CN105319181A - 一种生物组织热损伤参数的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物组织热损伤参数的测定方法，利用经由近红外漫反射光谱计算得出的约化散射系数定量监测不同温度加热条件下生物组织的热损伤进程，进而计算得到生物组织的热损伤活化能和分子碰撞频率因子；由此可知：本发明具有生物组织热损伤过程的监测方法简单有效、样品制备方法简单、热损伤参数的计算方法更加合理等优点。

Description

一种生物组织热损伤参数的测定方法

技术领域

本发明涉及一种生物组织热损伤参数的测定方法，尤其是一种基于测量热损伤过程中生物组织近红外约化散射系数μ'_s的变化，从而间接测定生物组织热损伤活化能E_a及分子碰撞频率因子A的方法。

背景技术

近年来肿瘤热疗技术的不断发展，促使人们对生物组织热损伤问题进行了大量研究。肿瘤热疗过程中组织的热损伤程度，直接反映了该部位组织的热疗效果，是肿瘤热疗过程中需要监测的重要因素。生物组织的热损伤程度是由组织的温度和在不同温度下的暴露时间共同决定的。归纳起来，生物组织的典型热损伤机理包括：蛋白质变性、代谢过程改变、细胞物理或化学特性(如膜的超透性、胞内离子浓度)的改变、细胞核老化、肌肉及胶原物质的双折射性质丧失、红细胞血色素缺失等。Henriques和Moritz将热损伤问题归为一种一阶化学反应过程，并给出了描述热损伤程度的模型。该模型是建立在化学反应动力学的基础上的，热激活反应物必须跨越一个能量屏障E_a以生成产物。因此细胞损伤的发生取决于细胞中所储存能量的大小是否高于反应的临界值(即活化能)。若将其看作一阶速率过程，定义损伤函数Ω，其变化率dΩ/dt与温度有关，是在整个热变性时间内的积分：

$\mathrm{\Ω}={\∫}_0^t\left(\frac{d\mathrm{\Ω}}{dt}\right)\·dt---\left(1\right)$

因此细胞的热损伤是一个依赖于温度的速率过程，该过程在t时刻的化学反应速率K(t)(即损伤速率)由Arrhenius公式表达为：

$\frac{d\mathrm{\Ω}}{dt}=K\left(t\right)=A\·e^{-\frac{E_a}{R\·T\left(t\right)}}---\left(2\right)$

式中E_a为活化能，单位是J·mol^-1；R＝8.31J·mol^-1·K^-1，为理想气体常数；T(t)为t时刻组织的绝对温度，单位是K；A为分子碰撞频率因子，表示单位时间内分子碰撞的次数，单位是s^-1。综合式(1)和式(2)可以得到定量描述生物组织热损伤程度的Henriques积分方程，即

$\mathrm{\Ω}={\∫}_0^{t}A\·e^{-\frac{E_a}{R\·T\left(t\right)}}\·dt---\left(3\right)$

由方程可知，根据实验测定活化能E_a和分子碰撞频率因子A之后，即可对生物组织的热损伤问题进行充分研究。

生物组织的热损伤是与温度和时间有关的动态变化过程，包含了细胞分子层面上多种蛋白质等的变性失活。生物组织在近红外波段的光学参数(吸收系数μ_a、各向异性因子g、散射系数μ_s、约化散射系数μ'_s等)在组织热损伤过程中也因组织形态、结构的改变而动态变化。散射系数μ_s在热损伤前后的变化最为明显，其随时间和温度变化的规律能够用来定量反映热损伤程度的进程。而因为热损伤前后各向异性因子g的变化较小，因此约化散射系数μ'_s与散射系数μ_s具有近似相同的变化规律。具体来说，在t时刻，当温度为T时，μ'_s的改变量为：

Δμ'_s(t,T)＝Δμ'_smax(T)·(1-e^-Ω)＝Δμ'_smax(T)·(1-e^-K(T)·t)(4)

其中，Δμ'_smax(T)为在温度T下的μ'_s最大改变量。由式(4)可知，通过测量生物组织热损伤过程的μ'_s变化，可以间接测得组织的热损伤活化能E_a和分子碰撞频率因子A。

