JP2011512201A - 組織工学足場 - Google Patents
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Abstract
Description
他の実施形態では、本発明は組織工学足場を提供する。一実施形態では、組織工学足場は、天然血管による応答と実質的に同様の応力および歪に対する機械的応答を有し、この足場は、(a)弾性エレメント、外側表面、内側管腔表面を備える第1の管状エレメント;および(b)引っ張りエレメント、外側表面、および第1の管状エレメントの外側表面に接触した内側管腔表面を備える第2の管状エレメントを備え、組織工学足場は、(i)約0.1MPa〜約0.5MPaの円周方向管弾性率1、(ii)約3.0MPa〜約6.0MPaの円周方向管弾性率2;および(iii)約0.57MPaから約1.12MPaの円周方向弾性率の移行部;(iv)孔径が、第2の管状エレメントの外側表面での約100ミクロンから、第1の管状エレメントの内側表面での約5〜約15ミクロンに徐々に減少する孔勾配;(v)0.45MJ/m3〜約1.0MJ/m3の円周方向管靭性;(vi)約0.1MJ/m3〜約0.5MJ/m3の軸方向管靭性;(vii)約0.05〜約0.3のタンジェントδ;および(viii)約400MPa〜約0.12MPaの貯蔵弾性率、またはこれらの任意の組合せのうちの少なくとも1つを含む。別の実施形態では、組織工学足場の応力および歪に対する機械的応答は、J字型応力/歪曲線を特徴とする。一実施形態では、組織工学足場は細胞にアクセス可能である。別の実施形態では、組織工学足場は破損に耐性である。さらに別の実施形態では、組織工学足場は粘弾性である。
他に定義されない限り、本明細書で使用される技術的および科学的な用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
図1はJ字型曲線を表し、これは、2つの主要な構造的なタンパク質、すなわちコラーゲンおよびエラスチンの相乗的相互作用から生じる、天然動脈に固有の応力および歪に対する機械的応答である(Roachら(1957年) Can. J. Biochem. Physiol. 35巻:681〜690頁)。天然血管の力学は非線形であり、コラーゲンおよびエラスチンの相乗的相互作用から生じる力(応力)/変位(歪)の図で「J」字型曲線を特徴とする(図2)。動脈中にコラーゲンとエラスチンの両方が存在することにより、動脈に大きい非線形挙動が与えられる。天然動脈が、残りの主要な構造タンパク質としてコラーゲンを残してそのエラスチンを抽出される場合、機械的な応答ははるかに滑らかでなくなる。反対に、天然動脈が処理されてコラーゲンが除去される場合、支配的な構造タンパク質はエラスチンであり、力学は線形の弾性特徴を反映する。天然動脈の「J」字型曲線は、動脈中に存在する主要な構造タンパク質である、コラーゲンおよびエラスチンの両方の合わせた効果から生じる非線形挙動である(Gosline & Shadwick (1998年) American Scientist. 86巻:535〜541頁)。
天然血管は多層構造または積層構造を有する。例えば、動脈は3つの層、すなわち、管腔表面を裏打ちする大血管性内皮細胞を含む、内膜と呼ばれる最内側層、複数のシートの平滑筋細胞を含む、中膜と呼ばれる中央層、ならびに疎性結合組織、より小さい血管、および神経を含有する、外膜と呼ばれる外側層を有する。内膜と中膜は、基底膜によって分離されている。
本発明の方法は、天然血管に相応する、適当な、持続性の生体力学的特性を有するTE足場の構築に関する。一態様では、本発明の方法は、積層構造、すなわち、弾性エレメント、外側表面、および内側管腔表面を備える第1の管状エレメントと;引っ張りエレメント、外側表面、および第1の管状エレメントの外側表面に接触した内側管腔表面を備える第2の管状エレメントとを有する血管足場を作製する方法を提供する。図3に例示するように、第1の管状エレメントは、限定することなく、エレクトロスピニング(図3A)および注型(図3B)、ならびにこれらの任意の組合せを含めた当技術分野で公知の技法によって、マンドレル上に形成することができる。