JP2012196207A - 生体試料中のl−トリプトファン分析方法およびそれに用いるキット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】検体とL-トリプトファンオキシダーゼと水を混合する工程、得られた反応液を酸素の存在下に所定時間放置する工程、放置後の反応液中に存在する前記酵素の作用による反応生成物を計測する工程を含む、L-トリプトファンの定量方法。前記L-トリプトファンオキシダーゼは、所定アミノ酸配列を有し、かつ酸素及び水の存在下、L-トリプトファンに作用して過酸化水素とアンモニアを生成するオキシダーゼ活性を有し、L-フェニルアラニンに対するオキシダーゼ活性はL-トリプトファンに対するオキシダーゼ活性の0〜3%の範囲であり、L-トリプトファン及びL-フェニルアラニン以外のタンパク質構成アミノ酸に対してはオキシダーゼ活性を有さない。上記L-トリプトファンオキシダーゼを含むL-トリプトファンの定量用キット。上記L-トリプトファンオキシダーゼを用いる酵素センサー。
【選択図】なし
Description
[1]
検体とL-トリプトファンオキシダーゼと水を混合する工程(A)、
前記混合により得られた反応液を酸素の存在下に所定時間放置する工程(B)、
放置後の反応液中に存在する前記酵素の作用による反応生成物の少なくとも一種の存在を確認するか、または前記反応生成物の少なくとも一種の量を計測する工程(C)
を含む、前記検体中のL-トリプトファンの分析方法であって、
前記L-トリプトファンオキシダーゼが、
(a1)下記(1)〜(3)の何れかのアミノ酸配列を有し、かつ(a2)酸素及び水の存在下、L-トリプトファンに作用して過酸化水素とアンモニアを生成するオキシダーゼ活性を有し、L-フェニルアラニンに対するオキシダーゼ活性はL-トリプトファンに対するオキシダーゼ活性の0〜3%の範囲であり、L-トリプトファン及びL-フェニルアラニン以外のタンパク質構成アミノ酸に対してはオキシダーゼ活性を有さない、前記方法。
(1)配列表の配列番号1または2に記載のアミノ酸配列;
(2)配列表の配列番号1または2に記載のアミノ酸配列において1から50個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列;又は
(3)配列表の配列番号1または2に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列
[2]
前記L-トリプトファンオキシダーゼの(a1)におけるL-フェニルアラニンに対するオキシダーゼ活性はL-トリプトファンに対するオキシダーゼ活性の0〜1%の範囲である、[1]に記載の方法。
[3]
工程(A)において検体との混合に用いられる前記L-トリプトファンオキシダーゼは、前記酵素の安定化剤の存在下で保存されているものである、[1]または[2]に記載の方法。
[4]
前記安定化剤が、グリセロール、スクロース、ソルビトール及びトレハロースから成る群から選ばれる少なくとも1種である、[3]に記載の方法。
[5]
前記工程(C)で確認または計測する反応生成物が過酸化水素である[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[6]
以下の試薬を含むL-トリプトファンの定量用キット。
(K1)L-トリプトファンオキシダーゼ
但し、前記L-トリプトファンオキシダーゼは、(a1)下記(1)〜(3)の何れかのアミノ酸配列を有し、かつ(a2)酸素及び水の存在下、L-トリプトファンに作用して過酸化水素とアンモニアを生成するオキシダーゼ活性を有し、L-フェニルアラニンに対するオキシダーゼ活性はL-トリプトファンに対するオキシダーゼ活性の0〜3%の範囲であり、L-トリプトファン及びL-フェニルアラニン以外のタンパク質構成アミノ酸に対してはオキシダーゼ活性を有さない、
(1)配列表の配列番号1または2に記載のアミノ酸配列;
(2)配列表の配列番号1または2に記載のアミノ酸配列において1から50個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列;又は
(3)配列表の配列番号1または2に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列
