JP2011518339A - 創傷が治癒しているかどうかを判定するために創傷組織の光学特性の変化を測定し、近赤外吸収（ｆＮＩＲ）および拡散反射分光散乱（ＤＲＳ）を、組織新血管新生およびコラーゲン濃度と相関させる方法 - Google Patents

Abstract

近赤外拡散反射分光法によって測定された創傷治癒中の組織の光学的変化は、組織学的変化と相関があることが示される。近赤外吸収係数は、時間経過における血管内方成長と相関があり、これに対して拡散反射分光法（ＤＲＳ）データはコラーゲン濃度と相関があった。より深い場所における創傷組織の光学特性の変化も、近赤外波長における拡散光子密度波（ＤＰＤＷ）手法によって定量化される。半無限媒体に対する拡散方程式を使用して、周波数領域装置または時間領域装置による位相と振幅の測定値に基づいて、吸収係数および散乱係数を計算する。非創傷部位と比較して、創傷の吸収係数および散乱係数の増加と、血液飽和の減少とが観察された。これらの変化は、創傷の治癒段階と相関があった。創傷の治癒状態に関する情報を収集するのに使用する手法は、（例えば、糖尿病の）患者における創傷治癒剤の効能を臨床的に評価するのに使用できるとともに、創傷治癒の進行、特に糖尿病による慢性創傷の治癒を検出する非侵襲的方法として使用できる。この手法は、虚血性環境、障害のある治癒状態、および圧迫潰瘍、静脈潰瘍、および偏在性潰瘍などの、新生の表面下組織劣化に適用できる。

Description

本発明は、急性創傷の治癒中の組織の光学特性における変化を測定する方法に関し、より具体的には、連続波、周波数領域、または時間領域の近赤外装置による位相および／または振幅の測定に基づいて創傷組織の吸収係数および散乱係数を計算するための、近赤外周波数における拡散光子密度波（ＤＰＤＷ：Diffuse Photon Density Wave）法の使用に関する。本発明はまた、近赤外吸収および拡散反射分光散乱を使用して行った測定値間の相関をとること、および時間経過による酸化ヘモグロビンの変化をモニタリングすることで、創傷における組織の新血管新生およびコラーゲン濃度を評価することによって、創傷が治癒しているかどうかを判定することに関する。本発明は、表面下組織の光学特性および酸素化に当てはまり、虚血性環境、障害のある治癒状態、および圧迫潰瘍（pressure ulcer）または偏在性潰瘍（ubiquitous ulcer）などの新生の創傷に関する。

関係出願の相互参照
本願は、２００８年４月２１日出願の米国特許仮出願第６１／０４６６４０号、および２００８年５月２０日出願の米国特許仮出願第６１／０５４５３５号の優先権を主張するものである。これらの特許出願の内容の全文を参照により本願に組み入れる。

慢性創傷における治癒の評価は、新規および高価な創傷治療が市場に出されるにつれて、その重要性が増している。局所成長因子、生物工学による皮膚等価物、負圧創傷療法、および高圧酸素療法などの多種多様な慢性創傷治療が商業的に利用可能であり、これらの製品の臨床研究から、標準的医療と比較して治癒が向上するという一部の事実が示されている。しかしながら、各治療の有効性は、すべての患者において同じではなく、失敗の治療を停止して、できる限り早く代替治療を開始するために、各個人における治癒進行を迅速、かつ正確に測定することが重要である。信頼性の高い創傷治癒の測定方法は、治療の期間とコストを低減することによって創傷診療の便益になるとともに、臨床試行の測定において創傷研究コミュニティの便益ともなる。

従来の創傷測定の主たる制限は、それから得られる情報のほとんどが創傷の表面からのものであることである。そのような創傷の表面特徴は、全創傷床における表面下の創傷環境の健全さを考慮に入れず、創傷の創傷治癒状態に関して不適切な情報をもたらす。したがって、誤診断が発生するか、または治療をできる限り早く変更することができない可能性があり、慢性創傷に対する医療の質とコストに直接的な影響がある。例えば、色彩またはテキスチャに対する創傷像の画像解析は、厳密に表面情報に関係し、拡散反射分光法（ＤＲＳ）または光学コヒーレンス断層撮影法（ＯＣＴ）などの光学的方法は、約１ｍｍ透過することができるだけである。慢性創傷床の全深さの非侵襲的解析は、臨床医に創傷健全性についてのより完全な像を与えて、表面測定だけによって得られるよりも、創傷閉鎖と創傷再発の予測の精度を上げることができる。

慢性創傷の表面下の組織を非侵襲的に特徴づける試みとして、ヒトでの研究がいくつか行われている。２０Ｍｈｚ域の周波数における高周波超音波（ＨＦＵＳ）は、最大２ｃｍの深さまでの皮膚の高解像度（顕微鏡レベル）撮像を可能にする。予備試験によると、ＨＦＵＳを使用して、ヒトの慢性創傷の表面下の構造特徴を撮像することが可能であることがわかり、健常な皮膚との定量的比較が行われた。ＨＦＵＳは、いくつかの種類のヒトの慢性創傷（糖尿病性、静脈性、圧迫性、および偏在性の潰瘍）における皮膚厚を測定するのに使用され、“Wound healing assessment using 20 MHz ultrasound and photography,” Skin Research and Technology, 2003, Vol. 9, pages 116-121に記載されたDysonらによる後の研究では、ヒトの被験者に実験的に生成された小さい急性創傷の幅と深さを計算するためにＨＦＵＳを使用する実例が示されている。しかしながら、形状、サイズが非常に異なり、または急性創傷よりもさらに曖昧な境界を有する慢性創傷に、この方法がどのように適用されるかは明らかではない。

光学コヒーレンス断層撮影法（ＯＣＴ）は、最大１．２ｍｍまでの深さでのヒトの皮膚における構造特徴の高解像度断面画像を生成するために、低コヒーレンス干渉法を使用する非侵襲的画像診断法である。この方法は、ヒトの創傷の撮像にはまだ使用されていないが、実験的に生成された動物の創傷のＯＣＴ画像において見える構造は、同創傷の組織学的顕微鏡写真と定性的に関係づけられて、これらの急性の動物創傷の大きさを計算するために自動化撮像アルゴリズムが開発された。別の動物試験においては、偏光感受型（polarization-sensitive）ＯＣＴを使用して、治癒中のコラーゲン複屈折の時間変化がモニタリングされており、化学的に障害が与えられた治癒と比較して、化学的に促進された創傷治癒において複屈折の測定値が大きいことが示されている。ＨＦＵＳと同様に、創傷モニタリング方法としてのＯＣＴの臨床的な有用性については、ヒトの慢性創傷の大きさと複雑さのために、断定はできない。

レーザドップラー流速計（ＬＤＦ）およびその改良型方法であるレーザドップラー画像法（ＬＤＩ）は、入射光線（通常は、近赤外波長域のレーザ）の周波数シフトに依拠して、組織体積内部の赤血球の平均速度と数に関係する定量的指数を定量する、光学的方法である。一部の研究者は、ＬＤＦおよびＬＤＩを使用して、ヒトの慢性創傷における皮膚血流の相対値を定量化している。これらの試験は、肉芽組織と相互に関係づけることのできる慢性創傷内部の血流の増加した領域を識別したが、時間経過による血流の変化はモニタリングされていない。慢性創傷の連続評価に対するＬＤＦおよびＬＤＩの臨床的な有用性は、侵入度が小さいこと（約１〜２ｍｍ）、および足の曲率によって生じる光反射や、創傷の表面の水分の存在という問題のために、限定される。

拡散反射（レミッタンス）分光法（ＤＲＳ）は、可視および近赤外の波長（４００〜１５００ｎｍ）の光を使用して、約１ｍｍの深さまでの、ヘモグロビン濃度および表面の毛細血管内の血液酸素化を測定する光学的方法である。（静脈および動脈の両方の）慢性下肢潰瘍からのＤＲＳスペクトルが、医師によって評価された定性的な創傷スコアと経験的に関係づけされており、酸素飽和の変化が、糖尿病性足部潰瘍においてＤＲＳを使用して治癒の過程を通して測定されている。しかしながら、出血およびその他の理由により表面様相が変化することが、創傷状態および酸素化についての情報を独自に提供するＤＲＳの能力に、重大な影響を及ぼすことになる。

一般的に、創傷表面積の定量は、非常に不正確で主観的である。（Robson, M.C., et al., “Wound Healing Trajectories as Predictors of Effectiveness of Therapeutic Agents,” in Archives of Surgery. 2000, Am Med Assoc. p. 773-777を参照のこと。）創傷縁端は、複雑な創傷の幾何学形状が理由で、特定するのが困難である。幅および深さの測定値は、同一の診療セッションの観察者間で異なることがあり、また来診間で非常に不正確である。表面積は、創傷体積の変化を考慮に入れない。超音波測定およびディジタル写真の画像解析からはより正確な情報が得られるが、多忙な臨床環境において使用するのは困難である。

本発明者らの以前の刊行物において、近赤外光学測定値が、創傷面積減少と相関があり、ラットモデルにおいて、糖尿病性創傷と非糖尿病性創傷とを区別することができたことが報告されている。Weingarten, M.S.他著、“Measurement of optical properties to quantify healing of chronic diabetic wounds,” Wound Repair and Regeneration, 2006, Vol. 14(3): pp. 364-370を参照のこと。本明細書において説明するように、本発明者らは、この研究を、近赤外（ＮＩＲ）と拡散反射分光法（ＤＲＳ）とを組み合わせること、また近赤外吸収係数が創傷の組織学的変化と相関があるかどうか、およびＤＲＳ散乱関数が治癒組織におけるコラーゲン濃度と相関があるかどうかを報告することによって拡張している。

さらに、創傷、火傷および病変部は治癒するのに酸素を必要とすること、および虚血状態は、障害のある治癒環境を意味することが立証されている。したがって、酸化ヘモグロビン、還元ヘモグロビン、および酸素飽和を測定することによって、本発明者らは、創傷治癒が予測可能であることを提案する。臨床創傷医療業務における現在の方法は、病変部の長さと幅を測定することによる表面積の測定に依拠している。これらの方法は、非常に主観的であり、より重要なことは、糖尿病による慢性創傷、静脈潰瘍、圧迫潰瘍、偏在性潰瘍、その他などの、障害のある環境における創傷治癒の確率を評価できないことである。生体組織検査に基づく侵襲的モニタリングによると、治癒の生理学および生化学についての情報が得られるが、侵襲的で実際的ではなく、これに対して創傷液に基づくモニタリングは、創傷液成分と創傷組織とに適当な相関があるかに対する論争があることから問題がある。

現在、様々な光学的方法が提案されており、皮膚傷害を表わすパラメータの定量、または治癒過程のモニタリングに使用することができる。ほとんどの光学的方法は、非侵襲的かつ比較的安価であり、そのために侵襲的方法と比較して大きな利点がある。拡散反射分光法（ＤＲＳ）の異なる改良形態が、創傷、火傷、病変部のモニタリングにおいて最も一般的な方法となっている。ＤＲＳは、表面の深さが最大１ｍｍまでの皮膚変化の測定に広範に使用されてきたが、その理由は、入力光（４００〜１５００ｎｍ）の通常の広域波長源によると、組織による強い吸収によって、より深い層での光学的な検査が制限されるからである。ＤＲＳ再発光スペクトルをファントムやモデルシステムに適合させる専用のアルゴリズムを使用して、多くの研究者が、火傷による傷害の深さ、日焼けによる損傷、局所薬物送達、および皮膚の水分濃度についての重要な情報を得た。

創傷の特徴解析において、大きな侵入度がないことは、ＤＲＳデータの解釈を困難にする。例えば、臨床的観測値を平均化する臨床創傷評価スコアを模倣可能な経験的アルゴリズムを開発するためには、多数の創傷からのＤＲＳデータを収集しなくてはならなかった。光学的非侵襲的方法によって、より深い組織の深さを検査するためには、ＤＲＳとは異なる手法が望まれる。そのような手法について、本明細書で説明する。

本発明者らは、血管内方成長（blood vessel in-growth）の変化および／または創傷内の虚血は、近赤外（ＮＩＲ）測定値を使用して定量化できること、およびコラーゲン濃度は、創傷組織内の拡散反射分光法（ＤＲＳ）測定値を使用して定量化できることを見出した。ＮＩＲ散乱係数は、コラーゲン濃度または細胞数とは相関がないが、おそらく検査した組織の深さが理由で、血管の器質化と相関があることがわかった。侵入度とＤＲＳにおいて使用される波長とが理由で、血管器質化、および好中球の存在は、コラーゲンと比較してＤＲＳ散乱における要因となりにくい。したがって、これらの２つの方法は、相補的な情報をもたらすことがわかった。

