JP2012500832A - 癌の治療のためのニューロピリン−2の中和によるp53発現の誘導 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
抗血管新生ストラテジーに関して、増殖因子、特にEGF又はVEGF (血管内皮増殖因子)が癌の進行及び血管新生に関与することが示されている。VEGFの作用を標的にするいくつかの分子が、抗血管新生医薬品として開発されている:VEGFを指向するヒト化モノクローナル抗体であるベバシズマブ(Avastin (登録商標))は、転移性結腸直腸癌の治療のために2004年から用いられている;VEGF/VEGF受容体経路におけるシグナル伝達を阻害する分子であるスニチニブ及びソラフェニブは、転移性腎癌の治療のための抗血管新生ストラテジーにおいて用いられている。
機能的p53タンパク質の発現の回復、及びこのタンパク質の過剰発現の誘導は、よって、抗腫瘍療法の開発における必須の目的である。
さらに、多くの知見が、これらの受容体が、血管新生を活性化することにより腫瘍進行において必須の役割を有することを示している:特に、NRP-2へのVEGFの結合は、NRP-2の短い細胞質内ドメインとVEGF受容体VEGFR1のそれとの間の協力により媒介される血管新生促進活性の原因である。NRP-2が、VEGFR1受容体及びAKTタンパク質のリン酸化を誘導する能力を有し、よって、癌の進行に有利であり、siRNAを用いるニューロピリン-2の抑制が、異種移植片における転移の出現に対向し、腫瘍サイズを減少させることが報告されている(Grayら J. Natl. Cancer Inst., 100:109〜120, 2008)。さらに、NRP-2のBドメインのVEGF結合部位を指向する抗NRP-2抗体(抗Nrp2B抗体とよばれる)が、腫瘍リンパ脈管新生及び転移の形成を低減できることも示されている。この抗体は、リンパ性内皮細胞遊走を阻害することにより作用するが、腫瘍細胞の遊走、増殖又はアポトーシスに対して影響しない(Cauntら, Cancer Cell, 13, 331〜42, 2008)。
これらのデータは、特に、化学療法又は放射線療法又はその他の抗癌剤に対する鋭敏化のための革新的なストラテジーを開発する可能性に関して、新しい治療の見通しを開く。
- これらはp53発現を誘導し、アポトーシスを誘導するそれらの能力は、このp53発現に依存する(これは、p53阻害剤であるピフィスリンαにより減少する);
- これらのニューロピリン結合特性及びアポトーシスを誘導するそれらの能力は、VEGF非依存性である(ヒトニューロピリン-2を発現する腫瘍細胞表面へのそれらの結合及び該細胞のアポトーシスを誘導するそれらの能力は、VEGFの存在により改変されない)。
用語「ヒト化抗体」とは、そのニューロピリン-2結合特性を保存する非ヒト動物、好ましくはマウスにより元来生成されるが、ヒトにおけるその免疫原性を低減させるために、できるだけ多くのマウス配列を対応するヒト配列で置き換えた抗体のことをいう。可変ドメインについて、置き換えられる配列は、一般的に、FR (フレームワーク)領域、すなわち超可変ループであるCDR間に位置する配列である。
本発明によるキメラ又はヒト化抗体は、好ましくは、IgGクラスの免疫グロブリン、特にアイソタイプIgG1、2、3又は4である。
本発明によるニューロピリン-2リガンドは、特に、以下のものであり得る:
- 該抗体の重鎖及び軽鎖のCDR3を少なくとも含み、そして好ましくはCDR2及び/又はCDR1も含む本発明による抗ニューロピリン-2抗体の任意のフラグメント;
- 上記で規定される本発明による抗ニューロピリン-2抗体フラグメントを含む、組換え免疫グロブリン分子を含む任意の組換えタンパク質。
- 本発明による少なくとも1つの抗ニューロピリン-2抗体フラグメントと、別の抗体の少なくとも1つのフラグメントとが会合したタンパク質;例えば、二重特異性免疫グロブリン、抗ニューロピリン-2抗体のFv又はFabフラグメントと、異なる特異性を有する抗体のFv又はFabフラグメントとのコンジュゲート、抗ニューロピリン-2フラグメントのscFvフラグメントと、異なる特異性を有する抗体のFv又はFabフラグメントとの会合により得られる「二重特異性ダイアボディ」が挙げられる;
