JP2012200245A - 細胞外に金属化合物結合能を提示するレポーターベクター - Google Patents
細胞外に金属化合物結合能を提示するレポーターベクター Download PDFInfo
- Publication number
- JP2012200245A JP2012200245A JP2011070799A JP2011070799A JP2012200245A JP 2012200245 A JP2012200245 A JP 2012200245A JP 2011070799 A JP2011070799 A JP 2011070799A JP 2011070799 A JP2011070799 A JP 2011070799A JP 2012200245 A JP2012200245 A JP 2012200245A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- metal compound
- peptide
- base sequence
- cell
- metal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
- A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
- A61K49/10—Organic compounds
- A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
- A61K49/16—Antibodies; Immunoglobulins; Fragments thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
- A61K49/18—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes
- A61K49/1896—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes not provided for elsewhere, e.g. cells, viruses, ghosts, red blood cells, virus capsides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/84—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving inorganic compounds or pH
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Radiology & Medical Imaging (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
Abstract
【解決手段】 実施形態の細胞外に金属化合物結合能を提示するレポーターベクターは、特定の条件に応じてプロモーター活性を示す塩基配列と、細胞外に提示される金属化合物結合ペプチドをコードする塩基配列と、転写終結シグナルをコードする塩基配列を含む。細胞外に提示される金属化合物結合ペプチドをコードする塩基配列は、特定の条件に応じてプロモーター活性を示す塩基配列の下流に機能的に連結される。転写終結シグナルをコードする塩基配列は、細胞外に提示される金属化合物結合ペプチドをコードする塩基配列の下流に機能的に連結される。
【選択図】なし
Description
1つの実施形態に従う、レポーターベクターは、レポーター遺伝子として細胞外に提示される金属化合物結合ペプチドをコードする塩基配列を含む。この構成により、レポーターベクターは、プロモーター活性に応じて、金属化合物結合ペプチドをレポーターとして細胞外に提示する。その結果、細胞外に提示された金属化合物結合ペプチドに、金属化合物が特異的に結合および/または集積することが可能となる。これにより、細胞が標識される。このように標識された細胞は、結合するべき金属化合物の種類に依存して、選択された検出方法により検出できる。即ち、金属化合物の種類により、例えば、磁気共鳴装置(MRI)や陽電子放射断層撮影装置(PET)や単一光子放射断層撮影装置(SPECT)コンピュータ断層撮影装置(CT)などの画像診断装置により検出が可能となる。
例えば、細胞外に提示可能な金属化合物結合ペプチドは、このペプチドがコードされる遺伝子から転写および翻訳されること、細胞膜に輸送されること、および細胞膜に固定されることを含む過程を介して細胞外に提示されてよい。また、当該ペプチドは、遺伝子からの転写翻訳に加えて、更に任意の修飾を受けてもよい。
金属化合物結合ペプチドは、特定の金属化合物に対して特異的に結合するペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドおよび/またはタンパク質であればよい。便宜上、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を総称して「ペプチド」と呼ぶ。金属化合物結合ペプチドと、これと特異的に結合する金属化合物は、結合対と解されてよい。