創傷治癒期間中の吸収係数の変化に差があることがわかり、対照創傷においては、吸収係数における変化率は、障害性（例えば、糖尿病性）創傷と比較して、６８５ｎｍおよび８３０ｎｍにおいて、一貫して高いことがわかった。これは、比較対照における血管成長がより急速に進行するときの、対照における血管内方成長によって予測されるとおりの挙動である。また、ＤＲＳによって求められる散乱関数は、障害性創傷および対照創傷の両方において、トリクローム染色によって定量されるコラーゲン濃度と非常に高い相関があることもかった。

これらの観察を一部には利用して、創傷の治癒状態に関する情報を収集する方法が提供される。例示的な一態様においては、この方法は、創傷組織を光源からの光で照射すること、前記光が前記創傷組織中を伝播するときに、前記光の振幅および／または位相シフトを測定すること、該測定値を使用して光吸収係数および／または換算散乱係数を計算すること、および創傷組織内のコラーゲン濃度と、測定パラメータから計算された換算散乱係数とを相互に関係づけること、および／または前記測定値を使用して、前記創傷組織内の血管内方成長および／または虚血と、光吸収係数とを相互に関係づけることを含む。時間経過によるコラーゲン濃度の変化は、時間経過による換算散乱係数の変化から求めてもよい。同様に、時間経過による血管内方成長および／または虚血の変化を、時間経過による光吸収係数の変化から求めてもよい。

光は、好ましくはレーザによって供給され、６５０〜８７０ｎｍなどの、近赤外波長において伝送される。光はまた、６８５ｎｍ、７８０ｎｍ、８３０ｎｍ、および／または９５０ｎｍなどの特定の近赤外波長においても伝送される。レーザによる光出力は、創傷組織内に拡散光子密度波（ＤＰＤＷ）を生成するように変調してもよい。他方で、光は、創傷内の時間経過による血管内方成長および／または虚血の変化を測定し、時間経過とともに創傷から得られる光吸収係数と、障害性創傷および対照創傷に対して組織学的に見た血管内方成長および／または虚血とを相互に関係づけることによって、障害性創傷（例えば、糖尿病性の圧迫潰瘍、静脈潰瘍、偏在性潰瘍および虚血性創傷）と非障害性創傷（正常に治癒している創傷）とを区別するのに使用することができる。態様によっては、本方法には、時間経過による光吸収係数の変化から、創傷内の圧迫潰瘍または静脈潰瘍を検出することを含めてもよい。

本明細書に記載する方法には、創傷表面積を計算することによって創傷の大きさを測定すること、および異なる時点における創傷の表面積間の差分を計算し、その差分を創傷の元の表面積で除することによって、創傷の治癒率を測定することをさらに含めてもよい。

例示的な一態様において、創傷組織内のコラーゲン濃度と、換算散乱係数（reduced scattering coefficient）を相互に関係づけることは、創傷内で時間経過により得られた拡散反射分光散乱関数の増加と、創傷の治癒中のコラーゲンの増加を相互に関係づけることを含む。例示的な一態様において、創傷内のコラーゲン濃度は、時間経過によるＤＲＳ測定値を使用して、測定してもよい。

前記照射するステップ、および前記測定するステップは、創傷に接触しない、連続波、周波数領域、または時間領域の測定装置を使用して実施してもよい。この態様においては、吸収係数および／または換算散乱係数の計算および血液酸素化の定量は、半無限媒体用の拡散方程式を使用して実施される。

本方法の別の観点によれば、酸化ヘモグロビンの時間による変化をモニタリングすることは、創傷が治癒しているかどうかの指標をもたらす。酸化ヘモグロビンの変化は、時間経過による光吸収係数およびヘモグロビン濃度の変化率と変動性とを計算することによって定量化してもよい。

本発明の上記およびその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明と、添付の図面を合わせて読めば明白になるであろう。

図１は、創傷のディジタル写真の画像解析から計算される、糖尿病ラットと対照ラットにおける創傷治癒率を示す図である。 図２は、創傷のディジタル写真の画像解析から計算される、糖尿病ラットと対照ラットにおける創傷収縮を示す図である。 図３は、糖尿病の非創傷組織、糖尿病の創傷、健常な非創傷組織、および健常な創傷における（ａ）６８５ｎｍ、（ｂ）７８０ｎｍ、（ｃ）８３０ｎｍ、および（ｄ）９５０ｎｍでの平均吸収係数（μ_ａ）を示す図である。 図４は、同様の結果がすべての波長に対して得られたことを示す、糖尿病性創傷‐対‐対照創傷における６８５ｎｍでの吸収係数（μ_ａ）の百分率変化率を示す図である。

図５は、糖尿病の非創傷組織、糖尿病の創傷、健常な非創傷組織、および健常な創傷における（ａ）６８５ｎｍ、（ｂ）７８０ｎｍ、（ｃ）８３０ｎｍ、および（ｄ）９５０ｎｍでの平均換算散乱係数（μ_ｓ’）を示す図である。 図６は、創傷治癒の状態を示す図であり、第５日および第１０日に、糖尿病の創傷において有意に高い数の好中球が存在し、これは第２１日には明白ではないが、第２１日には、対照創傷においてより多くの器質化組織があることによる。 図７は、対照創傷と比較して糖尿病性創傷における血管分布（vascularity）の減少を示す、創傷のレクチン染色を示す図である。 図８は、画像あたりの細胞総数に対する、ＤＡＰＩ染色した組織サンプルの画像解析を示す図である。 図９は、トリクローム染色した組織試料の画像解析により求められる、対照創傷‐対‐糖尿病性創傷におけるコラーゲン濃度の比を示す図である。

図１０は、トリクローム染色した組織試料の画像解析により求められる、ＤＲＳ散乱関数（任意単位）‐対‐相対コラーゲン濃度を示す図であり、（ａ）対照ラット、および（ｂ）糖尿病ラットの両方に対して見出された、ＤＲＳ散乱関数とコラーゲン濃度の間の強い相関を示す。 図１１は、血管に対するトリクローム染色を示す図である。 創傷治癒を測定するための、本発明者らにより実施された動物試験の時系列を示す。 各動物が左背に創傷を負い、測定は（１）創傷の中心、（２）創傷の縁端、および（３）創傷場所に対称の右背上の健常組織で行った、動物モデルにおけるプローブ配置場所（黒い四角形）を示す図である。

図１４は、各点が同一の日にとられた測定値の平均を表わし、実線が全測定期間に対する平均値を表わす、５０日期間にわたるシリコーン光学ファントムにおける（ａ）μ_ａおよび（ｂ）μ_ｓ’の日毎の平均値を示す図である。 図１５は、試験１および試験２から、６８５ｎｍにおける（ａ）左背μ_ａ、（ｂ）右背μ_ａ、（ｃ）左背μ_ｓ’、および（ｄ）右背μ_ｓ’のベースライン値を含む、時間の関数として測定された全動物に対する平均吸収および散乱係数を示す図である。 図１６は、各点が３つの測定値の平均を表わし、誤差バーが標準偏差を示す、３匹の代表的ラットからの（ａ）μ_ａおよび（ｂ）μ_ｓ’の左背ベースライン値を示す図である。

図１７は、各点が全ラット（ｎ＝１２）の平均を表わし、誤差バーが標準偏差を表わす、試験２におけるラットに対する治癒時間の関数としての、正規化された創傷面積を示す図である。 図１８は、試験１における動物に対する創傷治癒中の６８５ｎｍにおける（ａ）μ_ａおよび（ｂ）μ_ｓ’ （平均±標準偏差）、ならびに試験２における動物に対する創傷治癒中の６８５ｎｍにおける（ｃ）μ_ａおよび（ｄ）μ_ｓ’ （平均±標準偏差）を示す図である。 図１９は、創傷手術の後、（ａ）第５日、（ｂ）第１０日、および（ｃ）第２１日の創傷組織のレクチン染色画像を示す図である。 図２０は、試験２における動物に対する創傷治癒中の、酸化ヘモグロビン［ＨｂＯ_２］、還元ヘモグロビン［Ｈｂ］、および総ヘモグロビン［ＨｂＯ_２＋Ｈｂ］の平均±標準偏差を示す図である。

図２１は、試験２における動物に対する創傷治癒中の酸素飽和を示す図である。 図２２は、図１８に示す動物試験の結果に対して比較した、仮定の臨床創傷治癒曲線を示す図である。 図２３は、各時点における平均光学係数を、第３日の平均光学係数と比較するのに使用された両側の、対応のないｔ検定（two-tailed, unpaired t-tests）を示す図であり、結果として得られるｐ値が時間の関数として示されている。ここで（ａ）創傷の中心でのμ_ａ、（ｂ）創傷の縁端でのμ_ａ、（ｃ）創傷の中心でのμ_ｓ’、および（ｄ）創傷の縁端でのμ_ｓ’である。 図２４は、６１週期間にわたるシリコーン光学ファントムにおけるμ_ａの日々の平均値を示す図である。

図２５は、ヒトの実験における典型的な糖尿病性足部潰瘍に対する測定場所を示す図である。 図２６は、典型的な治癒中の創傷に対する試験の過程中のすべての波長におけるμ_ａのプロットを示す図である。 図２７は、典型的な非治癒中の創傷に対する、μ_ａのプロットを示す図である。 図２８は、創傷が最初は治癒しているように見えて、１７週間にわたってサイズが３１．５ｃｍ^２から１．６ｃｍ^２まで減少したが、完全には閉鎖せず、２５週間の後に、創傷サイズが１７．３ｃｍ^２に増大し、外科的な介入が必要となった特異な症例に対するμ_ａのプロットを示す図である。 図２９は、図２６〜２８における創傷に対する総ヘモグロビン濃度［Ｔｏｔ Ｈｂ］の計算値を示す図である。

図３０は、光吸収の傾向線から計算された傾きを示す図である。 図３１は、ヘモグロビン濃度傾向線から計算された傾きを示す図である。 図３２は、全光吸収係数（６８５ｎｍ、７００ｎｍ、および８３０ｎｍでのμ_ａ）および全ヘモグロビン濃度（［Ｔｏｔ Ｈｂ］、［ＨｂＯ_２］、および［Ｈｂ］）に対して比較した、治癒中の創傷と非治癒中の創傷における平均変化率を示す図である。 図３３は、各波長における光吸収と全ヘモグロビン濃度（酸化、還元、および総）とを使用して、治癒中の創傷と非治癒中の創傷における正規化ＲＭＳＤの平均値を比較する図である。 図３４は、治癒サイクルを通して、および創傷閉鎖後４２日間、ＤＰＤＷ法を使用して創傷がモニタリングされた、７匹のＺｕｃｋｅｒ糖尿病肥満（ＺＤＦ）ラットにおける創傷治癒試験の結果を示す図である。

図３５は、治癒中に観察される光学的変化の仮定モデルを示す図である。 図３６は、最初の１０週間の測定データを直線傾向線に当てはめることによって計算された、各創傷における［Ｔｏｔ Ｈｂ］の時間変化率を示す図であって、この図においては１０週傾向線の傾きが、入手できる全データから計算された傾きと比較されている。

例証的な態様の詳細な説明
本発明の例証的な態様の詳細な説明を図１〜３６を参照して次に述べる。この説明は、本発明の可能な実現形態についての詳細な例を提供するが、これらの詳細は例示のためのものであって、本発明の範囲を限定するものではないことに留意されたい。

創傷の治癒状態に関するデータを収集するための創傷の表面のモニタリング
材料および方法
ドレクセル大学（Drexel University）の生体医用工学部によって開発された周波数領域拡散光学断層撮影計器を、組織の光学特性を数ミリメートルまでの深さで非侵襲的に測定するのに使用した。この計器は、光学スイッチによって制御される４つのレーザダイオード（６８５、７８５、８３０、および９５０ｎｍ）、４つのアバランシェフォトダイオード検出チャネル、および７０ＭＨｚの周波数でレーザ出力を変調する、無線周波数（ＲＦ）発生器を含む。この装置は、光が組織を通過して伝播するときに、その振幅と位相シフトを測定し、拡散ベースのモデルを使用して、光吸収係数（μ_ａ）および換算散乱係数（μ’_ｓ）を計算する。