- 本発明による少なくとも1つの抗ニューロピリン-2フラグメントと、インビボで投与したときにその血漿半減期を延長するための分子、特にそのようにして得られる融合ポリペプチドの分子質量が腎臓ろ過閾値より大きくなるのに十分な分子質量の水溶性ポリペプチドとが会合したタンパク質。
非ヒト抗体のCDRを、ヒト起源の抗体のフレームワーク領域(FR)に移すことで構成されるCDR移植法に基づく方法を挙げることができる(例えばRoutledgeら,「Reshaping antibodies for therapy」, Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylatic and Therapeutic Applications in Man, 13〜44, Academic Titles, Nottingham, England, 1993、又はRoguskaら, Protein Engineering, 9(10): 895〜904, 1996を参照)。CDR移植法は、一般的に、フレームワーク領域の最適化により完了し、これは、ヒト化抗体の抗原結合親和性を増加させるためにフレームワーク領域のいくつかの残基を改変することである。コンビナトリアルライブラリーの使用により、この最適化ステップを単純化することが可能になる(Rosokら J. Biol. Chem. 271: 22611〜22618, 1996; Bacaら J. Biol. Chem. 272: 10678〜10684, 1997)。抗体ヒト化のための別のストラテジーは、起源の抗体の重鎖及び軽鎖のCDR3のみを保存し、残りの配列をヒトV遺伝子のナイーブライブラリーから選択することである(Raderら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 8910〜8915, 1998)。
本発明による発現ベクターの構築、及び宿主細胞の形質転換は、従来の分子生物学的手法により行うことができる。
本発明のある好ましい実施形態によると、該医薬品は、ニューロピリン-2を発現する腫瘍細胞のアポトーシスを、特に該腫瘍細胞におけるp53発現を増加させることにより、誘導することを意図する。
本発明は、ニューロピリン-2を発現する全ての種類の腫瘍、特に結腸直腸癌、乳癌、腎癌及び黒色腫に用い得る。腫瘍におけるニューロピリン-2の発現は、例えば抗ヒトニューロピリン-2抗体を用いて容易に検出できる。
本発明による抗ヒトニューロピリン-2抗体又はヒトニューロピリン-2のリガンドと組み合わせて用いることができる抗腫瘍薬物は、特に、化学療法剤(例えばアルキル化剤、ヌクレオチドアナログ又はトポイソメラーゼ阻害剤)、電離放射線又は生物学的療法(特に、例えばVEGF若しくはEGF受容体を中和する標的治療用分子、チロシンキナーゼ阻害剤又はmTor経路の阻害剤)である。
2つの株化細胞に形質移入して、それらの表面でNRP-2を発現させた。腫瘍免疫学におけるモデルとして広く用いられる実験的腫瘍であり、ヒトNRP-2を天然に発現しないマウス系統であるP815マスト細胞腫(Diaclone)と、HT29結腸直腸癌細胞から進展させ、その膜表面でNRP-2を天然に発現しないヒト腫瘍系統とに、ヒトNRP-2発現ベクターを形質移入した。プラスミドpcDNA3.1 (Invitrogen)に基づく用いた発現ベクターは、Rossignol Mら(Genomics. 2000 Dec 1; 70(2):211〜22)により記載される。
形質移入したP815及びHT29細胞を小さいフラスコ中に放置し、37℃にて5% CO2の下で湿潤環境中、48時間インキュベートした。D3にて、培養培地を、0.8 mg/mlのジェネテシン(G418, Invitrogen, France)を含有する新しい培地に、形質移入細胞の選択のために置き換えた。