研究表明，多种生物组织的近红外漫反射光谱在700～850nm波段具有很好的线性度，这段光谱的斜率与此波段的生物组织约化散射系数μ'_s存在比例关系。通过模型实验，μ'_s可以利用光谱斜率计算得出。常用的模型实验样本由模拟胶(Phantom)制备，用来模拟具有不同μ'_s的生物组织，而模拟胶的标准μ'_s则以血氧分析仪OXImeter的测量结果为准，通过系列实验可以得出计算μ'_s的公式。因此，利用μ'_s作为定量监测生物组织热损伤程度的指标可以测定不同生物组织的热损伤参数。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何方便、准确的测量生物组织的热损伤活化能E_a及分子碰撞频率因子A。为此本发明利用经由近红外漫反射光谱计算得出的约化散射系数μ'_s定量监测不同温度加热条件下生物组织的热损伤进程，进而计算得到生物组织的热损伤活化能E_a和分子碰撞频率因子A。

本发明为解决上述问题提出如下技术方案：

一种生物组织热损伤参数的测定方法，利用经由近红外漫反射光谱计算得出的约化散射系数μ'_s定量监测不同温度加热条件下生物组织的热损伤进程，进而计算得到生物组织的热损伤活化能E_a和分子碰撞频率因子A；其中：

热损伤活化能E_a和分子碰撞频率因子A满足下式：

$\ln K=-\frac{E_a}{R}\·\frac{1}{T}+\ln A$

上式中：K为生物组织的细胞热损伤速率，通过归一化约化散射系数μ'_s变化曲线计算而得，Ea为热损伤活化能；A为分子碰撞频率因子；R为常数，取值8.31J·mol^-1·K^-1；Δμ'_smax为在温度T下的μ'_s最大改变量；μ'_s为约化散射系数；t为时间；

根据t时间内计算的K值，采用最小二乘法拟合lnK与1/T的直线方程，即可得到热损伤活化能E_a及分子碰撞频率因子A。

本发明采用上述技术方案具有如下有益效果：

1.生物组织热损伤过程的监测方法简单、有效。采用由近红外漫反射光谱计算得到的约化散射系数μ'_s来定量监测生物组织热损伤过程，测量系统容易构建，且光纤可以直接插入组织内部进行测量，测量结果为小块组织某一区域的平均值。相比于其他测量方法需要搭建积分球测试系统，本发明的测量方法更容易实施，测量结果更加准确。

2.样品制备方法简单。由于近红外漫反射光谱可以由光纤直接插入新鲜组织进行采集，因此只需将小块样品置于无菌试管中，并用橡皮塞固定插入的光纤和热电偶即可进行对样品进行水浴加热并采集数据，无需进行组织冰冻切片，大大减少了测量工作量。

3.热损伤参数的计算方法更加合理。通过归一化的约化散射系数μ'_s计算得出不同水浴温度下的热损伤速率常数K的变化曲线，然后选择处于一阶化学反应阶段的K最高值与达到该最高值时的温度T进行线性回归分析，拟合方程得到热损伤活化能E_a及分子碰撞频率因子A的值。由于考虑了热损伤过程的不同反应阶段和多个温度下的速率常数值，所以拟合结果更加准确。