光ファイバプローブが、一本の光ファイバを介して光を送り、光源ファイバから４ｍｍから１６ｍｍの距離に配置された４本の光ファイバを介して光を収集する。この計器は、様々な濃度、したがって様々な散乱係数および吸収係数のイントラリピッド（intralipid）溶液を使用して較正し、その安定性を判定した。上述した測定の間、この計器は固体ファントムによって較正された。この計器の詳細は、Weingarten, M.S.らによって“Measurement of optical properties to quantify healing of chronic diabetic wounds,” Wound Repair and Regeneration, 2006, Vol. 14(3): pp. 364-370に先に発表されている。当業者が理解するように、これらの波長において送られる光を吸収する、創傷内の発色団は、主として酸化ヘモグロビンおよび還元ヘモグロビン、ならびに水である。

実験動物モデル
腹腔内ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）投与により、糖尿病にされた無毛ラットからなる動物モデルを使用した。特に、選択された動物モデルは無毛雌ラットであった。試験の過程において、動物は、アルファセルロースの敷物上の個別のケージに収容されて、１２時間の明暗サイクルを備える動物医療施設に維持された。食物と水は適宜に与えられた。

体重が約２０５ｇの１０週齢のSprague‐Dawley系雌無毛ラット３０匹を取得した。ベースライン近赤外データを、１４日間、すべてのラットについて収集した。１８匹のラットを、７５ｍｇ／ｋｇのＳＴＺの腹腔内注射を用いて糖尿病にした。１２匹のラットを、対照グループとして維持した。糖尿病の誘発を確実に成功させるために、糖尿病ラットにおける血液グルコースレベルをモニタリングした。第３６日に、４．６ｃｍ^２の全層（full thickness）創傷を、動物用手術着で無菌操作法を用いて作成した。１つの創傷を、各動物の背中領域の左側に与えた。各動物の右側は、創傷を与えずに残し、対照部位を得るとともに、糖尿病または創傷のいずれかに関係する光学特性の全身性変化の評価を可能にした。手術は、フェイスマスクを介して投与されるイソフルラン麻酔を使用して行った。すべての創傷を、テガダーム（Tegaderm）（ミネソタ州、ミネアポリス、３Ｍ）滅菌透明包帯で覆った。手術後に、すべてのラットに「エリザベス」型カラーを装着し、ラットがその創傷を引っ掻くのを防止した。ラットの血糖および体重を毎週、検査した。

創傷の光学測定
近赤外分光法（ＮＩＲ）
近赤外光学測定は、創傷側（創傷の中心および創傷のまわり）で２つの場所において、対照（右）側で１つの場所で実施した。測定の前に、創傷内に溜まった血液および流体をガーゼで取り除いた。光学データを創傷周囲領域、創傷中心、および対称な創傷のない右側（対照側）から収集した。各位置は、再現性を確保するために３回、測定した。報告されたデータは、これらの３つの測定値の平均を反映し、標準誤差は２％未満であった。近赤外計器を使用する創傷の測定は、毎週２回行った。

光学装置は各実験の前に較正した。６８０〜８７０ｎｍの波長を選択することで、創傷の酸化ヘモグロビンおよび還元ヘモグロビンにおける優勢な発色団の評価が可能となった。９５０ｎｍ波長の追加によって、創傷内の水分濃度、したがって組織の脱水状態の判定が可能となった。レーザは、７０ＭＨｚで変調して、組織内に散乱光子密度波（ＤＰＤＷ）を生成した。適当なアルゴリズムが、これらの４つの波長での振幅および位相を組織吸収および散乱の測定量に変換する。組織は、光が組織の１ｍｍごとに散乱される、非常に強い散乱媒体であるので、ＤＰＤＷの近似を使用して、吸収および散乱の係数を計算した。プローブは、約３〜５ｍｍの深さで組織を調べた。

拡散反射分光法（ＤＲＳ）
拡散反射分光法（ＤＲＳ）計器を使用して、皮膚／創傷表面から１００〜３００ミクロンの間の深さでの後方散乱光の強度を測定した。この計器は、タングステン光源（Ocean Optics、Boca Raton、フロリダ州）、分岐ファイバ束（Multimode Fiber Optics、East Hanover、ニュージャージ州）、分光光度計（Ocean Optics、Boca Raton、フロリダ州）およびアナライザからなる。光は、光源に接続されたファイバ束の一方の分岐によって皮膚に送られ、分光光度計に接続された他方の分岐によって収集された。６００本の５０μｍコア直径のランダムに混合した光ファイバが、わずかに皮膚の上に配置された。全体プローブサイズは、直径が約１／２インチであり、プローブの活性領域は直径が約２ｍｍである。反射スペクトルを、４００ｎｍと７５０ｎｍの間で取得した。ＤＲＳ散乱関数は、線形最小二乗法フィッティングアルゴリズムを用いて、６３０ｎｍから７００ｎｍの間の強度データに当てはめられた直線の、６３０ｎｍにおける切片を見つけることによって計算した。散乱強度の測度を表わすために、同様の関数がKnoefel, W.T.他により、“Reflectance spectroscopy of pancreatic microcirculation,” Journal of Applied Physiology, 1996, Vol. 80(1), pp. 116-123において使用された。

コラーゲン濃度を定量する方法の感度を評価するために、コラーゲンファントムのin vitro測定をＤＲＳを用いて実施した。それぞれが約１ｃｍ厚さの３つのコラーゲンタイプ１ジェルファントムを製作した。コラーゲンジェルは、推奨された製造メーカのプロトコルに従って、ラットテイルタイプＩ高濃度コラーゲン（BD science、カリフォルニア州）から、標準６ウェルプレート内に準備した。簡単にいえば、コラーゲンは水に溶かして、所望の濃度にした（３ｍｇ／ｍｌ、４．５ｍｇ／ｍｌ、および６ｍｇ／ｍｌ）。生理的ｐＨとイオン強度を得るために、リン酸緩衝生理食塩水と１ＮのＮａＯＨを加えた。コラーゲンは、約２０〜３０分間、３７℃でゲル化させた。

創傷サイズの決定
創傷サイズの測定値は、創傷表面積を計算することによって求めた。これは、近赤外データが収集されたのと同時にとられた交差偏波ディジタル写真を使用して求めた。画像解析ツールIMAGE PRO（Media Cybernetics、Silver Spring、メリランド州 ）を使用して、各創傷の面積を計算した。これらの創傷は深さが均一であるので、創傷体積は計算しなかった。近赤外分光法、ＤＲＳ、およびディジタル写真法は、運動によるアーチファクトを避けるように、吸入イソフルラン麻酔を受けたラットを用いて実施した。

創傷生体組織検査
ラットが吸入イソフルラン麻酔を受けている状態で、糖尿病グループのラットおよび対照グループのラットは、創傷を受けた後に、第５日、１０日、および２１日にそれらのラットの創傷、および創傷の反対側の背中の領域を完全に切除した。次いでこれらのラットを犠牲にした。創傷切除は、第５日に３匹の対照および６匹の糖尿病ラットについて実施し、第１０日に３匹の対照ラットと６匹の糖尿病ラットについて実施した。切除生体組織検査は、第２１日に６匹の対照ラットと４匹の糖尿病ラットについて実施した。合計２８の創傷および２８の対照領域を切除して、組織学的に試験した。

組織構造と細胞形態を観察するために、ヘマトキシリン‐エオシン染色を実施した。簡単に言うと、再水和の後に、スライドをヘマトキシリン溶液に３分間浸漬し、次いで、水道水で５分間洗浄し、エオシン溶液に１分間浸漬してキシレンで脱水させた。

レクチン染色（細胞を凝集させるか、または複合多糖を析出させる非免疫由来の糖結合タンパク質）を使用して、組織内の血管を染色し、血管新生を可視化した。レクチンは、内皮細胞に結合して全体の血管構造を見せるので、血管形成のマーカーとして使用することができる。簡単に言うと、再水和の後に切片を１Ｘ ＰＢＳで１０分間洗浄した。切片は、Alexa Flour 488結合レクチン（Invitrogen L2-1415）を用いて、濃度１：２５０で暗所で３０分間染色し、１Ｘ ＰＢＳで3回、それぞれ5分間洗浄した。微小血管密度の定量は、Weidnerらによって“Tumor angiogenesis and metastasis--correlation in invasive breast carcinoma,” in New England Journal of Medicine, 1991, pp. 1-8に記載されているように行った。血管計数は、光学顕微鏡法によって、低倍率において可視化された最大数の正レクチン領域を含む、創傷組織の領域において評価した。重複しない６つの最大血管分布領域を識別して、血管計数を行い、６つの計数値の平均を計算した。

レクチン染色後に行ったのと同じ手順であるが、ステップを追加したものをＤＡＰＩ（４’，６‐ジアミジノ‐２‐フェニルインドール）（核ＤＮＡを可視化）に使用した。このステップは、VECTASHIELD（登録商標）およびDAPI Mounting Mediumで切片をマウントすることを含む。血管は蛍光緑に染色され、細胞核は蛍光青に染色された。細胞数を評価するためにＤＡＰＩ染色蛍光画像（サンプル毎に３〜５画像）の画像解析を、F.Ottoによって“DAPI staining of fixed cells for high-resolution flow cytometry of nuclear DNA,” Methods Cell Biol, 1990. Col. 33, pp. 105-10に記載されているように行った。

コラーゲン繊維（collagen fiber）を、G.Gomoriによって“Aldehyde-fuchsin: a new stain for elastic tissue,” Am J Clin Pathol, 1950, Vol. 20(7), pp. 665-6に記載されているように、ゴモリのトリクローム染色法によって可視化した。トリクロームは、コラーゲンを選択的に染色する酸性色素であり、病理学研究室において使用される標準的な方法である。画像解析ソフトウエアImage Proを使用して、所与の領域のコラーゲンの画素強度を計数することによってコラーゲンの濃度を求めた。

結果
創傷サイズ
創傷を与えた後、２１日期間中に測定された３０の創傷において、対照グループにおける創傷サイズは、糖尿病グループに比較したときに、より高速で減少した（図１）。治癒率は、次の式によって計算した：
治癒百分率＝（元の創傷面積−創傷面積）／（元の創傷面積）
糖尿病ラットと対照ラットの間の統計的に有意な（ｐ＜０．０５）差を、スチューデントｔ検定を使用して見出した。これらの結果は、M.S.Weingartenらによる“Measurement of optical properties to quantify healing of chronic diabetic wounds,” Wound Repair and Regeneration, 2006, Vol. 14(3), pp. 364-370において、このグループによって観察された治癒率と類似するものであった。

創傷収縮は次のように定義した：
創傷収縮＝（創傷面積）／（元の創傷面積）
図２に示すように、対照グループにおける創傷収縮は、糖尿病グループよりも速く発生した。

近赤外吸収データ（μ _ａ ）
糖尿病ラットにおいて、吸収係数は、糖尿病を誘発させた直後から始まり、増加した。対照と比較して糖尿病性創傷においては、創傷を負ってから数日内に吸収係数が増加した。図３に示すように、治癒時間中にわたって、糖尿病の非創傷側および対照と比較すると、平均吸収係数は糖尿病性創傷において有意に高かった。

図４に示すように、対照創傷における吸収係数（μ_ａ）の百分率変化は、創傷を負ったときから始まり、糖尿病性創傷におけるμ_ａの百分率変化よりも大きかった。百分率変化は次の式を使用して計算した：

ここで、μ_ａ ^ｉｎｉｔ＝創傷手術後の第３日目の創傷からのμ_ａ（第３日は最早の創傷測定であった）。同様の結果をすべての波長に対して得た。

近赤外散乱データ（μ _ｓ ）
糖尿ラットにおいては、散乱係数も、糖尿病を誘発させた直後から始まり増加した。図５に示すように、平均散乱係数は、創傷を与えた直後および治癒期間を通して、糖尿病の非創傷側および対照と比較すると、糖尿病性創傷において有意に高かった。

図６は、第５日および第１０日に糖尿病性創傷において有意に高い数の好中球が存在する、創傷治癒の状態を示す。このことは第２１日ではそれほど明白ではなかったが、第２１日では、対照創傷において器質化組織が多かった。図６において、スケールバーは５０μｍを表わす。

図７は、対照創傷と比較して、糖尿病性創傷において創傷は、血管分布の減少を実証したことを、レクチン染色を用いて示している。図７において、スケールバーは２５μｍを表わす。

ＤＡＰＩによって染色された試料の画像解析によって、正常な創傷治癒過程と一致して、対照創傷は、第１０日においてより多くの細胞を有し、第５日では、細胞計数はほとんど好中球によって支配され、糖尿病において見られる高い計数が説明されることがわかった（図８）。これは、このモデルにおける障害性創傷治癒と一致している。散乱は、細胞とコラーゲンの両方の影響を受けるので、ＮＩＲからのμ_ｓ’とＤＡＰＩ画像解析からの細胞計数との間に統計的な相関はなかった。

