され、好ましくは前記核酸分子の核酸配列が推定される、請求項1〜15のいずれかに記載の方法。
- 前記修飾核酸断片のパターンが生成され、個々の断片の質量が質量分析法によって決定され、好ましくは前記核酸分子の核酸配列が推定される、請求項1〜15のいずれかに記載の方法。
- 前記核酸分子のヌクレオチド配列が未知である、請求項1〜17のいずれかに記載の方法。
- 前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程が、以下の工程:
fa)最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の質量および/またはヌクレオチド配列を決定する工程;
fb)前記最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の質量と1ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片n+x、x=1の質量を決定する工程;
fc)前記修飾核酸分子断片n+x、x=1の質量と前記最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の質量の質量差を決定する工程;
fd)前記質量差を個別のヌクレオチド種に帰属させ、前記個別のヌクレオチド種を前記最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の配列に付加することにより前記修飾核酸分子断片n+x、x=1の配列を生成させる工程
を含む、請求項1〜18のいずれかに記載の方法。 - 工程fb)〜fd)が反復され、各々の反復で、1の加数によりxが増加し、1回目の反復で、xが2となり、工程fb)において、修飾核酸分子断片n+(x−1)の質量と1ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片n+xの質量が決定され、工程fc)において、前記修飾核酸分子断片n+xの質量と前記修飾核酸分子断片n+(x−1)の質量の質量差が決定され、かつ工程fd)において、前記質量差が個別のヌクレオチド種に帰属させられ、前記個別のヌクレオチド種を前記修飾核酸分子断片n+(x−1)の配列に付加することにより前記修飾核酸分子断片n+xの配列が生成される、請求項19に記載の方法。
- 工程fb)〜fd)のm回目の反復で、xが次の通り、すなわち、x=m+1となる、請求項20に記載の方法。
- 前記核酸分子のヌクレオチド配列が既知であり、好ましくは前記方法が、前記核酸分子のヌクレオチド配列を確認するためのものである、請求項1〜17のいずれかに記載の方法。
- 前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程が、以下の工程:
fa)最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の質量と1ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片n+x、x=1の質量を決定する工程;
fb)前記修飾核酸分子断片n+x、x=1の質量と前記最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の質量の質量差を決定する工程;
fc)前記質量差を個別のヌクレオチド種に帰属させ、前記個別のヌクレオチド種を前記最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の配列に付加することにより前記修飾核酸分子断片n+x、x=1の配列を生成させる工程
を含む、請求項22に記載の方法。 - 工程fa)〜fc)が反復され、各々の反復で、1の加数によりxが増加し、1回目の反復で、xが2となり、工程fa)において、前記修飾核酸分子断片n+(x−1)の質量と1ヌクレオチドだけ異なる前記修飾核酸分子断片n+xの質量が決定され、工程fb)において、前記前記修飾核酸分子断片n+xの質量と前記修飾核酸分子断片n+(x−1)の質量の質量差が決定され、かつ工程fc)において、前記質量差が個別のヌクレオチド種に帰属させられ、前記個別のヌクレオチド種を前記修飾核酸分子断片n+(x−1)の配列に付加することにより前記修飾核酸分子断片n+xの配列が生成される、請求項23に記載の方法。
- 工程fa)〜fc)のm回目の反復で、xが次の通り、すなわち、x=m+1となる、請求項24に記載の方法。
