JP2012500258A - ルミネッセンスを生じる化合物およびチトクロムp4503a酵素を検出するための方法 - Google Patents
ルミネッセンスを生じる化合物およびチトクロムp4503a酵素を検出するための方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
ルミネッセンスは、ルシフェラーゼが媒介する酸化反応の結果として特定の生物中にて生成される。多種多様な種に由来するルシフェラーゼ遺伝子、特に、Photinus pyralisおよびPhoturis pennsylvanica(北アメリカのホタル)のルシフェラーゼ遺伝子、Pyrophorus plagiophthalamus(ジャマイカンクリックビートル(Jamaican click beetle))のルシフェラーゼ遺伝子、Renilla reniformis(シーパンジー(sea pansy))のルシフェラーゼ遺伝子、ならびに数種の細菌(例えば、Xenorhabdus luminescensおよびVibrio spp)のルシフェラーゼ遺伝子は、非常に一般的なルミネッセンスのレポーター遺伝子である。また、ホタルのルシフェラーゼは、ATPの濃度を決定するための一般的なレポーターであり、このような役割に基づき、バイオマスを決定するために広く用いられている。また、ルミネッセンスは、他の酵素が特定の合成基質(例えば、アルカリホスファターゼとアダマンチルジオキセタンホスフェート、または西洋わさびペルオキシダーゼとルミノール)と混合されたときにも、生成される。
本発明は、ルシフェリンのアセタール誘導体を提供する。また、本発明は、このような誘導体を酵素活性のアッセイに用いるための方法を提供する。この酵素活性のアッセイにおいて、ルシフェリン誘導体は、所望の酵素の基質としての役割を果たすものであり、ルシフェラーゼのプロサブストレート(プロルシフェリン)である。したがって、所望のルシフェラーゼでない酵素のための特定の酵素認識部位(この酵素のための基質として称される分子内の化学的な反応基)がルシフェリン骨格(またはルシフェラーゼのための適切な基質を構成する他の化学的な部分)に連結されているルシフェリン誘導体を提供することによって、ルシフェラーゼでない酵素がバイオルミネッセンスのアッセイにて測定され得る。このような誘導体は、例えば、D−ルシフェリンまたはアミノルシフェリンのカルボキシル基にて修飾を有し、必要に応じて他の修飾を有する誘導体である。
上記式(I)において、
Yは、N、N‐オキシド、N‐(C1〜C6)アルキルまたはCHであり;
Xは、S、O、CH=CH、N=CHまたはCH=Nであり;
X*はそれぞれ独立してOまたはSであり;
R’およびR”はそれぞれ独立して、(C1〜C20)アルキル、(C2〜C20)アルケニル、(C2〜C20)アルキニル、(C3〜C20)シクロアルキル、(C6〜C30)アリール、ハロアリールもしくは複素環であるか、または、R’およびR”は共に環式部分を形成しており;
R’およびR”は、ヒドロキシル、(C1〜C12)アルコキシ、オキシ、アミノ、ハロ、カルボキシル、チオ、(C6〜C30)アリール、ハロアリールまたは複素環で任意に置換されていてもよく、
Zは、H、OR、OH、NH2、NHRまたはNRRであり;
W1はH、ハロ、(C1〜C6)アルキル、(C2〜C20)アルケニル、ヒドロキシルもしくは(C1〜C6)アルコキシであり、nは1、2または3であるか、または
W1およびZは、環Aにおいて共にケト基を形成しており、環Aにおいて任意の結合を示す破線の少なくとも1つが存在せず;
W2はそれぞれ独立して、H、ハロ、(C1〜C6)アルキル、(C2〜C4)アルケニル、ヒドロキシルまたは(C1〜C6)アルコキシであり;
K1、K2、K3およびK4はそれぞれ独立して、CH、N、N‐オキシド、またはN‐(C1〜C6)アルキルであり、
K1とK2との間およびK3とK4との間の破線は、任意の結合を示し、何れかのCHの炭素が置換されているとき、Hは存在せず、
環Bにおける破線は、任意の二重結合であり、
Rは、それぞれ独立して、H、(C1〜C20)アルキル、(C2〜C20)アルケニル、(C2〜C20)アルキニル、(C3〜C20)シクロアルキル、(C1〜C12)アルコキシ、(C6〜C30)アリール、アリール(C1〜C20)アルキル、ハロアリール、複素環、(C1〜C20)アルキルスルホニル、(C6〜C30)アリールスルホニル、ハロアリールスルホニル、(C1〜C20)アルキルスルフィニル、(C6〜C30)アリールスルフィニル、ハロアリールスルフィニル、(C1〜C20)アルコキシカルボニル、アミノ、NH(C1〜C6)アルキル、N((C1〜C6)アルキル)2、トリ(C1〜C20)アンモニウム(C1〜C20)アルキル、ハロアリール(C1〜C20)アルキル、第4級窒素を有するハロアリール、第4級窒素を有するハロアリールカルボニル、(C6〜C30)アリールチオ、(C1〜C20)アルキルリン酸塩、(C1〜C20)アルキルホスホン酸塩、(C6〜C30)アリールリン酸塩、(C6〜C30)アリールホスホン酸塩、リン酸塩、硫酸塩もしくはサッカライドあるか、または、ZがNRRであるとき、Nと共にRRは任意にハロアリール基または複素環基を形成しており;
上記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、アリール、ハロアリールまたは複素環基は何れも、(C1〜C20)アルキル、(C2〜C20)アルケニル、(C2〜C20)アルキニル、(C3〜C20)シクロアルキル、(C1〜C20)アルコキシル、(C1〜C20)アルキルカルボニル、(C1〜C20)アルキルカルボキシル、ハロ、ヒドロキシル、‐COORx、‐S(O)Rx、‐SO2Rx、‐SO3Rx、ニトロ、アミノ、リン酸塩、(C1〜C20)アルキルリン酸塩、(C1〜C20)アルキルホスホン酸塩、NH(C1〜C6)アルキル、NH(C1〜C6)アルキニル、N((C1〜C6)アルキル)2、N((C1〜C6)アルキニル)2、メルカプト、(C1〜C20)アルキルチオ、(C6〜C14)アリール、(C6〜C14)アリールチオ、トリフルオロメチル、=O、ハロアリールまたは複素環から選ばれる1、2、3、4または5の置換基によって任意に置換されていてもよく、
上記RxがH、(C1〜C6)アルキル、(C6〜C14)アリール、複素環もしくはハロアリールまたはこれらの塩であり、上記それぞれの置換基は1〜3のR基によって任意に置換されていてもよく;
上記Zが窒素部分を含むとき、Zの窒素部分の水素の1または両方は、(C1〜C20)アルキルまたは置換基Lによって置き換えられていてもよく;
上記置換基Lは、ルシフェラーゼでない酵素のための基質であるアミノ酸ラジカル、20以下のアミノ酸部分を有するペプチドラジカルまたはその他の低分子であり;
上記Zがヒドロキシル基または窒素部分であるとき、ヒドロキシル基の水素または窒素部分が、(HO)2P(O)‐OCH2‐、スルホ、‐PO3H2または1〜約12の炭素原子の炭素鎖を介してZ基に連結しているセファロスポラニン酸によって置き換えられていてもよく、
上記Zがヒドロキシル基または窒素部分であるとき、ヒドロキシル基の1つの水素または窒素部分が、L’基‐リンカーによって置き換えられていてもよく;
上記L’基は、リンカーを固定しない酵素によって除去可能であり、リンカーは自己切断性を有し、1または複数の窒素原子、酸素原子、カルボニル基、任意で置換されている芳香族環またはペプチド結合によって任意に割り込まれていてもよい炭素鎖であり;