図1のパネルA及びC(P815及びHT29ctrl)は、フローサイトメトリーにより対照細胞を用いて得られた結果を示し、パネルB及びD(P815-NRP-2及びHT29-NRP-2)は、それらの膜表面でNRP-2を発現する細胞を用いて得られた結果を示す。黒色の線での分布曲線は、対照抗体を用いた標識の結果を示し、灰色の線での分布曲線は、マウス抗ヒトNRP-2 IgG抗体を用いた標識の結果を示す。
Matthew及びSandrockにより記載されたもの(J. Immunol. Methods, 100: 73〜82, 1987)に由来する免疫化プロトコルを用いた。各実験において、5匹の雌性Balb/Cマウス(Charles River Laboratories)に、P815-NRP-2形質移入細胞を、週1回、5週間にわたって免疫した。
それぞれの免疫化は、「肉趾」に、1×106のP815-NRP-2細胞を、マウスの各後肢に投与することからなる(すなわち、マウスあたり2×106のP815-NRP-2)。マウスの免疫化のために用いた細胞は、25μlの1×PBS及び25μlのRibiアジュバント(Immunochem Research, USA)で希釈した。50μlの細胞混合物を、次いで、それぞれのマウスに、免疫化プロトコル中に数回注射した(後肢あたり25μl)。最後の注射の5日後に、マウスのリンパ節を回収し、リンパ球を骨髄腫系統と融合させた。融合は、以下のようにして行った。回収したリンパ球を、X63/AG 8653マウス骨髄腫細胞(リンパ球/骨髄腫細胞の比率は5:1)と、ポリエチレングリコールの存在下で融合した(Kearneyら, J. of Immunol., 123: 1548, 1978)。P3X63/AG8.653マウス骨髄腫は、ATCC (ref CRL-1580)を起源とする。
P815-NRP-2系統を認識する抗体を生成するハイブリドーマを、限界希釈法を用いてクローニングした(培養ウェルあたり1細胞の播種密度)。
NRP-2を特異的に認識するいくつかの候補を作製し、ニューロピリン-2を発現する腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するそれらの能力について、クローンITAC-B1及びITAC-B2を含めて選択した。ITAC-B1クローンは、ブダペスト条約に従って、CNCM (Collection Nationale des Microorganismes [フランス国立微生物コレクション], Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France)に、2008年7月30日に、寄託番号CNCM I-4054の下で寄託した。ITAC-B1及びITAC-B2モノクローナル抗体を特徴決定するために、膜標識を、フローサイトメトリーにより、200000個のHT29、HT29-NRP-2、P815又はP815-NRP-2細胞を5μg/mlのITAC-B1又はITAC-B2と、4℃にて15分間接触させることにより行った。FITC結合ヤギ抗マウス2次抗体を、次いで、4℃にて暗所で15分間インキュベートした後に、フローサイトメトリーにより読み取った。ITAC-B1について得られたフローサイトメトリー分析の結果を、図2に示す。
同様の結果が、ITAC-B2抗体について得られた。
- 5'-GARGTTAAGCTGSAGGAGTCAGG-3' (縮重センスプライマー) (配列番号21)
- 5'-ATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC-3' (アンチセンスプライマー) (配列番号22);
及び
- 5'-GAGGTGCAGCTGGAGGAGTCAGG-3' (センスプライマー) (配列番号23)
- 5'-ATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC-3' (アンチセンスプライマー) (配列番号24)。
- 5'-GATATTGTGATSACMCARDCTACA-3' (縮重センスプライマー) (配列番号25)
- 5'-GGATACAGTTGGTGCAGCATTA-3' (アンチセンスプライマー) (配列番号26);
及び