- 前記最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の質量および/またはヌクレオチド配列が既知である、請求項22〜25のいずれかに記載の方法。
- 前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程が、以下の工程:
fa)最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の質量と1ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片n+x、x=1の質量を決定する工程;
fb)前記修飾核酸分子断片n+x、x=1の質量を、そのヌクレオチド配列が既知である核酸分子の核酸分子断片n+x、x=1の計算質量に帰属させ、前記個別のヌクレオチド種を前記最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の配列に付加することにより前記修飾核酸分子断片n+x、x=1の配列を生成させる工程
を含む、請求項22に記載の方法。 - 工程fa)〜fb)が反復され、各々の反復で、1の加数によりxが増加し、1回目の反復で、xが2となり、工程fa)において、前記修飾核酸分子断片n+(x−1)の質量と1ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片n+xの質量が決定され、かつ工程fb)において、前記修飾核酸分子断片n+x、x=1の質量を、そのヌクレオチド配列が既知である核酸分子の核酸分子断片n+x、x=1の計算質量に帰属させられ、前記個別のヌクレオチド種を前記修飾核酸分子断片n+(x−1)の配列に付加することにより断片n+xの修飾核酸分子配列が生成される、請求項27に記載の方法。
- 工程fa)〜fc)のm回目の反復で、xが次の通り、すなわち、x=m+1となる、請求項28に記載の方法。
- 前記修飾が核酸分子断片の5’末端に存在し、かつ前記最小の修飾核酸分子断片が全長核酸分子の末端5’ヌクレオチドを含むか、または前記修飾が核酸分子断片の3’末端に存在し、かつ前記最小の修飾核酸分子断片が全長核酸分子の末端3’ヌクレオチドを含む、請求項19〜29のいずれかに記載の方法。
- 前記修飾が1つの部分を含む一成分修飾である、請求項1〜30のいずれかに記載の方法。
- 前記部分が、前記修飾核酸分子断片を前記非修飾核酸分子から分離するときに使用される、請求項31に記載の方法。
- 前記部分が、パターンの生成において前記修飾核酸分子断片を分離または分別するときに使用される、請求項32に記載の方法。
- 前記修飾が、少なくとも第1の部分と第2の部分を含む多成分修飾であり、任意で前記少なくとも第1の部分と第2の部分がリンカーで連結されている、請求項1〜30のいずれかに記載の方法。
- 前記第1の部分が、修飾核酸分子断片を非修飾核酸分子から分離するときに使用され、前記第2の部分が、パターンの生成において前記修飾核酸分子断片を分離または分別するときに使用される、請求項34に記載の方法。
- 前記修飾核酸分子断片を前記非修飾核酸分子から分離するときに使用される部分が、相互作用パートナーに対するリガンドを含み、そのような相互作用パートナーが支持体上に存在し、好ましくはそのような支持体に連結され、前記リガンドと前記相互作用パートナーの相互作用が前記支持体上への前記修飾核酸分子断片の固定を仲介する、請求項31〜35のいずれかに記載の方法。
- 前記固定が、化学的固定、親和性固定、磁気固定を含む群から選択される、請求項36に記載の方法。
- 前記固定が親和性固定である、請求項37に記載の方法。
- 前記支持体上への前記核酸分子および前記核酸分子断片の固定を仲介する相互作用が、ビオチン−アビジン相互作用、ビオチン−ニュートロアビジン相互作用、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用、抗原−抗体相互作用、前記核酸分子が、DNA、RNA、LNA、PNA、またはその組合せからなる、2つのオリゴヌクレオチドの相互作用、カルモジュリンとカルモジュリン結合ペプチドの相互作用、アルブミンとシバクロンブルーの相互作用、金属キレーター剤と金属キレート化支持体の相互作用を含む群から選択される、請求項38に記載の方法。
- 前記修飾核酸分子断片を前記非修飾核酸分子から分離するときに使用される部分が、ビオチン、オリゴヌクレオチド、カルモジュリン結合ペプチド、アルブミンおよび金属キレーター剤を含む群から選択される、請求項31〜39のいずれかに記載の方法。