エラスチンおよび/または弾性ポリマーなどの弾性エレメントは、少なくともインビボ用途に必要な名目上のサイズである第1の直径を有する第1の管状エレメントを形成するのに使用することができる。エレクトロスピニングは、(i)1つまたは複数の弾性天然成分および/もしくはより多くの弾性合成成分のうちの1つを含有し;かつ/または(ii)1つまたは複数の引っ張り天然成分および/もしくはより多くの引っ張り合成成分のうちの1つを含有する溶液を塗布することによって実施することができる。エレクトロスピニングは、弾性エレメントの繊維を円周方向に配置する利点を提供し、したがって血管の強度を増大させる。
別の態様では、本発明は、本発明のTE足場から得られる組織工学による血管(TEBV)を提供する。天然血管との実質的な類似性を考慮すると、足場は、改変してTEBVを作製するのに特に適用でき、これはさらには心血管障害を治療するための血管バイパス移植片として使用することができる。血管バイパス移植片には動静脈(AV)シャントが含まれる。好適な実施形態では、本発明の足場は、心血管障害を治療するのに使用するために、一般に6mm未満の小直径を有するTEBVを作製するのに使用することができる。
2成分管状構造における「J」字型機械的応答の生成。
内径3.175mm(D1)を有する薄肉のラテックス管(Primeline Industries)を、外径8.0mm(D2)を有するマンドレル上で伸ばし、円周方向の長さを151%増加させた。この新しい、より大きい円周で、PDO縫合糸(1.0メートル、Ethicon)を、ラテックス管の長さにわたってらせん状に手で巻いた。縫合糸の頂部に液体ラテックス(Environmental Technologies, Inc.)の薄層を塗布することによって、PDO縫合糸を適所に固定した。
これらの試験試料のそれぞれの引っ張り負荷は、最初の低弾性率(スチフネス)領域、その後の最初の弾性率から1桁以上増加した弾性率への鋭い上昇を特徴とする「J」字型曲線をもたらした。図8は、ラテックス/PDO構造の得られた挙動を示す。最初の弾性率および最終的な弾性率の計算値は、それぞれ0.3MPaおよび2MPaである。図9は、ラテックス/Vicryl構造の得られた挙動を示す。この試料の弾性率は、曲線の最初の領域および最終的な領域のそれぞれについて、2MPaおよび20MPaであると計算された。図10は、PDOおよびVicrylのそれぞれの応力/歪挙動を実証し、これらはそれぞれ、3GPaおよび9GPa〜18GPaの弾性率を有する。図11は、ラテックスの応力/歪関係を実証し、これは、0.3MPa〜0.5MPaの弾性率を有する。
堅い外側層(引っ張りエレメント)に結合した弾性内側層の組合せも試験した。内側層はエレクトロスピニングしたポリウレタン(PU)であり、外側層はエレクトロスピニングしたポリグリコール酸(PGA)である。
1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−2−プロパノール(HFIP)中の10%PU、およびHFIP中の10%のPGAが、エレクトロスピニングにおいて使用したベース溶液であった。標準的なエレクトロスピニング手順を利用して、5mmのODのマンドレル上に10%のPU約2ミリリットルをエレクトロスピニングした。完了した後、PU管を、5mmのODのマンドレルから回転して外し、8mmのODのマンドレル上に回転して取り付けた。5mmのODおよび8mmのODのマンドレルの使用は、円周方向の長さの60%の増加に匹敵する。
図12は、純粋なPGAおよび純粋なPUから構築した管の応力/歪挙動、ならびに上述したように構築した両材料のハイブリッドから得られた応力/歪挙動の両方を例示する。ハイブリッドの引っ張り負荷は、最初の低弾性率(スチフネス)領域、その後の最初の弾性率の約2倍の弾性率(0.5MPa対0.24MPa)までの鋭い上昇を特徴とする「J」字型曲線をもたらした。