細胞において産生されたペプチド、即ち、遺伝子の転写翻訳および任意に修飾されたペプチドは、細胞膜に輸送される。細胞膜への輸送は、例えば、シグナル・ペプチドを利用すればよい。シグナル・ペプチドの例としては、イムノグロブリンκ鎖のリーダー・ペプチド、プレプロアルブミンのリーダー・ペプチド、プレIgG軽鎖のリーダー・ペプチド、アセチルコリン受容体γサブユニット前駆体のリーダー・ペプチド、ポリヒスチジンやポリバリンをコードする塩基配列などが挙げられる。しかしながらシグナル・ペプチドは、これらに限定されるものではない。
上述のように、細胞外への金属化合物結合ペプチドの提示は、例えば、細胞において金属化合物結合ペプチドをコードする塩基配列に基づいて産生されたペプチドが細胞膜に輸送されて細胞膜に固定されることにより達成される。
1つの実施形態に従う、レポーターベクターは、特定の条件に応じてプロモーター活性を示す塩基配列を含む。この塩基配列は、その下流に機能的に結合されたレポーター遺伝子を条件に応じて発現させるように構成された塩基配列であればよい。
1つの実施形態に従う、レポーターベクターは、その上流に機能的に結合されたレポーター遺伝子について、条件に応じて開始された転写を終結するように構成された塩基配列を含む。
1つの実施形態に従うレポーターベクターは、特定の条件に応じてプロモーターが活性化することにより、レポーターペプチドを産生し、細胞外に金属化合物結合性を提示する。
更なるもう1つの実施形態に従うレポーター遺伝子の塩基配列の例を、配列番号10に示す。当該レポーター遺伝子は、イムノグロブリンκ鎖のリーダー・ペプチドをコードする塩基配列と、抗Gd−DTPA一本鎖抗体ペプチドをコードする塩基配列と、PDGFRのアンカー・ペプチドをコードする塩基配列を、機能的に連結して作製したGd−DTPA結合一本鎖抗体ペプチドである。
1つの実施形態に従うレポーターベクターは、意図される細胞に送達され、検出しようとする条件においてレポーター遺伝子を発現することが可能であればよい。従って、そのような構成が可能である限り、レポーター遺伝子構築物と解されてもよい。即ち、当該レポーター遺伝子構築物は、細胞に導入され、導入された細胞の状態または環境に依存して活性化される塩基配列のプロモーター活性によって発現が調節されたレポーター遺伝子を含み、条件に応じてレポーター遺伝子を発現し、その結果産生されたれレポーターペプチドが標識として細胞外に提示され、金属化合物結合能を示すように構成されればよい。
使用例1 検出方法
実施形態に従うレポーターベクターは、特定の状況にある細胞をインビトロおよびインビポにおいて検出するために使用することが可能である。
(1)細胞を含む検出対象に対して、特定の条件に応じてプロモーター活性を示す塩基配列と、細胞外に提示される金属化合物結合ペプチドをコードする塩基配列と、転写終結シグナルをコードする塩基配列とを上流から下流に向けてこの順番で含む細胞外に金属化合物結合能を提示するレポーターベクターを取り込ませることと、
(2)前記細胞外に金属化合物結合ペプチドを提示させることと、
(3)前記金属化合物結合ペプチドに対して、前記金属化合物結合ペプチドと結合対を形成可能な金属を接触させることと、
(4)前記金属化合物結合ペプチドに結合した金属を検出することと、
を含む特定の条件を有する細胞を検出する方法である。
上述した何れのレポーターベクターも、上記のような検出において使用される検出剤または検出用組成物として提供されてよい。
実施形態に従うレポーターベクターは、特定の状況にある細胞をインビトロおよびインビポにおいて検出するために使用することが可能である。
(1)細胞を含む検査対象に、特定の条件に応じてプロモーター活性を示す塩基配列と、細胞外に提示される金属化合物結合ペプチドをコードする塩基配列と、転写終結シグナルをコードする塩基配列とを上流から下流に向けてこの順番で含む細胞外に金属化合物結合能を提示するレポーターベクターを取り込ませることと、
(2)前記細胞外に金属化合物結合ペプチドを提示させることと、
(3)前記細胞に対して、前記金属化合物結合ペプチドと結合対を形成可能な金属化合物を接触させることと、
(4)前記金属化合物結合ペプチドに結合した金属化合物を検出することと、
(5)前記(4)における金属化合物の検出結果に基づいて検査対象が特定の条件の細胞を有すると診断すること、
を含む。
更なる実施形態に従うと検査対象における疾患の診断方法が提供される。この使用例は特に個体について疾患を診断するために有用である。
(1)検査対象に含まれる細胞内に、特定の条件に応じてプロモーター活性を示す塩基配列と、細胞外に提示される金属化合物結合ペプチドをコードする塩基配列と、転写終結シグナルをコードする塩基配列とを上流から下流に向けてこの順番で含む細胞外に金属化合物結合能を提示するレポーターベクターを取り込ませることと、
(2)前記細胞外に金属化合物結合ペプチドを提示させることと、
(3)前記細胞に対して、前記金属化合物結合ペプチドと結合対を形成可能な金属化合物を接触させることと、
(4)前記金属化合物結合ペプチドに結合した金属化合物を検出することと、
(5)前記(4)における金属化合物の検出結果に基づいて検査対象における前記疾患について診断すること、
を含む。
上述した何れのレポーターベクターも、上記のような診断において使用される診断剤または診断用組成物として提供されてよい。