コラーゲンに対するトリクローム染色
相対コラーゲン濃度を、組織のトリクローム染色の画像解析によって計算した。図９に示すように、時間経過において対照創傷と比較するとき、コラーゲン濃度は、糖尿病性創傷において減少した。

ＤＲＳデータ
図１０に示すように、コラーゲンはＲＤＳ散乱関数と相関があった。図１０にも示すように、糖尿創傷および対照創傷において時間経過とともに得られた、ＤＲＳ散乱関数は、治癒中に観察されたコラーゲンの増加とも相関があった。図１１に示すように、糖尿病性創傷は、吸収係数データから予測されるように、より低い血管内方成長を含んでいた。

考察
上述の実験は、動物モデルにおいて、正常創傷治癒率と障害性（遅延）治癒とを区別するのに適当なデータを収集するのに近赤外分光法が使用できることを実証している。正常創傷治癒中の６８５ｎｍ、７８５ｎｍ、および８３０ｎｍにおける吸収係数の値が上昇することから、血管内方成長が進行するにつれて血液量が増加することが示唆された。糖尿病性創傷における散乱係数に顕著な差があり、炎症細胞の数との関係またはコラーゲン濃度の減少との相関が示唆された。散乱係数はまた、コラーゲンまたは血管器質化の関数である可能性がある。このモデルにおけるＮＩＲ散乱係数は、コラーゲン濃度または細胞計数との相関はないが、おそらくは調べられた組織の深さの理由で、血管器質化と相関がある。

拡散反射分光法（ＤＲＳ）は、生物組織の表面のせいぜい５００μｍの構造および組成についての定量的な情報が得られる、非侵襲的光学的方法である。ＤＲＳは、３３０〜８３０ｎｍの波長の光が組織に進入したときの、光学的信号の減衰を直接的に測定する。吸収は主として、発色団である酸化ヘモグロビンおよび還元ヘモグロビンによるものであり、散乱特性は、細胞、オルガネラ、および不均質組織構造のサイズおよび分布に関係し、主として間質のコラーゲン繊維の影響を受ける。コラーゲン繊維は直径が約２〜３μｍであり、約０．３μｍのコラーゲン原繊維で構成される。コラーゲン繊維からの散乱は、可視範囲において支配的である。近赤外分光法（ＮＩＲ）は、７００〜１０００ｎｍの波長を使用し、光源と検出ファイバの距離に応じて、ＤＲＳより大きい侵入度を有する（使用したプローブに対しては３〜５ｍｍ）。ＤＲＳは、１００〜５００ミクロンからの情報のみを与える。ＤＲＳに使用される侵入度と波長が理由で、血管器質化および好中球の存在は、ＤＲＳ散乱においては、コラーゲン濃度と比較して要因となることは少ない。したがって、これらの２つの方法は、相補的な情報を与える。

上記の実験において、本発明者らは、創傷治癒期間中の吸収係数の変化の差を定量することができた。対照創傷において、吸収係数の変化の速度（図４）は、糖尿病性創傷と比較して、６８５ｎｍ、７８０ｎｍ、および８３０ｎｍにおいて一貫して高かった。これは、より迅速に進行した対照における血管成長と同様に、対照における血管内方成長によって予測される挙動である。このことは、血管密度に対するトリクローム染色およびレクチン染色の画像解析によって確認された。ＤＲＳによって定量された散乱関数は、糖尿病性創傷および対照創傷の両方においてトリクローム染色によって定量されたコラーゲン濃度と非常によい相関があった。

要約すると、近赤外分光法を使用して得られた吸収係数は、治癒中に、組織学的に見られた血管内方成長と、血管染色によるそれの両方と相関があり、慢性創傷（例えば、糖尿病性、圧迫潰瘍、血管潰瘍、偏在性潰瘍、および／または虚血性創傷）を対照（非障害性または正常に治癒中の）創傷から区別することができ、創傷内の圧迫潰瘍および／または静脈潰瘍を識別することができた。拡散反射分光法（ＤＲＳ）を用いて得られた散乱関数データは、治癒段階中にコラーゲン濃度の増加と相関があった。創傷の近赤外撮像を使用することによって、臨床医は正常創傷治癒を評価して、組織学的相関物に基づいて最適な創傷治癒径路を開発することができる。高圧酸素および局所成長因子などの活性創傷治癒剤は、障害性創傷の治癒径路を正常創傷のそれにシフトさせることが期待される。上述したデータ収集技法は、創傷の治癒状態に互いに関係づけて、例えば、研究者が治癒過程と治癒過程に干渉する機構を研究することを可能にすることのできる値をモニタリングするのに使用することができる。創傷の治癒状態は、何らかの診断または治療が必要かどうかを決定するのにも使用することができる。

創傷の深層組織モニタリング
上記のように、拡散反射分光法（ＤＲＳ）技法は、深さが最大１ｍｍまでに対して創傷組織に関するデータを収集するのに使用することができる。しかしながら、近赤外分光法の拡散光子密度波（ＤＰＤＷ）法を使用することによって、皮膚または組織表面から数ミリメートルから数センチメートルまでの組織生理機能をさらに調査することができる。専用計器が構築されて、組織がその光にできる限り透明に見える、近赤外波長（６５０〜８７０ｎｍ）において作動される。このような波長において、組織の吸収係数μ_ａは、可視波長におけるその値よりも著しく低い。組織内での光の伝播は、３つの現象：散乱、吸収および様々な層からの反射によって特徴づけられる。拡散方程式は、連続する光子散乱事象間の特性距離（平均自由行程）が、１／μ_ａよりずっと小さいが、入射光の波長よりも大きい場合に、組織内の光伝播を説明することができる。

次いで、組織内の光伝播の支配的な現象は、細胞、オルガネラ、毛細管、ならびにその他の界面および組織構造による多重光散乱である。これは、ヘモグロビン、水および脂質の吸収が相対的に非常に小さい（ヘモグロビンに対して、ＤＲＳ法において血液酸素化を定量するのに使用される範囲である５４０〜５８０ｎｍでの吸収と比較して、３０〜５０倍少ない）、ＮＩＲ波長において実際に当てはまる。さらに、ＮＩＲ波長の選択された範囲において、酸化ヘモグロビンおよび還元ヘモグロビンのスペクトルは互いに有意に異なっており、特定の波長におけるそれらの吸光係数が既知である場合には、両方の種類のヘモグロビンの絶対濃度、およびその結果として、酸素飽和の計算を可能にする。拡散方程式の特殊境界条件に対して、実験データから特定のＮＩＲ波長における吸収および散乱係数の計算を可能にする、単純な閉形式解を得ることができる。

ＤＰＤＷ法は、血液酸素化および血液体積、水および脂質含有量についての定量的な情報に加えて、組織構造の変化について定性的な情報を得ることができる。この非侵襲的光学的方法が、内科医によって広範囲の内科病理学を診断するのに用いられるデータを収集するのに使用される、多数の生物医学的な応用例がある。これには、腫瘍血管形成におけるように、組織への血液供給が疾病の結果として大きく変わる場合が含まれる。脳卒中、動脈瘤、または脳損傷および頭部傷害において、出血または虚血を光学的方法によって判定することができる。さらなる応用が、ヒトの筋肉の血行力学、抹消血管疾患、光力学療法（ＰＤＴ）の制御、および病変部モニタリングの領域にある。

皮下病変部の特徴解析を行い、火傷による壊死の深さを評価するのにＤＰＤＷ法を使用する可能性は、Trombergらによる“Reflectance measurements of layered media with diffuse photon density waves: a potential tool for evaluating deep burns and subcutaneous lesions,” Phys. Med. Biol., 1999, Vol. 44(3), pp. 801-813と題するの論文において最初に考察された。本発明者らによる先の研究（Papazoglou他、“Optical Properties of Wounds: Diabetic Versus Healthy Tissue,” IEEE Transactions on Biomedical Engineering, 2006, Vol. 53(6), pp. 1047-1055）において、動物モデルにおいて糖尿病性創傷と正常創傷とを区別するのに、ＮＩＲ波長におけるＤＰＤＷ法を使用することが報告された。その研究においては、創傷および非創傷組織の光学特性の時間変化がＤＰＤＷ法を用いてＮＩＲ波長で創傷治癒の全過程でモニタリングされた、２つの新しい動物試験の結果が報告された。

吸収係数および散乱係数は計算が可能であり、また血液酸素化は、半無限境界条件での拡散近似を使用することによって定量化することができる。本発明者らのアプローチは、創傷組織の光学特性をｉｎ ｖｉｖｏで測定し、光吸収係数を使用して組織酸素化を計算することであった。侵入度は、関係する生理学的深さにおいて達成されるので、スペクトルデータの経験的なフィッティングを行う必要性はない。本発明に従って採取されたｉｎ ｖｉｖｏ測定値から得られたデータは、壊死性熱傷組織または皮膚病変部の試験にＤＰＤＷを使用することの利点についてのTrombergらの結論を強化、支持するものである。治癒の過程における、創傷側と非創傷側の間の組織光学特性の差異は、その炎症状態やその治癒の割合などの、組織の生理学的な変化についての情報を明らかにすることができる。以下に示す結果は、創傷治癒工程をモニタリング、定量化するのにその値を使用することのできるデータを収集するのに、ＮＩＲ方法は非常に有用であることを示している。

材料および方法
光学的方法
周波数領域ＤＰＤＷ計器が、近赤外ウィンドウ内の６８５、７８０、８３０および９５０ｎｍにおいて、その強度を無線周波数ω＝７０ＭＨｚで変調された４つのダイオードレーザで動物組織を照射した。装置の概略および詳細な説明は、Papazoglouらによる、“Optical Properties of Wounds: Diabetic Versus Healthy Tissue,” IEEE Transactions on Biomedical Engineering, 2006, Vol. 53(6), pp. 1047-1055と題する、前述した文献で参照することができる。後方散乱された光は、アバランシェ発光ダイオード（ＡＰＤ）と直交（Ｉ／Ｑ）復調器に基づく、４つの検出器ブロックに送られる。各検出器におけるＩおよびＱ信号が測定され、これらは、位置合わせされた散乱光の減衰した振幅Ａ_ａｔｔ、および位相シフトΘ_ｌａｇによって求められた。光源ファイバの端部における出力電力は、すべての４つの波長に対して５〜７ｍＷの範囲であった。

拡散近似は、Haskellらによる“Boundary conditions for the diffusion equation in radiative transfer,” J. Opt. Soc. Am. A, 1994, Vol. 11(10), pp. 2727-2741、およびPhamらによる“Broad bandwidth frequency domain instrument for quantitative tissue optical spectroscopy,” Review of Scientific Instruments, 2000, Vol. 71, pp. 2500-2513に記載されているように、半無限組織形状を想定する、時間依存拡散方程式の解に基づいて、組織の吸収係数μ_ａおよび散乱係数μ_ｓを計算するのに使用することができる。拡散方程式に対する閉形式解析を、Phamらによって開示された技法を用いて、動物組織の光学特性を計算するのに使用した。半無限媒体に対するいわゆる外挿条件が、境界においてフルエンス（fluence）率が非ゼロである、非侵襲的臨床応用において良好な近似であることがわかった。

組織内での、光のこのような拡散および「蛇状」伝播の間に、光はその強度が減衰し、また位相がシフトされ、これは、強く散乱する媒体（組織）を通過する、光子の平均飛行時間を反映する。換算散乱係数が、散乱係数μ_ｓの関数として、μ_ｓ’＝μ_ｓ（１−ｇ）で定義され、ここで生物組織に対して、散乱の平均コサイン角度ｇ≒０．９であり、その逆は平均移動長ｌ^＊として定義される。通常、ｌ^＊の２倍または３倍を超える伝播の後に、光子は、光の入射方向の記憶はなく、放射は準等方性であると想定することができる。

ほとんどの生物学的組織に対して、μ_ｓは５〜１５ｃｍ^−１の間にあり、その値が、適当な実験プローブの設計を決定する。本発明者らによって実施された試験においては、動物組織に対してμ_ｓ≒１０ｃｍ^−１と想定して、最適なプローブを設計した。本試験から計算された散乱係数は、約１ｍｍのｌ^＊に対応する、１０ｃｍ^−１の想定値に非常に近かった。本発明者らが使用したプローブ（４ｍｍ）の最小光源‐検出器間隔は３×ｌ^＊よりも大きいので、拡散近似は正しいであろう。