ここでは、本発明者らは、多成分の構成的な改変を通じて、天然血管の複雑な応力/歪挙動を反復することに成功する新規の方法を記載する。さらに、この方法は、材料選択と形成プロセスの変形の組合せを通じて、これらの複雑な生体力学的特性を「調整」するための機会を提示する。Tecothane 1074またはポリ(L−ラクチド−コ−ε−カプロラクトン、およびポリグリコール酸で編まれたメッシュ管で作製された管状足場は、0.5MPa〜3.97MPaの弾性率、および平均1676mm−Hgの破裂圧力を有する、天然血管に特徴的な応力/歪挙動を生じた。
図15A〜Bは、拡大するマンドレル技法を使用して構築される足場に一般的な肉眼像を例示する。このPU/PGA足場の長さを伝わる波形が、低拡大率A)、および大拡大率B)で眼で見える。足場の大きさは約12cmである。
破裂圧力試験
社内製の破裂試験装置は、高圧シリンジポンプ(Cole−Parmer)、ステンレス鋼の20mlシリンジ(Cole−Parmer)、および較正された最大100psiの液体/ガス圧力計(Omega)からなっていた。このシステムは、Labview v8.5、およびコンパクトフィールドポイント(National Instruments)を使用して制御した。試験の間に確実に漏れがないようにするために、管状足場の内側管腔を、円筒形の5mmのIDの標準的なラテックスバルーン(Unique Industries, Inc.)で裏打ちした。破損が起こるまで、液体体積を1ml/分の定常速度で足場に送達した。機械的破損直前の最大値が、報告される破裂圧力値である。
試験した管状足場は、2成分システムに相応した応力/歪挙動を常に生じた(図17)。すべての足場は、機械的破損の前に374±229%の移行歪で高スチフネスゾーン(E=3.97±1.6MPa)を生じる、最初の低スチフネス挙動(E=0.5±0.24MPa)からなる機械的挙動を実証する。図18は、管状足場の破裂圧力試験からの結果を例示する。全破裂圧力は1676±676mm−Hgであった。要約データを表4に示す。
ガラスカバーガラスをエレクトロスピニングされたPLCLまたはPUの薄層でコーティングし、その後細胞外基質タンパク質でコーティングした。フィブロネクチンコーティングについては、PBS中の5ug/mlのヒトフィブロネクチンI(Chemicon FC010)中に、4Cで一晩足場を浸漬した。低濃度コラーゲンコーティングについては、0.1%の酢酸中の50ug/mlのラット尾コラーゲンI(BD354236)中に、RTで1時間、足場を浸漬した後、PBSで簡単に洗浄した。低濃度コラーゲン足場は、播種する前に空気乾燥した。高濃度コラーゲン足場は、3mg/mlのラット尾コラーゲンI(BD 354236)の薄層を塗布し、次いで閉じたチャンバー内で3分間足場をアンモニア蒸気に曝すことによって調製した。次いで高濃度コラーゲン足場を水で簡単に洗浄し、その後PBS中で一晩洗浄した。最後に、MATRIGEL(商標)コーティングについては、足場を、MATRIGEL(商標)溶液(BD356234)の薄層で覆い、37Cで30分間インキュベートすることによって、タンパク質重合を可能にした。
PLCLおよびPGAメッシュから、以前に述べたように2つの管状足場を構築し、これらはそれぞれの長さが6cmおよび10cmであり、それぞれ短い、および長いと呼んだ。
生/死(Live/Dead)染色(Invitrogen、L3224):各導管の遠位および近位セクションからの1つの代表的な断片を、蛍光染色のために確保した。構築物セクションを過剰のDPBS中で洗浄した。DPBSを除去し、調製した染色剤2.5mlで置換した。(DPBS 10ml、カルセインAM(緑色)20μl、エチジウムホモ二量体−1(赤色)5μl)。10分インキュベーションした後、足場セクションを、倒立蛍光顕微鏡を使用して視覚化した。断片は著しい程度の湾曲を維持しており、視覚化をかなり困難にした。ウェル内で、構築物セクションの頂部に円形のカバースリップを置くことによって、断片を平らにするのに役立てた。
インビボ移植後の、TEBV上に播種された細胞の保持は、Flugelmanの米国公開特許出願第20070190037号の実施例26の改良版で評価することができる。
本発明のTEBVのインビボの有効性は、Corteらの米国特許第7,459,564号に記載されている、「In Vivo Rabbit Arterio−Venous Shunt Thrombosis Model」の改良版で試験することができる。