実施形態に従うレポーターベクターは、上述において診断方法1および診断方法2を例として記載するような診断方法において利用することに加えて、治療方法としても使用することが可能である。
(1)検査対象に含まれる細胞内に、特定の条件に応じてプロモーター活性を示す塩基配列と、細胞外に提示される金属化合物結合ペプチドをコードする塩基配列と、転写終結シグナルをコードする塩基配列とを上流から下流に向けてこの順番で含む細胞外に金属化合物結合能を提示するレポーターベクターを取り込ませることと、
(2)前記細胞外に金属化合物結合ペプチドを提示させることと、
(3)前記細胞に対して、前記金属化合物結合ペプチドと結合対を形成可能な金属化合物を接触させることと、
(4)前記金属化合物結合ペプチドに結合した金属化合物にエネルギーを与えて、レポーターペプチドを発現した細胞を特異的に死滅することと、
を含む。
上述した何れのレポーターベクターも、上記のような治療において使用される治療剤または治療用組成物として提供されてよい。
抗Gd−DTPAモノクローナル抗体(抗Gd-DTPA mAb)の軽鎖可変領域(VL)と重鎖可変領域(VH)をリンカー・ペプチドで連結して抗Gd−DTPA一本鎖抗体(GdscFv)のアミノ酸配列をデザインした(配列番号1)。このアミノ酸配列をもとに、塩基配列をヒトのコドン使用頻度に最適化し、Gd−scFv遺伝子を化学合成した(配列番号2)。
細胞外のGd−DTPAを捕捉するため、Gd−scFvを融合蛋白質として細胞表面に提示されるように設計したベクターを作製した。pDisplay(Life Technologies)は、蛋白質を細胞膜に輸送するシグナル・ペプチド、及び細胞膜に輸送された蛋白質を膜に固定するためのアンカー・ペプチドが組込まれたベクターで、両ペプチド間に目的遺伝子を組込むことで、融合蛋白質として遺伝子産物を細胞膜に固定化して細胞表面に提示することができる。pDisplayには、この他に融合蛋白質の検出を容易にするヘマグルチン(HA)タグ配列とc−mycタグ配列が組込まれている。このpDisplayを、GdscFv遺伝子組込みベクター(pDis-GdscFv)の作製に用いた。1)に記載の方法で合成したGdscFv遺伝子を制限酵素(Bgl IIとSal I)で消化した後、同じく制限酵素(Bgl IIとSal I)で消化したpDisplayベクターに組み込み、pDis−GdscFvを作製した(図3)。pDis−GdscFvのGdscFv融合遺伝子の塩基配列を配列番号10に、同遺伝子がコードする融合蛋白質のアミノ酸配列を配列番号9に示した。
50μLのOpti−MEM培地に1.0μLのlipofectamine 2000を加えて室温に5分間静置した後、0.6μgのベクター(pDis-GdscFv or pDisplay)を含むOpti−MEM培地50μLと混合して室温に20分間静置した後、この溶液を一晩培養しておいたHuh−7細胞(24 wellプレートに8.0 x 104細胞/wellで播種)の培養液に加えて培養を続けた。48時間後、培地を取り除き、細胞をPBSで2回洗浄した後、セルスクレーパーを用いてプレート底面から細胞を剥がしてPBSに縣濁した。14,000rpm、5分間の遠心で細胞を回収して細胞溶解液(1 x SDS-PAGE buffer)を加え、沸騰水中に5分間インキュベートした後、8%SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動をおこなった。泳動終了後、ゲル中の蛋白質を、サブマリン型電気泳動装置を用いて、PVDF膜(Pore size: 0.44 μm, Millipore)に転写(ブロッティング)した。ブロックエース(Dainippon Sumitomo Pharma)でPVDF膜のブロッキングをおこなった後、一次抗体溶液(500倍希釈した一次抗体と10% ヤギ正常血清を含むPBS)に膜を浸し、穏やかに振とうしながら1時間、室温で反応させた。一次抗体は、GdscFv融合蛋白質内部のヘマグルチニン・タグ配列を認識するマウス抗HA抗体(Millipore)を使用した。1時間後、一次抗体溶液を取り除き、トリス緩衝食塩水(TBS)で膜を3回洗浄した。以降は、ABC kit(Alkaline Phosphatase Universal, VECTASTAIN)を用いて、一次抗体が結合した蛋白質を検出した。操作はキットのマニュアルに従った。PVDF膜は、Alkaline phosphataseの基質であるBCIP/NBT(KPL)で発色させた。図4に示したように、pDis-GdscFvを導入した細胞で、Gd-scFv融合蛋白質に由来するシグナルが検出された(矢印のバンド、分子量が約35 kDa)。