- 5'-GATATTGTGMTSACCCAGACTCCA-3' (縮重センスプライマー) (配列番号27)
- 5'-GGATACAGTTGGTGCAGCATTA-3' (アンチセンスプライマー) (配列番号28)。
ヒトNRP-2遺伝子を標的にする2本鎖siRNAを発現するベクターの生成
ヒトNRP-2の遺伝子配列の一部分に相当するセンスオリゴヌクレオチド:5'-AAA GGC TGG AAG TCA GCA CTA AT-3' (配列番号29)及びアンチセンスオリゴヌクレオチド:5'-AAA AAT TAG TGC TGA CTT CCA GC-3' (配列番号30)をハイブリッド形成させ、得られた2重鎖を、BbsI酵素で予め消化した二重プロモーター発現ベクター(pFiv H1/U6puro SiRNA発現ベクター, System Biosciences)に挿入した。
挿入断片が予測されるサイズを実際に有すること(21塩基対)を確認した後に、100μlのコンピテント大腸菌(E. coli) HB101細菌(Gibco)を、この挿入断片を含有するベクター1μgで形質転換した。コロニーを、200 mlのアンピシリン含有LB培地中で、high-speed midi prepキット(Qiagen)を用いて増殖させ、次いでmaxiprep (Qiagen)を行い、プラスミドpFiv H1/U6puro SiRNA-NRP-2を精製した。
センス鎖:5'- GGC UGG AAG UCA GCA CUA AUU U-3' (配列番号31);
アンチセンス鎖5'- AUU AGU GCU GAC UUC CAG CCU U - 3' (配列番号32)
で構成される、NRP-2転写産物を指向する2本鎖siRNAが作製される。
その膜表面でニューロピリン-2を天然に発現するColo320系統に、プラスミドpFiv H1/U6puro siRNA-NRP-2を、Effectene (登録商標)キット(Qiagen)を用いて形質移入した。これと並行して、Colo320細胞に、pFiv H1/U6puro SiRNA発現ベクターキット(System Biosciences)で提供される対照siRNA (siRNA-ctrl)を形質移入した。Colo320siRNA-NRP-2及びColo320siRNA-ctrl形質移入細胞を、次いで、D2に、2μg/mlのピューロマイシンで選択した。形質移入の効率を、D7以降、マウス抗ヒトNRP-2 IgG抗体(Clone C9, Santa Cruz Biotechnology)で標識することにより、フローサイトメトリーによって評価した。得られた結果を図3に示す。
これらの結果は、NRP-2タンパク質の発現が、siRNA-NRP-2を発現する細胞において効率的に阻害されることを示す。
MTT増殖アッセイは、活性な生存細胞のミトコンドリアスクシネート脱水素酵素による3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミドの還元(フォルマザンを生じる)に基づく。この反応により誘導される着色強度(OD)は、アッセイ中に存在する生存細胞の数と、その代謝活性とに比例する。
図4.Bは、Colo320細胞におけるNRP-2発現が抑制される場合にODが減少することを示す(Colo320siRNA-ctrlを表すバーと比較してColo320siRNA-NRP-2を表すバーを参照)。この結果は、HT29細胞を用いて得られた結果:NRP-2が細胞において、より大きい細胞増殖及び生存を誘導することを確実にする。
図4-2は、細胞がNRP-2を発現する場合に、G2M期及びS期の細胞の数が増加するが、G1期の細胞の数は減少することを示す。つまり、ニューロピリン-2発現は、S及びG2M期の細胞画分の増加と関連する。
図5.A、5.B、5.C及び5.Dは、それぞれHT29ctrl、HT29-NRP-2、Colo320siRNA-ctrl及びColo320siRNA-NRP-2細胞を皮下接種したマウスの写真である。
NRP-2を発現しない細胞を接種したマウスにおいて(図5.A及び図5.D)、異種移植片の異常な進行はなく、異種移植片の増殖の異常な増加が、NRP-2を発現する細胞を接種したマウスにおいて観察される(図5.B及び図5.C)。