[7]
前記(K1)L-トリプトファンオキシダーゼの(a1)におけるL-フェニルアラニンに対するオキシダーゼ活性はL-トリプトファンに対するオキシダーゼ活性の0〜1%の範囲である、[6]に記載のキット。
[8]
前記(K1)L-トリプトファンオキシダーゼは、前記酵素の安定化剤との混合物である、[6]または[7]に記載のキット。
[9]
前記安定化剤が、グリセロール、スクロース、ソルビトール及びトレハロースから成る群から選ばれる少なくとも1種である、[8]に記載のキット。
[10]
(K2)反応用緩衝液、(K3)過酸化水素検出用試薬、(K4)アンモニア検出薬および(K5)インドールピルビン酸検出薬の少なくとも一つをさらに含む、[6]〜[9]のいずれかに記載のキット。
[11]
L-トリプトファンオキシダーゼを含むL-トリプトファンの分析用組成物であって、
前記L-トリプトファンオキシダーゼは、(a1)下記(1)〜(3)の何れかのアミノ酸配列を有し、かつ(a2)酸素及び水の存在下、L-トリプトファンに作用して過酸化水素とアンモニアを生成するオキシダーゼ活性を有し、L-フェニルアラニンに対するオキシダーゼ活性はL-トリプトファンに対するオキシダーゼ活性の0〜3%の範囲であり、L-トリプトファン及びL-フェニルアラニン以外のタンパク質構成アミノ酸に対してはオキシダーゼ活性を有さない、前記組成物。
(1)配列表の配列番号1または2に記載のアミノ酸配列;
(2)配列表の配列番号1または2に記載のアミノ酸配列において1から50個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列;又は
(3)配列表の配列番号1または2に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列
[12]
前記L-トリプトファンオキシダーゼの(a1)におけるL-フェニルアラニンに対するオキシダーゼ活性はL-トリプトファンに対するオキシダーゼ活性の0〜1%の範囲である、[11]に記載の組成物。
[13]
前記酵素の安定化剤を含有する、[11]または[12]に記載の組成物。
[14]
前記安定化剤が、グリセロール、スクロース、ソルビトール及びトレハロースから成る群から選ばれる少なくとも1種である、[13]に記載の組成物。
[15]
L-トリプトファンオキシダーゼを用いるL-トリプトファンの検出または定量用酵素センサーであって、
前記検出用電極は過酸化水素検出用電極であり、かつ
前記L-トリプトファンオキシダーゼは、(a1)下記(1)〜(3)の何れかのアミノ酸配列を有し、かつ(a2)酸素及び水の存在下、L-トリプトファンに作用して過酸化水素とアンモニアを生成するオキシダーゼ活性を有し、L-フェニルアラニンに対するオキシダーゼ活性はL-トリプトファンに対するオキシダーゼ活性の0〜3%の範囲であり、L-トリプトファン及びL-フェニルアラニン以外のタンパク質構成アミノ酸に対してはオキシダーゼ活性を有さない、前記センサー。
(1)配列表の配列番号1または2に記載のアミノ酸配列;
(2)配列表の配列番号1または2に記載のアミノ酸配列において1から50個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列;又は
(3)配列表の配列番号1または2に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列
[16]
前記L-トリプトファンオキシダーゼの(a1)におけるL-フェニルアラニンに対するオキシダーゼ活性はL-トリプトファンに対するオキシダーゼ活性の0〜1%の範囲である、[15]に記載の酵素センサー。
[17]
前記L-トリプトファンオキシダーゼは、前記酵素の安定化剤と共に用いられる、[15]または[16]に記載の酵素センサー。
[18]
前記安定化剤が、グリセロール、スクロース、ソルビトール及びトレハロースから成る群から選ばれる少なくとも1種である、[17]に記載の酵素センサー。
[19]
過酸化水素検出用電極は、酵素式過酸化水素電極または隔膜式過酸化水素電極である[15]〜[18]のいずれかに記載の酵素センサー。
本発明のL-トリプトファンの分析方法は、
検体とL-トリプトファンオキシダーゼと水を混合する工程(A)、