長さ２５ｍｍ、幅７ｍｍで、ソースと検出ファイバ間の間隔＝４、８、１２および１６ｍｍであるTeflon（登録商標）プローブ内に、光ファイバを挿入した。確からしい拡散光の侵入度Ｄ_νを、拡散理論を用いて光源‐検出器間隔ρの関数として評価することができる。この問題の詳細な研究は、Fridolinらによる、“Optical non-invasive technique for vessel imaging: II. A simplified photon diffusion analysis,” Phys. Med. Biol., 2000, Vol. 45(12), pp. 3779-92と題する論文、およびWeissらによる、“Statistics of Penetration Depth of Photons Re-emitted from Irradiated Tissue,” Journal of Modern Optics, 1989, Vol. 36(3), pp. 349-359と題する論文に記載されているが、よく用いられる経験則は、Ｄ_ν≒（１／３〜１／２）ρである。

較正手順
散乱光の測定強度Ａ_ａｔｔは、組織特性だけでなく、アバランシェ発光ダイオード（ＡＰＤ）の感度、検出器ファイバへのカップリング、光ファイバの透過、および各検出器ブロックのゲインにも依存する。位相シフトΘ_ｌａｇは、光学的および電気的な信号の遅延は、ファイバ長およびカップリング、ＲＦ同軸ケーブルの長さ、および検出器回路における何らかの遅延に依存するので、各チャネルにおいて異なる可能性がある。計器較正は、計器ハードウエア部品による変動を、サンプルおよび測定変動から分離することを可能にするために実施する。

第１の計器較正を実施するために、等距離プローブを構築する。４つの検出器ファイバが、同一の１２ｍｍ光源‐検出器間隔で、Teflon（登録商標）プローブ中に挿入される。プローブは、半無限形状における組織光学特性を模擬する、液体光学ファントム（イントラリピッド）の表面上に配置される。第１検出器に対する第２、第３および第４検出器の振幅および位相を等しくする較正係数の組を決定する。その後のすべての実験データは、この較正係数の組を用いて補正する。

なお、数日にわたる実験用の光学的ファントムとしてイントラリピッド溶液を使用することは、その溶液が相分離および劣化によって光学特性を変化させるので、最良のアプローチではない。イントラリピッドを使用するときのオペレータ変動に寄与するさらなる要因は、固体プラスチックプローブを、厳密に溶液の表面上に配置する反復性である。半無限近似を使用することは、空隙がなく、またプローブを液体に浸漬することなく、固体と液体表面の間を完全に接触させることに依拠する。固体ファントムは、これらの課題の一部を克服することができる。シリコーン光学ファントムが、ＮＩＲ装置を較正するために選択した方法であったが、その理由は、これらのモデルは我々の実験の間に光学特性を変えないからである。散乱物として作用する二酸化チタンと、吸収材として作用するカーボンブラックの粒子を分散させた、シリコーンでできた円筒状ファントムを使用した。直径９０ｍｍ、厚さ４５ｍｍの円筒を、活性物質を備える（Silicones Inc製の白金を触媒とする）シリコーンＸＰ５６５から合成し、直径０．９〜１．６μｍのＴｉＯ_２粒子が組織散乱を模擬し、５０％圧縮の、９９．９＋％（金属ベース）（直径＝０．０４２μｍ）カーボンブラックアセチレンが光吸収を模擬した。ＴｉＯ_２とカーボンブラックの両方をAlfa Aesarから入手した。

本発明者らは、気泡のない所望の成分のファントムを確保するために、混合の強度および時間、構成要素の添加の順序、ならびに架橋反応を含めて、これらのモデルの準備を最適化した。微小気泡が存在しないことは、ファントムを薄い層に切断し、光学顕微鏡下でその表面を観察することによって検証した。

光強度を測定するいずれの装置もそうであるように、この計器の、電気出力信号が入力信号の光パワーに比例する域には制限がある。第２の較正はこのように、約１００ｍＶの出力信号で発生する、飽和領域を定義するために実施された。この試験において使用される装置の直線域は、＞５０ｄＢであった。通常のＩおよびＱ復調信号の絶対値は、２〜７０ｍＶの域であった。光なしで測定された信号として定義される、この計器のオフセットは、動物についてのすべての実験の前に測定され、試験を全体を通して平均値が約２５０μＶであって、いかなる実験に対しても５００μＶを超えなかった。この較正実験によって、装置のノイズ等価電力（Noise-Equivalent Power：ＮＥＰ）も計算すること可能となり、それは５ｐＷ／Ｈｚである。

動物モデル
創傷治癒中の組織光学特性を試験するための動物モデルとして、無毛ラットを使用した。これは、広く使用されており、皮膚特性および創傷特性の試験用として受け入れられているモデルである。毛のないことは、創傷部位を剃ることによって導入される炎症の合併症を取り除き、光学測定を妨げない。
２つの独立した試験を、以下に示すように実施した。

第１試験：それぞれが生後５〜６週間で約１５０ｇである、３匹の雌の無毛スプラーグ‐ドーリーラットをCharles River Laboratory (Wilmington、マサチュセッツ州)から購入した。１５週間にわたり測定プロトコルを展開し、測定が開始されるとき、ラットの重さは、それぞれ約３００ｇであった。ラットは、ＮＩＲで４８日間モニタリングし（図１２）、独立した測定値を通常、３〜４日毎に採取した。第４８日に、全ラット上に創傷動物モデルを作製するために、１／４サイズ（４．６ｃｍ^２）の全層創傷（図１３）を、各動物の左背領域に負わせた。全層創傷は表面的な創傷であり、表皮および真皮が、下にある組織を露出させるために取り除かれる。それは切除創傷とは異なり、収縮によって治癒する。１６連の光学測定を、創傷と、創傷の縁端と境界を接する皮膚とについて行った。対称的な測定を、全動物の右背中側について行った（図１３）。

第２試験：第１試験におけるものと同一の１２匹の健常なラットを購入し、重さがそれぞれ約２００ｇとなるまで、４週間その環境に順化させた。独立した測定値を３〜４日毎に採取して、３３日間、すべてのラットについてベースライン近赤外データを収集した（図１２）。第３６日に、動物用手術着で無菌操作法を用いて全層創傷４．６ｃｍ^２を形成した。１つの創傷を、各動物の背中領域の左側に負わせた。各動物の右側は、創傷を与えずに残して、対照部位とした。創傷が完全に上皮再形成すると、第５７日まで、創傷および対照部位についてＮＩＲ測定を行った（図１３）。創傷手術および全光学測定は、動物が動くのを防ぐために、フェイスマスクを介して投与されるイソフルランおよび酸素の麻酔薬を使用して実施した。ＮＩＲ測定を行う前に、運動アーチファクトをなくするために動物に麻酔をかけることは必要であった。動物は、動きが止まるとすぐに測定され、ＮＩＲ測定は長くて１５分間続いた。創傷手術の後、および光学測定の間、Tegaderm（３Ｍ、ミネアポリス、ミネソタ州）滅菌透明包帯で全創傷に覆いをした。手術の後に、全ラットには、創傷を引っ掻くのを防止するために、「エリザベス」型カラーを装着した。

免疫組織化学法
組織切除
第２試験の間に、それぞれ創傷手術の後に、第５日と第１０日に、それぞれ３匹のラットをＣＯ_２窒息によって犠牲にした。創傷および周囲の皮膚は、創傷に反対側の背中の領域と同じように、完全に切除した。この手順は、創傷手術の後に、第２１日に残りの６匹のラットに対して繰り返した。すべての切除された組織は、必要となるまで−８０℃で直ちに冷凍した。

血管染色
組織内の血管に染色をして、血管新生を可視化するために、レクチン染色（細胞を凝集させるか、または複合多糖を析出させる、非免疫由来の糖結合タンパク質）を使用した。レクチンは、内皮細胞に結合して、全体の血管構造を見せるので、血管形成のマーカーとして使用することができる。簡単に言うと、再水和の後に切片を１Ｘ ＰＢＳで１０分間洗浄した。切片は、Alexa Flour 488結合レクチン（Invitrogen L2-1415）を用いて、濃度１：２５０で暗所において３０分間染色し、１Ｘ ＰＢＳで３回、それぞれ５分間洗浄した。

結果
ベースライン
本試験に使用した周波数領域ＮＩＲ計器の安定性および精度が図１４に実証されており、この図は、シリコーンファントム内で測定された、５０日間の過程にわたる吸収係数と換算散乱係数を追跡している。本試験の期間全体を通して、標準誤差は４％未満のままであった。勿論のこと、当業者であれば、適当な時間領域ＮＩＲ計器も同様に使用できることを理解するであろう。

創傷治癒中に起きる光学特性の小さな変化を検出できるようにするためには、使用したＮＩＲ装置は、非常に良い安定性を示す必要がある。そうでなければ、実際の生理学的変化と系統的な装置ドリフトとを見分けることができないであろう。第１および第２の試験における、創傷手術の前のそれぞれ４８日および３６日の期間のｉｎ ｖｉｖｏ測定によって、本発明者らは、動物に対する局所値μ_ａおよびμ_ｓ’を高い一貫性をもって定量することができた。

これらの値は、創傷治癒試験中の光学特性の変化を評価するためのベースライン測定値を形成する。両動物試験からのμ_ａおよびμ_ｓ’に対するベースライン測定値の複合結果が、６８５ｎｍについて図１５に示されている。図１５における誤差バーは、動物間の変動を示し、この変動は、試験２における各時点に対するμ_ａおよびμ_ｓ’の平均値の１５％未満であった。同様の結果が、７８５ｎｍおよび８３０ｎｍ測定値に対しても得られた。３匹の代表ラットに対するベースライン測定値が図１６に示されている。動物内変動は、第２試験における各動物に対するμ_ａおよびμ_ｓ’の平均値の１５％未満であった。

なお、図１５は、全動物に対する平均の吸収係数および散乱係数を時間の関数として示している。試験１および試験２からの、６８５ｎｍにおける（ａ）左背、（ｂ）右背、（ｃ）左背、および（ｄ）右背のベースライン値が示されている。各点は、その日に採取された測定値の平均を表わし、誤差バーは標準偏差を表わす。両方の試験において、ベースライン光学測定値は、各動物の左背および右背上の対称な場所で採取した。第２試験中に得られたベースライン安定性の平均データ（黒い点）は、第１試験（灰色の点）におけるｎ＝３と比較して動物数が多い（ｎ＝１２）ので、装置安定性のより優れた指標である。

図１６は、３つの代表的ラットからの（ａ）および（ｂ）の左背ベースライン値を示す。各点は３つの測定値の平均を表わし、誤差バーは標準偏差を示す。

前記のｉｎ ｖｉｖｏデータを、ファントムから得られたものと比較すると、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ測定の両方に共通する、レーザダイオード、電子回路、およびファイバからのノイズに加えて、さらなるノイズが、実験中に動物組織における生理学的変化から発生しているのは明らかである。このような変化にはいくつかの理由が関係している：ラットの大きさが２ｃｍプローブと比較しても小さいこと。ラットは、測定の間に麻酔されており、動くことができない；しかしながら、呼吸によってプローブ位置に意図しない変化が生じた可能性がある。食糧供給は適宜に行われ、これが、様々な時点における測定部位における血液量に影響を与えた可能性がある。ラットは、ベースライン測定の間に成長を続けており、したがって、時間が過ぎるとともに、わずかに異なる組織体積が試験された。

吸収係数は、全動物に対してすべての時点で、右背側と比べて左背側が系統的に高いという事実に注意されたい（図１５）。第２試験中に、２つの側の差は、０．０１〜０．０１５ｃｍの範囲であり、これは動物生理における非対称性によるものである可能性がある。

創傷治癒中の光学特性
実験において、創傷サイズは、近赤外データを収集したのと同時に採取された、交差偏光ディジタル画像からの創傷表面積を計算することによって求めた。画像解析ツールIMAGE PRO（Media Cybernetics、Silver Spring、マリランド州）を、各創傷の面積を計算するのに使用した。各創傷の元のサイズは、ラットのサイズに比較して大きいが、このモデルに対しては（すべての健常な動物についてと同様に）創傷治癒速度は非常に速く、治癒中に動物における激しい生理学的変化が明らかであった。正規化された創傷面積を、毎日の創傷面積と、手術の日（第０日）の初期創傷面積の比を計算することによって得た。平均正規化創傷面積が図１７（試験２）に示されている。この動物モデルにおける創傷治癒率は、Mastらによって“Optical Measurements of tissue oxygen saturation in lower limb wound healing,” Adv. Exp. Med. Biol., 2003, Vol. 540, pp. 265-9に報告されているように、非線形挙動を示している。データから、治癒率は第３〜第１０日の間で高く、次いで、減速して完全創傷閉鎖に達することが観察される。（なお、第０日および第３日のデータポイントは破線で結んであるが、これはMastらから、治癒率は、第３日より前には高度に非線形の挙動を示すことがわかっているからである。）