50μLのOpti−MEM培地に1.0μLのlipofectamine 2000を加えて室温に5分間静置した後、0.6μgのベクター(pDis-GdscFv or pDisplay)を含むOpti−MEM培地50μLと混合して室温に20分間静置した後、この溶液を一晩培養しておいたHuh−7細胞(8 wellチャンバースライドに4.0 x 104細胞/チャンバーで播種)の培養液に加えて培養を続けた。48時間後、培養液を除いて細胞をPBSで2回洗浄してから、4%のパラホルムアルデヒドを300μL加えて室温で20分間反応させた。PBSで細胞を3回洗浄した後、ブロッキング液(5% ヤギ正常血清を含むPBS )を500μL加えて室温に静置した。1時間後、ブロッキング液を取り除き、一次抗体溶液(250倍希釈した一次抗体と5% ヤギ正常血清を含むPBS)を加えた。一次抗体は、GdscFv融合蛋白質内部のc−mycタグ配列を認識するマウス抗c−myc抗体(Sigma)を使用した。4℃に1晩静置した後、一次抗体溶液を取り除き、PBSで3回洗浄してから、二次抗体溶液(1000倍希釈した蛍光標識(Alexa 555標識)ヤギ抗マウス・モノクローナル抗体, Life Technologies)と室温で反応させた。1時間後、二次抗体溶液を取り除き、PBSで2回洗浄した後、DAPI溶液(1 μg/ml)で核染色をおこなった。PBSで2回洗浄後、チャンバーを取り外して、封入剤AntiFade(Life Technologies)を1滴垂らした。封入剤の上にカバーグラスを載せ、その4辺をマニキュアで固定してから、蛍光装置付き倒立顕微鏡による観察をおこなった。図5に示したように、pDis−GdscFvを導入した細胞において、Gd−scFv融合蛋白質に由来する蛍光が検出された(図5)。
上記3)に記載の方法でpDis−GdscFvを導入したHuh−7細胞(Gd-scFv細胞)と、ベクターを導入していないこと以外、前記細胞と同じ処理をおこなったHuh−7細胞(Mock細胞)を準備した。48時間後、培地を除いて細胞をPBSで洗浄してから、8% ヤギ正常血清を含むPBSを加え、室温で30分間ブロッキングした。30分後、溶液を取り除いて西洋ワサビ過酸化酵素(HRP)で標識したガドペンテト酸(Gd-DTPA, BioPAL)と蛍光色素(DyLight 488)で標識したウサギ抗HRP抗体(蛍光標識抗体)(SEIKAGAKU BIOBUSSINESS)の混合溶液、或いは蛍光標識抗体のみを細胞に加え、室温で1時間反応させた。HRP-Gd-DTPAとDyLight 488標識HRP抗体は、前もって、5% ヤギ正常血清を含むPBS中で室温に30分間インキュベートして複合体を形成させてから加えた。1時間後、細胞をPBSで2回洗浄し、上記4)の核染色後と同様の方法により、蛍光観察用のサンプルを作製して正立型落射蛍光顕微鏡による観察をおこなった。図6に示したように、pDis−GdscFvを導入した細胞において、Gd−DTPA/蛍光標識抗体に由来する蛍光が検出された(図6)。
上記3)に記載の方法でpDis−GdscFvを導入したHuh−7細胞(Gd-scFv細胞)を0.25% トリプシン処理により回収した。この際、ベクターを導入していないこと以外、前記細胞と同じ処理をおこなったHuh−7細胞(Mock細胞)を準備した。回収したGd−scFv細胞、及びMock細胞をそれぞれ2つに分割した後、一方に10μg/mLのGd−DTPAを含む培地を、もう一方にはGd−DTPAを含まない培地を500μL加えた合計4サンプルを調整し(Gd-scFv細胞/Gd+, Gd-scFv細胞/Gd-, Mock細胞/Gd+, Mock細胞/Gd-)、穏やかに振盪しながら37℃にインキュベートした。2時間後、1,000rpm、3分間の遠心で細胞を回収し、1mLのPBSで細胞を洗浄した。予め40℃に温めておいた350μLのPBSに細胞を縣濁し、同じく40℃に温めておいた350μLの2.0%アガロースに加えてすばやく混ぜ合わせた。この溶液を24wellプレートのwellに注いで固化させて、マイクロMRI撮像用サンプルを調整した。このサンプルのT1強調画像を、オックスフォード社製のマイクロMRI(4.7T)で撮像した。図7に、マイクロMRIで撮像した結果を示した。Gd−scFv細胞/Gd+では、Gd−DTPAの造影効果(水分子のT1緩和時間短縮)により、MR画像のコントラストが増強された。
12.細胞外に提示される金属化合物結合ペプチドをコードする塩基配列
13.特定の条件に応じてプロモーター活性を示す塩基配列13
14.転写終結シグナルをコードする塩基配列
21.細胞
22.細胞膜
23.金属化合物結合ペプチド
24.金属化合物
Claims (19)
- 特定の条件に応じてプロモーター活性を示す塩基配列と、細胞外に提示される金属化合物結合ペプチドをコードする塩基配列と、転写終結シグナルをコードする塩基配列とを上流から下流に向けてこの順番で含む細胞外に金属化合物結合能を提示するレポーターベクター。
- 前記細胞外に提示される金属化合物結合ペプチドをコードする塩基配列が、
(a)金属化合物結合ペプチドをコードする塩基配列と、
(b)前記金属化合物結合ペプチドを細胞膜に輸送するシグナル・ペプチドをコードする塩基配列と、
(c)前記シグナル・ペプチドによって前記細胞膜に輸送された前記金属化合物結合ペプチドを前記細胞膜に固定化するアンカー・ペプチドをコードする塩基配列と
を上流から下流に向けてこの順番で含む請求項1に記載のレポーターベクター。 - 前記(a)における金属化合物結合ペプチドが、特定の金属化合物に対するモノクローナル抗体に由来する重鎖可変領域断片と、前記モノクローナル抗体に由来する軽鎖可変領域断片と、前記重鎖可変領域断片と前記軽鎖可変領域断片との間に存在するリンカー・ペプチドとを含み、且つ前記重鎖可変領域断片と前記軽鎖可変領域断片とにより免疫学的に前記特定の金属化合物と特異的に結合する一本鎖抗体ペプチドである請求項2に記載のレポーターベクター。
