JP2021525859A - Rnaの直接配列決定で使用するための方法およびシステム - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる2018年5月25日に出願された米国仮出願第62/676,754号の利益および優先権を主張する。
である。アルゴリズムは、考えられる全てのタプルがセットVに保存されるまで、全てのデータポイントに対して塩基コールを実行する。ここで留意すべきことに、セットV中の各タプルは、個々の塩基コールの可能性を表す。
Claims (20)
- RNA分子のヌクレオチドの順番を決定するためのコンピューターにより実装される方法であって、
RNA試料の液体クロマトグラフィー−質量分析(LC−MS)データを受け取るステップであって、前記LC−MSデータは、質量、保持時間(RT)、体積、および品質スコア(QS)を含む、ステップ;
質量に基づいて前記LC−MSデータをフィルタリングするステップであって、前記フィルタリングは、予め決定されたサイズより小さい質量を除去することを含む、ステップ;
フィルタリングされた前記LC−MSデータを分析して、複数のRNA配列を決定するステップであって、前記フィルタリングされたLC−MSデータを分析することは、
少なくとも2つの隣接するラダー断片間の質量差を決定すること;および
前記質量差が、正規のヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドの少なくとも1つに等しいかどうかを決定すること
を含む、ステップ;ならびに
残存するLC−MSデータ中に残存する有効なヌクレオチドがないことを決定した後、RNA配列を、配列リードとして読み出すステップであって、前記RNA配列は、それぞれの同定された正規のヌクレオチドおよびあらゆる同定された修飾されたヌクレオチドの配列の順番を含む、ステップ
を含む、方法。 - 配列決定されたLC−MSデータ中に何らかのギャップがあるかどうかを決定するステップ;
前記ギャップに基づく有効なヌクレオチドを生じなかった何らかの残存するRNA断片があるかどうかを決定するステップ;
前記RNA断片に対して階層クラスタリングアルゴリズムを実行して、その関連する質量付加物から、可能性のあるヌクレオチドを同定するステップであって、前記階層クラスタリングアルゴリズムは、
化合物の質量とRTに基づいて距離メトリックを決定すること;および
各断片が真のラダー断片の可能性のある質量付加物を含むように、RNA断片を、その質量の関係に基づいて、質量のクラスターにグループ分けすること
を含む、ステップ;
同定された前記質量付加物と前記質量のクラスターとの間の項目ごとの比較に基づいて、各クラスターにつきRNA断片の質量を決定するステップ;
各クラスターにつき決定された前記質量に基づいて、ラダー断片を予測するステップ;および
予測された前記ラダー断片に基づいて、RNA配列を読み出すステップであって、前記RNA配列は、あらゆる同定された質量付加物を含む、ステップ
をさらに含む、請求項1に記載のコンピューターにより実装される方法。 - 前記RNA分子の長さが、20ヌクレオチドより大きい、請求項1に記載のコンピューターにより実装される方法。
- 1つまたは複数のRNA分子が、配列決定される前記RNA試料中に存在する、請求項1に記載のコンピューターにより実装される方法。
- 前記RNA試料が、精製されたRNA試料を含む、請求項1に記載のコンピューターにより実装される方法。
- 前記RNA試料が、治療用RNA分子を含む、請求項1に記載のコンピューターにより実装される方法。
- 前記RNA配列が、MSデータ出力と公知のリボヌクレオチドの質量の相関によって決定される、請求項1に記載のコンピューターにより実装される方法。
- 質量分析(MS)データ出力を公知の修飾されたリボヌクレオチドの質量と相関させることに基づいて、修飾されたリボヌクレオチドのタイプ、位置、および量を決定するステップをさらに含む、請求項1に記載のコンピューターにより実装される方法。
- 前記フィルタリングされたLC−MSデータの配列決定が、RNA断片の固有の特性に基づく、請求項1に記載のコンピューターにより実装される方法。
- 前記RNA断片の前記固有の特性が、電子的または光学的なシグネチャーシグナルの少なくとも1つを含む、請求項9に記載のコンピューターにより実装される方法。
- RNA分子のヌクレオチドの順番を決定するためのシステムであって、
1つまたは複数のプロセッサー;および
命令を保存する1つまたは複数のメモリー
を含み、
前記命令は、前記1つまたは複数のプロセッサーによって遂行されると、前記システムに、
RNA試料の液体クロマトグラフィー−質量分析(LC−MS)データを受け取るステップであって、前記LC−MSデータは、質量、保持時間(RT)、体積、および品質スコア(QS)を含む、ステップ;
質量に基づいて前記LC−MSデータをフィルタリングするステップであって、前記フィルタリングは、予め決定されたサイズより小さい質量を除去することを含む、ステップ;
フィルタリングされた前記LC−MSデータを分析して、複数のRNA配列を決定するステップであって、前記フィルタリングされたLC−MSデータを分析することは、
少なくとも2つの隣接するラダー断片間の質量差を決定すること;および
前記質量差が、正規のヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドの少なくとも1つに等しいかどうかを決定すること
を含む、ステップ;ならびに
残存するLC−MSデータ中に残存する有効なヌクレオチドがないことを決定した後、RNA配列を、配列リードとして読み出すステップであって、前記RNA配列は、それぞれの同定された正規のヌクレオチドおよびあらゆる同定された修飾されたヌクレオチドの配列の順番を含む、ステップ
を実施させる、システム。 - RNA分子のヌクレオチドの順番を決定するためのコンピューターにより実装される方法であって、
RNA試料の液体クロマトグラフィー−質量分析(LC−MS)データを受け取るステップであって、前記RNA試料は、RNAラダー断片を含む、ステップ;
塩基への修飾を有するものを含む全ての公知のリボヌクレオチドの化学式から計算された理論上の質量を含むデータベースにアクセスするステップ;
前記LC−MSデータに、アンカーベースのサブセッティングを実行するステップであって、前記アンカーベースのサブセッティングは、データゾーンを選択することを含む、ステップ;
LC−MSデータの前記サブセットに塩基コールを実行して、タプルのデータセットを生成するステップ;
前記データセット中のタプルを連結するトラジェクトリを構築して、前記RNAラダー断片のドラフトリードを生成するステップ;および
ドラフトリードストラテジーを実行するステップ
を含む、方法。 - 前記ドラフトリードストラテジーが、リード長さ、平均体積、平均品質スコア(QS)、または平均百万分率(PPM)の少なくとも1つに基づいて、スコア付けすることを含む、請求項12に記載のコンピューターにより実装される方法。
- 平均PPMが、ドラフトリードに含有されるデータポイントに関連する全てのPPM値の合計をリード長さで割った値である、請求項12に記載のコンピューターにより実装される方法。
- トラジェクトリを構築することが、深さ優先探索(DFS)アルゴリズムを実行して、考えられる全てのドラフトリードが、前記LC−MSデータから確実に見出されるようにすることをさらに含む、請求項12に記載のコンピューターにより実装される方法。
- 前記RNA試料の生化学的な標識付けをさらに含む、請求項12に記載のコンピューターにより実装される方法。
- 前記ドラフトリードストラテジーが、グローバル階層ランク付けストラテジーまたはローカルベストストラテジーを含む、請求項12に記載のコンピューターによる方法。
- 前記ドラフトリードストラテジーが、ローカルベストストラテジーを含む、請求項12に記載のコンピューターにより実装される方法。
- 前記RNA分子の異なる断片から完全なRNA配列をアセンブルするように構成されたアライメント/アセンブリアルゴリズムを実行するステップをさらに含む、請求項12に記載のコンピューターにより実装される方法。
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