全動物に対して創傷治癒中の光学特性の変化をモニタリングした。実験の結果としての６８５ｎｍにおける光学特性の変化が図１８に示されている。創傷の吸収係数は、創傷治癒中に増大しており、実験の全体を通して非創傷部位（図１８、中実の菱形）と比較して、漸近的に０．０３５〜０．０４０ｃｍ^−１、または３５〜４０％だけ高い値に接近する。創傷と非創傷組織とのμ_ａにおける差は、第５日より後では、統計的に有意（ｐ＜０．０１）である。創傷と非創傷組織とのμ_ｓ’における差は、第３日より後では、統計的に有意（ｐ＜０．０５）である。同様の形状の治癒曲線が、その他の波長において観察され、非創傷部位と比較すると、７８０ｎｍにおけるμ_ａは０．０３０〜０．０３５ｃｍ^−１（約３５％）だけ増大し、８３０ｎｍにおけるμ_ａは０．０４０〜０．０４５ｃｍ^−１（約４０％）だけ増大している。

図１８において、（ａ）は、試験１における動物に対して、創傷治癒中の６８５ｎｍにおけるμ_ａを示し（平均±標準偏差）、（ｂ）は同じくμ_ｓ’を示している。創傷手術は第０日に実施した。中空の三角形は、創傷の縁端において採取された測定値を表わし、中空の四角形は、創傷の中心において採取された測定値を表わし、中実の菱形は、非創傷部位の対照測定値を表わす。図１８において、（ｃ）は、試験２における動物に対して、創傷治癒中の６８５ｎｍにおけるμ_ａを示し（平均±標準偏差）、（ｄ）は同じくμ_ｓ’を示している。ここでも、創傷手術は第０日に実施した。中空の四角形は、創傷の中心において採取された測定値を表わし、中実の菱形は、非創傷部位での対照測定値を表わす。各時点における創傷中心データと対照データを比較するために、両側の、対応のあるｔ検定（two-tailed paired t-test）を実施した（^＊ｐ＜０．０１、^＊＊ｐ＜０．０５）。

創傷が治癒するにつれて増大するμ_ａの値は、血管形成および新血管新生によるものである可能性があり、このことは、染色された内皮細胞に対して図１９に示すように、血管のレクチン染色画像において血管内方成長が時間とともに増大した、免疫組織学的解析によって支持される。図１９は、血管構造が染色されている、創傷手術後（ａ）第５日、（ｂ）第１０日、および（ｃ）第２１日での創傷組織のレクチン染色画像を示す。血管構造の数とサイズは、創傷が治癒するにつれて増大する。

図１８からわかるように、創傷の中心の測定値から得られたμ_ａの値は、特に、創傷がプローブと比較してサイズが大きい、最初の数回の測定値対して、創傷周辺領域の測定値から得られる吸収係数と（実験誤差内で）同一である。このことは、両方の動物試験において一貫しており、実験の幾何形状によって説明することができる。使用されたものと類似の幾何形状を用いた、これらの波長における光子侵入度の試験によって、１６ｍｍの光源‐検出器間隔を有するプローブは、その表面から最大５ｍｍまでの組織体積から散乱光を記録することが示されている（Weiss他、“Statistics of Penetration Depth of Photons Re-emitted from Irradiated Tissue,” Journal of Modern Optics, 1989, Vol. 36(3), pp. 349-359）。創傷中心と創傷周辺で測定された光学特性間の類似性は、測定された組織が皮膚表面下に位置しており、したがって、プローブが創傷の中心または周辺に配置されるときに、重畳する組織体積が調べられることの証拠となる。この観察は、光ファイバプローブが開口創傷の表面に直接的に接触することなく、創傷をモニタリングすることができることを示しているので、臨床的に有用である。

図１８のデータは、正常な創傷治癒中に、ＮＩＲ波長における組織の光学特性が測定可能に変化し、したがって創傷の吸収係数の変化を測定することによって、治癒を追跡することができることを示唆している。酸化ヘモグロビン濃度（［ＨｂＯ_２］）および還元ヘモグロビン濃度（［Ｈｂ］）を、μ_ａおよびμ_ｓ’の値からランベルト・ベール（Beer-Lambert）の式：

の変形形態を用いて計算し、ここで

および

は、還元ヘモグロビンおよび酸化ヘモグロビンの分子吸光係数であり、

は、純水の吸収係数、［％Ｈ_２Ｏ］は測定組織内の水の百分率であり、それは７０％と想定される。平均ヘモグロビン値は、図２０に示すように創傷治癒中に増大した。実験の精度限界の範囲で、酸素飽和における有意な変化は、図２１に示すように創傷治癒の過程で得られなかった。酸素飽和は、

で定義され、ここでＨｂＯ_２およびＨｂは、酸化ヘモグロビンおよび還元ヘモグロビンの濃度である。

このような小さな変化は、創傷環境へのヘモグロビン送達は、創傷の周囲の領域における微小血管損傷、血管狭窄、および凝固によって中断されるので、酸素飽和は、創傷治癒に感度のある尺度ではないと示唆した、T.K.Hungらによる“Oxygen and wound healing,” Hyperbaric Medicine 2000, 8th Annual Advanced Symposium, 2000、およびJonssonらによる“Tissue oxygenation, anemia, and perfusion in relation to wound healing in surgical patients, Ann. Surg, 1991, Vol. 214(5), pp. 605-613における知見を支持している。しかしながら、酸素飽和のわずかな変化とは対照的に、組織の光学特性は、この動物モデルにおいて創傷治癒中に測定可能に変化をする。したがって、組織吸収係数は、創傷治癒中の良好な変化の全体的指標として、適当な感度を有することができる。

考察
ＮＩＲ領域において、ヘモグロビンは、水および脂質とともに６８０〜８７０ｎｍ波長域における主たる吸収発色団であるので、吸収係数μ_ａの変化は、酸化ヘモグロビンまたは還元ヘモグロビンの濃度における変動を反映している。創傷治癒中のＮＩＲ吸収係数（図１８）は、創傷側で０．０２０〜０．０３５ｃｍ^−１だけ増加し、総ヘモグロビン濃度は、０．０６〜０．０７ｍＭだけ増加する（図２０）。このことは、正常な治癒中に、この動物モデルにおいて創傷側と対照側との間の血液量の差が３０〜３５％ある結果として、組織の光学特性は測定可能に変化をすることを意味する。組織が完全に再造形され、系が創傷の動揺から回復した後に、吸収係数が、どのように正常レベル（創傷前）に復帰するかをモニタリングすることは重要である。

左背側と右背側の間のベースライン差を実証する実験結果は、創傷部位に対して、よく理解された光学特性を有する対照部位を選択することの重要性、および反対側位置が最適な対照部位ではないかもしれないことを強調している。臨床応用において、光学測定は、すでに既存の創傷を有する患者について行われる。したがって、創傷部位の吸収係数および散乱係数の傾向を、時間経過とともに注目しなくてはならない。患者創傷の光学特性を、いかなる創傷前ベースラインとも比較することは不可能であるので、診療においては、好適な光学特性を有する対照部位を選択することが望ましい。この対照部位の光学特性は、以下に述べるヒトの試験のベースライン安定性を確立するのに使用される。この実験モデルの枠組みにおいて、仮定の臨床創傷治癒曲線を示す、図２２に実証されているように、適正な治癒が発生する場合には、吸収係数は減少するはずである。黒い実線は、図１８に示す動物試験の結果を表わし、これに対して、その他の線は、治癒中および非治癒中の創傷に対する仮定された曲線である。治癒曲線がベースラインに収束するのに要する時間量は未知である。

実験結果をさらに解析する目的で、この動物モデルにおいてどのように光学データが創傷治癒の過程を反映するかを理解するために、両側ｔ検定を行った。このｔ検定は、平均値とその標準偏差とを単純比較するのと比較して、統計的な有意差とより細かい詳細さで、時間の経過による吸収と散乱の値の差を見つけることを可能にする。創傷治癒の第３日からの吸収係数および散乱係数を、それ以後の各時点からのデータとｔ検定を用いて比較した。図２３に示す結果から、６８５ｎｍ吸収係数に対して得られたｐ値は、第１８日には創傷中心に対して、また第８日には創傷縁端に対して、非常に小さくなる（０．０１のレベル）。図２３は、各時点における平均光学係数を、第３日の平均光学係数と比較するのに使用された両側の、対応のないｔ検定を示す。結果として得られるｐ‐値は、（ａ）創傷の中心におけるμ_ａ、（ｂ）創傷の縁端におけるμ_ａ、（ｃ）創傷の中心におけるμ_ｓ’、および（ｄ）創傷の縁端におけるμ_ｓ’に対して、時間の関数として示されている。

６８５ｎｍにおける吸収は、大部分が、組織代謝活動に対応する還元ヘモグロビンによるものである。したがって、創傷中心において、有意な代謝活動に対して時間遅れがあるかもしれない。他の２つの波長７８５ｎｍおよび８３０ｎｍにおいて、ｐ‐値は系統的に高く、６８５ｎｍ吸収が、他の波長での吸収や酸素飽和よりも、創傷治癒中に発生する代謝変化のより感度の高い指標であることを実証している。これらのデータからの非常に重要なもう１つの結論は、ｐ値が、創傷中心に対するよりも創傷縁端に対して、早く減少することである。これらの結果は、治癒が縁端から始まり、また創傷が収縮により治癒するという、治癒中の創傷モデルと一致している。これは、この動物モデルがその後に続く創傷治癒モードであり、この場合に、代謝活性の増大に伴い、治癒が創傷の「まわり」から始まり、創傷中心が、上皮形成（新皮）が形成される最後の場所である。

実証された装置の安定性によって、６〜１２か月の期間にまたがる慢性創傷についての測定を行う臨床的環境において、この方法を使用することが可能となる。この結果は、ＮＩＲ法および本発明者が開発した計器は安定であり、かつ創傷治癒に関係する光学特性の変化を検出できることを示唆している。この定量的で非侵襲的な方法は、視覚的な観察と創傷サイズの測定に基づく現在の創傷治癒モニタリングの慣行を補完して、特に糖尿病、圧迫潰瘍（床ずれ）、静脈潰瘍、偏在性潰瘍、虚血、その他による慢性創傷に対する、創傷医療の品質を向上させることができる。さらに、本発明の方法は、そうでなければ創傷の視覚試験時に目に見えない、圧迫潰瘍、静脈潰瘍、その他の識別を可能にする。

要約すると、無毛ラット動物モデルを使用するｉｎ ｖｉｖｏ試験によって、調べられた全ＮＩＲ波長（６８０、７８５、８３０）における組織の吸収係数は、血管新生の増加に対応して、動物の非創傷側と比較して創傷において高いことが実証された。動物の創傷側と非創傷側の間でμ_ａにおいて観察された差は、これらの波長において異なる種類の組織発色団についての証拠が見つかっていないので、従来型の酸化ヘモグロビンおよび還元ヘモグロビンの発色団に帰するものとすることができる。この結果はまた、これらの動物の右側および左側は、その光学特性においてわずかに非対称であり、このことは長期の創傷治癒研究のためにさらに探究する必要があることを実証した。先の実施形態において同様に、上述のデータ収集技法は、創傷の治癒状態に相関づけて、例えば、研究者が治癒過程、および治癒過程を妨げる何らかの機構を試験することを可能にする値をモニタするのに使用することができる。また、創傷の治癒状態は、何らかの診断または治療が必要かどうかを判定するのに使用してもよい。

ヒトのデータ
材料および方法
近赤外計器装備
Papazoglouらによって “Optical properties of wounds: diabetic versus healthy tissue, ” IEEE Trans. Biomed. Eng., 2006, 53(6), pages 1047-55に記載されたタイプの周波数領域近赤外計器を使用した。３つのダイオードレーザ（λ＝６８５、７８０、８３０ｎｍ）から組織へ強度変調光（７０ＭＨｚ）を送出するのに光ファイバを使用した。組織からの後方散乱光をアバランシェ発光ダイオード（ＡＰＤ）と直交（Ｉ／Ｑ）復調器に送出するのに４つの光ファイバ束を使用した。各検出器におけるＩおよびＱ信号を検出した；これらは登録の散乱光の減衰した振幅および位相シフトから求めた。すべての光ファイバは、４つの検出ファイバを光源ファイバから４、８、１２、１６ｍｍの距離で固定して、Teflon（登録商標）プローブ上に動かなくした。