上記リンカーは、リンカーの1つの末端にて、酸素原子またはNH基を介してL’基と連結されており、リンカーの他の末端は、Z基とエーテル、エステルまたはアミド結合を形成しており;
上記ZがORであるとき、式Iは任意で、(C1〜C12)アルキルジラジカルを含むリンカーを介して2つの環Aに結合されたダイマーであってもよく;
上記リンカーは、式Iのダイマー間において、架橋を形成する1〜4の酸素原子、窒素原子または任意で置換されていてもよいアリール、ハロアリールまたは複素環基によって割り込まれていてもよく、式Iのダイマーに結合している上記それぞれのZ基のR基は、架橋によって置き換えられている化合物。
以下の図面にて、本発明の特定の実施形態および/または種々の態様をさらに実証する。必要に応じて、添付の図面を本明細書に示した詳細な説明と組み合わせて参照すれば、本発明の実施形態を最もよく理解することができる。この説明および添付の図面は特定の具体的な例または本発明の特定の態様を強調することがあるが、当業者は、この例または態様の部分を本発明の他の例または態様と組み合わせて用いてもよいことを理解するだろう。
<I.定義>
本明細書で用いるに際し、以下の用語および表現は示された意味を持つ。本発明に係る化合物は、非対称の置換された炭素原子群を含み、光学活性またはラセミ体にて単離され得る。ラセミ体の分割または光学活性な出発原料からの合成など、どのように光学活性体を調製する手法は公知である。構造の、全てがキラル型、ジアステレオマー体、ラセミ体および全ての幾何異性体は、本発明の一部である。ラジカル、置換基および範囲に関する特定値は、説明に関するもののみ記載している。これらは、ラジカルおよび置換基に係る範囲において、他の規定された値または他の値を排除するものではない。
用語“ペプチド”は、2〜35のアミノ酸(例えば、上記規定された)の配列またはペプチド残基にて説明される。上記配列は、直鎖式または環式であってもよい。例えば、環式ペプチドが調製されてもよく、または、配列における2つのシステイン残基間において、ジスルフィドの架橋の形成から生じたものであってもよい。
本発明は、アセタールルシフェリン誘導体またはアセタールアミノルシフェリン誘導体を用いて、1つ以上の分子(例えば、酵素、酵素反応のための補助因子、酵素の基質、酵素の阻害物質、酵素の活性化物質)を検出する、バイオルミネッセンスを生じる方法を提供する。よって、本発明は、サンプル中の分子の量、活性または存在を検出するバイオルミネッセンスを生じるアッセイを提供する。
本発明に係るバイオルミネッセンスの基質は、ルシフェリンのまたはアミノルシフェリンのアセタール誘導体を含む。このような化合物には、以下の一般式で示す化合物が含まれる。
Yは、N、N‐オキシド、N‐(C1〜C6)アルキルまたはCHであり;
Xは、S、O、CH=CH、N=CHまたはCH=Nであり;
X*はそれぞれ独立してOまたはSであり;
R’およびR”はそれぞれ独立して、(C1〜C20)アルキル、(C2〜C20)アルケニル、(C2〜C20)アルキニル、(C3〜C20)シクロアルキル、(C6〜C30)アリール、ハロアリールもしくは複素環であるか、または、R’およびR”は共に環式部分を形成しており;
R’およびR”は、ヒドロキシル、(C1〜C12)アルコキシ、オキシ、アミノ、ハロ、カルボキシル、チオ、(C6〜C30)アリール、ハロアリールまたは複素環で任意に置換されていてもよく、
Zは、H、OR、OH、NH2、NHRまたはNRRであり;
W1はH、ハロ、(C1〜C6)アルキル、(C2〜C20)アルケニル、ヒドロキシルもしくは(C1〜C6)アルコキシであり、nは1、2または3であるか、または
W1およびZは、環Aにおいて共にケト基を形成しており、環Aにおいて任意の結合を示す破線の少なくとも1つが存在せず;
W2はそれぞれ独立して、H、ハロ、(C1〜C6)アルキル、(C2〜C4)アルケニル、ヒドロキシルまたは(C1〜C6)アルコキシであり;
K1、K2、K3およびK4はそれぞれ独立して、CH、N、N‐オキシド、またはN‐(C1〜C6)アルキルであり、
K1とK2との間およびK3とK4との間の破線は、任意の結合を示し、何れかのCHの炭素が置換されているとき、Hは存在せず、
環Bにおける破線は、任意の二重結合であり、
Rは、それぞれ独立して、H、(C1〜C20)アルキル、(C2〜C20)アルケニル、(C2〜C20)アルキニル、(C3〜C20)シクロアルキル、(C1〜C12)アルコキシ、(C6〜C30)アリール、アリール(C1〜C20)アルキル、ハロアリール、複素環、(C1〜C20)アルキルスルホニル、(C6〜C30)アリールスルホニル、ハロアリールスルホニル、(C1〜C20)アルキルスルフィニル、(C6〜C30)アリールスルフィニル、ハロアリールスルフィニル、(C1〜C20)アルコキシカルボニル、アミノ、NH(C1〜C6)アルキル、N((C1〜C6)アルキル)2、トリ(C1〜C20)アンモニウム(C1〜C20)アルキル、ハロアリール(C1〜C20)アルキル、第4級窒素を有するハロアリール、第4級窒素を有するハロアリールカルボニル、(C6〜C30)アリールチオ、(C1〜C20)アルキルリン酸塩、(C1〜C20)アルキルホスホン酸塩、(C6〜C30)アリールリン酸塩、(C6〜C30)アリールホスホン酸塩、リン酸塩、硫酸塩もしくはサッカライドあるか、または、ZがNRRであるとき、Nと共にRRは任意にハロアリール基または複素環基を形成しており;
上記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、アリール、ハロアリールまたは複素環基は何れも、(C1〜C20)アルキル、(C2〜C20)アルケニル、(C2〜C20)アルキニル、(C3〜C20)シクロアルキル、(C1〜C20)アルコキシル、(C1〜C20)アルキルカルボニル、(C1〜C20)アルキルカルボキシル、ハロ、ヒドロキシル、‐COORx、‐S(O)Rx、‐SO2Rx、‐SO3Rx、ニトロ、アミノ、リン酸塩、(C1〜C20)アルキルリン酸塩、(C1〜C20)アルキルホスホン酸塩、NH(C1〜C6)アルキル、NH(C1〜C6)アルキニル、N((C1〜C6)アルキル)2、N((C1〜C6)アルキニル)2、メルカプト、(C1〜C20)アルキルチオ、(C6〜C14)アリール、(C6〜C14)アリールチオ、トリフルオロメチル、=O、ハロアリールまたは複素環から選ばれる1、2、3、4または5の置換基によって任意に置換されていてもよく、
上記RxがH、(C1〜C6)アルキル、(C6〜C14)アリール、複素環もしくはハロアリールまたはこれらの塩であり、上記それぞれの置換基は1〜3のR基によって任意に置換されていてもよく;
上記Zが窒素部分を含むとき、Zの窒素部分の水素の1または両方は、(C1〜C20)アルキルまたは置換基Lによって置き換えられていてもよく;
上記置換基Lは、ルシフェラーゼでない酵素のための基質であるアミノ酸ラジカル、20以下のアミノ酸部分を有するペプチドラジカルまたはその他の低分子であり;
上記Zがヒドロキシル基または窒素部分であるとき、ヒドロキシル基の水素または窒素部分が、(HO)2P(O)‐OCH2‐、スルホ、‐PO3H2または1〜約12の炭素原子の炭素鎖を介してZ基に連結しているセファロスポラニン酸によって置き換えられていてもよく、
上記Zがヒドロキシル基または窒素部分であるとき、ヒドロキシル基の1つの水素または窒素部分が、L’基‐リンカーによって置き換えられていてもよく;