Claims (36)
- 組織工学(TE)足場を作製する方法であって、
(a)弾性エレメント、外側表面、内側管腔表面、および第1の直径を備える第1の管状エレメントを提供するステップと;
(b)前記第1の管状エレメントを第2の直径に拡張するステップと;
(c)引っ張りエレメント、外側表面、およびステップ(b)の前記拡張された第1の管状エレメントの表面上の内側管腔表面を備える第2の管状エレメントを提供するステップと;
(d)ステップ(b)の前記拡張された第1の管状エレメントおよび前記第2の管状エレメントを結合するステップと;
(e)TE足場を形成するために、前記第1の管状エレメントの前記第2の直径を、ステップ(a)の前記第1の直径に減少させるステップと
を含む、方法。 - 前記第2の管状エレメントが波形をつけられている、請求項1に記載の方法。
- 前記波形をつけられた第2の管状エレメントが、繊維ネットワークを含み、前記繊維の方向が円周方向に配向している、請求項2に記載の方法。
- (a)の前記提供するステップが、マンドレル上にエレクトロスピニングするステップを含む、請求項1に記載の方法。
- (c)の前記提供するステップが、マンドレル上にエレクトロスピニングするステップを含む、請求項1に記載の方法。
- (c)の前記提供するステップが、ステップ(b)の前記拡張された第1の管状エレメント上に予め形成された第2の管状エレメントを配置するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記弾性エレメントが、第1の弾性率を有する弾性成分を含み、前記引っ張りエレメントが、前記第1の弾性率より大きい第2の弾性率を有する引っ張り成分を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の弾性率が前記第1の弾性率より少なくとも1桁大きい、請求項7に記載の方法。
- 前記弾性エレメントが天然弾性成分を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記弾性エレメントが合成弾性成分を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記弾性エレメントが天然弾性成分および合成弾性成分を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記天然弾性成分が、エラスチン、レシリン、アブダクチン、および絹からなる群から選択される、請求項9または11に記載の方法。
- 前記合成弾性成分が、ラテックス、ポリウレタン(PU)、ポリカプロラクトン(PCL)、ポリ−L−ラクチド酸(PLLA)、ポリジアキサノン(PDO)、ポリ(L−ラクチド−コ−カプロラクトン)(PLCL)、およびポリ(エーテルウレタン尿素)(PEUU)からなる群から選択される、請求項10または11に記載の方法。
- 前記引っ張りエレメントが天然引っ張り成分を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記引っ張りエレメントが合成引っ張り成分を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記引っ張りエレメントが天然引っ張り成分および合成引っ張り成分を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記天然引っ張り成分がコラーゲン、セルロース、絹、およびケラチンである、請求項14または16に記載の方法。
- 前記合成引っ張り成分が、ナイロン、Dacron(登録商標)(ポリエチレンテレフタレート(PET))、Goretex(登録商標)(ポリテトラフルオロエチレン)、ポリエステル、ポリグリコール酸(PGA)、ポリ乳酸−コ−グリコール酸(PLGA)、およびポリ(エーテルウレタン尿素)(PEUU)からなる群から選択される、請求項15または16に記載の方法。