- 前記(a)における金属化合物結合ペプチドが、常磁性金属含有物と特異的に結合するペプチドである請求項2または3に記載のレポーターベクター。
- 前記(a)における金属化合物結合ペプチドが、常磁性金属、常磁性金属イオン、常磁性金属錯体または磁性金属錯体塩と特異的に結合するペプチドである請求項2または3に記載のレポーターベクター。
- 前記(a)における金属化合物結合ペプチドが、ガドリニウム化合物、テルビウム化合物、鉄化合物、マンガン化合物、銅化合物またはクロム化合物と特異的に結合するペプチドである請求項2または3に記載のレポーターベクター。
- 前記(a)における金属化合物結合ペプチドが、ガドリニウム、ガドリニウムイオン、ガドリニウム錯体、ガドリニウム錯体塩、テルビウム、テルビウムイオン、テルビウム錯体、テルビウム錯体塩、鉄、鉄錯体、鉄錯体塩、マンガン、マンガンイオン、マンガン錯体、マンガン錯体塩、銅、銅イオン、銅錯体、銅錯体塩、クロム、クロムイオン、クロム錯体、クロム錯体塩、それらの金属原子を含む酸化金属、酸化金属塩、水酸化金属および金属炭酸塩、並びにそれらの水和物からなる群より選択される金属化合物と特異的に結合するペプチドである請求項2または3に記載のレポーターベクター。
- 前記(a)における金属化合物結合ペプチドが、ガドペンテト酸と特異的に結合するペプチドである請求項2または3に記載のレポーター・ベクター。
- 更に、前記(a)における金属化合物結合ペプチドをコードする塩基配列が、ガドペンテト酸と特異的に結合する一本鎖抗体ペプチドをコードする塩基配列である請求項8に記載のレポーターベクター。
- 前記一本鎖抗体ペプチドをコードする塩基配列が、配列番号1に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列である請求項9に記載のレポーターベクター。
- 前記一本鎖抗体ペプチドをコードする塩基配列が、配列番号2に記載の塩基配列である請求項9に記載のレポーターベクター。
- 更に、前記(b)におけるリーダー・ペプチドをコードする塩基配列が、イムノグロブリンκ鎖のリーダー・ペプチドをコードする塩基配列である請求項2〜11の何れか1項に記載に記載のレポーターベクター。
- 更に、前記(c)におけるアンカー・ペプチドをコードする塩基配列が、血小板由来成長因子受容体を細胞膜に固定するアンカー・ペプチドをコードする塩基配列である請求項2〜12の何れか1項に記載のレポーターベクター。
- インビトロにおいて、特定の条件を有する細胞を検出する方法であって、
(1)細胞を含む検出対象に対して、請求項1〜13の何れか1項に記載のレポーターベクターを取り込ませることと、
(2)前記細胞外に金属化合物結合ペプチドを提示させることと、
(3)前記金属化合物結合ペプチドに対して、前記金属化合物結合ペプチドと結合対を形成可能な金属を接触させることと、
(4)前記金属化合物結合ペプチドに結合した金属を検出することと、
を含む方法。 - 請求項1〜13の何れか1項に記載のレポーターベクターを有効成分として含む特定の条件を有する細胞のための検出剤。
- 請求項1〜13の何れか1項に記載のレポーターベクターを有効成分として含む、前記特定の条件を指標とする疾患のための診断剤。
- 請求項1〜13の何れか1項に記載のレポーターベクターを有効成分として含む、前記特定の条件を指標とする疾患のための造影剤。
- 請求項1〜13の何れか1項に記載のレポーターベクターを有効成分として含む、前記特定の条件に関連する疾患を治療するための治療剤。
- 前記疾患が癌または骨代謝異常である請求項15〜18の何れか1項に記載の薬剤。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2011070799A JP5703086B2 (ja) | 2011-03-28 | 2011-03-28 | 細胞外に金属化合物結合能を提示するレポーターベクター |
US13/429,926 US9442104B2 (en) | 2011-03-28 | 2012-03-26 | Reporter vector presenting extracellular binding capacity to metallic compounds |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2011070799A JP5703086B2 (ja) | 2011-03-28 | 2011-03-28 | 細胞外に金属化合物結合能を提示するレポーターベクター |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2012200245A true JP2012200245A (ja) | 2012-10-22 |
JP5703086B2 JP5703086B2 (ja) | 2015-04-15 |
Family
ID=47175186