上記L’基は、リンカーを固定しない酵素によって除去可能であり、リンカーは自己切断性を有し、1または複数の窒素原子、酸素原子、カルボニル基、任意で置換されている芳香族環またはペプチド結合によって任意に割り込まれていてもよい炭素鎖であり;
上記リンカーは、リンカーの1つの末端にて、酸素原子またはNH基を介してL’基と連結されており、リンカーの他の末端は、Z基とエーテル、エステルまたはアミド結合を形成しており;
上記ZがORであるとき、式Iは任意で、(C1〜C12)アルキルジラジカルを含むリンカーを介して2つの環Aに結合されたダイマーであってもよく;
上記リンカーは、式Iのダイマー間において、架橋を形成する1〜4の酸素原子、窒素原子または任意で置換されていてもよいアリール、ハロアリールまたは複素環基によって割り込まれていてもよく、式Iのダイマーに結合している上記それぞれのZ基のR基は、架橋によって置き換えられている化合物。
上記式(II)において、
Yは、NまたはCHであり;XはSまたは‐CH=CH‐であり;W1はHまたはハロであり、4つ以下のW1置換基が存在してもよく;
Z、R’およびR”は式Iにて規定される通りである。ある実施形態において、W1はFであり、A環において、1,2,3または4のF基が存在していてもよい。
上記式(III)において、
W1はHまたはハロであり、4つ以下のW1置換基が存在してもよく、Z、R’およびR”は式Iにて規定される通りである。
上記式(IV)において、
R’およびR”は式Iにて規定される通りである。式I〜式IVのそれぞれに係るR’およびR”、または共になったR’およびR”の一例には、任意に置換された(C1〜C20)アルキルまたは(C1〜C12)アルキル(C6〜C10)アリールが含まれる。
上記式(V)において、
X=OまたはNHであり;Y=NまたはCHであり;Fが、3’、4’、5’、7’または8’位に存在してもよい;
上記(VI)において、X=OまたはNHであり;Fが、4’、5’または7’;Rは、式Iで規定された通りであってもよい。
有機的な作用物質は、本明細書に記載した特定の反応(ルシフェラーゼによって媒介される反応が挙げられる。)における光の発生を安定化するに有用であり得る。有機的な作用物質としては、特定の有機化合物(すなわち、1つ以上の炭素原子を含んでいる化合物)が挙げられる。このような作用物質は、ルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応またはルシフェラーゼによって媒介される反応の開始の前、開始時、および/またはこれらの反応の間に添加してもよい。適切な有機化合物およびそれを使用する方法としては、米国特許第7,118,878号明細書(Hawkins et al.)に記載されているものが挙げられる。なお、この文献の開示は、参考として本明細書に援用される。
本発明は、サンプル中の1つ以上の分子の存在または活性を検出するためのキット、あるいはサンプルにおける状態を検出するためのキットも提供する。これらの分子は、反応のための試薬であるか、反応を増強または阻害するものである。これらのサンプルとしては、インタクトな細胞(intact cells)、細胞溶解物(例えば、少なくとも部分的に精製された溶解物)、または細胞の上清が挙げられる。一実施形態において、このキットは本発明の化合物を備えている。以下のルシフェリンまたはアミノルシフェリンの誘導体(例えば、本明細書に記載されたようなアセタール化合物)、別の基質、酵素(例えばエステラーゼ)、または反応混合物の2つ以上を備えている本発明のキットに関し、それぞれは別々の容器に備えられていることができる。いくつかの成分は、いくつかの容器内にて組み合わせられていてもよいし、これらは単一の容器に備えられていてもよい。
<材料および方法>
以下の材料および方法を実施例1および2に記載した実験に用いた。
プロルシフェリンアセタールである化合物を調製した。実施例1および2にて試験したこれらの化合物に、任意の数字表示3320、3357、3358、3359、3363、3364、3365、3366、3377、3387、3391、3397および3403を与えた。これらの化合物の構造を図2および図8〜20に示す。
二段階のスキームに従って、組換えP450酵素を用いるアッセイを行った。第1のステップでは、ルシフェリン誘導体をP450によって酸化する。第2のステップでは、P450の反応混合物にLDRを添加して、P450の活性を停止させ、グロースタイルのルシフェラーゼ反応を開始する。この反応において、ルミネッセンスのシグナルの強度は、第1のステップにてP450によって酸化されたルシフェリン誘導体の量に依存する。
A.ルシフェリン誘導体を用いた、ヒトのチトクロムP450酵素の活性の測定
二段階のルミネッセンスのアプローチによって、プロルシフェリンアセタールを用いたP450の活性の測定を行った(Cali et al., Exp. Op. Drug Metab. Toxicol. (2006) vol.2(4), 629−645; Cali, Cell Notes. 7:2 (2003); Cali et al., Cell Notes, 13:8 (2005a); および Cali, Bioluminescent P450 assays that use D−luciferin derivatives as substrates for CYP1A1, 1A2, 1B1, 2C8, 2C9, 2J2, 3A4, 3A7, 4A11, 4F3B, 4F12 and 19, Proc. 14th Int. Conf. Cytochromes P450, Medimond Int. Proc. (2005b))。すなわち、第1のステップにおいて、本発明のプロルシフェリンアセタールをP450酵素によって最初に酸化する。次いで、酸化された産物は、非酵素的な変換を経験してプロルシフェリンエステルになると考えられる。第2のステップでは、プロルシフェリンエステルをルシフェリンに変換するエステラーゼ酵素を含んでいるルシフェラーゼの反応混合物を添加することによって、プロルシフェリンエステルを検出する。ルシフェリンはルシフェラーゼと反応し、ルシフェリンの量に比例する量の光を生成する。それ故、ルシフェリンはP450酵素の活性の量に比例する量の光を生成する。活性なP450酵素を含んでいるサンプルは、通常、P450の活性を欠いているコントロールと比較する。コントロールを顕著に超過するルミネッセンスのシグナルを与えるP450を含んでいるサンプルは、示唆される反応のメカニズムに縛られることなく、活性であると記録される。
種々の阻害物質の存在下にて、CYP3A4を用いて化合物3391から発生したシグナルを決定した(図3〜6)。CYP3A4と3391との反応は、CYP3A4の基質であるテストステロン、ミダゾラム、ニフェジピン、および標準的な3A4の阻害物質であるケトコナゾールによって阻害された。対照的に、アセタールでないルシフェリン誘導体(ルシフェリン−BEおよびルシフェリン−PFBE)を用いたCYP3A4のアッセイはミダゾラムによって阻害され、ニフェジピンおよびテストステロンによって促進された。アセタールでないルシフェリン誘導体(ルシフェリン−PPXE)を用いたCYP3A4のアッセイはミダゾラムおよびニフェジピンによって阻害され、テストステロンによって促進される(Sobol, M. et al. Promega Notes, 2007, vol. 96, pages 15−18)。このように、化合物3391は、アセタールでないルミネッセンスを生じる基質よりも、CYP3A4の阻害物質を検出するためのプローブとしての使用範囲が広い。なお、このような阻害物質のいくつかは、競合阻害物質としての役割を果たすCYP3A4の基質であり得る。