- 前記修飾核酸分子断片が、濾過、透析、クロマトグラフィー、磁場、遠心分離および沈殿を含む群から選択される手段によって、前記非修飾核酸分子から分離される、請求項1〜40のいずれかに記載の方法。
- クロマトグラフィーがサイズ排除クロマトグラフィーであり、前記修飾核酸断片が、そのサイズによるかまたは前記修飾によってそれに与えられる修飾断片のサイズの増加によって、前記非修飾核酸分子から分離される、請求項41に記載の方法。
- 前記パターンの生成において前記修飾核酸分子断片を分離または分別するときに使用される部分が、質量タグまたは親油性タグから選択される、請求項31〜42のいずれかに記載の方法。
- 前記修飾核酸分子断片が、好ましくは濾過および透析およびクロマトグラフィーおよび質量分析法を含む群から選択される質量またはサイズ識別のための方法によって分離または分別され、好ましくはそのような方法がMS、LCMSまたはESI MSである、請求項1〜43のいずれかに記載の方法。
- 前記修飾核酸分子断片が、好ましくはRP−HPLCである疎水性相互作用に基づく方法によって分離または分別される、請求項1〜44のいずれかに記載の方法。
- 前記リンカーが疎水性リンカーである、請求項34〜45のいずれかに記載の方法。
- 前記リンカーが切断可能なリンカーである、請求項34〜46のいずれかに記載の方法。
- 前記リンカーが、選択的に切断可能なリンカーであり、より好ましくは、前記選択的に切断可能なリンカーが、酵素的に切断可能、化学的に切断可能、光切断可能または熱切断可能なものである、請求項47に記載の方法。
- 前記核酸分子が、RNA分子、DNA分子、ヌクレオチド修飾RNA分子およびヌクレオチド修飾DNA分子、PNA、LNAならびにそれらの組合せ、好ましくは、RNA分子、DNA分子、ヌクレオチド修飾RNA分子、ヌクレオチド修飾DNA分子およびデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含有する核酸分子の群から選択される、請求項1〜48のいずれかに記載の方法。
- 前記核酸分子が、アプタマー、シュピーゲルマー、リボザイム、シュピーゲルザイム、アンチセンス分子、siRNA分子およびデコイ分子からなる群、好ましくはシュピーゲルマーから選択される、請求項1〜49のいずれかに記載の方法。
- 前記核酸分子がRNA分子および/またはヌクレオチド修飾RNA分子である、請求項1〜50のいずれかに記載の方法。
- 前記切断が、アルカリ加水分解、アミン、またはポリアミンによってなされる前記RNA分子および/または前記ヌクレオチド修飾RNA分子の化学的切断である、請求項51に記載の方法。
- 前記切断が、ヌクレアーゼ、好ましくはリボヌクレアーゼ、および/または核酸ベースの酵素、好ましくは核酸ベースの酵素の使用によってなされる前記RNA分子および/または前記ヌクレオチド修飾RNA分子の酵素的切断である、請求項51に記載の方法。
- 前記切断が、前記RNA分子および/または前記ヌクレオチド修飾RNA分子の熱による切断である、請求項51に記載の方法。
- 前記切断が、二価カチオンの使用による前記RNA分子および/または前記ヌクレオチド修飾RNA分子の切断である、請求項51に記載の方法。
- 前記核酸がDNA分子および/またはヌクレオチド修飾DNA分子である、請求項1〜50のいずれかに記載の方法。
- 前記切断が、酸加水分解の使用によってなされる前記DNA分子および/または前記ヌクレオチド修飾DNA分子の化学的切断である、請求項56に記載の方法。
- 前記切断が、ヌクレアーゼ、好ましくはデオキシリボヌクレアーゼ、および/または核酸ベースの酵素、好ましくは核酸ベースの酵素の使用によってなされる前記DNA分子および/または前記ヌクレオチド修飾DNA分子の酵素的切断である、請求項56に記載の方法。
- 質量分析法が、直接質量分析法、LC−MSおよびMS/MSを含む群から選択される、請求項16〜58のいずれかに記載の方法。
- 核酸分子の特異的なマスフィンガープリントが決定される、請求項1〜59のいずれかに記載の方法。
- 前記特異的なマスフィンガープリントが、核酸分子の同定および/または品質管理に使用される、請求項60に記載の方法。
- 前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子の前記少なくとも1つの修飾が、工程a)またはb)の前に、前記核酸分子の5’末端または3’末端に付加される、請求項1〜61のいずれかに記載の方法。