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011070799A Active JP5703086B2 (ja) | 2011-03-28 | 2011-03-28 | 細胞外に金属化合物結合能を提示するレポーターベクター |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9442104B2 (ja) |
JP (1) | JP5703086B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014185549A1 (ja) | 2013-05-17 | 2014-11-20 | 株式会社 東芝 | 細胞のエピジェネティックな情報を得る方法、細胞の特性を判定する方法、薬剤感受性を判断するまたは薬剤若しくは免疫療法剤の種類を選択する方法、疾患の診断方法、並びに自己複製ベクター、アッセイキットおよび分析装置 |
EP3196308A1 (en) | 2016-01-19 | 2017-07-26 | Toshiba Medical Systems Corporation | Reporter vector for evaluating characteristics of subject cell, assay kit, procedure and device |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2958488B1 (en) * | 2013-02-22 | 2017-08-02 | Koninklijke Philips N.V. | Hyperthermia for diagnostic imaging |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007135958A1 (ja) * | 2006-05-18 | 2007-11-29 | National University Corporation NARA Institute of Science and Technology | グラム陰性細菌の細胞表層発現システム |
-
2011
- 2011-03-28 JP JP2011070799A patent/JP5703086B2/ja active Active
-
2012
- 2012-03-26 US US13/429,926 patent/US9442104B2/en active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007135958A1 (ja) * | 2006-05-18 | 2007-11-29 | National University Corporation NARA Institute of Science and Technology | グラム陰性細菌の細胞表層発現システム |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JPN6013037177; NMR Biomed. Vol.20, No.3, 200705, p.275-290 * |
JPN6015001919; J Biol Chem. Vol.271, No.44, 19961101, p.27677-27685 * |
JPN6015001922; Analytica Chimica Acta Vol.444, No.1, 20011012, p.3-11 * |
JPN6015001924; J Inorg Biochem. Vol.69, No.3, 19980215, p.159-163 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014185549A1 (ja) | 2013-05-17 | 2014-11-20 | 株式会社 東芝 | 細胞のエピジェネティックな情報を得る方法、細胞の特性を判定する方法、薬剤感受性を判断するまたは薬剤若しくは免疫療法剤の種類を選択する方法、疾患の診断方法、並びに自己複製ベクター、アッセイキットおよび分析装置 |
EP3196308A1 (en) | 2016-01-19 | 2017-07-26 | Toshiba Medical Systems Corporation | Reporter vector for evaluating characteristics of subject cell, assay kit, procedure and device |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US9442104B2 (en) | 2016-09-13 |
US20120295274A1 (en) | 2012-11-22 |
JP5703086B2 (ja) | 2015-04-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Li et al. | Molecular imaging of atherosclerotic plaques targeted to oxidized LDL receptor LOX-1 by SPECT/CT and magnetic resonance | |
Shigemoto et al. | Induction of myasthenia by immunization against muscle-specific kinase | |