図7において、CYP3A4の化合物3391との反応の濃度依存性を説明する。このデータは、活性が濃度依存的に増加し、化合物3391が12.5μMのときに最大速度に達し、化合物3391の濃度がより高いときには観察されたこの最大値からわずかに低減することを示している。データは、方程式Y=(Vmax・X)/(Km+X+(X・X/Ki))によって記述された基質の阻害モデルに上手く適合する(R2=0.99)。Xは基質濃度である。Yは相対的な光のユニット(RLU)における活性である。Kmは最大半量の速度である。Kiは基質の阻害定数である。化合物3391に関して算出されたKmおよびKiの値はそれぞれ2μMおよび171μMである。このKm値は、図2にて用いたアセタールでないルシフェリン誘導体(CYP3A4の基質)よりも低い(ルシフェリン−BE:Km=50μM、ルシフェリン−PFBE:Km=50μM、ルシフェリン−PPXE:Km=25μM)(Cali et al Exp. Op. Drug Metab. Toxicol (2006) vol.2(4), 629−645)。
21個の組換えP450酵素の一団とP450酵素の活性を欠いたコントロールに対する、二段階のアッセイのスキームを用いた、いくつかのプロルシフェリンアセタールのスクリーニングを図8〜19に示す。1ピコモルの各酵素を必要な補助因子および緩衝液と一緒に、50μMのプロルシフェリンアセタールの存在下にて37℃で30分間インキュベートした。この条件は、さらに適度な活性の検出を可能にする。各プロルシフェリンアセタールは21個の酵素の種々のサブセットによる活性を示した。この活性は、P450を含んでいないコントロールと比べたときのルミネッセンスの増加として測定された。プロルシフェリンアセタールは、P450酵素のCYP3Aのサブファミリー(CYP3A4、CYP3A5およびCYP3A7が挙げられる。)に対する強い選択性を示した。
図20において、図2に示した実験を改良し、CYP3A4に対する化合物の選択性を実証した。この酵素の重要な役割が薬物代謝であるので、CYP3A4に対して選択的なアッセイは特に関心を集めている。他のCYP3A4のサブファミリーのメンバーであるCYP3A5およびCYP3A7よりもCYP3A4について選択的であるアッセイを設計することは、特にやりがいのある仕事である。図2において用いた条件は、特定の酵素が有利になるようにバイアスをかけることなくスクリーニングされた、P450酵素のいずれかによる化合物3391を用いた活性を検出するために設計された。この条件において、化合物3391はCYP3Aに対する非常に優れた選択性を示したが、CYP3A5およびCYP3A7と比べた場合、CYP3A4に対する選択性は適度なものであった(CYP3A5と比べた場合、CYP3A4に対する選択性は1.4倍であり、CYP3A7と比べた場合CYP3A4に対する選択性は8.5倍である。)。図20において、化合物3301がCYP3A4と反応するための最適な条件にて、酵素の一団を再度スクリーニングした:すなわち、2μMの化合物3391を0.1ピコモルの各P450酵素と一緒に反応緩衝液(100mMのKPO4緩衝液(pH7.4))に存在させ、37℃で10分間インキュベートした。CYP3A4の反応のKmの濃度は2μMであり、100mMのKPO4は化合物3391によるCYP3A4の活性についての最適な緩衝液である。CYP3A4による産物は少なくとも10分間、直線的に蓄積する。そして、0.1ピコモルのCYP3A4を用いた場合、10%未満の化合物3391が10分間のインキュベーションで酸化される。これらの条件はP450の阻害剤のためのスクリーニングに究極的に用いられるアッセイにとって理想的である。これらの条件下にて、化合物3391の反応性は、CYP3A4に対して非常に選択的であり、CYP3A5と比較した場合、CYP3A4に対する選択性は8.0倍を示し、CYP3A7と比較した場合、CYP3A4に対する選択性は48.5倍を示し、スクリーニングされた他のP450酵素を用いた活性は無視できるものである。
化合物3391を用いた実験を培養されたヒトの肝細胞に適用した。この実験を行い、インタクトな細胞におけるCYP3A4の酵素活性を測定した。図21に、ヒトの肝細胞における、バックグラウンド、基底およびフェノバルビタールによって誘導されたルミネッセンスの活性、ならびに基底およびフェノバルビタールによって誘導された活性のケトコナゾールによる阻害を示す。アセタールでないルシフェリン誘導体を用いたバイオルミネッセントなP450酵素のアッセイ(Sobol, M. et al. Promega Notes, 2007, vol. 96, pages 15−18; Cali et al., Exp. Op. Drug Metab. Toxicol (2006) vol.2 (4), 629−645)について以前に記載されたようにして、アッセイを行った。すなわち、化合物3391を肝細胞の培養液に溶解し、公知のCYP3A4の誘導物質であるフェノバルビタールまたはそのビヒクル(DMSO)で48時間処置した後の細胞にアプライした。また、公知のCYP3A4の阻害物質であるケトコナゾールも、化合物3391と組み合わせて、いくつかのウェルにアプライした。化合物に短期間曝露した後、細胞から培地のサンプルを取り出し、別のプレートにおいてルシフェリンを検出する試薬(LDR)と組み合わせて、ルミネッセンスを読んだ。CYP3A4の選択性の予想は、図20に示した組換え酵素の一団のスクリーニングに基づいている。
2‐(4‐(ジイソプロポキシメチル)‐4,5‐ジヒドロチアゾール‐2‐イル)ベンゾ[d]チアゾール‐6‐オールの調製
A.tert‐ブチル 4‐(メトキシ(メチル)カルバモイル)‐2,2‐ジメチルチアゾリジン‐3‐カルボン酸塩
0.918g、3mmolのtert-ブチル 4−(メトキシ(メチル)カルバモイル)−2,2−ジメチルチアゾリジン−3−カルボン酸塩(2)およびジエチルエーテル(20mL)を収容したフラスコをアイスバス中で冷却した。
C.2−(4−(ジイソプロポキシメチル)−4,5−ジヒドロチアゾール−2−イル)ベンゾ[d]チアゾール−6−オール
tert−ブチル 4−ホルミル−2,2−ジメチルチアゾリジン−3−カルボン酸塩(750mg、3.06mmol)をイソプロパノール(20mL)中に懸濁させ、室温にて窒素雰囲気下で攪拌した。HCl(2.3mL、4.0Mジオキサン溶液)を滴下し、反応物を16時間攪拌した。水5mLに溶解させたTCEP(1.49g、5.2mmol)溶液を反応混合物に添加した。飽和炭酸ナトリウムにて反応物のpHを約8に調整した。6−ヒドロキシ−ベンゾ[d]チアゾール−2−カルボニトリル(590mg、3.35mmol)のTHF溶液(5mL)を上記反応物に滴下により添加し、反応物を20時間攪拌した。
1H-NMR(300 MHz, CD2Cl2) ・: 7.94 (d, 1H, J = 9 Hz), 7.32 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.05 (dd, 1H, J = 8.7 Hz, 2.4 Hz), 4.95 (d, 1H, J = 4.5 Hz), 4.79 (1H, m), 3.90 (2H, m), 3.48 (2H, m), 1.2 (12H, m); mass spectrum, calculated for C17H23N2O3S2(MH+) 367.1, Found 367.2.