- 前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子が非核酸部分を含む、請求項1〜62のいずれかに記載の方法。
- 前記非核酸部分が、工程a)またはb)の前に、前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子から除去される、請求項63に記載の方法。
- 第1の工程において、前記非核酸部分が、前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子から除去され、第2の工程において、前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子の修飾が、工程a)またはb)の前に、5’末端、3’末端または前記核酸分子もしくは前記核酸分子の複数の分子のヌクレオチド配列内のヌクレオチドに付加される、請求項64に記載の方法。
- 以下の工程:
a)少なくとも1つの修飾を有する核酸分子の複数の分子を提供する工程;
b)複数の修飾核酸分子をランダムに切断し、それにより修飾核酸分子断片を提供する工程;
c)前記修飾核酸分子断片をその長さ、質量および/または電荷によって分離または分別し、そのような分離または分別が修飾核酸断片のパターンを生成させる、工程;ならびに
d)任意で前記修飾核酸断片のパターンを可視化する工程
を含む、核酸分子のヌクレオチド配列を決定するための方法。 - 工程b)またはc)の後に得られる反応混合物が、該少なくとも1つの修飾を有さない1以上の核酸分子またはその断片を含有する、請求項66のいずれかに記載の方法。
- 前記修飾核酸断片のパターンの可視化が、前記少なくとも1つの修飾を利用し、好ましくは前記修飾が、該修飾を有する核酸分子と該修飾を有さない核酸分子の識別を可能にする、請求項66および67の1つに記載の方法。
- 前記修飾が、質量タグ、核酸分子の親油性部分よりも顕著に大きい所与の波長でのUV吸光度を有する部分、規定の分子質量を有するポリマー、放射性標識およびイオン移動度の変化を与える部分を含む群から選択される、請求項66〜68のいずれかに記載の方法。
- 前記核酸分子よりも顕著に大きい所与の波長でのUV吸光度を有する部分が、発色団、色素および蛍光標識を含む群から選択される、請求項69に記載の方法。
- 前記方法が、
e)前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程
をさらに含む、請求項66〜70のいずれかに記載の方法。 - 複数の分子の個々の核酸分子が、そのヌクレオチド配列が決定される核酸分子の5’末端に、3’末端にまたはヌクレオチド配列内に少なくとも1つの修飾を有する、請求項66〜71のいずれかに記載の方法。
- 前記切断が、化学的切断、酵素的切断、熱による切断および/または二価カチオンの使用による切断によって行なわれる、請求項66〜72のいずれかに記載の方法。
- 前記切断が、化学的切断、好ましくはヌクレオチド非特異的切断である、請求項66〜73のいずれかに記載の方法。
- 前記切断が限定的切断である、請求項66〜74のいずれかに記載の方法。
- 前記切断が、限定的なランダム切断、好ましくは限定的で化学的なランダム切断である、請求項66〜75のいずれかに記載の方法。
- 切断する工程が、断片、好ましくは修飾断片の混合物を提供し、断片のそのような混合物が前記核酸分子の全てのあり得るヌクレオチド配列断片を含む、請求項66〜76のいずれかに記載の方法。
- 前記混合物が、そのヌクレオチド配列が決定される修飾された全長形態の前記核酸分子を含む、請求項77に記載の方法。
- 前記修飾核酸断片のパターンが修飾核酸断片のラダーを含む、請求項66〜78のいずれかに記載の方法。
- 前記修飾核酸断片のパターンが質量分析法、好ましくはLC−MSによって生成され、かつ好ましくは前記核酸分子の核酸配列が推定される、請求項66〜79のいずれかに記載の方法。
- 前記修飾核酸断片のパターンが生成され、個々の断片の質量が質量分析法によって決定され、かつ好ましくは、前記核酸分子の核酸配列が推定される、請求項66〜79のいずれかに記載の方法。
- 前記核酸分子のヌクレオチド配列が未知である、請求項66〜81のいずれかに記載の方法。
- 前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程が、以下の工程:
fa)最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の質量および/またはヌクレオチド配列を決定する工程;
fb)前記最小の修飾核酸分子断片n+1、x=0の質量と1ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片n+x、x=1の質量を決定する工程;
fc)前記修飾核酸分子断片n+x、x=1の質量と前記最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の質量の質量差を決定する工程;
fd)前記質量差を個別のヌクレオチド種に帰属させ、前記個別のヌクレオチド種を前記最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の配列に付加することにより修飾核酸分子断片n+x、x=1の配列を生成させる工程
を含む、請求項66〜82のいずれかに記載の方法。 - 工程fb)〜fd)が反復され、各々の反復で、1の加数によりxが増加し、1回目の反復で、xが2となり、工程fb)において、前記修飾核酸分子断片n+(x−1)の質量と1ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片n+xの質量が決定され、工程fc)において、前記修飾核酸分子断片n+xの質量と前記修飾核酸分子断片n+(x−1)の質量の質量差が決定され、工程d)において、前記質量差が個別のヌクレオチド種に帰属させられ、前記個別のヌクレオチド種を前記修飾核酸分子断片n+(x−1)の配列に付加することにより前記修飾核酸分子断片n+xの配列が生成される、請求項83に記載の方法。
- 工程fb)〜fd)のm回目の反復で、xが次の通り、すなわち、x=m+1となる、請求項84に記載の方法。
- 前記核酸分子のヌクレオチド配列が既知であり、好ましくは、前記方法が前記核酸分子のヌクレオチド配列を確認するためのものである、請求項66〜81のいずれかに記載の方法。
- 前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程が、以下の工程:
fa)最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の質量と1ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片n+x、x=1の質量を決定する工程;
fb)前記修飾核酸分子断片n+x、x=1の質量と前記最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の質量の質量差を決定する工程;
fc)前記質量差を個別のヌクレオチド種に帰属させ、前記個別のヌクレオチド種を前記最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の配列に付加することにより修飾核酸分子断片n+x、x=1の配列を生成させる工程
を含む、請求項86に記載の方法。 - 工程fa)〜fc)が反復され、各々の反復で、1の加数によりxが増加し、1回目の反復で、xが2となり、工程fa)において、修飾核酸分子断片n+(x−1)の質量と1ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片n+xの質量が決定され、工程fb)において、前記修飾核酸分子断片n+xの質量と前記修飾核酸分子断片n+(x−1)の質量の質量差が決定され、工程fc)において、質量差が個別のヌクレオチド種に帰属させられ、前記個別のヌクレオチド種を前記修飾核酸分子断片n+(x−1)の配列に付加することにより断片n+xの配列が生成される、請求項87に記載の方法。
- 工程fa)〜fb)のm回目の反復で、xが次の通り、すなわち、x=m+1となる、請求項88に記載の方法。
- 前記最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の質量および/またはヌクレオチド配列が既知である、請求項86〜89のいずれかに記載の方法。
- 前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程が、以下の工程:
fa)最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の質量と1ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片n+x、x=1の質量を決定する工程;
fb)前記修飾核酸分子断片n+x、x=1の質量を、そのヌクレオチド配列が既知である核酸分子の前記核酸分子断片n+x、x=1の計算質量に帰属させ、個別のヌクレオチド種を前記最小の修飾核酸分子断片n+x、x=0の配列に付加することにより修飾核酸分子断片n+x、x=1の配列を生成させる工程