前記混合により得られた反応液を酸素の存在下に所定時間放置する工程(B)、
放置後の反応液中に存在する前記酵素の作用による反応生成物の少なくとも一種の存在を確認するか、または前記反応生成物の少なくとも一種の量を計測する工程(C)
を含み、これらの工程を経ることで、検体中のL-トリプトファンの存在を確認するか、またはを定量する方法である。
(a1)下記(1)〜(3)の何れかのアミノ酸配列を有し、かつ(a2)酸素及び水の存在下、L-トリプトファンに作用して過酸化水素とアンモニアを生成するオキシダーゼ活性を有し、L-フェニルアラニンに対するオキシダーゼ活性はL-トリプトファンに対するオキシダーゼ活性の0〜3%の範囲であり、L-トリプトファン及びL-フェニルアラニン以外のタンパク質構成アミノ酸に対してはオキシダーゼ活性を有さない酵素である。
(1)配列表の配列番号1または2に記載のアミノ酸配列;
(2)配列表の配列番号1または2に記載のアミノ酸配列において1から50個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列;又は
(3)配列表の配列番号1または2に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるSf9、Sf21〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるHiFive(インビトロジェン社製)等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
工程(A)におけるL-トリプトファンオキシダーゼの混合量は、10 mU/ml(トリプトファン1 μmolを1分間で消費する活性を1 Uとする)以上とすることが適当であり、水の混合量は、サンプル中のTrp濃度または反応系中の全質量に応じて適宜決定できるが、例えば、反応系中の全質量の5〜95%の範囲とすることができ、モル比としては、1モルのTrpに対して、例えば、1モル以上の水が存在すればよい。酵素反応を水溶液中で行う場合には過剰量の水が反応系中に存在することになる。L-トリプトファンオキシダーゼの混合量の上限は特にないが、実用的には、例えば、100 mU/ml以下であることができる。しかし、L-トリプトファンオキシダーゼの混合量および水の混合量は、この範囲に限定する意図ではなく、適宜調整できる。
工程(B)では、前記混合により得られた反応液を酸素の存在下に所定時間放置する。
L-トリプトファンオキシダーゼによるL-トリプトファン酸化反応においては、反応式Aに示すように、L-トリプトファン脱アミノ化生成物であるインドール-3-ピルビン酸と共に、アンモニア(NH3)と過酸化水素(H2O2)が生成物として得られる。上記反応を、例えば、空気と接触する状態で実施することで、反応液中の溶存酸素として上記酸素は供給される。反応液中酸素を供給する目的で反応液に空気などの酸素含有気体を強制的に供給する必要は通常はない。酵素反応に必要とされる酸素量が微量であり、溶存酸素により十分に賄えるためである。酵素のための放置時間は、例えば、使用する酵素量にもよるが、例えば、10分〜1時間の範囲とすることができる。しかし、この範囲に限定する意図ではなく、適宜調整できる。
工程(C)では、放置後の反応液中に存在する前記酵素の作用による反応生成物の少なくとも一種の存在を確認するか、または反応生成物の少なくとも一種の量を計測する。
存在確認または定量に用いられる生成物が過酸化水素である場合、例えばペルオキシダーゼ反応を用いて測定する方法等の公知の方法により、過酸化水素の存在確認または定量可能である。ペルオキシダーゼ反応を用いて測定する場合、使用可能なペルオキシダーゼは過酸化水素の存在確認または定量に利用可能な酵素であればよく、例えば西洋わさび由来ペルオキシダーゼが挙げられる。また、使用するペルオキシダーゼの基質となり得るものであれば発色剤として使用可能であり、西洋わさび由来ペルオキシダーゼを用いる場合には4-アミノアンチピリン:フェノールなどが挙げられる。西洋わさび由来ペルオキシダーゼを用いる過酸化水素の存在確認または定量のための反応は以下に示す通りである。
本発明は、以下の試薬を含むL-トリプトファンの分析用キットを包含する。