組織の吸収係数および散乱係数は、プローブの光源と検出ファイバの間の最小距離が、輸送平均自由行程の２倍よりも大きいと、拡散近似を用いて散乱ＮＩＲ光の振幅および位相シフトから計算できることは、当業者に知られている。輸送平均自由行程（ｌ^＊）は、平行光線が実質的に等方性になる以前の、それの伝播距離を表わすものであり、組織においてそうであるようにμ_ｓ’≫μ_ａであるときに、１／μ_ｓ’で近似することができる。約２倍の輸送平均自由行程を超えて伝播した後に、ほとんどの光子は、多重光散乱を起こしており（すなわち、それらの入射方向と異なる方位にあり）、拡散していると説明することができる。ヒトの皮膚における波長６８５〜８３０ｎｍにおけるμ_ｓ’の値は、通常５〜２０ｃｍ^−１の範囲にあり、したがって、Ｉ^＊は換算散乱係数μ_ｓ’の逆数であるので、輸送長ｌ^＊は、約０．５〜２ｍｍの範囲にある。

このことは、拡散近似を正当にするためのプローブ設計に使用することのできる最小光源‐検出器距離は、２〜４ｍｍであることを示唆する。本発明者らが使用したプローブは、光源と検出ファイバの間の最小距離が４ｍｍであり、したがって、拡散近似レジームの範囲内にある。拡散方程式に対する閉形式解析は、半無限測定形状に対して導出されており、このような形状は、光源および検出器が空気‐組織インターフェイス上に設置され、光ファイバ光源が等方性の、点光源としてモデル化されるとき、非侵襲的組織測定に典型的なものである。光強度の測定値からの吸収係数および散乱係数を、光源‐検出器間隔距離の関数として光強度および位相シフトの測定値から説明する最終方程式は、Papazoglouらによる前述の文献に含まれている。

そのヒトの試験は１年以上にわたって続き、したがってそのような測定の過程における装置の安定性を試験する必要があった。このことを達成するために、散乱物質として作用するＴｉＯ_２の分散粒子（直径０．９〜１．６μｍ、Alfa Aesar）と、光を吸収するカーボンブラックアセチレン（５０％圧縮、直径０．０４２μｍ、Afla Aesar）とを含む、シリコーン（XP565、Silicones,Inc.）製の光学ファントムを、各患者測定セッションの前に測定した。６１週にわたってシリコーンファントムから測定された吸収係数を図２４に示してある。特に、図２４は、シリコーン光学ファントムにおけるμ_ａの日々の平均値を６１週期間にわたって示している。各点は、同一日に採取された測定値の平均を表わす。実線は、全測定期間に対する平均値を表わす。標準誤差は、試験の期間を通して、３％未満のままであった。

酸化ヘモグロビン濃度（［ＨｂＯ_２］）および還元ヘモグロビン濃度（［Ｈｂ］）を、これらの波長（以下の式の左辺および右辺）における、予測吸収と測定吸収の差を最小化することによって、μ_ａの測定値から計算した：

ここで、

および

は、還元ヘモグロビンおよび酸化ヘモグロビンの分子吸光係数であり、

は、各波長（λ）における純水の吸収係数であり、水の濃度［％Ｈ_２Ｏ］は７０％と想定した。［％Ｈ_２Ｏ］の値の選択は、６８５〜８３０ｎｍ範囲における波長において、水の吸収はヘモグロビンに対して低いので、ヘモグロビン濃度の計算値にはほとんど影響がない。総ヘモグロビン濃度［Ｔｏｔ Ｈｂ］は、［Ｈｂ］と［ＨｂＯ_２］の合計として計算した。

ヒト被験者
糖尿病と慢性創傷をもつ１１人の被験者を、ペンシルベニア州フィラデルフィア、ドレクセル大学創傷治癒センタ（the Drexel University Wound Healing Center）から集めた。全患者は、年齢が１６才から６５才で、少なくとも６か月間の診断記録がある真性糖尿病を有しており、また血管病および／または神経疾患を含む、糖尿病の合併症に副次的な、１ｃｍ^２の最小表面積の足首または足部創傷を有していた。全患者は標準的な創傷医療を受けて、これには、週単位または２週単位の壊死組織切除、湿潤創傷治癒手順での治療、および適当な場合には清拭を含めた。一部の患者において、局所成長因子などの活性創傷治癒剤、高圧酸素、および生物工学による皮膚代用物を用いた。各創傷のサイズ、測定の継続時間、および各創傷について用いた活性治療についての詳細を表１に示した。

表１： サイズ、継続時間、および各創傷に使用した活性治療

表１に示すように、試験に登録された１１の創傷の内、５つの創傷は１５週未満で完全に治癒し、３つの創傷は切断する結果となり、３つの創傷が試験の終了時に未治癒のままであった。５つの治癒した創傷の内の４つは、閉鎖の前に手術介入は必要ではなかったが、１つの創傷は、１８週間試験に参加した後、手術による壊死組織切除と、生物工学による皮膚代用物（Apligraf（登録商標）、Orgnogenesis, Inc.,Canton、マサチュセッツ州）の適用を受け、さらに１７週間経過後に閉鎖に到達した。手術介入の前に得られたデータは、非治癒中の創傷として分類したが、手術後に得られたデータは、治癒中の創傷として分類し、創傷の総数を１２とした（５つの治癒および７つの非治癒）。

すべての拡散ＮＩＲ測定は、週単位または２週単位で、創傷壊死組織切除の前に実施した。各測定セッションの間に、各患者の創傷は、ＮＩＲ計器を使用して最大１０の異なる場所で調べた。測定場所は、各創傷の形状およびサイズに基づいて選択し、４つの概略場所：（１）創傷の直上、（２）創傷の縁端における完全な状態の皮膚の上、（３）使用できる場合には、創傷場所に対称な反対側脚の非創傷組織の上、（４）創傷から少なくとも２ｃｍの距離の、同側脚上の非創傷組織の上、に分類することができる。典型的な糖尿病性足部潰瘍に対するＮＩＲ測定場所を図２５に示してある。右足のかかと上の黒い卵形は、典型的な糖尿病性足部潰瘍を表わす。灰色の四角形は、測定セッション中のプローブ場所を表わす。Tegaderm透明無菌包帯（3M Health Care）を使用して、すべての測定中に光ファイバプローブを覆った。Tegadermの存在は、本発明者らによって、測定ＮＩＲ係数に影響を与えないことがわかっている。

創傷は、各測定セッションの間に、表面反射を低減するために交差偏光フィルタを用いて、Fujifilm Finepix s700ディジタルカメラを使用してディジタル写真を撮影した。創傷面積は、Matlab（Mathworks, Inc.）ソフトウエアで開発された画像解析コードを使用して写真から計算した。

結果
糖尿病性足部潰瘍からの結果
治癒中および非治癒中の創傷の両方において、創傷中心および創傷縁端におけるＮＩＲ吸収係数μ_ａの値は、対照（非創傷）部位におけるμ_ａの値よりも大きかった。すべての治癒中の創傷において、創傷の中心部位および縁端部位におけるμ_ａの値は減少し、対照部位において測定された値に収束した。このことは、図２６に示されており、この図は、典型的な治癒中の創傷に対する試験の過程における、すべての波長におけるμ_ａのプロットを示す。図２６は、代表的な治癒創傷に対する、創傷サイズ、光吸収、およびヘモグロビンデータを示す。左上には、選択された時点からのディジタル写真が示されている。右上には、ディジタル写真の解析により求められた創傷面積を示す（◆）。下方区画には、各測定日からの６８５ｎｍ、７８０ｎｍ、および８３０ｎｍにおけるμ_ａの平均値が示されている。各データ点は、創傷の中心（●）、創傷の縁端（△）、創傷のある足部上の対照部位（＋）、および創傷のない足部上の対称標準部位（×）から得られた測定値の平均を表わす。

以前につまさき全体を切断により失った足部の前方領域に位置する、この創傷の面積は、試験の始めには６ｃｍ^２超であり、１０週間のモニタリング後、閉鎖した。対照的に、非治癒中の創傷のμ_ａの値は、対照部位よりも大きいままであり、試験の過程にわたって収束しなかった。このことが図２７に示されており、この図は、図２６におけるのと同じ特性配置図で、典型的な非治癒中の創傷に対するμ_ａのプロットを示している。創傷のある足部の好適な対照部位は、創傷のサイズと以前の切断が理由で、利用可能ではなかった。足部の足底中足領域（plantar metatarsal region）上に位置する、この創傷の面積は、３７週の過程にわたって約５０％だけ減少し、その後に、膝下切断が実施された。図２８は、サイズが３１．５ｃｍ^２から１．６ｃｍ^２へと１７週にわたって減少し、最初に創傷が治癒しているように見えた、特異な症例に対するμ_ａのプロットを示す。

図２８は、図２６および２７と同じ特性配置図であるが、以前の切断のために、非創傷足部上の好適な対照部位が利用できなかった。しかしながら、足部の足底中足領域上に位置する、この創傷は、完全に閉鎖することはなく、第２５週の後、創傷サイズが１７．３ｃｍ^２に増大し、手術介入が必要であった。試験の初期の１７週の間に、創傷サイズが迅速に減少したにもかかわらず、この創傷部位からのＮＩＲデータは、この試験における治癒中の創傷の特徴である、非創傷データへの収束を示さなかった。このことは、拡散ＮＩＲにより達成されるより大きな侵入度は、創傷サイズの表面的な測定よりも、臨床医に対してより正確な創傷状態の評価を提供することができたことを示している可能性がある。

図２６〜２８における創傷に対する、総ヘモグロビン濃度［Ｔｏｔ Ｈｂ］の計算値が図２９に示されている。図２９において、各測定日からの総ヘモグロビン濃度の平均値が、治癒中の創傷＃１（左）、非治癒中の創傷＃１（中央）、および非治癒中の創傷＃２（右）に対して示されている。各データ点は、創傷の中心（●）、創傷の縁端（△）、創傷のある足部上の対照部位（＋）、および創傷のない足部上の対照部位（×）から得られた測定値の平均を表わしている。予期されるように、ヘモグロビン濃度傾向は、光吸収について観察された傾向と同様である。

光学データにおける変化率
本発明者らは、臨床データを解析するために、観察された傾向を説明し、かつ臨床的な結果を代表する共通パラメータを識別する。特に、各波長における吸収係数の時間変化率に加えて、ヘモグロビン濃度の時間変化率は、各創傷からのデータを線形の傾向線に当てはめることによって評価することができる。データ精度に加えて、この試験の間に収集された実験データの量が限定されていことから、今回はより複雑なフィッティングモデルを使用することができなかった。傾向線の傾きは、光学特性の時間による変化率と対応することがわかり、治癒中の創傷の進行を定量化するのに有用であることが証明された。光吸収およびヘモグロビン濃度傾向線から計算された傾きは、本明細書では、各創傷における変化率と呼ぶことにして、それぞれ図３０および３１に示してある。

全創傷に対する光吸収における変化率が、左：６８５ｎｍ、中心：７８０ｎｍ、および右：８３０ｎｍの波長において、図３０に示されている。同様に、全創傷に対してヘモグロビン濃度の変化率が図３１において、左：総ヘモグロビン濃度、中央：酸化ヘモグロビン濃度、および右：還元ヘモグロビン濃度、に示されている。白色のバーが、治癒中の創傷の中心からのデータを表わし、明灰色バーが治癒中の創傷の縁端からのデータを表わし、暗灰色バーは非治癒中の創傷の縁端からのデータを表わし、黒色バーは非治癒創傷の中心からのデータを表わす。すべての治癒中の創傷において、各波長における光吸収係数、総ヘモグロビン濃度、および酸化ヘモグロビン濃度に対して負の変化率が観察された。すべての非治癒中の創傷において、上記の特性に対する変化率は、ゼロに近いか、またはわずかに正であった。還元ヘモグロビン濃度に対する変化率は、治癒中および非治癒中の創傷の両方において、ゼロに近かった。

図３２において、治癒中および非治癒中の創傷における平均変化率が、すべての光吸収係数（６８５ｎｍ、７８０ｎｍ、および８３０ｎｍにおけるμ_ａ）およびすべてのヘモグロビン濃度（［Ｔｏｔ Ｈｂ］、［ＨｂＯ_２］、および［Ｈｂ］）に対して比較される。図３２において、誤差バーは標準偏差を表わす。図３２では、片側異分散ｔ検定を使用して、治癒中および非治癒中の創傷における変化率間の差を試験し、ここで^＊ｐ＜０．００５、^＊＊ｐ＜０．０１である。図３２に示すように、治癒中と非治癒中の創傷の傾き間の統計的に有意な差が、各波長における光吸収係数、総ヘモグロビン濃度、および還元ヘモグロビン濃度に対して得られた。