<実施例4>
ジメトキシメチルチアゾリルベンゾチアゾール誘導体の調製
tert-ブチル 4−ホルミル−2,2−ジメチルチアゾリジン−3−カルボン酸塩(684mg、2.8mmol)およびメタノール(4mL)を収容したフラスコに、4MのHClジオキサン(500μL)溶液を添加した。
pHを7.5に調整するために、メタノール(1mL)における4−(ジメトキシメチル)−2,2−ジメチルチアゾリジン(40mg、0.17mmol)を収容したガラス瓶へ、充分に飽和させた炭酸水素ナトリウムを添加した。
1H NMR (300 MHz, DMSO) δ 10.13 (s, 1H), 7.91 (dd, J = 2.7, 8.8, 1H), 7.39 (d, J = 2.4, 1H), 7.01 (dd, J = 2.5, 8.9, 1H), 4.84 (td, J = 5.5, 9.3, 1H), 4.60 (d, J = 5.0, 1H), 3.54 ‐ 3.20 (m, 11H(includes water peak)).
C.2−(4−(ジメトキシメチル)−4,5−ジヒドロチアゾール−2−イル)−N,N−ジメチルベンゾ[d]チアゾール−6−アミン(化合物3357)
方法Aを使用し、2−シアノ−6−ヒドロキシベンゾチアゾールを6−(N,N‐ジメチルアミノ)−2−シアノベンゼンチアゾール(6−アミノ−2−シアノベンゾチアゾールをヨウ化メチルにて完全メチル化することにより合成される)に置換する合成を行った。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.97 (d, J = 9.1, 1H), 7.25 (s, 1H), 7.02 (d, J = 9.0, 1H), 4.86 (dd, J = 5.2, 9.3, 1H), 4.63 (d, J = 4.8, 1H), 3.50 (dd, J = 2.8, 14.8, 8H), 3.08 (t, J = 4.6, 7H); mass spectrum, calculated (MH+) 338, found 338.
D.2−(4−(ジメトキシメチル)−4,5−ジヒドロチアゾール−2−イル)ベンゾ[d]チアゾール−6−アミン(化合物3359)
方法Aを使用し、2−シアノ−6−ヒドロキシベンゾチアゾールを6−アミノ−2−シアノベンゼンチアゾール(O'Brienら、U.S. Patent No. 7,148,030)に置換する合成を行った。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.85 (d, J = 8.8, 1H), 7.04 (d, J = 2.3, 1H), 6.82 (dd, J = 2.3, 8.8, 1H), 4.84 (td, J = 5.1, 9.0, 1H), 4.59 (d, J = 5.1, 1H), 3.55 ‐ 3.33 (m, 9H), 1.97 (d, J = 0.6, 2H). mass spectrum, calculated (MH+) 310, found 310.
E.3−(2−(4−(ジメトキシメチル)−4,5−ジヒドロチアゾール−2−イル)ベンゾ[d]チアゾール−6−イルアミノ)プロパン−1−オール(化合物3366)
方法Aを使用し、2−シアノ−6−ヒドロキシベンゾチアゾールにより、6−(3−ヒドロキシプロピルアミノ)−2−シアノベンゼンチアゾール(Daily, Hawkinsら、WO 2006/130551)を置換する合成を行った。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.85 (dd, J = 2.4, 8.9, 1H), 6.97 (d, J = 2.3, 1H), 6.80 (dd, J = 2.4, 8.9, 1H), 4.86 (dt, J = 6.9, 13.9, 1H), 4.61 (dd, J = 2.5, 5.0, 1H), 3.91 ‐ 3.75 (m, 2H), 3.59 ‐ 3.38 (m, 9H), 3.36 ‐ 3.25 (m, 2H), 2.16 (d, J = 2.6, 1H), 2.02 ‐ 1.82 (m, 2H). mass spectrum, calculated (MH+) 368, found 368.
混合アセタール誘導体の調製
2‐(4‐(ジメトキシメチル)‐4,5‐ジヒドロチアゾール‐2‐イル)ベンゾ[d]チアゾール‐6‐オール(50mg)を収容したガラス瓶に、2‐ブロモエタノール(1mL)およびHClのジオキサン溶液(4Mの125uL)を添加した。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.96 (d, J = 8.9, 1H), 7.33 (d, J = 2.4, 1H), 7.06 (dd, J = 2.3, 8.9, 1H), 4.88 (dt, J = 6.8, 13.2, 1H), 4.79 ‐ 4.67 (m, 1H), 4.16 ‐ 3.73 (m, 3H), 3.64 ‐ 3.38 (m, 8H), 1.36 (dd, J = 2.4, 5.3, 1H). mass spectrum, calculated (MH+) 304/306, found 304/306
B.2−(4−((3−ブロモプロポキシ)(メトキシ)メチル)−4,5−ジヒドロチアゾール−2−イル)ベンゾ[d]チアゾール−6−オール(化合物3364)および2−(4−(ビス(3−ブロモプロポキシ)メチル)−4,5−ジヒドロチアゾール−2−イル)ベンゾ[d]チアゾール−6−オール(化合物3365)
方法Bを使用し、2−(4−(ジメトキシメチル)−4,5−ジヒドロチアゾール−2−イル)ベンゾ[d]チアゾール−6−オール(200mg)、3−ブロモプロパノール(2mL)およびHClのジオキサン溶液(4Mの480uL)を出発原料として合成を行った。生成物を調製用のRP−HPLCにて分離し、混合アセタールを70mg得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.97 (d, J = 8.9, 1H), 7.29 (d, J = 2.2, 1H), 7.05 (dd, J = 2.2, 8.9, 1H), 5.00 ‐ 4.64 (m, 2H), 3.99 ‐ 3.64 (m, 2H), 3.62 ‐ 3.40 (m, 7H), 2.26 ‐ 1.99 (m, 2H). mass (MH+) calc and found 416/418;
また、対称アセタールを20mg得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.96 (d, J = 8.9, 1H), 7.33 (d, J = 2.4, 1H), 7.06 (dd, J = 2.5, 8.9, 1H), 4.90 (ddd, J = 4.7, 11.2, 18.2, 2H), 3.91 (td, J = 5.5, 9.1, 2H), 3.72 (ddd, J = 5.7, 9.6, 20.4, 2H), 3.60 ‐ 3.41 (m, 6H), 2.13 (ddd, J = 6.1, 12.2, 19.4, 4H). mass (MH+) calc and found 523/525/527.
C.2−(4−((2−(ジメチルアミノ)エトキシ)(メトキシ)メチル)−4,5−ジヒドロチアゾール−2−イル)ベンゾ[d]チアゾール−6−オール(化合物3363)
DMF(200uL)中の2−(4−((2−ブロモエトキシ)(メトキシ)メチル)−4,5−ジヒドロチアゾール−2−イル)ベンゾ[d]チアゾール−6−オール(16mg)を収容したガラス瓶へ、ジメチルアミン(THF溶液、2Mの40uL)を添加した。室温で48時間後、反応物を調製用のRP−HPLCにて分離し、8mgを得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.78 (d, J = 9.2, 1H), 7.14 (d, J = 2.2, 1H), 6.97 (d, J = 8.9, 1H), 4.74 ‐ 4.59 (m, 2H), 4.12 ‐ 3.78 (m, 1H), 3.21 (dd, J = 7.2, 14.9, 1H), 3.10 (s, 2H), 2.63 (s, 5H), 1.29 (t, J = 7.3, 1H). mass (MH+) calc and found 368.