これらの実験は、形質移入の後のニューロピリン-2の発現、又は干渉RNAによるこのタンパク質の抑制が、これらの系統の発癌に影響することを示す。
p53、Eカドヘリン及びサイトケラチン20の、ニューロピリン-2を発現するか又は発現しない腫瘍細胞(HT29ctrl又はHT29-NRP-2系統)の異種移植片における発現を、これらの3つのタンパク質のそれぞれに特異的な抗体を用いる免疫組織化学により検討した。
図6.A、6.C及び6.Eは、HT29ctrl対照系統を接種したマウスで採集された異種移植片の切片の写真であり、図6.B、6.D及び6.Fは、NRP-2を発現する系統(HT29-NRP-2)を接種したマウスにおいて採集された異種移植片の切片の写真である。
図6.A、6.C及び6.Eは、HT29ctrl対照系統に由来する異種移植片が、抗サイトケラチン、抗Eカドヘリン及び抗p53抗体で強く標識されるが、HT29-NRP-2対照系統に由来する異種移植片はこれらの抗体のいずれによっても標識されないことを示す。
図7は、フローサイトメトリーにより、抗p53抗体で標識した、HT29-ctrl (パネルA)、HT29-NRP-2 (パネルB)、Colo320siRNA-ctrl (パネルC)及びColo320siRNA-NRP-2 (パネルD)細胞について得られた結果を示す。黒色の線の曲線は、対照抗体での標識の結果を示し、灰色の線の曲線は、抗p53抗体での標識の結果を示す。事象の数(細胞の数)をy軸に示し、蛍光強度(抗p53抗体での細胞の標識に相当する)をx軸に示す。
図8は、p53タンパク質が、NRP-2を発現しないHT29-ctrl系統において強く発現されるが、これはHT29-NP-2系統において検出できないことを示す。同様に、p53は、NRP-2を発現するColo320siRNA-ctrl系統で示されないが、これは、NRP-2の発現が抑制されたColo320siRNA-NRP-2系統において強く発現される。
これらのデータは、ニューロピリン-2発現の阻害が、p53発現の増加を可能にすることを示す。
半固形寒天培地での腫瘍コロニーの形成についての試験
ITAC-B1抗体が、インビトロでの腫瘍コロニーの形成に対して中和活性を有するかを決定するために、寒天含有半固形寒天培地でのインビトロ腫瘍コロニー形成についての試験を行った。この試験の原理は、Colo320ヒト腫瘍細胞(その膜表面にてNRP-2を発現し、そしてさらに培養培地中にVEGFを天然に分泌する)をITAC-B1抗体と接触させることに基づく。4000個のColo320細胞を24ウェルプレートのそれぞれのウェルに、寒天含有半固形培地中で、10μg/mlの抗NRP-2抗体ITAC-B1の存在下に播種する。比較のために、同じ試験を、証明された作用を有する細胞傷害性薬物、すなわち50μg/mlの量で用いる5-フルオロウラシル(5-FU)若しくは50μg/mlの量で用いるAvastin (登録商標) (ベバシズマブ:VEGFを指向するヒト化モノクローナル抗体)、又は10μg/mlの量で用いる対照アイソタイプ抗体(マウスIgG1モノクローナル抗体(BZ1))の存在下で行う。
播種の10日後に、コロニーを光学顕微鏡の下で計数した。
これらの結果は、ITAC-B1抗体の存在下では、5-FUの存在下と同様に、コロニーの数はおよそ40個であり、これに対して、「細胞単独」対照又は陰性対照について140個を超え、細胞をAvastin (登録商標) (ベバシズマブ)の存在下で培養した場合はおよそ120個のコロニーであることを示す。
結果を図10に示す。y軸は、形成されたコロニーの数を示す。x軸上に、培養培地に存在する抗体を「+」で示す。
それらの膜表面にてNRP-2を示すヒト腫瘍細胞の増殖に対するITAC-B1抗体の影響も、上記の実施例3に記載されるようなMTTアッセイを用いて検討した。