(K1)L-トリプトファンオキシダーゼ
上記L-トリプトファンオキシダーゼは、前記L-トリプトファンの定量方法で説明したL-トリプトファンオキシダーゼと同様のものである。L-トリプトファンの分析には、L-トリプトファンの存在確認および定量を含む。
本発明は、L-トリプトファンオキシダーゼを含むL-トリプトファンの分析用組成物も包含する。この組成物に含まれるL-トリプトファンオキシダーゼは、前記L-トリプトファンの定量方法で説明したL-トリプトファンオキシダーゼと同様のものである。L-トリプトファンの分析には、L-トリプトファンの存在確認および定量を含む。本発明の分析用組成物は、前記L-トリプトファンに加えて、例えば、前記酵素の安定化剤、緩衝液または緩衝剤などを含有することができる。
本発明は、L-トリプトファンオキシダーゼを用いたL-トリプトファンの検出または定量用酵素センサーを包含する。この酵素センサーに用いるL-トリプトファンオキシダーゼは、前記L-トリプトファンの定量方法で説明したL-トリプトファンオキシダーゼと同様のものである。
クロモバクテリウム・ビオラセウム(Chromobacterium violaceum)NBRC 12614ゲノムDNAを調製し、これを鋳型として塩基配列データベース上の各菌の配列(AF172851.1)を元に設計した配列番号5および6のプライマーを用いてPCRを行い、L-トリプトファンオキシダーゼ遺伝子vioAを増幅した。増幅産物をpET-28aに挿入し、vioA発現用プラスミドとした。また、ストレプトマイセス・エスピー(Streptomyces sp.)TA-A0724のゲノム断片を含むコスミドpTYMCsta(非特許文献D)をStuI処理した断片を、HincIIで処理したベクターpTYM19(非特許文献K)に挿入し、L-トリプトファンオキシダーゼ遺伝子staOをサブクローニングした。Stratagene社製QuikChange site-directed mutagenesis kitと配列番号7〜10のプライマーを用い、上記サブクローニングプラスミドの配列を改変した。このプラスミドからNdeIおよびHindIII処理によりstaO遺伝子を切り出し、同制限酵素で処理したpET-26bに挿入し、staO発現用プラスミドとした。なお、各酵素のN末またはC末にHis-tagが付加されるようにプライマー設計を行った。各発現用プラスミドで大腸菌BL21 (DE3)株を形質転換し、VioAもしくはStaO異種発現株とした。プライマーの塩基配列は以下の通りである。
VioA-F: ATTCTAGACATATGAAGCATTCTTCCGATATCTG(配列番号5)
VioA-R: AATAAGCTTCGCGGCGATGCGCTG(配列番号6)
StaO-N-sense: TACTGGAGGAAACATATGACGGCACCC(配列番号7)
StaO-N-anti: CAAGGGTGCCGTCATATGTTTCCTCCA(配列番号8)
StaO-C-sense: GACCGGTCGGCGAAGCTTTCTTCGACCTG(配列番号9)
StaO-C-anti: GCAGGTCGAAGAAAGCTTCGCCGACCGGT(配列番号10)
20 mM トリス−塩酸バッファー (pH 8.0)、5 mM L-トリプトファン、1 mMフェノール、1 mM 4-アミノアンチピリン、15 U/ml西洋わさび由来ペルオキシダーゼ、および任意の量のL-トリプトファンオキシダーゼ酵素液を含む反応液を調製し、30℃での505 nmの吸光度変化を測定する。キノンイミン色素のモル吸光係数は6.4 mM-1・cm-1とする。1分間に1 μmolの過酸化水素を生成する活性を1 Uと定義する。本法の検出限界は0.5%である。
リン酸カリウムバッファー (pH 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5)およびトリス−塩酸バッファー (pH 8.0, 8.5, 9.0)をバッファーとして用い、各バッファー使用時のStaOの活性測定を行った。20 mMの上記のうちいずれかのバッファー、5 mM L-トリプトファン、1 mMフェノール、1 mM 4-アミノアンチピリン、15 U/ml西洋わさび由来ペルオキシダーゼ、およびStaO酵素液を含む反応液を調製し、30℃での505 nmの吸光度変化を測定した。その結果、StaOの酵素活性はpH8.0-9.0で最大になることが示された。尚、VioAの至適pHは非特許文献Cに9.25であることが報告されている。