附图说明：

图1是在恒温水浴加热过程中监测生物组织约化散射系数μ'_s和温度变化的系统组成。

图2是一组实验中在不同水浴温度加热条件下测得的猪肝约化散射系数μ'_s和温度的变化曲线。

图3是一组实验中计算得出的不同水浴温度加热条件下猪肝速率常数K的变化曲线。

图4是两组实验中计算得到的lnK与1/T的数据及两者拟合得到的直线。

具体实施方案：

下面结合附图对技术方案的实施作进一步的详细描述：

一种生物组织热损伤参数的测定方法，包括以下步骤：

步骤一，约化散射系数μ'_s的定标。为了通过生物组织的近红外漫反射光谱获取其约化散射系数μ'_s，需要先通过不同浓度的模拟胶(Phantom,Sigma)进行参数定标。近红外漫反射光谱的获取是通过双光纤测量系统采集得到的。测量系统由芯径200μm的双光纤、卤素宽带光源(HL-2000,OceanOptics)、光纤光谱仪(USB2000,OceanOptics)和上位机构成，可以实时采集和显示待测样品的近红外漫反射光谱。同时采用生物组织血氧分析仪OXImeter获取样品在690nm处的μ'_s作为定标标准参数。定标过程中，首先配制不同浓度模拟胶的待测样本，然后用OXImeter测量各个样品在690nm处的μ'_s，同时用双光纤测量模拟胶样本的近红外漫反射光谱。计算各个样本的光谱在690nm～850nm波段光谱曲线的斜率绝对值Slope_690-850，将其与标准参数用最小二乘法进行线性拟合，可以得到μ'_s的计算公式为：

μ'_s690＝3.18·exp(0.43·Slope_690-850)(5)

因此，在以下步骤中可以利用此双光纤测量系统实时采集生物组织的近红外漫反射光谱并根据式(5)计算690nm处的μ'_s690，对生物组织的热损伤程度进行分析。

步骤二，热损伤过程中的温度和约化散射系数μ'_s测量。在水浴环境中对生物组织进行恒温加热，测量生物组织的温度和光学参数变化。以猪肝为例，将新鲜猪肝切成长约5cm的条状，重量约为5g，装入无菌具塞试管中。试管直径约为1.3cm，高约为7.5cm，上部橡胶试管塞穿孔，可插入针式热电偶和双光纤，同时测量猪肝的温度和μ'_s变化。如附图1所示，水浴加热在恒温水浴锅中进行，将水浴温度设置为50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，不同温度各加热2例猪肝样本，共12例样本，分为2组，每6例不同水浴温度的猪肝样本为1组，样本全部来自同一猪肝。实验过程中，室温保持20℃，将装有猪肝的试管没入水中约7cm，同时开始记录猪肝温度和μ'_s变化，每秒采集一次数据。数据稳定后停止记录，记录时间分别为50℃下3600s，55℃下2400s，60℃下1200s，65℃、70℃、75℃下600s。其中1组测量结果如附图2所示。

步骤三，热损伤参数的计算。根据式(4)有：

$\frac{{{\mathrm{\Δ\μ}}^{\′}}_s\left(t\right)}{{{\mathrm{\Δ\μ}}^{\′}}_{s\max }}=1-e^{-K\·t}---\left(9\right)$

则可以得到t时刻的速率常数为：

$K=-\frac{ln\[1-\left(\frac{{{\mathrm{\Δ\μ}}^{\′}}_s\left(t\right)}{{{\mathrm{\Δ\μ}}^{\′}}_{s\max }}\right)\]}{t}---\left(6\right)$

又，根据式(2)，在温度T时，有：

$\ln K=-\frac{E_a}{R}\·\frac{1}{T}+\ln A---\left(7\right)$

由式(7)可知，lnK与1/T呈线性关系。因此在多个温度T下测得不同的K值之后，可以通过lnK与1/T拟合得到的直线方程得到活化能E_a及频率因子A的值。将步骤二中测得的μ'_s数据进行归一化和平滑处理，根据式(6)得到不同温度恒温水浴加热时的K值曲线，其中一组样本的数据如附图3所示。恒温水浴加热过程中，组织在升至设定温度之前有一段升温过程，因此速率常数K随着温度升高达到最大值。此后由于组织进一步受热损伤，损伤过程不再满足一阶化学反应的条件，因此K值逐渐减小。实验中2组样本测得的K最大值及达到最大值时刻的组织温度如表1所示：

表1

将lnK与1/T进行线性拟合，可以得到拟合直线如附图4所示，直线方程为：

$\ln K=-12204.8\·\frac{1}{T}+32.044---\left(8\right)$

对比式(7)，可以计算得到猪肝组织的热损伤活化能E_a≈1.014×10⁵J·mol^-1，分子碰撞频率因子A≈8.251×10¹³s^-1。其他类型生物组织，如肺、肾脏等的热损伤参数获取过程与猪肝组织相同。