100μlの10%非働化FCS含有DMEM培地中のColo320siRNA-ctrl細胞(空のベクターを形質移入した対照細胞)又はColo320siRNA-NRP-2細胞(NRP-2を標的にするsiRNAで形質移入)のウェルあたり4000個の細胞を、96ウェルMaxisorpプレートに播種した。細胞接着の後に、5μg/mlのITAC-B抗NRP-2抗体又は5μg/mlの対照抗体を加えた。24、48又は72時間の培養の後に、PBS中で5 mg/mlに再構成した10μlのMTTを各培養ウェルに加えた。プレートを、次いで、暗所で3時間、37℃及び5% CO2にてインキュベートし、遠心分離し、次いで上清を除去した。次いで、200μlのDMSOを各ウェルに加えた。光学密度を1時間以内に570 nmにて、プレートを振とうした後に読み取った。アッセイは3重で行った。結果を図11に示す。
NRP-2を発現する腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するITAC-B1抗体の能力を決定するために、インビトロアネキシンV-APCアポトーシス試験を行った(BD Pharmingen, San Diego, CA)。この試験は、アポトーシス細胞によるホスファチジルセリンの外在化とこの分子へのアネキシンV-APCの結合とに基づく。
1 mlの10%の非働化FCS含有DMEM培地及び100000個のHT29-NRP-2細胞又は100000個のHT29ctrl細胞を、ウェルあたりに、24ウェルNuncプレートに播種した。細胞接着の後に(3時間)、3つの濃度のITAC-B抗NRP-2抗体(0.5μg/ml、1μg/ml及び5μg/ml)を種々のウェル中で試験した。並行して、「細胞単独」対照を、陰性対照(ITAC-B1抗体と同じ濃度の抗ヒトマウスIgG1抗体(BZ1))と同様に行った。
16時間のインキュベーションの後に、培養上清を排出し、500μlのトリプシン-EDTAを各ウェルに加え、10分間接触させた。細胞が剥離し始めたら、500μlのDMEM培地-10% FCSをウェルあたりに加えた。細胞を、次いで遠心分離し、PBSで2回洗浄し、次いで300μlの1×結合バッファー(キットにおいて提供される)中に採集し、5μlのアネキシンV-APCをその後、100μlのこの溶液に加えた。ITAC-B1抗体及び対照抗体の濃度の関数としてのアネキシンV-APCで標識された細胞集団のフローサイトメトリー分析を、図12に示す。
ITAC-B1抗体が、1μg/ml以上の用量にて、その細胞表面でNRP-2を発現する細胞のアポトーシスを誘導することが注目される。ITAC-B1により誘導されるアポトーシスは、より高い濃度のITAC-B1がより多くのアポトーシスを導くので、用量依存的である。
これらの実験は、よって、ITAC-B1抗体が、それらの膜表面にてNRP-2を発現する腫瘍細胞(HT29-NRP-2)のアポトーシスを、NRP-2を発現しない細胞(HT29)のアポトーシスを誘導することなく、特異的に誘導することを示す。
NRP-2を発現する細胞のアポトーシスを誘導するITAC-B1の能力を評価するための同様の実験を、化学療法において一般的に用いられる2つの抗癌剤である5-FU (5-フルオロウラシル)又はイリノテカンのいずれかの存在下で培養した細胞を用いて行った。この一連の実験において、2.5μg/ml及び5μg/mlのITAC-B1抗体濃度を試験した。並行して、「細胞単独」対照を、2.5μg/ml及び5μg/mlの濃度でのBZ1抗体を用いる対照と同様に行った。5-FU及びイリノテカンを、10μg/mlで用いた。これらの実験の結果を、図13に示す。
5-FUとITAC-B1抗体との組み合わせの存在下で培養した細胞のアポトーシスは、培地中のITAC-B1の濃度が2.5μg/mlについて78.5%程度であり、ITAC-B1濃度5μg/mlについて80%程度である。
イリノテカンとITAC-B1との存在下で培養した細胞について、アポトーシスは、ITAC-B1抗体濃度2.5μg/mlについて51%程度であり、5μg/mlの濃度について58%程度である。
これらの結果は、よって、ITAC-B1抗体と抗癌分子との相乗作用を示し、5-FU/ITAC-B1の組み合わせが、試験した条件下で最も有効である。