20 mM トリス−塩酸バッファー (pH 8.0)、1 mMフェノール、1 mM 4-アミノアンチピリン、15 U/ml西洋わさび由来ペルオキシダーゼ、0.2〜20 mU/ml L-トリプトファンオキシダーゼと0.5 mMのアミノ酸(20種類のタンパク構成アミノ酸のうちいずれか1種)を含む反応液を調製し、30℃での505 nmの吸光度変化を測定した。得られた測定値から各アミノ酸との相対活性を算出し、表1のような結果となった。本法の検出限界は0.5%である。
20 mM トリス−塩酸バッファー (pH 8.0)、1 mMフェノール、1 mM 4-アミノアンチピリン、15 U/ml西洋わさび由来ペルオキシダーゼ、0.5 mU/ml L-トリプトファンオキシダーゼと、0, 6.3, 13, 25, 50, 100, 500μMのL-トリプトファンを含む反応液を調製し、30℃での505 nmの吸光度変化を測定した。
40 mM トリス−塩酸バッファー (pH 8.0)、2 mMフェノール、2 mM 4-アミノアンチピリン、30 U/ml西洋わさび由来ペルオキシダーゼ、20 mU/ml L-トリプトファンオキシダーゼ酵素液を含む反応液を調製した。これと等量の0, 20, 40, 60, 80, 100μMのL-トリプトファン水溶液を標準試料として混合した。30℃で反応を進行させ、30℃での505 nmの吸光度の経時的変化を測定し、反応の進行をモニタリングした。
7−1.ヒト血漿試料の前処理
ヒト血漿試料はコージンバイオより購入し、−20℃で保管していた3検体を用いた。それぞれ使用直前に解凍し、そのまま、もしくはMicrocon YM-10で限外濾過による除タンパク処理後に、下記のL-トリプトファン定量に供した。
酵素法による定量の比較対象として、超高速アミノ酸分析システムを用いたプレカラム誘導体化法による定量を行った。前述のようにヒト血漿試料を除タンパク質処理したものを超高速アミノ酸分析システムWaters UPLC Amino Acid Analysis Solution systemに供した。サンプルの誘導体化、分析操作などは上記システムの説明書の手順に従った。0, 20, 40, 60, 80, 100μMのL-トリプトファン水溶液を標準試料として検量線を作製し、血漿試料中L-トリプトファンの定量を行った。
40 mM トリス−塩酸バッファー (pH 8.0)、2 mMフェノール、2 mM 4-アミノアンチピリン、30 U/ml西洋わさび由来ペルオキシダーゼ、20 mU/ml L-トリプトファンオキシダーゼ酵素液を含む反応液を調製した。これと等量の0, 20, 40, 60, 80, 100μMのL-トリプトファン水溶液、もしくは除タンパク処理前後のヒト血漿試料を混合した。30℃で反応を進行させ、30分後に505 nmの吸光度を測定した。L-トリプトファン水溶液サンプルの測定値から検量線を作製し、血漿試料中L-トリプトファンの定量を行った。
上記の測定結果を図6に示す。StaO, VioAいずれの酵素を使った定量系でも、機器分析による測定値に近い値が得られた。よってL-トリプトファンオキシダーゼによる定量法がヒト血漿試料においても有効であることが裏付けられた。
StaO, VioA精製酵素液に終濃度0〜50% (v/v)となるようにグリセロールを添加した。各酵素液を4℃で保存し、経時的にサンプリングして活性測定を行った。各種グリセロール濃度存在下におけるStaOまたはVioAの残存活性の経時的変化を図7と図8に示す。StaOに関しては、バッファーのみを含む溶液中では不安定ではあるが、30%以上のグリセロール添加条件で高い安定性を示した。VioAはグリセロール非添加でも比較的安定であるが、10%以上のグリセロールを添加するとその安定性はさらに高まった。