ルシフェリンのキノリンアセタール誘導体の調製
Claims (20)
- 以下の式(I)で示される化合物であって、
上記式(I)において、
Yは、N、N‐オキシド、N‐(C1〜C6)アルキルまたはCHであり;
Xは、S、O、CH=CH、N=CHまたはCH=Nであり;
X*はそれぞれ独立してOまたはSであり;
R’およびR”はそれぞれ独立して、(C1〜C20)アルキル、(C2〜C20)アルケニル、(C2〜C20)アルキニル、(C3〜C20)シクロアルキル、(C6〜C30)アリール、ハロアリールもしくは複素環であるか、または、R’およびR”は共に環式部分を形成しており;
R’およびR”は、ヒドロキシル、(C1〜C12)アルコキシ、オキシ、アミノ、ハロ、カルボキシル、チオ、(C6〜C30)アリール、ハロアリールまたは複素環で任意に置換されていてもよく;
Zは、H、OH、OR、NH2、NHRまたはNRRであり;
W1はH、ハロ、(C1〜C6)アルキル、(C2〜C20)アルケニル、ヒドロキシルもしくは(C1〜C6)アルコキシであり、nは1、2または3であるか、または
W1およびZは、環Aにおいて共にケト基を形成しており、環Aにおいて任意の結合を示す破線の少なくとも1つが存在せず;
W2はそれぞれ独立して、H、ハロ、(C1〜C6)アルキル、(C2〜C4)アルケニル、ヒドロキシルまたは(C1〜C6)アルコキシであり;
K1、K2、K3およびK4はそれぞれ独立して、CH、N、N‐オキシド、またはN‐(C1〜C6)アルキルであり;
K1とK2との間およびK3とK4との間の破線は、任意の結合を示し、何れかのCHの炭素が置換されているとき、Hは存在せず;
環Bにおける破線は、任意の結合であり;
Rは、それぞれ独立して、H、(C1〜C20)アルキル、(C2〜C20)アルケニル、(C2〜C20)アルキニル、(C3〜C20)シクロアルキル、(C1〜C12)アルコキシ、(C6〜C30)アリール、アリール(C1〜C20)アルキル、ハロアリール、複素環、(C1〜C20)アルキルスルホニル、(C6〜C30)アリールスルホニル、ハロアリールスルホニル、(C1〜C20)アルキルスルフィニル、(C6〜C30)アリールスルフィニル、ハロアリールスルフィニル、(C1〜C20)アルコキシカルボニル、アミノ、NH(C1〜C6)アルキル、N((C1〜C6)アルキル)2、トリ(C1〜C20)アンモニウム(C1〜C20)アルキル、ハロアリール(C1〜C20)アルキル、第4級窒素を有するハロアリール、第4級窒素を有するハロアリールカルボニル、(C6〜C30)アリールチオ、(C1〜C20)アルキルリン酸塩、(C1〜C20)アルキルホスホン酸塩、(C6〜C30)アリールリン酸塩、(C6〜C30)アリールホスホン酸塩、リン酸塩、硫酸塩もしくはサッカライドであるか、または、ZがNRRであるとき、Nと共にRRは任意にハロアリール基または複素環基を形成するよう連結しており;
上記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、アリール、ハロアリールまたは複素環基は何れも、(C1〜C20)アルキル、(C2〜C20)アルケニル、(C2〜C20)アルキニル、(C3〜C20)シクロアルキル、(C1〜C20)アルコキシル、(C1〜C20)アルキルカルボニル、(C1〜C20)アルキルカルボキシル、ハロ、ヒドロキシ、‐COORx、‐S(O)Rx、‐SO2Rx、‐SO3Rx、ニトロ、アミノ、リン酸塩、(C1〜C20)アルキルリン酸塩、(C1〜C20)アルキルホスホン酸塩、NH(C1〜C6)アルキル、NH(C1〜C6)アルキニル、N((C1〜C6)アルキル)2、N((C1〜C6)アルキニル)2、メルカプト、(C1〜C20)アルキルチオ、(C6〜C14)アリール、(C6〜C14)アリールチオ、トリフルオロメチル、=O、ハロアリールまたは複素環から選ばれる1、2、3、4または5の置換基によって任意に置換されていてもよく、
上記RxがH、(C1〜C6)アルキル、(C6〜C14)アリール、複素環もしくはハロアリールまたはこれらの塩であり、上記それぞれの置換基は1〜3のR基によって任意に置換されていてもよく;
上記Zが窒素部分を含むとき、Zの窒素部分の水素の1または両方は、(C1〜C20)アルキルまたは置換基Lによって置き換えられていてもよく;
上記置換基Lは、ルシフェラーゼでない酵素のための基質であるアミノ酸ラジカル、20以下のアミノ酸部分を有するペプチドラジカルまたはその他の低分子であり;
上記Zがヒドロキシル基または窒素部分であるとき、ヒドロキシル基の水素または窒素部分 が、(HO)2P(O)‐OCH2‐、スルホ、‐PO3H2または1〜約12の炭素原子の炭素鎖を介してZ基に連結しているセファロスポラニン酸によって置き換えられていてもよく、
上記Zがヒドロキシル基または窒素部分であるとき、ヒドロキシル基の1つの水素または窒素部分が、L’基‐リンカーによって置き換えられていてもよく;
上記L’基は、リンカーを固定しない酵素によって除去可能であり、リンカーは自己切断性を有し、1または複数の窒素原子、酸素原子、カルボニル基、任意で置換されている芳香族環またはペプチド結合によって任意に割り込まれていてもよい炭素鎖であり;
上記リンカーは、リンカーの1つの末端にて、酸素原子またはNH基を介してL’基と連結されており、リンカーの他の末端は、Z基とエーテル、エステルまたはアミド結合を形成しており;
上記ZがORであるとき、式Iは任意で、(C1〜C12)アルキルジラジカルを含むリンカーを介して2つの環Aに結合されたダイマーであってもよく;
上記リンカーは、式Iのダイマー間において、架橋を形成する1〜4の酸素原子、窒素原子または任意で置換されていてもよいアリール、ハロアリールまたは複素環基によって割り込まれていてもよく、式Iのダイマーに結合している上記それぞれのZ基のR基は、架橋によって置き換えられている化合物。 - 下記a)〜j)の何れかを満たす請求項1に記載の化合物。
a)K1〜K4がそれぞれCHまたはCである
b)W1がそれぞれ独立して、H、F、またはClであり、nが1または2であり;W2がそれぞれHである
c)YがNであり、XがSまたは‐CH=CH‐である
d)XがSである
e)X*がOである
f)R’およびR”がそれぞれ独立して、任意で置換された(C1〜C12)アルキルである
g)R’およびR”が、‐X*‐CH‐X*‐と共に、512員環の任意で置換された複素環基を形成するように連結されている
h)ZがNRRであり、上記Rがそれぞれ独立して、Hまたは任意で置換された(C1〜C12)アルキルである
i)ZがOHまたはORであり、上記Rが任意で置換された(C1〜C20)アルキル、(C6〜C30)アリールまたは(C1〜C12)アルキル(C6〜C14)アリール基である
j)a)〜h)の組み合わせ - 上記YがNであり、XがSまたは‐CH=CH‐であり;
X*がそれぞれOであり;
W1がH、FまたはClであり;nが1または2であり;
W2がHであり;
K1、K2、K3およびK4が全てCまたはCHである請求項1に記載の化合物。 - 上記Zが環Aの6’位に存在し、
上記Zが、OH、NH2、NMe2またはNHCH2CH2CH2OHであり;
上記W1が、上記環Aの5’位におけるH、FまたはClである請求項4の化合物。 - ルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応のための分子の存在または量を検出または決定する方法であって、
混合物中のルミネッセンスを検出または決定して、該分子の存在または量を検出または決定する工程を包含しており、
該混合物はサンプル、ルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応のための反応混合物、および請求項1に記載の化合物を含んでいる、方法。 - 前記ルシフェラーゼでない酵素が、チトクロムP450酵素である、請求項7に記載の方法。
- 請求項1に記載の化合物におけるR’およびR’’が(C1〜C6)アルキルである、請求項7に記載の方法。
- 前記化合物が、ルシフェラーゼでない酵素のための基質であり、かつビートルのルシフェラーゼのためのプロサブストレートである、請求項7に記載の方法。
- 前記混合物が、ルシフェラーゼによって媒介される反応のための反応混合物をさらに含んでいる、請求項7に記載の方法。
- 検出または決定される前記分子が、ルシフェラーゼでない酵素、または該ルシフェラーゼでない酵素のための補助因子である、請求項7に記載の方法。
- 前記サンプルが、インタクトな細胞の調製物、細胞溶解物、細胞成分分画、組織、組織画分、または精製された酵素の調製物もしくは部分的に精製された酵素の調製物を含んでいる、請求項7に記載の方法。
- ルシフェラーゼでない酵素の活性に対する作用物質の効果を決定するための方法であって、混合物中のルミネッセンスを検出または決定して、該ルシフェラーゼでない酵素の活性に対する作用物質の効果を決定する工程を包含しており、
該混合物は1つ以上の作用物質、ルシフェラーゼでない酵素によって媒介される反応のための反応混合物、および請求項1に記載の化合物を含んでいる、方法。 - 前記化合物が、ルシフェラーゼでない酵素のための基質であり、かつビートルのルシフェラーゼのためのプロサブストレートである、請求項13に記載の方法。
- 前記混合物が、ルシフェラーゼによって媒介される反応のための反応混合物をさらに含んでいる、請求項13に記載の方法。
- 前記ルシフェラーゼでない酵素が、チトクロムP450酵素、フラビンモノオキシゲナーゼ、またはチトクロムP450 3A 酵素である、請求項13に記載の方法。
- 動物中のチトクロムP450の酵素活性に対する化合物の効果を決定するための方法であって、
該動物中のルミネッセンスを検出または決定して、該動物中のチトクロムP450の酵素活性を決定する工程を包含しており、
該動物はテスト化合物および請求項1に記載の化合物に曝露されたものである、方法。 - 前記化合物が、チトクロムP450酵素であり、かつビートルのルシフェラーゼのためのプロサブストレートである、請求項17に記載の方法。
- 前記動物が、バイオルミネッセンスの酵素の導入遺伝子を有するトランスジェニック動物である、請求項17に記載の方法。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022050233A1 (ja) * | 2020-09-03 | 2022-03-10 | 黒金化成株式会社 | 発光システム及びシトクロムp450の定量方法 |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006508339A (ja) * | 2002-09-20 | 2006-03-09 | プロメガ コーポレイション | シトクロムp450活性を測定するための発光を利用する方法およびプローブ |