アポトーシスの誘導をp53発現と相関させるために、Colo320siRNA-ctrl細胞を18時間、27μMの用量のp53の化学的阻害剤であるピフィスリンα(PFTα, Sigma)で前処理した。前処理の後に、細胞を3 mlのPBSで2回洗浄し、24ウェルプレートに、100000細胞/ウェルの割合で、1 mlのRPMI-10% FCS中に入れる。前処理していない細胞を、同じ条件下に置く。細胞を5時間、20μg/mlの対照マウスアイソタイプ抗体(BZ1)又はITAC-B1とインキュベートし、アポトーシスを上記のようにして測定する。
これらの結果は、PFTαでの前処理が、ITAC-B1依存性アポトーシスを妨げることを示す。ITAC-B1により誘導されるアポトーシスは、よって、p53発現に依存するようである。
細胞をITAC-B1抗体で処理する間に観察されたアポトーシス効果が、NRP-2とのVEGFの結合に依存するかを決定するために、NRP-2を発現するHT29-NRP-2細胞(そしてこれは、Colo320細胞と同様に、VEGFを培養培地中に天然に分泌する)を、50μg/mlでの抗VEGFヒト化モノクローナル抗体Avastin (登録商標) (ベバシズマブ)の存在下で培養し、細胞を、次いで、20μg/mlの対照マウスアイソタイプ抗体(BZ1)又はITAC-B1の存在下で6時間インキュベートした。誘導されたアポトーシスは、上記のようにアネキシンV-APCで標識することにより測定した。結果を図15に示す。
Avastin (登録商標)あり又はなしでBZ1対照抗体の存在下で培養した細胞は、それぞれ12%及び13%のアポトーシスを示す。ITAC-B1抗体の存在下で培養したHT29-NRP-2細胞のアポトーシスは51%程度であり、細胞のおよそ58%がAvastin (登録商標)で前処理された。
これらの結果は、VEGFの中和が、アポトーシスを誘導するITAC-B1抗体の能力を損なわないことを明確に示し、よって、ITAC-B1抗体のアポトーシス促進特性がVEGF非依存性であることが確認される。
VEGF受容体(VEGFR1)のリン酸化の程度と、VEGF受容体により活性化されるAKTタンパク質のリン酸化に対するITAC-B1抗体の可能性のある効果を、HT29-NRP-2及びColo320siRNA-ctrl腫瘍細胞について調べた。
細胞を24時間、RPMI培地 + 10% FCS中で、20μg/mlのBZ1対照抗体、20μg/mlのITAC-B1又は50μg/mlの5-FUの存在下で培養した。「未処置細胞」対照を加えた(「培地」対照)。細胞を、次いで、単離して溶解し、VEGFR-1及びAKTのリン酸化を、非リン酸化VEGFR1 (抗VEGFR1ウサギポリクローナル抗体)若しくはリン酸化VEGFR1 (抗ホスホ-VEGFR1Tyr1213ウサギポリクローナル抗体, R&D systems)を指向する抗体、又は非リン酸化AKT(ウサギポリクローナル抗体C67E7, Cell Signaling technology)若しくはリン酸化AKT (抗ホスホ-AKTSer473ウサギポリクローナル抗体DE-9, Cell Signaling technology)を指向する抗体を用いる細胞タンパク質抽出物についてのウェスタンブロッティングにより評価した。結果を図16及び17に示す。
ニューロピリン-2の認識についてVEGFaとITAC-B1との間でのいずれかの競合を示すために、ニューロピリン-2を発現するHT29-NRP-2腫瘍細胞を、VEGF (1000 ng/ml)とともに又はなしで15分間プレインキュベーションした。これらの細胞を、次いで、ITAC-B1抗体又は対照アイソタイプ抗体 (BZ1抗体)とインキュベートし、上記の実施例2に記載されるようにしてフローサイトメトリーにより分析した。
これらの結果を、図18に示す。これらの結果は、VEGFaの存在が、腫瘍細胞とのITAC-B1の結合を妨げないことを示す。
ニューロピリン-2が、p53の発現を、HT29系統において変更し、それをColo320siRNA-NRP-2系統において回復する能力を有することを示した後で、HT29-NRP-2及びColo320siRNA-ctrlのようなニューロピリン-2を発現する系統におけるp53の発現に対するITAC-B1抗体の影響を検討した。