反応温度20, 30, 40, 50, 60℃でのStaO, VioAの活性測定を行った。20 mM トリス−塩酸バッファー (pH 8.0)、1 mM L-トリプトファン、1 mMフェノール、1 mM 4-アミノアンチピリン、15 U/ml西洋わさび由来ペルオキシダーゼ、およびL-トリプトファンオキシダーゼ酵素液を組成とする活性測定反応液を用いた。上記反応液のうちペルオキシダーゼとL-トリプトファンオキシダーゼ酵素液以外を混合し、上記各種温度で10分間プレインキュベーションを行った。上記反応液の温度を保ったままペルオキシダーゼとL-トリプトファンオキシダーゼ酵素液を添加して反応を開始させ、速やかに505 nmの吸光度変化を測定した。測定結果から算出した、各温度におけるStaO, VioAの相対活性値を表2に示す。両酵素とも、反応温度の上昇と共に活性の上昇が見られた。なお、StaOでは60℃、VioAでは50℃以上で、高温による失活の影響が顕著となり正確な活性測定が困難になった。
20%グリセロールを含んだStaO酵素液、および10%グリセロールを含んだVioA酵素液を30, 40, 50, 60, 70℃で1時間熱処理した後、活性測定を行った。熱処理後の各酵素液の残存活性を表3に示す。いずれの酵素も40℃以上の熱処理では顕著な熱失活が見られ、50℃以上の熱処理では残存活性が検出限界以下となった。
Claims (19)
- 検体とL-トリプトファンオキシダーゼと水を混合する工程(A)、
前記混合により得られた反応液を酸素の存在下に所定時間放置する工程(B)、
放置後の反応液中に存在する前記酵素の作用による反応生成物の少なくとも一種の存在を確認するか、または前記反応生成物の少なくとも一種の量を計測する工程(C)
を含む、前記検体中のL-トリプトファンの分析方法であって、
前記L-トリプトファンオキシダーゼが、
(a1)下記(1)〜(3)の何れかのアミノ酸配列を有し、かつ(a2)酸素及び水の存在下、L-トリプトファンに作用して過酸化水素とアンモニアを生成するオキシダーゼ活性を有し、L-フェニルアラニンに対するオキシダーゼ活性はL-トリプトファンに対するオキシダーゼ活性の0〜3%の範囲であり、L-トリプトファン及びL-フェニルアラニン以外のタンパク質構成アミノ酸に対してはオキシダーゼ活性を有さない、前記方法。
(1)配列表の配列番号1または2に記載のアミノ酸配列;
(2)配列表の配列番号1または2に記載のアミノ酸配列において1から50個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列;又は
(3)配列表の配列番号1または2に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列 - 前記L-トリプトファンオキシダーゼの(a1)におけるL-フェニルアラニンに対するオキシダーゼ活性はL-トリプトファンに対するオキシダーゼ活性の0〜1%の範囲である、請求項1に記載の方法。
- 工程(A)において検体との混合に用いられる前記L-トリプトファンオキシダーゼは、前記酵素の安定化剤の存在下で保存されているものである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記安定化剤が、グリセロール、スクロース、ソルビトール及びトレハロースから成る群から選ばれる少なくとも1種である、請求項3に記載の方法。
- 前記工程(C)で確認または計測する反応生成物が過酸化水素である請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 以下の試薬を含むL-トリプトファンの分析用キット。
(K1)L-トリプトファンオキシダーゼ
但し、前記L-トリプトファンオキシダーゼは、(a1)下記(1)〜(3)の何れかのアミノ酸配列を有し、かつ(a2)酸素及び水の存在下、L-トリプトファンに作用して過酸化水素とアンモニアを生成するオキシダーゼ活性を有し、L-フェニルアラニンに対するオキシダーゼ活性はL-トリプトファンに対するオキシダーゼ活性の0〜3%の範囲であり、L-トリプトファン及びL-フェニルアラニン以外のタンパク質構成アミノ酸に対してはオキシダーゼ活性を有さない
(1)配列表の配列番号1または2に記載のアミノ酸配列;
(2)配列表の配列番号1または2に記載のアミノ酸配列において1から50個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列;又は