を含む、請求項86に記載の方法。 - 工程fa)〜fb)が反復され、各々の反復で、1の加数によりxが増加し、1回目の反復で、xが2となり、工程fa)において、前記修飾核酸分子断片n+(x−1)の質量と1ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片n+xの質量が決定され、工程fb)において、前記修飾核酸分子断片n+x、x=1の質量が、そのヌクレオチド配列が既知である核酸分子の核酸分子断片n+x、x=1の計算質量に帰属させられ、前記個別のヌクレオチド種を前記修飾核酸分子断片n+(x−1)の配列に付加することにより断片n+xの修飾核酸分子配列が生成される、請求項91に記載の方法。
- 工程fa)〜fc)のm回目の反復で、xが次の通り、すなわち、x=m+1となる、請求項92に記載の方法。
- 前記修飾が前記核酸分子断片の5’末端に存在し、かつ前記最小の修飾核酸分子断片が全長核酸分子の末端5’ヌクレオチドを含むか、または前記修飾が前記核酸分子断片の3’末端に存在し、かつ前記最小の修飾核酸分子断片が全長核酸分子の末端3’ヌクレオチドを含む、請求項83〜93のいずれかに記載の方法。
- 前記修飾が、パターンの生成において前記修飾核酸分子断片を分離または分別するときに使用される、請求項66〜94のいずれかに記載の方法。
- 前記修飾が、その波長吸光度が前記核酸分子のヌクレオ塩基の波長吸光度とは異なる蛍光標識である、請求項66〜95のいずれかに記載の方法。
- 前記核酸分子が、RNA分子、DNA分子、ヌクレオチド修飾RNA分子、ヌクレオチド修飾DNA分子、PNA、LNAおよびそれらの組合せ、好ましくはRNA分子、DNA分子、ヌクレオチド修飾RNA分子、ヌクレオチド修飾DNA分子およびデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含有する核酸分子の群から選択される、請求項66〜96のいずれかに記載の方法。
- 前記核酸分子が、アプタマー、シュピーゲルマー、リボザイム、シュピーゲルザイム、アンチセンス分子、siRNA分子およびデコイ分子からなる群、好ましくはシュピーゲルマーから選択される、請求項66〜97のいずれかに記載の方法。
- 前記核酸分子がRNA分子および/またはヌクレオチド修飾RNA分子である、請求項66〜98のいずれかに記載の方法。
- 前記切断が、前記RNA分子および/または前記ヌクレオチド修飾RNA分子の化学的切断であり、かつそのような切断がアルカリ加水分解によってなされる、請求項99に記載の方法。
- 前記切断が、ヌクレアーゼ、好ましくはリボヌクレアーゼ、および/または核酸ベースの酵素、好ましくは核酸ベースの酵素の使用によってなされる前記RNA分子および/または前記ヌクレオチド修飾RNA分子の酵素的切断である、請求項99に記載の方法。
- 前記切断が、前記RNA分子および/または前記ヌクレオチド修飾RNA分子の熱による切断である、請求項99に記載の方法。
- 前記切断が、二価カチオンの使用による前記RNA分子および/または前記ヌクレオチド修飾RNA分子の切断、あるいは熱および切断剤による切断の組合せである、請求項99に記載の方法。
- 前記核酸がDNA分子および/またはヌクレオチド修飾DNA分子である、請求項66〜98のいずれかに記載の方法。
- 前記切断が、酸加水分解の使用によってなされる前記DNA分子および/または前記ヌクレオチド修飾DNA分子の化学的切断である、請求項104に記載の方法。
- 前記切断が、ヌクレアーゼ、好ましくはデオキシリボヌクレアーゼ、および/または核酸ベースの酵素、好ましくは核酸ベースの酵素の使用によってなされる前記DNA分子および/または前記ヌクレオチド修飾DNA分子の酵素的切断である、請求項104に記載の方法。
- 核酸分子の特異的なマスフィンガープリントが決定される、請求項66〜106のいずれかに記載の方法。
- 前記特異的なマスフィンガープリントが、核酸分子の同定および/または品質管理に使用される、請求項107に記載の方法。
- 前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子の前記少なくとも1つの修飾が、工程a)またはb)の前に、前記核酸分子の5’末端または3’末端に付加される、請求項66〜108のいずれかに記載の方法。