- 天然血管による応答と実質的に同様の応力および歪に対する機械的応答を有する組織工学足場であって、(a)弾性エレメント、外側表面、および内側管腔表面を備える第1の管状エレメントと;(b)引っ張りエレメント、外側表面、および前記第1の管状エレメントの前記外側表面に接触した内側管腔表面を備える第2の管状エレメントとを備え、応力および歪に対する前記組織工学足場の機械的応答がJ字型応力/歪曲線を特徴とする組織工学足場。
- 天然血管による応答と実質的に同様の応力および歪に対する機械的応答を有する組織工学足場であって、(a)弾性エレメント、外側表面、および内側管腔表面を備える第1の管状エレメントと;(b)引っ張りエレメント、外側表面、および前記第1の管状エレメントの前記外側表面に接触した内側管腔表面を備える第2の管状エレメントとを備え、
(i)約0.1MPa〜約0.5MPaの円周方向管弾性率1
(ii)約3.0MPa〜約6.0MPaの円周方向管弾性率2;および
(iii)約0.57から約1.12の円周方向弾性率移行部
のうちの少なくとも1つを有する組織工学足場。 - J字型応力/歪曲線を特徴とする、請求項20に記載の組織工学足場。
- 前記第2の管状エレメントが波形をつけられている、請求項19または20に記載の組織工学足場。
- 前記波形をつけられた第2の管状エレメントが、繊維ネットワークを含み、前記繊維の方向が円周方向に配向している、請求項22に記載の組織工学足場。
- 前記弾性エレメントが第1の弾性率を有する弾性成分を含み、前記引っ張りエレメントが前記第1の弾性率より大きい第2の弾性率を有する引っ張り成分を含む、請求項19または20に記載の組織工学足場。
- 前記第2の弾性率が前記第1の弾性率より少なくとも1桁大きい、請求項24に記載の組織工学足場。
- 前記弾性エレメントが天然弾性成分を含む、請求項19または20に記載の組織工学足場。
- 前記弾性エレメントが合成弾性成分を含む、請求項19または20に記載の組織工学足場。
- 前記弾性エレメントが天然弾性成分および合成弾性成分を含む、請求項19または20に記載の組織工学足場。
- 前記天然弾性成分が、エラスチン、レシリン、アブダクチン、および絹からなる群から選択される、請求項26または28に記載の組織工学足場。
- 前記合成弾性成分が、ラテックス、ポリウレタン(PU)、ポリカプロラクトン(PCL)、ポリ−L−ラクチド酸(PLLA)、ポリジアキサノン(PDO)、ポリ(L−ラクチド−コ−カプロラクトン)(PLCL)、およびポリ(エーテルウレタン尿素)(PEUU)からなる群から選択される、請求項27または28に記載の組織工学足場。
- 前記引っ張りエレメントが天然引っ張り成分を含む、請求項19または20に記載の組織工学足場。
- 前記引っ張りエレメントが合成引っ張り成分を含む、請求項19または20に記載の組織工学足場。
- 前記引っ張りエレメントが天然引っ張り成分および合成引っ張り成分を含む、請求項19または20に記載の組織工学足場。
- 前記天然引っ張り成分が、コラーゲン、セルロース、絹、およびケラチンからなる群から選択される、請求項31または33に記載の組織工学足場。
- 前記合成引っ張り成分が、ナイロン、Dacron(登録商標)(ポリエチレンテレフタレート(PET))、Goretex(登録商標)(ポリテトラフルオロエチレン)、ポリエステル、ポリグリコール酸(PGA)、ポリ−乳酸−コ−グリコール酸(PLGA)、およびポリ(エーテルウレタン尿素)(PEUU)からなる群から選択される、請求項32または33に記載の組織工学足場。
- 以下、すなわち
(i)孔径が、前記第2の管状エレメントの前記外側表面での約100ミクロンから、前記第1の管状エレメントの前記内側表面での約5〜約15ミクロンに徐々に減少する孔勾配;
(ii)約0.45MJ/m3〜約1.0MJ/m3の円周方向管靭性;
(iii)約0.1MJ/m3〜約0.5MJ/m3の軸方向管靭性;
(iv)約0.05〜約0.3のタンジェントδ;および
(v)約400MPa〜約0.12MPaの貯蔵弾性率
のうちの少なくとも1つを有する、請求項19または20に記載の組織工学足場。
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