(3)配列表の配列番号1または2に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列 - 前記(K1)L-トリプトファンオキシダーゼの(a1)におけるL-フェニルアラニンに対するオキシダーゼ活性はL-トリプトファンに対するオキシダーゼ活性の0〜1%の範囲である、請求項6に記載のキット。
- 前記(K1)L-トリプトファンオキシダーゼは、前記酵素の安定化剤との混合物である、請求項6または7に記載のキット。
- 前記安定化剤が、グリセロール、スクロース、ソルビトール及びトレハロースから成る群から選ばれる少なくとも1種である、請求項8に記載のキット。
- (K2)反応用緩衝液、(K3)過酸化水素検出用試薬、(K4)アンモニア検出薬および(K5)インドールピルビン酸検出薬の少なくとも一つをさらに含む、請求項6〜9のいずれかに記載のキット。
- L-トリプトファンオキシダーゼを含むL-トリプトファンの分析用組成物であって、
前記L-トリプトファンオキシダーゼは、(a1)下記(1)〜(3)の何れかのアミノ酸配列を有し、かつ(a2)酸素及び水の存在下、L-トリプトファンに作用して過酸化水素とアンモニアを生成するオキシダーゼ活性を有し、L-フェニルアラニンに対するオキシダーゼ活性はL-トリプトファンに対するオキシダーゼ活性の0〜3%の範囲であり、L-トリプトファン及びL-フェニルアラニン以外のタンパク質構成アミノ酸に対してはオキシダーゼ活性を有さない、前記組成物。
(1)配列表の配列番号1または2に記載のアミノ酸配列;
(2)配列表の配列番号1または2に記載のアミノ酸配列において1から50個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列;又は
(3)配列表の配列番号1または2に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列 - 前記L-トリプトファンオキシダーゼの(a1)におけるL-フェニルアラニンに対するオキシダーゼ活性はL-トリプトファンに対するオキシダーゼ活性の0〜1%の範囲である、請求項11に記載の組成物。
- 前記酵素の安定化剤を含有する、請求項11または12に記載の組成物。
- 前記安定化剤が、グリセロール、スクロース、ソルビトール及びトレハロースから成る群から選ばれる少なくとも1種である、請求項13に記載の組成物。
- L-トリプトファンオキシダーゼを用いるL-トリプトファンの検出または定量用酵素センサーであって、
前記検出用電極は過酸化水素検出用電極であり、かつ
前記L-トリプトファンオキシダーゼは、(a1)下記(1)〜(3)の何れかのアミノ酸配列を有し、かつ(a2)酸素及び水の存在下、L-トリプトファンに作用して過酸化水素とアンモニアを生成するオキシダーゼ活性を有し、L-フェニルアラニンに対するオキシダーゼ活性はL-トリプトファンに対するオキシダーゼ活性の0〜3%の範囲であり、L-トリプトファン及びL-フェニルアラニン以外のタンパク質構成アミノ酸に対してはオキシダーゼ活性を有さない、前記センサー。
(1)配列表の配列番号1または2に記載のアミノ酸配列;
(2)配列表の配列番号1または2に記載のアミノ酸配列において1から50個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列;又は
(3)配列表の配列番号1または2に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列 - 前記L-トリプトファンオキシダーゼの(a1)におけるL-フェニルアラニンに対するオキシダーゼ活性はL-トリプトファンに対するオキシダーゼ活性の0〜1%の範囲である、請求項15に記載の酵素センサー。
- 前記L-トリプトファンオキシダーゼは、前記酵素の安定化剤と共に用いられる、請求項15または16に記載の酵素センサー。
- 前記安定化剤が、グリセロール、スクロース、ソルビトール及びトレハロースから成る群から選ばれる少なくとも1種である、請求項17に記載の酵素センサー。
- 過酸化水素検出用電極は、酵素式過酸化水素電極または隔膜式過酸化水素電極である請求項15〜18のいずれかに記載の酵素センサー。
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