- 前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子が非核酸部分を含む、請求項66〜109のいずれかに記載の方法。
- 前記非核酸部分が、工程a)またはb)の前に、前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子から除去される、請求項110に記載の方法。
- 第1の工程において、前記非核酸部分が、前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子から除去され、第2の工程において、前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子の修飾が、工程a)またはb)の前に、前記核酸分子もしくは前記核酸分子の複数の分子の5’末端、3’末端またはヌクレオチド配列内のヌクレオチドに付加される、請求項111に記載の方法。
- 以下の工程:
a)核酸分子の複数の分子を提供する工程;
b)前記核酸分子の複数の分子をヌクレオ塩基選択的処置に供し、前記核酸分子を形成する1個または数個のヌクレオ塩基種を選択的に修飾し、そのようなヌクレオ塩基選択的処置の後で、前記核酸分子の選択的に処置可能なヌクレオ塩基のいくつかを修飾し、前記核酸分子の選択的に処置可能なヌクレオチドまたはヌクレオ塩基のいくつかを非修飾のままにする工程;
c)修飾ヌクレオ塩基の3’で選択的に核酸リン酸骨格を化学的に切断し、前記修飾ヌクレオ塩基の全てではない前記核酸リン酸骨格を切断する工程;
d)核酸分子断片をLC−MSおよび/またはLC−MS−MSにより分析する工程;ならびに
e)インタクトの末端を有する核酸分子断片をサイズが増加する順に同定し、それから核酸分子の配列を生成させ、ここで、好ましくは、前記核酸分子断片が同じインタクトの末端、より好ましくは同じインタクトの3’末端を有する、工程
を含む、核酸分子のヌクレオチド配列を決定する方法。 - 前記核酸分子が、RNA分子、DNA分子、ヌクレオチド修飾RNA分子およびヌクレオチド修飾DNA分子、PNA、LNA、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含む核酸分子、ならびにそれらの組合せ、好ましくはRNA分子、DNA分子、ヌクレオチド修飾RNA分子およびヌクレオチド修飾DNA分子の群から選択される、請求項113に記載の方法。
- 前記核酸分子が、アプタマー、シュピーゲルマー、リボザイム、シュピーゲルザイム、アンチセンス分子、siRNA分子およびデコイ分子からなる群、好ましくはシュピーゲルマーから選択される、請求項113〜114のいずれかに記載の方法。
- 前記核酸分子が、RNA分子および/またはヌクレオチド修飾RNA分子である、請求項113〜115のいずれかに記載の方法。
- 前記選択的に処置可能なヌクレオ塩基が、グアノシン、アデノシン、シチジン、チミジンおよびウラシルを含む群から選択される、請求項113〜116のいずれかに記載の方法。
- ヌクレオ塩基Uが、ヒドラジンと酢酸とアニリンの組合せで選択的に処置され、5’リン酸付加3’断片とアニリン修飾リボース5’断片が生じる、請求項113〜117のいずれかに記載の方法。
- 前記5’リン酸付加3’断片とインタクトの核酸分子が、請求項113に記載の工程d)においてアニリン修飾リボース5’断片よりも効率的にイオン化される、請求項118に記載の方法。
- 前記5’リン酸付加3’断片が、請求項113に記載の工程d)においてアニリン修飾リボース5’断片よりも効率的にイオン化される、請求項119に記載の方法。
- 前記5’リン酸付加3’断片が、請求項113に記載の工程e)において使用される、請求項120に記載の方法。
- 前記核酸分子が25個よりも多いヌクレオチドまたはヌクレオ塩基を含む、請求項1〜121のいずれかに記載の方法。
- 前記核酸分子が35個よりも多いヌクレオチドまたはヌクレオ塩基を含む、請求項1〜122のいずれかに記載の方法。
- 前記核酸分子が、26個〜50個のヌクレオ塩基、または36個〜50個のヌクレオ塩基、好ましくは26個〜45個のヌクレオ塩基または36個〜45個のヌクレオ塩基を含む、請求項1〜123のいずれかに記載の方法。
- 前記核酸分子の複数の分子の核酸分子の凝集が軽減される、請求項1〜124のいずれかに記載の方法。
- 前記凝集が、工程a)〜e)のいずれか、好ましくは工程a)およびb)のいずれかへのカオトロピック溶液の添加によって軽減される、請求項125に記載の方法。
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