WO2006130551A2 (en) | 2005-05-31 | 2006-12-07 | Promega Corporation | Luminogenic and fluorogenic compounds and methods to detect molecules or conditions |
EP2323996B1 (en) | 2008-08-18 | 2014-10-22 | Promega Corporation | Luminogenic compounds and methods to detect cytochrome p450 3a enzymes |
JP6495232B2 (ja) * | 2013-03-12 | 2019-04-03 | プロメガ コーポレイションPromega Corporation | 赤方偏移ルシフェリン及びその使用方法 |
JP6604938B2 (ja) | 2013-03-15 | 2019-11-13 | プロメガ コーポレイション | タンパク質を官能基または固体表面に共有結合的に係留するための基質 |
US9790537B2 (en) | 2014-01-29 | 2017-10-17 | Promega Corporation | Quinone-masked probes as labeling reagents for cell uptake measurements |
WO2016040788A1 (en) * | 2014-09-11 | 2016-03-17 | Promega Corporation | Luciferase sequences utilizing infrared-emitting substrates to produce enhanced luminescence |
AR117472A1 (es) | 2018-12-21 | 2021-08-11 | Celgene Corp | Inhibidores de tienopiridina de ripk2 |
CN111100089A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-05-05 | 四川大学华西医院 | 一种检测亚硫酸盐的生物发光探针及其制备方法和用途 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006508339A (ja) * | 2002-09-20 | 2006-03-09 | プロメガ コーポレイション | シトクロムp450活性を測定するための発光を利用する方法およびプローブ |
US20070015790A1 (en) * | 2005-05-31 | 2007-01-18 | Cali James J | Luminogenic and fluorogenic compounds and methods to detect molecules or conditions |
Family Cites Families (54)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2929115A1 (de) * | 1979-07-18 | 1981-02-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur herstellung von luciferin |
US4665022A (en) * | 1984-02-17 | 1987-05-12 | The Regents Of The University Of California | Bioluminescent assay reagent and method |
JPS6124741A (ja) * | 1984-07-12 | 1986-02-03 | 名取 通弘 | 関節型伸展トラスビ−ム |
DE3537877A1 (de) | 1985-10-24 | 1987-04-30 | Geiger Reinhard | Luciferin-derivate und immunoassays unter einsatz derartiger luciferin-derivate |
DE3700908A1 (de) * | 1987-01-14 | 1988-07-28 | Geiger Reinhard | Aminoluciferine, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung bei der bestimmung von enzymaktivitaeten |
AU609824B2 (en) * | 1987-06-15 | 1991-05-09 | Southern Cross Biotech Pty Ltd. | Production of proteins in active forms |
US5498523A (en) * | 1988-07-12 | 1996-03-12 | President And Fellows Of Harvard College | DNA sequencing with pyrophosphatase |
US5114704A (en) * | 1989-05-30 | 1992-05-19 | Nabisco Brands, Inc. | Raw hide having a coating containing an inorganic pyrophosphate |
CA2022236A1 (en) | 1989-07-31 | 1991-02-01 | Hiroaki Yanagisawa | Coumarin derivatives, their preparation and their use in the treatment of cerebrovascular disorders |
ES2089213T3 (es) * | 1990-05-16 | 1996-10-01 | Baylor College Medicine | Una linea celular permanente de hepatocitos humanos y su uso en un dispositivo de asistencia hepatica. |
US5283180A (en) * | 1990-07-19 | 1994-02-01 | Charm Sciences, Inc. | Bioluminescence method for the determination of pesticides |
US5374534A (en) * | 1990-07-19 | 1994-12-20 | Charm Sciences, Inc. | Method of preparing D-luciferin derivatives |
US5283179A (en) * | 1990-09-10 | 1994-02-01 | Promega Corporation | Luciferase assay method |
US5840739A (en) | 1992-11-16 | 1998-11-24 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Thiazoline acid derivatives |
AU5959994A (en) * | 1992-12-23 | 1994-07-19 | Iowa State University Research Foundation Inc. | Molecular flashlight |
US6676967B1 (en) * | 1993-09-20 | 2004-01-13 | Kos Pharmaceuticals, Inc. | Methods for reducing flushing in individuals being treated with nicotinic acid for hyperlipidemia |
US6649143B1 (en) * | 1994-07-01 | 2003-11-18 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Non-invasive localization of a light-emitting conjugate in a mammal |
US5650135A (en) * | 1994-07-01 | 1997-07-22 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Non-invasive localization of a light-emitting conjugate in a mammal |
JP3648763B2 (ja) | 1994-08-23 | 2005-05-18 | 日本油脂株式会社 | ウミホタルルシフェリン誘導体および糖加水分解酵素の定量方法 |
JPH08224096A (ja) * | 1995-02-20 | 1996-09-03 | Sapporo Breweries Ltd | 微生物検査用培地と該培地を用いた微生物検査方法 |
WO1996031206A2 (en) | 1995-04-07 | 1996-10-10 | Warner-Lambert Company | Flavones and coumarins as agents for the treatment of atherosclerosis |
US5744320A (en) * | 1995-06-07 | 1998-04-28 | Promega Corporation | Quenching reagents and assays for enzyme-mediated luminescence |
WO1997008342A1 (en) * | 1995-08-30 | 1997-03-06 | Gentest Corporation | Cytochrome p450 reporter gene |
US5902732A (en) * | 1995-10-04 | 1999-05-11 | Cytoscan Sciences Llc | Drug screening process measuring changes in cell volume |
US6291164B1 (en) * | 1996-11-22 | 2001-09-18 | Invitrogen Corporation | Methods for preventing inhibition of nucleic acid synthesis by pyrophosphate |