HT29、HT29-NRP-2、Colo320siRNA-ctrl及びColo320siRNA-NRP-2腫瘍細胞を、20μg/mlのITAC-B1抗体又は対照抗体に曝露し、48時間培養した。株化細胞の溶解、10%ポリアクリルアミドゲル上で得られたタンパク質ペレットの泳動(ウェルあたり10μgのタンパク質)及びPVDFメンブレンへのその後のトランスファーの後に、メンブレンを、1/500に希釈した抗p53一次抗体(BD Biosciences, マウス抗ヒトp53)と1晩インキュベートした。TBS/0.1% Tween20で洗浄した後に、メンブレンを1時間、1/6000に希釈した抗マウスIgG-HRP二次抗体とインキュベートした。結果を図19に示す。
この実験は、ニューロピリン-2の存在とp53の存在との間に負の相関関係が存在し、ITAC-B1が、p53発現のレベルを調節できる元々の能力を有することを確実にする。
HT29-NRP-2腫瘍細胞を、20匹の免疫不全マウスに、マウスあたり1×106細胞の割合で、右側腹部に皮下注射した。注射の10日後に、腫瘍はおよそ5 mm×5 mmと測定される。同等の腫瘍を有する3匹のマウスの4群を作製した。各群に、PBS (対照群A)又はITAC-B1抗体(群B)又は5-FU (群C)又は5-FUとITAC-B1抗体(D群)のいずれかを腹腔内で与えた。
化学療法プロトコルは、図20に模式的に示す。
上記のプロトコルに従って、群Bに、ITAC-B1を、D0 (12 mg/kg)、D3 (6 mg/kg)、D7 (12 mg/kg)及びD10 (6 mg/kg)にて接種した。群Cに、20 mg/kgの5-FUを、D0〜D4にて、そして100 mg/kgをD9にて接種した。群Dに、ITAC-B1を、D0 (12 mg/kg)、D3 (6 mg/kg)、D7 (12 mg/kg)及びD10 (6 mg/kg)に、そして20 mg/kgの5-FUをD0〜D4にて、100 mg/kgの5-FUをD9にて接種した。
腫瘍を週に2回測定し、腫瘍の量を、式:V(mm3) = d2×D/2を用いて算出した。これらの測定の結果を図21に示す。
腫瘍量の減少が、D14から開始して、ITAC-B1抗体又は5-FUを接種したマウスで観察される。この減少は、5-FU/ITAC-B1の組み合わせの処置の間により著しい。
これらの結果は、ITAC-B1抗体が、インビボで腫瘍成長を遅くできることを示す。さらに、ITAC-B1と組み合わせた5-FUで処置したマウスが、5-FU単独又はITAC-B1単独で処置したマウスと比較して腫瘍成長の最大の遅延を経験するので、これらの結果は、ITAC-B1抗体の使用が、5-フルオロウラシルの有効性を強化することを明確に示す。
Claims (6)
- ヒトニューロピリン-2を発現する腫瘍細胞へのその結合が、該腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することを特徴とする抗ヒトニューロピリン-2抗体。
- i) それぞれ配列番号2及び配列番号4の配列で規定される、ITAC-B1抗体の重鎖の可変ドメインと軽鎖の可変ドメインとを含む抗体;
ii) それぞれ配列番号6及び配列番号8の配列で規定される、ITAC-B2抗体の重鎖の可変ドメインと軽鎖の可変ドメインとを含む抗体
から選択される請求項1に記載の抗ヒトニューロピリン-2抗体。 - 請求項1又は2に記載の抗体の重鎖のCDR3と軽鎖のCDR3とを少なくとも含むことを特徴とするヒトニューロピリン-2のリガンド。
- ITAC-B1又はITAC-B2抗体の重鎖及び軽鎖のCDR2及び/又はCDR1も含むことを特徴とする請求項3に記載のヒトニューロピリン-2のリガンド。
- 抗腫瘍医薬品を得るための、請求項1若しくは2に記載の抗体又は請求項3若しくは4に記載のリガンドの使用。
- 前記医薬品が、ヒトニューロピリン-2を発現する腫瘍細胞のアポトーシスを、該細胞のp53発現を増加させることにより誘導することを特徴とする請求項5に記載の使用。
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