本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (8)

1.一种生物组织热损伤参数的测定方法，其特征在于，利用经由近红外漫反射光谱计算得出的约化散射系数μ'_s定量监测不同温度加热条件下生物组织的热损伤进程，进而计算得到生物组织的热损伤活化能E_a和分子碰撞频率因子A；其中：

热损伤活化能E_a和分子碰撞频率因子A满足下式：

$\ln K=-\frac{E_a}{R}\·\frac{1}{T}+\ln A$

上式中：K为生物组织的细胞热损失速率，通过归一化约化散射系数μ'_s变化曲线计算而得，Ea为热损伤活化能；A为分子碰撞频率因子；R为常数，取值8.31J·mol^-1·K^-1；Δμ'_smax为在温度T下的μ'_s最大改变量；约化散射系数μ'_s，t为时间；

根据t时间内计算的K值，采用最小二乘法拟合lnK与1/T的直线方程，即可得到热损伤活化能E_a及分子碰撞频率因子A。

2.根据权利要求1所述的生物组织热损伤参数的测定方法，其特征在于，约化散射系数μ'_s通过以下步骤获得：通过双光纤测量系统采集不同浓度模拟胶样品的近红外漫反射光谱，并用血氧分析仪OXImeter采集这些样品在690nm处的μ'_s作为定标参考的标准参数。将690nm～850nm波段光谱曲线的斜率绝对值Slope_690-850与标准光学参数用最小二乘法进行线性拟合，可以得到μ'_s的计算公式为：

μ'_s690＝3.18·exp(0.43·Slope_690-850)。

3.根据权利要求2所述的生物组织热损伤参数的测定方法，其特征在于，采用不同温度下的恒温水浴致使生物组织产生热损伤。

4.根据权利要求3所述的生物组织热损伤参数的测定方法，其特征在于，恒温水浴的水浴温度分别为：50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃。

5.根据权利要求4所述的生物组织热损伤参数的测定方法，其特征在于，所述的生物组织样品呈5cm左右的长条状，由新鲜组织切成。

6.根据权利要求5所述的生物组织热损伤参数的测定方法，其特征在于，所述的生物组织样品为猪肝、肺或者肾脏。

7.根据权利要求6所述的生物组织热损伤参数的测定方法，其特征在于，所述的生物组织样品为猪肝时，lnK与1/T的直线拟合方程为：此时猪肝组织的热损伤活化能E_a≈1.014×10⁵J·mol^-1，分子碰撞频率因子A≈8.251×10¹³s^-1。

8.一种生物组织热损伤参数的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，约化散射系数μ'_s的定标

首先配制不同浓度模拟胶的待测样本，然后用OXImeter测量各个样品在690nm处的μ'_s，同时用双光纤测量模拟胶样本的近红外漫反射光谱，计算各个样本的光谱在690nm～850nm波段光谱曲线的斜率绝对值Slope_690-850，将其与标准参数用最小二乘法进行线性拟合，得到μ'_s的计算公式为：

μ'_s690＝3.18·exp(0.43·Slope_690-850)(5)

步骤二，热损伤过程中的温度和约化散射系数μ'_s测量

在水浴环境中对生物组织进行恒温加热，测量生物组织的温度和光学参数变化；

步骤三，热损伤参数热损伤活化能E_a和分子碰撞频率因子A的计算

热损伤活化能E_a和分子碰撞频率因子A满足下式：

$\ln K=-\frac{E_a}{R}\·\frac{1}{T}+\ln A$

上式中：K为生物组织的细胞热损失速率，通过归一化约化散射系数μ'_s变化曲线计算

而得，Ea为热损伤活化能；A为分子碰撞频率因子；R为常数，取值8.31J·mol^-1·K^-1；Δμ'_smax为在温度T下的μ'_s最大改变量；约化散射系数μ'_s，t为时间；

根据t时间内计算的K值，采用最小二乘法拟合lnK与1/T的直线方程，即可得到热损伤活化能E_a及分子碰撞频率因子A。