US5876946A (en) * | 1997-06-03 | 1999-03-02 | Pharmacopeia, Inc. | High-throughput assay |
US6302685B1 (en) * | 1997-09-16 | 2001-10-16 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Human lysosomal protein and methods of its use |
US6602677B1 (en) | 1997-09-19 | 2003-08-05 | Promega Corporation | Thermostable luciferases and methods of production |
ATE295899T1 (de) * | 1998-02-23 | 2005-06-15 | Phylonix Pharmaceuticals Inc | Screeningverfahren für die aktivität von agenzien unter verwendung von teleosten |
US6902918B1 (en) | 1998-05-21 | 2005-06-07 | California Institute Of Technology | Oxygenase enzymes and screening method |
US6312917B1 (en) | 1998-12-04 | 2001-11-06 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Method of screening candidate compounds for susceptibility to oxidative metabolism |
ES2199605T3 (es) | 1998-12-14 | 2004-02-16 | Vertex Pharmaceuticals (San Diego) Llc | Indicadores moleculares opticos de actividad del citocromo p450. |
US6143492A (en) * | 1998-12-14 | 2000-11-07 | Aurora Biosciences Corporation | Optical molecular sensors for cytochrome P450 activity |
US6514687B1 (en) * | 1998-12-14 | 2003-02-04 | Vertex Pharmaceuticals (San Diego), Llc | Optical molecular sensors for cytochrome P450 activity |
US6420130B1 (en) | 1998-12-14 | 2002-07-16 | Aurora Biosciences Corporation | Optical molecular sensors for cytochrome P450 activity |
JP2000270894A (ja) | 1999-03-23 | 2000-10-03 | Kikkoman Corp | D−ルシフェリン−O−β−D−グルクロニド誘導体、その製造方法、その誘導体を有効成分とするβ−グルクロニダーゼの活性測定方法、及び大腸菌の検出方法 |
JP3618572B2 (ja) * | 1999-03-24 | 2005-02-09 | キッコーマン株式会社 | D−システインの測定法 |
US7118878B1 (en) * | 2000-06-09 | 2006-10-10 | Promega Corporation | Method for increasing luminescence assay sensitivity |
JP2002080476A (ja) | 2000-08-31 | 2002-03-19 | Iatron Lab Inc | D−ルシフェリン類縁体並びにルシフェラーゼ活性分析用試薬及びatp分析用試薬 |
US6531297B2 (en) * | 2000-10-20 | 2003-03-11 | Applera Corporation | Isolated human drug-metabolizing proteins, nucleic acid molecules encoding human drug-metabolizing proteins, and uses thereof |
CA2448370A1 (en) * | 2001-06-01 | 2002-12-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Luciferin hydrazides |
US7268229B2 (en) | 2001-11-02 | 2007-09-11 | Promega Corporation | Compounds to co-localize luminophores with luminescent proteins |
FR2831889B1 (fr) * | 2001-11-08 | 2004-01-16 | Proteus | Procede pour generer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un echantillon, le traitement de ladite empreinte et les systemes pour leur mise en oeuvre |
WO2003066611A1 (en) | 2002-02-01 | 2003-08-14 | Promega Corporation | Bioluminescent protease assay |
WO2003075838A2 (en) * | 2002-03-05 | 2003-09-18 | M.C.W Research Foundation, Inc. | Methods and compositions for pharmacological and toxicological evaluation of test agents |
EP1537230A4 (en) * | 2002-09-09 | 2008-06-18 | Applera Corp | METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETERMINING FLUORESCENT ENZYMES |
EP1588143B1 (en) | 2002-12-23 | 2014-03-05 | Promega Corporation | Improved luciferase-based assays |
US20050153306A1 (en) * | 2003-07-14 | 2005-07-14 | Irm Llc | Fluorogenic enzyme substrates and uses thereof |
US6913545B2 (en) * | 2003-07-31 | 2005-07-05 | Karsten Manufacturing Corporation | Golf club head having a face insert with a visual outline |
RU2242471C1 (ru) | 2003-07-31 | 2004-12-20 | Азад Зияд Оглы Абышев | Производные 2-н-1-бензопиран-2-она, проявляющие антикальциевую активность |
WO2006026368A2 (en) * | 2004-08-25 | 2006-03-09 | The Trustees Of Collumbia University In The City Of New York | Development of fluorogenic substrates for monoamine oxidases (mao-a and mao-b) |
JP4899046B2 (ja) * | 2005-09-30 | 2012-03-21 | 国立大学法人 東京大学 | 新規ルシフェリン誘導体 |
US7652133B2 (en) * | 2006-10-19 | 2010-01-26 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Indole compound |
EP2323996B1 (en) | 2008-08-18 | 2014-10-22 | Promega Corporation | Luminogenic compounds and methods to detect cytochrome p450 3a enzymes |
-
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006508339A (ja) * | 2002-09-20 | 2006-03-09 | プロメガ コーポレイション | シトクロムp450活性を測定するための発光を利用する方法およびプローブ |
US20070015790A1 (en) * | 2005-05-31 | 2007-01-18 | Cali James J | Luminogenic and fluorogenic compounds and methods to detect molecules or conditions |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN5011009984; MISKA W: JOURNAL OF CLINICAL CHEMISTRY AND CLINICAL BIOCHEMISTRY V25 N1, 19870101, P23-30 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022050233A1 (ja) * | 2020-09-03 | 2022-03-10 | 黒金化成株式会社 | 発光システム及びシトクロムp450の定量方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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