治癒中および非治癒中の創傷データの統計的特性解析
光学特性の変化率に加えて、創傷からの光学データの統計的特徴は治癒可能性の指標とすることができる。図２６〜２８の視覚的比較から、治癒中のデータにおけるよりも非治癒中のデータにおいて週毎の変動が大きいことわかる。変動差を定量化するために、当てはめた１次多項式からの実験データの根２乗平均偏差（ＲＭＤＳ）を計算した。ＲＭＳＤ値は、各創傷に対する実験値を平均で除することによって正規化した。図３３は、各波長における光吸収および全ヘモグロビン濃度（酸化、還元、および総ヘモグロビン濃度）を使用して、治癒中および非治癒中の創傷における正規化ＲＭＳＤの平均値を比較している。図３３において、ラインの正規化ＲＭＳＤは、光吸収（左）データおよびヘモグロビン濃度（右）データに対して当てはめられる。平均正規化ＲＭＳＤは、すべての吸収係数およびヘモグロビン濃度に対して、治癒中の創傷におけるよりも非治癒中の創傷において大きかった。

考察
本発明者らは、組織病理学および免疫組織学により検証された、血管新生に関係する創傷のＮＩＲ光学特性の変化に基づく、治癒の仮定モデルを開発した。具体的には、動物試験の結果から、治癒中の創傷において血液量が増加するにつれて、光吸収が増加することが実証された。本発明者らは、創傷が閉鎖した後にＤＰＤＷ測定を続けると、血管密度／血液量が正常レベルまで減少するにつれて、創傷治癒の後期増殖段階中に光学的吸収が減少することが予想されるとさらに仮定した。吸収におけるこのような減少は、７匹の肥満したＺｕｃｋｅｒ糖尿病肥満（ＺＤＦ）ラットにおける創傷治癒の未発表の予備試験によって確認されており、その試験では、治癒サイクル全体を通して、および創傷閉鎖の後、４２日間、ＤＰＤＷ法を使用して創傷をモニタリングした。８３０ｎｍにおける測定された光吸収係数は、図３４に示すように、予想通りの挙動を示し、第３３日における創傷閉鎖の前には増加し、次いで試験の残りの４２日間、徐々に減少した。図３４における各データ点は、創傷の中心（●、黒色ライン）、および創傷の縁端（△、灰色ライン）から得られた測定値の平均を表わす。

創傷治癒中に観察される光学的変化の仮定モデルを図３５に示してある。図３５において、黒色点線は正常（非創傷）組織を表わし、これに対して下降する黒色破線は、治癒中の創傷に対して仮定される曲線を表わす。灰色のマークは、非治癒中の創傷についての測定値を表わす。ヒトの患者に対するＮＩＲ光吸収の時間依存性は、動物試験の間に観察されたものと異なることが予想される。ヒトの患者が最初に診察されるのは、すでに発達した慢性創傷を有するときであり、治癒モデルにおける、高いがまだ一定の吸収レベル（非治癒中の指標）に対応する。治癒における進展があるとそれは、ＮＩＲ吸収係数における減少によって発現するとともに、非創傷組織の値（図３５、黒色破線）への収束として現われる。治癒しない創傷においては、レベルは、非創傷組織（図３５、灰色マーク）に収束しないと予想される。図３２にまとめられた、治癒中の創傷および非治癒中の創傷における変化率は、仮定治癒モデルと一致しており、臨床医が治癒中の創傷と非治癒中の創傷を区別するのを助ける、定量的な「治癒指標」の基礎を提供することができる。

ＤＰＤＷデータから導出される定量的治癒指標の予測能力は、より多くの時点で測定値を採取する、より多くの患者の試験によって確認することができる。第１の近似として、各創傷における［Ｔｏｔ Ｈｂ］の時間変化率を、最初の１０週の測定値からのデータを線形の傾向線に当てはめることによって計算した。図３６において、１０週傾向線の傾きが、使用できる全データから計算した傾きと比較されている。図３６には、全創傷の中心からの総ヘモグロビン濃度における変化率が示されている。暗いバーは、使用できる全測定値を使用して計算した率を表わし、明るいバーは、各創傷に対して使用できる最初の１０週の測定値を使用して計算した率を表わしている。負の変化率が治癒していると予測し、それに対して無視できる変化率は治癒していなと予測するように、負の変化率と無視できる変化率の間の閾値を−０．００３ｃｍ^−１／週と考えると、１００％の治癒中の創傷が正しく分類され（４の内４）、７１％の非治癒中の創傷が正しく分類される（７の内５）。予想傾向を確立するのに必要な時間は、測定をより頻繁に行えば、短縮できると思われる。各創傷は、最初の１０週期間中に平均して５．０回測定され、５つの測定データが統計的に適切な傾向線を確立するのに適当であると思われるので、［Ｔｏｔ Ｈｂ］傾向は、１０週のデータを使用して測定した。ＤＰＤＷ測定が毎週実施される場合には、５週間で予測傾向線を確立することも可能である。

治癒中の創傷内の酸化ヘモグロビン濃度の変化率は、図３１に示されるように、還元ヘモグロビン濃度の変化率よりも大きい。創傷治癒の後期の炎症段階／初期の増殖段階の間は、血管形成により、創傷への酸素化された血液の供給が増加し、結果として［ＨｂＯ_２］の値が増大する。後期の増殖段階においては、血管形成は停止して、血管はアポトーシスの結果として崩壊し始める。結果として生じる創傷への酸化ヘモグロビン供給の減少は、図３１において観察される［ＨｂＯ_２］の負の変化率によって反映されることになる。還元ヘモグロビンの濃度は、創傷床内部の代謝活動を反映し、創傷に酸素化された血液が適当に供給されていると想定すると、比較的に一定で存続すると予想されることになる。これによって、治癒中の創傷における［Ｈｂ］の変化が［ＨｂＯ_２］の変化よりも顕著ではないことの理由を説明することもできる。

慢性創傷（例えば、糖尿病性の圧迫潰瘍、血管潰瘍、偏在性潰瘍、および／または虚血性創傷）は、治癒過程の様々な段階で「止まっている（stuck）」のかもしれないと仮定された。図２７および２８に表わす障害性（非治癒中の）創傷は、治癒の増殖段階終了まで達する前に、「停止（arrest）」して、結果として、正常組織よりも常に大きく、非傷害性（治癒中の）創傷のように減少しない酸化ヘモグロビン濃度が生じた可能性がある。さらに、糖尿病患者における神経疾患および長期の炎症応答が、糖尿病性足部潰瘍の原因における重要な要因であるという証拠がある。糖尿病性神経疾患は、足部への正常な大血管の血流を有する患者においてでも、足部における微小循環不全に関連している。足部の微小血管内部の反復的な虚血および血流再開は、足部潰瘍における炎症のサイクルにつながり、創傷治癒過程をさらに悪化させる可能性があると仮定した。図３３に示す治癒中の創傷と比較した、非治癒中の創傷における週ごとの高度な変動は、この仮説を支持しており、創傷の微小循環および炎症状態の周期的変化の兆候ともなり得る。

要約すると、ヘモグロビン濃度に関係する糖尿病性足部潰瘍のＮＩＲ光学特性における時間的変化は、本発明の技法を使用して測定することができる。測定値における変化は、時間経過による治癒進行をモニタリングするのに使用することができる。このような変化は、時間経過による光吸収係数およびヘモグロビン濃度における線形変化率および週ごとの変動を計算することによって定量化することができる。これらの測定規準（metrics）は、ヒトの糖尿病性足部潰瘍の試験において、治癒中（非障害性）創傷と非治癒中（障害性）創傷を区別するのに使用され、近赤外波長におけるＤＰＤＷ法は、創傷治療臨床医に、治療選択肢を決定するときに、総合的な創傷健全性の評価を助ける客観的かつ定量的なデータを提供することができることを示した。言い換えると、総合的創傷健全性は、何らかの治療が必要かどうかを決定するのに使用することができる。治療の性質は、創傷の性質、患者が糖尿病かどうか、創傷の治癒率、その他を含む、多数の要因に依存することになる。

当業者であれば、本明細書で開示した近赤外（ＮＩＲ）手法は、光源ファイバ‐検出ファイバ距離に依存する距離において、２ｍｍから数ｃｍの組織の深さの範囲である、皮膚／創傷表面下の組織を検出することを理解するであろう。したがって、組織の光学特性を評価することができるとともに、酸化ヘモグロビンおよび還元へのグロビンの濃度、したがって組織酸素飽和を評価することができる。このことによって、本方法は、血液供給における問題、または患部への酸素供給における問題によって生じる、様々な虚血性環境において使用することが可能となる。すべての場合の障害性治療および表面下循環障害を、開示した手法によって評価することができる。例えば、新生の圧迫潰瘍（床ずれ）または偏在性潰瘍は、ＮＩＲ法によって評価することのできる環境および組織状態を表わす。表面撮像は、圧迫潰瘍または床潰瘍の根底にある問題を、その潰瘍が表面に出る前に明らかにすることができないが、そのような状態に先行して起こる、血液および／または酸素の供給不良は、本明細書に記載するＮＩＲ手法によって非侵襲的に評価することができる。

また当業者であれば、例示的な実施形態において、本発明の新規の教示と効果から実質的に逸脱することなく、多くの追加の改変が可能であることを容易に理解するであろう。例えば、改変型のより簡単な（例えば、連続波）またはより複雑な（例えば、時間分解の）方法、または周波数領域計器のより高い周波数での変調は、上述の技法を使用して提供されるのと類似の情報を提供することができる。これら、およびその他の明白な拡張も、本発明の範囲に含まれるものである。したがって、そのような改変は、以下の例示的な特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲内に含めることを意図するものである。

Claims (16)

1. 創傷組織を光源からの光で照射するステップ、
   前記光が前記創傷組織中を伝播するときに、前記光の振幅および／または位相シフトを測定するステップ、
   該測定値を使用して光吸収係数および／または換算散乱係数を計算するステップ、および
   創傷組織内のコラーゲン濃度と、測定パラメータから計算された前記換算散乱係数とを相互に関係づけるステップ、および／または前記測定値を使用して、前記創傷組織内の血管内方成長および／または虚血と、光吸収係数とを相互に関係づけるステップ
   を含む、創傷の治癒状態に関する情報を収集する方法。
2. 時間経過による換算散乱係数の変化から、時間経過によるコラーゲン濃度の変化を定量すること、および／または時間経過による光吸収係数の変化から、時間経過による血管内方成長および／または虚血の変化を定量することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 光が近赤外波長において伝送される、請求項１または２に記載の方法。
4. 光が６５０〜８７０ｎｍの波長を有する、請求項３に記載の方法。
5. 近赤外波長が、６８５ｎｍ、７８０ｎｍ、８３０ｎｍ、および９５０ｎｍのうちの１種を含む、請求項３に記載の方法。
6. 光が、レーザーによって出力され、創傷組織内に拡散光子密度波（ＤＰＤＷ）を生成するように変調される、請求項３に記載の方法。
7. 創傷表面積を計算することによって、創傷のサイズを測定することをさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 異なる時点における創傷の表面積の間の差分を計算し、該差分を前記創傷の元の表面積によって除することによって、前記創傷の治癒率を測定することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
9. 創傷組織におけるコラーゲン濃度と、換算散乱係数とを相互に関係づけるステップは、創傷において時間経過により得られた拡散反射分光散乱関数における増分と、前記創傷の治癒中のコラーゲンの増分とを相互に関係づけることを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 時間経過による拡散反射分光法（ＤＲＳ）測定値を採取することによって、時間経過による創傷内のコラーゲン濃度を測定することをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 時間経過による創傷内の血管内方成長および／または虚血の変化を測定し、時間経過により創傷から得られる光吸収係数と、障害性創傷および対照創傷に対して、組織学的に見た血管内方成長および／または虚血とを相互に関係づけることによって、障害性創傷と非障害性創傷とを区別することをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 時間経過による光吸収係数の変化から、創傷内の圧迫潰瘍または静脈潰瘍を検出することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
13. 照射するステップおよび測定するステップは、創傷に接触しない、連続波、周波数領域、または時間領域の測定装置を使用して実行される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 光吸収係数および／または換算散乱係数の計算、および血液酸素化の定量化が、半無限媒体に対する拡散方程式を使用して行われる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 創傷が治癒しているかどうかの指標として、時間経過による酸化ヘモグロビンの変化をモニタリングすることをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 時間経過による光吸収係数およびヘモグロビン濃度の変化および変動の割合を計算することによって、酸化ヘモグロビンの変化を定量化することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。

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