TWI450727B (zh) | 抗人類輸鐵蛋白受體的單域抗體與其應用 | |
JP5836940B2 (ja) | ソリシジン由来ペプチドならびにtrpv−6がんの検出および薬剤送達のための方法 | |
Foray et al. | Imaging temozolomide-induced changes in the myeloid glioma microenvironment | |
WO2022227617A1 (zh) | Crmp2及抗crmp2抗体的应用 | |
JP5703086B2 (ja) | 細胞外に金属化合物結合能を提示するレポーターベクター | |
CN103491983B (zh) | 与心血管成像相关的材料及方法 | |
JP6810609B2 (ja) | Ehd2抗体とその乳がん免疫組織化学的検出試薬の製造への応用 | |
CN102241772B (zh) | 抗体与诊断试剂盒 | |
EP2757376A1 (en) | Molecular marker for early indentification of pleural mesothelioma patients, and expression analysis method for same | |
CN107271692B (zh) | 一种标记特异性高亲和力重组抗体的荧光微球及其应用 | |
US20220211856A1 (en) | A Polypeptide EXP and its Drug Delivery System as well as Extracellular Vesicle Extraction | |
JPH10512158A (ja) | 膀胱の核マトリックスタンパク質ならびに細胞増殖性疾患の検出及び治療におけるその使用 | |
TW201111510A (en) | Recombinant nucleotide sequence, cell or vector containing the recombinant nucleotide sequence, recombinant single chain anti-polyethylene glycol membrane antibody encoded thereof and method for using the cell containing the recombinant nucleotide sequen | |
RU2395229C1 (ru) | Способ экспресс-диагностики гиперпаратиреоза | |
CN1997669A (zh) | 抗胃泌素激素单克隆抗体 | |
CN110325547A (zh) | 新淀粉样蛋白β寡聚体特异性结合分子 | |
CN104945496A (zh) | 一种多肽及其在制备与纯化对ehd2特异的抗体中的应用 | |
CN104945506A (zh) | 一种用于乳腺癌诊断和预后判断的免疫组化试剂 | |
WO2020077532A1 (zh) | 一种基于胎盘样硫酸软骨素a的癌症筛查和早期诊断的试剂方法 | |
Monieri et al. | A stapled chromogranin A-derived peptide homes in on tumors that express αvβ6 or αvβ8 integrins | |
CN104330566A (zh) | 梅毒试纸条及其制备方法、梅毒检测卡及其制备方法 | |
JP3779294B2 (ja) | 癌およびリウマチの診断剤、並びに検査・診断方法 | |
JP5087767B2 (ja) | βカゼインによって認識される複合体とその癌診断への応用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130730 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20130731 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130930 |
|
RD07 | Notification of extinguishment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7427 Effective date: 20140319 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140507 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140703 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150127 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150223 |
|
R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 5703086 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |