KR20100120686A

KR20100120686A - 조직 공학 지지대

Info

Publication number: KR20100120686A
Application number: KR1020107020398A
Authority: KR
Inventors: 에이치. 스콧 라포포트; 제프리 이. 피시; 네일 에프. 주니어 로빈스; 로저 엠. 일라간; 켈리 아이. 구스리; 상하 남라타
Original assignee: 텐젼, 인코포레이티드
Priority date: 2008-02-14
Filing date: 2009-02-13
Publication date: 2010-11-16
Also published as: HK1206579A1; EP2249742A1; WO2009103012A1; JP2011512201A; JP2016187640A; US20090227026A1; EP2249742B1; AU2009214508B2; CN102006837A; HK1155936A1; CA2715642A1; JP5632749B2; JP2014094315A; CN104248477B; JP2015006400A; JP5978425B2; CN104248477A; CN102006837B; AU2009214508A2; KR101669292B1

Abstract

본 발명은 천연 혈관의 생체역학적 거동을 모방하는 조직 공학 지지대(TE 지지대), TE 지지대로부터 유래된 조직 공학적 혈관(TEBV), 및 TE 지지대 및 TEBV의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

Description

조직 공학 지지대{TISSUE ENGINEERING SCAFFOLDS}

본 발명은 천연 혈관의 생체역학적 거동을 모방하는 조직 공학 지지대 및 그의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

혈관 조직 공학의 중요한 문제는 천연 혈관과 동등한 적당한 장기 지속적인 생체역학적 성질을 가지는 혈관 이식편의 제작이다. 동맥 치환은 모든 혈관에 공통되는 주기적 부하 및 추가로, 혈관에 요구되는 높은 작동 압력 때문에 특수 문제를 제기한다. 연구자들은 다양한 합성 및 유기 물질, 상이한 제작 방식(예를 들어, 전기방사 및 캐스팅) 및 많은 복합체 설계를 통해 이 문제에 접근하였다. 예를 들어, 공여자 이식편, 천연 성분 및 합성 성분의 조합을 이용해서 혈관 이식편을 생성하는 시도를 하였다(예를 들어, 질라(Zilla) 등, 미국 특허 출원 공개 2005/0131520; 플루겔만(Flugelman), 미국 특허 출원 공개 2007/0190037; 쉬미주(Shimizu), 미국 특허 6,136,024; 마츠다(Matsuda) 등, 미국 특허 5,718,723; 및 리(Rhee) 등, 미국 특허 5,292,802 참조). 폴리(에스테르 우레탄) 우레아(PEUU) (커트니(Courtney) 등 (2006), Biomaterials, 27:3631-3638) 및 PEUU/콜라겐(구안(Guan) 등 (2006), Cell Transplant. Vol. 15. Supp. 1;S17-S27)로 이루어진 다른 지지대가 조직과 유사한 기능적 성질을 나타낸다고 보고되었다. 그러나, 합성 물질, 예를 들어 다크론(등록상표)(Dacron®)(에틸렌 테레프탈레이트) 및 PTFE(테플론)이 직경이 큰 혈관에는 성공적으로 이용되어 왔지만, 직경이 작은(예를 들어, 6 ㎜ 미만의 내경) 혈관 이식편에는 합성 물질이 성공적으로 이용되지 못했다. 5 ㎜ 미만의 내경을 가지는 다크론(등록상표)(에틸렌 테레프탈레이트) 및 PTFE로 이루어진 혈관 이식편은 급성 혈전 생성 및 만성 문합부 및/또는 내막 과다증식 때문에 임상적으로 허용되지 않는 것으로 밝혀졌다(월포트(Walpoth) 등(2005) Expert Rev. Med. Dev. 2(6):647-51). 직경이 작은 혈관 이식편의 성공이 어려운 것은 생체내 역학적 성질과 적절히 부합할 수 없음을 포함하는 요인들에 부분적으로 기인할 수 있다.

천연 혈관의 생체역학적 성질은 광범위하게 특성화되었다. 응력 및 변형에 대한 그의 반응이 중요한 특징임이 명백해졌다(로치(Roach) 등, (1957) Can. J. Biochem. Physiol. 35:681-690; 고슬린(Gosline) 및 섀드윅(Shadwick)(1998) American Scientist. 86:535-541). "J형" 곡선으로 알려진 응력-변형 곡선을 나타내는 물질이 조직 공학 지지대, 예를 들어 혈관 지지대에 이용하기에 적합할 수 있는 후보 물질이고, 이 경우, 천연 혈관과 흡사한 응력 및 변형에 대한 역학적 반응이 바람직하다. 엘라스틴, 콜라겐 및 합성 중합체의 블렌드로부터 제조된 다양한 제작된 지지대의 역학적 성질이 보고되었다(리(Lee) 등 (2007), J. Biomed. Mater. Res. A., Dec 15:83(4): 999-1008; 스미스(Smith) 등 (2008) Acta Biomater. Jan;4(1):58-66; 렐케스(Lelkes) 등, 미국 특허 출원 공개 2006/0263417). 그러나, J형 곡선 거동을 재현할 수 있는 조직 공학 지지대 및 이러한 지지대의 제조 방법이 필요하다.

본 발명은 응력 및 변형에 대해 천연 혈관에서 관찰되는 것과 동일한 유형의 반응, 즉 J형 응력/변형 곡선을 나타내는 조직 공학 지지대 및 그의 사용 및 제조 방법을 제공한다.

발명의 요약

본 발명은 조직 공학 지지대 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

한 양상에서, 본 발명은 둘 이상의 상이한 관형 요소를 포함하는 조직 공학 지지대의 제조 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 이 방법은 (a) 엘라스토머성 요소, 외부 표면, 내부 관강 표면, 및 제1 직경을 가지는 제1 관형 요소를 제공하는 단계; (b) 제1 관형 요소를 제2 직경으로 확장시키는 단계; (c) 인장 요소, 외부 표면 및 내부 관강 표면을 가지는 제2 관형 요소를 단계 (b)의 확장된 관형 요소의 외부 표면 상에 제공하는 단계; (d) 단계 (b)의 확장된 제1 관형 요소의 외부 표면과 제2 관형 요소의 내부 관강 표면을 결합시키는 단계; 및 (e) 제1 관형 요소의 제2 직경을 단계 (a)의 제1 직경으로 감소시키는 단계를 포함한다.

한 실시태양에서, 단계 (a)의 제1 관형 요소 및/또는 단계 (c)의 제2 관형 요소는 전기방사에 의해 생성된다. 다른 한 실시태양에서, 단계 (a)의 제1 관형 요소는 표면 상에 물질을 전기방사함으로써 생성된다. 다른 실시태양에서, 단계 (c)의 제2 관형 요소는 확장된 제1 관형 요소의 외부 표면 상에 물질을 전기방사함으로써 또는 미리 생성된 제2 관형 요소를 확장된 제1 관형 요소의 표면 상에 놓음으로써 생성된다. 다른 한 실시태양에서, 단계 (a)의 제1 관형 요소는 전기방사에 의해 생성되고, 단계 (c)의 제2 관형 요소는 미리 생성된 제2 관형 요소를 확장된 제1 관형 요소의 외부 표면 상에 놓음으로써 제공된다.

다른 한 실시태양에서, (d)의 결합 단계는 제2 관형 요소의 내부 표면을 확장된 제1 관형 요소의 외부 표면에 부착하는 것을 포함한다. 다른 한 실시태양에서, 결합 단계 (d)는 확장된 제1 관형 요소의 외부 표면 상에 제2 관형 요소를 전기방사한 후에 또는 미리 생성된 제2 관형 요소를 확장된 제1 관형 요소의 외부 표면 상에 놓은 후에 수행되고, 제2 관형 요소의 외부 표면 상에 추가의 물질 층을 적용해서 제1 관형 요소와 추가의 물질 층 사이에 제2 관형 요소의 접착 삽입을 허용하는 단계를 포함한다. 다른 한 실시태양에서, 추가의 층은 제1 관형 층을 생성하는 데 이용된 것과 동일한 유형의 물질이거나 또는 그러한 물질을 함유한다.

다른 한 실시태양에서, 상기 단계 (c)의 제2 관형 요소의 외부 층 또는 표면은 주름진다. 한 실시태양에서, 주름진 제2 관형 요소는 섬유 방향이 원주방향으로 배향된 섬유 망상구조를 가진다. 다른 실시태양에서는, 제3 관형 요소, 제4 관형 요소, 제5 관형 요소 등등의 외부 층 또는 표면이 주름지고/주름지거나 섬유 방향이 원주 방향으로 배향된 섬유 망상구조를 가진다.

일부 실시태양에서, (a)의 제공 단계 및/또는 (c)의 제공 단계는 심봉 상에 물질을 전기방사하는 것을 포함한다. 다른 한 실시태양에서, (c)의 제공 단계는 미리 생성된 제2 관형 요소를 단계 (b)의 확장된 제1 관형 요소 위에 놓는 것을 포함한다. 다른 한 실시태양에서, (a)의 제공 단계는 심봉 상에 물질을 전기방사하여 제1 관형 요소를 생성하는 것을 포함하고, 단계 (c)의 제공 단계는 미리 생성된 제2 관형 요소를 단계 (b)의 확장된 제1 관형 요소 위에 놓는 것을 포함한다.

다른 실시태양에서, 추가의 관형 요소의 생성은 심봉 상에 전기방사하는 것 또는 추가의 미리 생성된 관형 요소를 존재하는 관형 요소 층 위에 놓는 것을 포함한다.

다른 실시태양에서, 단계 (a) 및 (c)는 캐스팅 기술을 포함한다. 다른 한 실시태양에서, 단계 (a)는 제1 직경에 상응하는 캐스트의 사용을 포함하고, 단계 (c)는 제2 직경에 상응하는 캐스트의 사용을 포함한다. 다른 실시태양에서, 추가의 관형 요소의 생성은 캐스팅을 포함하고, 예를 들어, 단계 (c)의 제2 직경보다 크거나 또는 작은 직경에 상응하는 캐스트의 사용 및/또는 단계 (a)의 제1 직경보다 크거나 또는 작은 직경에 상응하는 캐스트의 사용을 통한 캐스팅을 포함한다.

모든 실시태양에서, 본 발명의 방법은 제2 관형 요소 구조 내에 연속성 인장 요소 또는 연속성 강직을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 연속성은 제2 관형 요소 물질 내의 섬유의 다양한 모르폴로지 때문이다.

모든 실시태양에서, 관형 요소를 제공하는 단계는 캐스팅, 미리 생성된 관형 요소 사용, 및 전기방사 기술 중 하나 이상의 사용을 고려한다.

모든 실시태양에서, 본 발명의 방법은 제1 관형 요소 및 제2 관형 요소 위에 추가의 관형 요소, 예를 들어 제3 관형 요소, 제4 관형 요소, 제5 관형 요소 등의 제공을 고려한다. 모든 실시태양에서, 추가의 관형 요소 각각은 하나 이상의 엘라스토머성 요소 및/또는 하나 이상의 인장 요소를 포함할 수 있다. 당 업계 숙련자는 본원에 기술된 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 추가의 관형 요소를 제공하는 다양한 기술을 인식할 것이다.

본 발명의 다른 한 실시태양에서, 엘라스토머성 요소는 제1 탄성계수를 가지는 엘라스토머성 성분을 포함하고, 인장 요소는 제1 탄성계수보다 큰 제2 탄성계수를 가지는 인장 성분을 포함한다. 바람직한 한 실시태양에서, 제2 탄성계수는 제1 탄성계수보다 10 배 이상 크다.

일부 실시태양에서, 엘라스토머성 요소는 천연 엘라스토머성 성분, 합성 엘라스토머성 성분, 또는 천연 엘라스토머성 성분 및 합성 엘라스토머성 성분을 포함한다. 한 실시태양에서, 천연 엘라스토머성 성분은 엘라스틴이다. 다른 실시태양에서, 천연 엘라스토머성 성분은 엘라스틴, 레실린, 애브덕틴 및 실크로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 다른 한 실시태양에서, 합성 엘라스토머성 성분은 라텍스, 폴리우레탄(PU), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리-L-락티드산(PLLA), 폴리디악사논(PDO), 폴리(L-락티드-코-카프로락톤)(PLCL) 및 폴리(에테르우레탄 우레아)(PEUU)로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.

다른 실시태양에서, 인장 요소는 천연 인장 성분, 합성 인장 성분, 또는 천연 인장 성분 및 합성 인장 성분을 포함한다. 한 실시태양에서, 천연 인장 성분은 콜라겐이다. 다른 실시태양에서, 천연 인장 성분은 콜라겐, 셀룰로오스, 실크 및 케라틴으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 다른 한 실시태양에서, 합성 인장 성분은 나일론, 다크론(등록상표)(폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)), 고어텍스(등록상표)(Goretex®) (폴리테트라플루오로에틸렌), 폴리에스테르, 폴리글리콜산(PGA), 폴리-락틱-코-글리콜 산(PLGA) 및 폴리(에테르우레탄 우레아)(PEUU)로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

다른 한 양상에서, 본 발명은 천연 혈관의 성질을 모방하거나 또는 천연 혈관의 성질과 실질적으로 유사한 성질을 가지는 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 조직 공학 지지대를 제공한다. 한 실시태양에서, 본 발명은 (a) 엘라스토머성 요소, 외부 표면 및 내부 관강 표면을 가지는 제1 관형 요소, 및 (b) 제1 관형 요소의 외부 표면과 접촉하는, 인장 요소, 외부 표면 및 내부 관강 표면을 가지는 제2 관형 요소를 가지고, 응력 및 변형에 대한 역학적 반응이 J형 응력/변형 곡선임을 특징으로 하는, 응력 및 변형에 대해 천연 혈관의 역학적 반응과 실질적으로 유사한 역학적 반응을 가지는 조직 공학 지지대를 제공한다.

모든 실시태양에서, 본 발명의 지지대는 제1 관형 요소 및 제2 관형 요소와 함께 하나 이상의 추가의 관형 요소를 고려한다. 일부 실시태양에서, 추가의 관형 요소(들)은 제2 관형 요소의 외부 표면 상에 생성된다.

다른 한 실시태양에서, 응력 및 변형에 대해 천연 혈관의 역학적 반응과 실질적으로 유사한 역학적 반응을 가지는 조직 공학 지지대는 (a) 엘라스토머성 요소, 외부 표면 및 내부 관강 표면을 가지는 제1 관형 요소, 및 (b) 제1 관형 요소의 외부 표면과 접촉하는, 인장 요소, 외부 표면 및 내부 관강 표면을 가지는 제2 관형 요소를 가지고, 이 경우, 조직 공학 지지대는 (i) 약 0.1 MPa 내지 약 0.5 MPa의 원주방향 관 탄성계수 1, (ii) 약 3.0 MPa 내지 약 6.0 MPa의 원주방향 관 탄성계수 2, 및 (iii) 약 0.57 내지 약 1.12의 원주방향 계수 천이를 가진다.

다른 실시태양에서, 응력 및 변형에 대한 조직 공학 지지대의 역학적 반응은 J형 응력/변형 곡선임을 특징으로 한다.

일부 실시태양에서, 응력 및 변형에 대한 조직 공학 지지대의 역학적 반응은 제1 관형 요소의 엘라스토머성 요소와 제2 관형 요소의 인장 요소 사이의 상승작용 때문이다. 다른 한 실시태양에서, 엘라스토머성 요소는 조직 공학 지지대에 탄성을, 인장 요소는 조직 공학 지지대에 강성을 상승적으로 제공한다.

다른 한 실시태양에서, 조직 공학 지지대의 제2 관형 요소는 주름진다. 한 실시태양에서, 주름진 제2 관형 요소는 섬유 방향이 원주방향으로 배향된 섬유 망상구조를 가진다. 다른 한 실시태양에서, 주름의 축은 지지대의 축 방향에 대해 평행하게 구성된다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 지지대는 하나 이상의 추가의 관형 요소, 예를 들어 제3 관형 요소, 제4 관형 요소, 제5 관형 요소 등을 고려하고, 이 경우, 제3 관형 요소, 제4 관형 요소, 제5 관형 요소 등의 외부 층 또는 표면은 주름지고/주름지거나 섬유 방향이 원주방향으로 배향된 섬유 망상구조를 가진다.

본 발명의 일부 실시태양은 엘라스토머성 요소가 제1 탄성계수를 가지는 엘라스토머성 성분을 함유하고, 인장 요소가 제1 탄성계수보다 큰 제2 탄성계수를 가지는 인장 성분을 함유하는 조직 공학 지지대를 제공한다. 바람직한 한 실시태양에서, 제2 탄성계수는 제1 탄성계수보다 10 배 이상 크다.

다른 한 실시태양에서, 본 발명은 엘라스토머성 요소가 천연 엘라스토머성 성분, 합성 엘라스토머성 성분, 또는 천연 엘라스토머성 성분 및 합성 엘라스토머성 성분을 가지는 조직 공학 지지대를 제공한다. 한 실시태양에서, 천연 엘라스토머성 성분은 엘라스틴이다. 다른 실시태양에서, 천연 엘라스토머성 성분은 엘라스틴, 레실린, 애브덕틴 및 실크로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 다른 한 실시태양에서, 합성 엘라스토머성 성분은 라텍스, 폴리우레탄(PU), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리-L-락티드산(PLLA), 폴리디악사논(PDO), 폴리(L-락티드-코-카프로락톤)(PLCL) 및 폴리(에테르우레탄 우레아)(PEUU)로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 지지대는 (i) 둘 이상의 상이한 유형의 천연 엘라스토머성 성분 및/또는 (ii) 둘 이상의 상이한 유형의 합성 엘라스토머성 성분을 포함한다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 인장 요소가 천연 인장 성분, 합성 인장 성분, 또는 천연 인장 성분 및 합성 인장 성분을 가지는 조직 공학 지지대를 제공한다. 한 실시태양에서, 천연 인장 성분은 콜라겐이다. 다른 실시태양에서, 천연 인장 성분은 콜라겐, 셀룰로오스, 실크 및 케라틴으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 다른 한 실시태양에서, 합성 인장 성분은 나일론, 다크론(등록상표)(폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)), 고어텍스(등록상표)(폴리테트라플루오로에틸렌), 폴리에스테르, 폴리글리콜산(PGA), 폴리-락틱-코-글리콜 산(PLGA) 및 폴리(에테르우레탄 우레아)(PEUU)로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 지지대의 인장 요소는 (i) 둘 이상의 상이한 유형의 천연 인장 성분 및/또는 (ii) 둘 이상의 상이한 유형의 합성 인장 성분을 포함한다.

다른 한 실시태양에서, 본 발명의 조직 공학 지지대는 (i) 기공 직경이 제2 관형 요소의 외부 표면에서의 약 100 ㎛에서부터 제1 관형 요소의 내부 표면에서의 약 5 내지 약 15 ㎛로 점진적으로 감소하는 기공 구배; (ii) 약 0.45 MJ/㎥ 내지 약 1.0 MJ/㎥의 원주방향 관 인성; (iii) 약 0.1 MJ/㎥ 내지 약 0.5 MJ/㎥의 축방향 관 인성; (iv) 약 0.05 내지 약 0.3의 탄젠트 델타; 및 (v) 약 400 MPa 내지 약 0.12 MPa의 저장계수 중 하나 이상을 가진다. 한 실시태양에서, 기공 구배는 TE 지지대의 세포 시딩(seeding) 능력 증진에 기여한다. 다른 한 실시태양에서, 축방향 인성 및/또는 원주방향 인성은 지지대가 내파괴성 또는 내인열성을 가지게 하는 데 기여한다. 다른 한 실시태양에서, TE 지지대의 점탄성은 탄젠트 델타 및/또는 저장계수 값으로 특성화된다.

모든 실시태양에서, 본 발명의 TE 지지대는 제1 관형 요소 및 제2 관형 요소 이외에 추가로 관형 요소를 포함할 수 있다. 당업계 숙련자는 본원에 기술된 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 추가의 관형 요소에 함유될 수 있는 다양한 성분을 인식할 것이다.

추가의 실시태양에서, 본 발명은 조직 공학 지지대의 제조 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 이 방법은 (a) 엘라스토머성 요소, 외부 표면, 내부 관강 표면, 및 제1 직경을 포함하는 제1 관형 요소를 제공하는 단계; (b) 제1 관형 요소를 제2 직경으로 확장시키는 단계; (c) 인장 요소, 외부 표면 및 내부 관강 표면을 포함하는 제2 관형 요소를 단계 (b)의 제1 관형 요소의 외부 표면 상에 제공하는 단계; (d) 제공 단계 (c)를 완료하기 전에 제공 단계 (a)를 완료하는 단계; (e) 단계 (b)의 확장된 관형 요소와 단계 (c)의 제2 관형 요소를 결합시키는 단계; 및 (e) 제1 관형 요소의 제2 직경을 단계 (a)의 제1 직경으로 감소시키는 단계를 포함한다. 다른 한 실시태양에서, 조직 공학 지지대는 제1 관형 요소와 제2 관형 요소 사이의 계면에 대역 계조를 포함한다. 다른 한 실시태양에서, 대역 계조는 제1 관형 요소의 엘라스토머성 요소 및 제2 관형 요소의 인장 요소를 포함하는 불균질성 천이 대역을 포함한다.

다른 한 실시태양에서, 조직 공학 지지대의 제조 방법은 (a) 엘라스토머성 요소, 외부 표면, 내부 관강 표면, 및 제1 직경을 포함하는 제1 관형 요소를 제공하는 단계; (b) 제1 관형 요소를 연속 변화율로 제2 직경으로 확장시키는 단계; (c) 확장 단계 (b) 동안에 인장 요소, 외부 표면 및 내부 관강 표면을 포함하는 제2 관형 요소를 단계 (b)의 제1 관형 요소의 외부 표면 상에 제공하는 단계; (d) 단계 (b)의 확장된 관형 요소와 단계 (c)의 제2 관형 요소를 결합시키는 단계; 및 (e) 제1 관형 요소의 제2 직경을 단계 (a)의 제1 직경으로 감소시키는 단계를 포함한다. 다른 한 실시태양에서, 제2 관형 요소는 연속성 인장 요소 또는 연속성 강직을 포함한다. 다른 한 실시태양에서, 연속성 인장 요소는 상이한 변형 값으로 맞물린다. 다른 한 실시태양에서, 결합 단계 (d)는 제2 관형 요소의 섬유를 제1 관형 요소에 결합시킴으로써 연속성을 제공하는 것을 포함한다. 한 실시태양에서, 제2 관형 요소의 섬유들은 제공 단계 (c) 전에 연결된다. 다른 한 실시태양에서, 섬유는 꼬임 정도에 의존해서 변형시 변하는 간격으로 맞물린다. 한 실시태양에서, 꼬임 양이 많은 섬유 이전에 꼬임 양이 적은 섬유들이 곧게 펴져서 맞물린다. 다른 한 실시태양에서는, 섬유 맞물림으로 인해 응력/변형 곡선이 점진적으로 둥그스름해지고, 이렇게 함으로써 천연 혈관과 유사한 역학적 성질을 제공한다.

다른 한 실시태양에서, 이 방법은 (f) 외부 표면 및 내부 관강 표면을 포함하는 제3 관형 요소를 제2 관형 요소의 외부 표면 상에 제공하는 것을 더 포함한다. 다른 한 실시태양에서, 이 방법은 (g) 외부 표면 및 내부 관강 표면을 포함하는 제4 관형 요소를 제3 관형 요소의 외부 표면 상에 제공하는 것을 더 포함한다. 다른 한 실시태양에서, 이 방법은 (h) 외부 표면 및 내부 관강 표면을 포함하는 제5 관형 요소를 제4 관형 요소의 외부 표면 상에 제공하는 것을 더 포함한다. 한 실시태양에서, 이 방법은 추가의 관형 요소 각각의 내부 관강 표면이 가장 바깥 관형 요소와 접촉하도록 외부 표면 및 내부 관강 표면을 포함하는 하나 이상의 추가의 관형 요소를 제공하는 것을 더 포함한다. 한 실시태양에서, 추가의 관형 요소(들)는 엘라스토머성 요소를 포함한다. 한 실시태양에서, 추가의 관형 요소(들)는 인장 요소를 포함한다. 다른 한 실시태양에서, 결합 단계 (e)는 엘라스토머성 요소, 외부 표면 및 내부 관강 표면을 포함하는 추가의 관형 요소를 제2 관형 요소의 외부 표면 상에 제공하는 것을 포함한다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 조직 공학 지지대를 제공한다. 한 실시태양에서, 조직 공학 지지대는 응력 및 변형에 대해 천연 혈관의 역학적 반응과 실질적으로 유사한 역학적 반응을 가지고, 이 지지대는 (a) 엘라스토머성 요소, 외부 표면 및 내부 관강 표면을 포함하는 제1 관형 요소, 및 (b) 제1 관형 요소의 외부 표면과 접촉하는, 인장 요소, 외부 표면 및 내부 관강 표면을 포함하는 제2 관형 요소를 포함하고, 조직 공학 지지대는 (i) 약 0.1 MPa 내지 약 0.5 MPa의 원주방향 관 탄성계수 1, (ii) 약 3.0 MPa 내지 약 6.0 MPa의 원주방향 관 탄성계수 2, 및 (iii) 약 0.57 MPa 내지 약 1.12 MPa의 원주방향 계수 천이, (iv) 기공 직경이 제2 관형 요소의 외부 표면에서의 약 100 ㎛에서부터 제1 관형 요소의 내부 표면에서의 약 5 내지 약 15 ㎛로 점진적으로 감소하는 기공 구배; (v) 약 0.45 MJ/㎥ 내지 약 1.0 MJ/㎥의 원주방향 관 인성; (vi) 약 0.1 MJ/㎥ 내지 약 0.5 MJ/㎥의 축방향 관 인성; (vii) 약 0.05 내지 약 0.3의 탄젠트 델타; 및 (viii) 약 400 MPa 내지 약 0.12 MPa의 저장계수, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 다른 한 실시태양에서, 응력 및 변형에 대한 조직 공학 지지대의 역학적 반응은 J형 응력/변형 곡선임을 특징으로 한다. 한 실시태양에서, 조직 공학 지지대는 세포에 접근할 수 있다. 다른 한 실시태양에서, 조직 공학 지지대는 내파괴성이다. 다른 한 실시태양에서, 조직 공학 지지대는 점탄성이다.

다른 한 실시태양에서, 본 발명은 (a) 엘라스토머성 요소, 외부 표면 및 내부 관강 표면을 포함하는 제1 관형 요소, 및 (b) 제1 관형 요소의 외부 표면과 접촉하는, 인장 요소, 외부 표면 및 내부 관강 표면을 포함하는 주름진 제2 관형 요소를 포함하는 조직 공학 지지대를 제공한다.

추가의 한 실시태양에서, 본 발명은 조직 공학적 혈관(TEBV)을 제공한다. 한 실시태양에서, TEBV는 (a) (i) 엘라스토머성 요소, (ii) 외부 표면, (iii) 내부 관강 표면을 포함하는 제1 관형 요소; (b) 제1 관형 요소의 외부 표면과 접촉하는, (i) 인장 요소, (ii) 외부 표면, (iii) 내부 관강 표면을 포함하는 제2 관형 요소; 및 (c) 제1 세포 군집을 포함하고, 응력 및 변형에 대한 TEBV의 역학적 반응은 J형 응력/변형 곡선임을 특징으로 한다. 다른 한 실시태양에서, TEBV는 (a) (i) 엘라스토머성 요소, (ii) 외부 표면, (iii) 내부 관강 표면을 포함하는 제1 관형 요소; (b) 제1 관형 요소의 외부 표면과 접촉하는, (i) 인장 요소, (ii) 외부 표면, (iii) 내부 관강 표면을 포함하는 제2 관형 요소; 및 (c) 제1 세포 군집을 포함하고, TEBV는 (i) 약 0.1 MPa 내지 약 0.5 MPa의 원주방향 관 탄성계수 1, (ii) 약 3.0 MPa 내지 약 6.0 MPa의 원주방향 관 탄성계수 2, 및 (iii) 약 0.57 MPa 내지 약 1.12 MPa의 원주방향 계수 천이, (iv) 기공 직경이 제2 관형 요소의 외부 표면에서의 약 100 ㎛에서부터 제1 관형 요소의 내부 표면에서의 약 5 내지 약 15 ㎛로 점진적으로 감소하는 기공 구배; (v) 약 0.45 MJ/㎥ 내지 약 1.0 MJ/㎥의 원주방향 관 인성; (vi) 약 0.1 MJ/㎥ 내지 약 0.5 MJ/㎥의 축방향 관 인성; (vii) 약 0.05 내지 약 0.3의 탄젠트 델타; 및 (viii) 약 400 MPa 내지 약 0.12 MPa의 저장계수 중 하나 이상을 포함한다. 다른 한 실시태양에서, TEBV는 J형 응력/변형 곡선을 가짐을 특징으로 한다. 한 실시태양에서, 응력 및 변형에 대한 TEBV의 역학적 반응은 제1 관형 요소의 엘라스토머성 요소와 제2 관형 요소의 인장 요소 사이의 상승작용 때문이다. 다른 한 실시태양에서, 엘라스토머성 요소는 TEBV에 탄성을, 인장 요소는 TEBV에 강성을 상승적으로 제공한다. 다른 한 실시태양에서, 제2 관형 요소는 주름진다. 다른 한 실시태양에서, 주름진 제2 관형 층은 섬유 방향이 원주방향으로 배향된 섬유 망상구조를 포함한다. 다른 한 실시태양에서, 엘라스토머성 요소는 제1 탄성계수를 가지는 엘라스토머성 성분을 포함하고, 인장 요소는 제1 탄성계수보다 큰 제2 탄성계수를 가지는 인장 성분을 포함한다. 다른 실시태양에서, 제2 탄성계수는 제1 탄성계수보다 10 배 이상 크다. 다른 한 실시태양에서, 엘라스토머성 요소는 천연 엘라스토머성 성분을 포함한다. 다른 한 실시태양에서, 엘라스토머성 요소는 합성 엘라스토머성 성분을 포함한다. 다른 한 실시태양에서, 엘라스토머성 요소는 천연 엘라스토머성 성분 및 합성 엘라스토머성 성분을 포함한다. 한 실시태양에서, 천연 엘라스토머성 성분은 엘라스틴, 레실린, 애브덕틴 및 실크로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 다른 한 실시태양에서, 합성 엘라스토머성 성분은 라텍스, 폴리우레탄(PU), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리-L-락티드산(PLLA), 폴리디악사논(PDO), 폴리(L-락티드-코-카프로락톤)(PLCL) 및 폴리(에테르우레탄 우레아)(PEUU)로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한 실시태양에서, 인장 요소는 천연 인장 성분을 포함한다. 한 실시태양에서, 인장 요소는 합성 인장 성분을 포함한다. 한 실시태양에서, 인장 요소는 천연 인장 성분 및 합성 인장 성분을 포함한다. 한 실시태양에서, 천연 인장 성분은 콜라겐, 셀룰로오스, 실크 및 케라틴으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한 실시태양에서, 합성 인장 성분은 나일론, 다크론(등록상표)(폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)), 고어텍스(등록상표)(폴리테트라플루오로에틸렌), 폴리에스테르, 폴리글리콜산(PGA), 폴리-락틱-코-글리콜 산(PLGA) 및 폴리(에테르우레탄 우레아)(PEUU)로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한 실시태양에서, 제1 세포 군집은 제2 관형 요소 내에 및/또는 제2 관형 요소의 외부 표면 상에 있다. 한 실시태양에서, 제1 세포 군집은 평활근 군집이다. 한 실시태양에서, 관형 지지대는 제2 세포 군집을 더 포함한다. 다른 한 실시태양에서, 제2 세포 군집은 제1 관형 요소의 내부 관강 표면 상에 및/또는 제1 관형 요소의 내부 관강 내에 있다. 한 실시태양에서, 제2 세포 군집은 내피세포 군집이다.

다른 한 실시태양에서, 본 발명은 (a) (i) 엘라스토머성 요소, (ii) 외부 표면, (iii) 내부 관강 표면을 포함하는 제1 관형 요소; (b) 제1 관형 요소의 외부 표면과 접촉하는, (i) 인장 요소, (ii) 외부 표면, (iii) 내부 관강 표면을 포함하는 주름진 제2 관형 요소, 및 (c) 제1 세포 군집을 포함하는 TEBV를 제공한다.

추가의 실시태양에서, 본 발명은 (a) 엘라스토머성 요소, 외부 표면, 내부 관강 표면, 및 제1 직경을 포함하는 제1 관형 요소를 제공하는 단계; (b) 제1 관형 요소를 제2 직경으로 확장시키는 단계; (c) 인장 요소, 외부 표면, 제2 관형 요소의 외부 표면 상의 및/또는 제2 관형 요소 내의 제1 세포 군집, 및 내부 관강 표면을 포함하는 제2 관형 요소를 단계 (b)의 제1 관형 요소의 외부 표면 상에 제공하는 단계; (d) 단계 (b)의 확장된 관형 요소와 단계 (c)의 제2 관형 요소를 결합시키는 단계; (e) 제1 관형 요소의 제2 직경을 단계 (a)의 제1 직경으로 감소시켜서 TEBV를 제공하는 단계; (f) TEBV를 배양하는 단계를 포함하는 조직 공학적 혈관(TEBV)의 제조 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 단계 (c)의 제2 관형 요소는 주름진다. 한 실시태양에서, 주름진 제2 관형 요소는 섬유 방향이 원주방향으로 배향된 섬유 망상구조를 포함한다. 한 실시태양에서, (a)의 제공 단계는 심봉 상에 엘라스토머성 성분을 전기방사하는 것을 포함하고, (c)의 제공 단계는 (i) 심봉 상에 인장 성분을 전기방사하고, (ii) 심봉 상에 제1 세포 군집을 전기분사하는 것을 포함한다. 한 실시태양에서, (i)의 전기방사 단계 및 (ii)의 전기분사 단계는 동시에 수행된다. 한 실시태양에서, 이 방법은 단계 (a)의 내부 관강 표면에 제2 세포 군집을 시딩하는 단계(f)를 더 포함한다. 한 실시태양에서, 엘라스토머성 요소는 제1 탄성계수를 가지는 엘라스토머성 성분을 포함하고, 인장 요소는 제1 탄성계수보다 큰 제2 탄성계수를 가지는 인장 성분을 포함한다. 한 실시태양에서, 제2 탄성계수는 제1 탄성계수보다 10 배 이상 크다. 한 실시태양에서, 엘라스토머성 요소는 천연 엘라스토머성 성분을 포함한다. 한 실시태양에서, 엘라스토머성 요소는 합성 엘라스토머성 성분을 포함한다. 한 실시태양에서, 엘라스토머성 요소는 천연 엘라스토머성 성분 및 합성 엘라스토머성 성분을 포함한다. 한 실시태양에서, 천연 엘라스토머성 성분은 엘라스틴이다. 한 실시태양에서, 합성 엘라스토머성 성분은 폴리카프로락톤(PCL), 폴리-L-락티드산(PLLA), 폴리디악사논(PDO), 폴리(L-락티드-코-카프로락톤)(PLCL) 및 폴리(에테르우레탄 우레아)(PEUU)로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한 실시태양에서, 인장 요소는 천연 인장 성분을 포함한다. 한 실시태양에서, 인장 요소는 합성 인장 성분을 포함한다. 한 실시태양에서, 인장 요소는 천연 인장 성분 및 합성 인장 성분을 포함한다. 한 실시태양에서, 천연 인장 성분은 콜라겐이다. 한 실시태양에서, 합성 인장 성분은 폴리글리콜산(PGA), 폴리-락틱-코-글리콜 산(PLGA) 및 폴리(에테르우레탄 우레아)(PEUU)로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한 실시태양에서, 이 방법은 단계 (f) 전에 또는 단계 (f) 후에 단계 (e)의 TEBV를 하나 이상의 추가의 세포 군집과 접촉시키는 것을 더 포함한다. 한 실시태양에서, 배양 단계 (f)는 생체반응기에서 맥동류 및/또는 정상류에 의해 컨디셔닝하는 것을 포함한다.

추가의 실시태양에서, 본 발명은 본원에 게재된 방법 또는 다른 적당한 방법에 의해 제조된, 제1 관형 요소와 제2 관형 요소 사이의 계면에서 대역 계조를 가지는 조직 공학 지지대(TE 지지대) 또는 조직 공학적 혈관(TEBV)에 관한 것이다. 다른 실시태양에서, 대역 계조는 제1 관형 요소의 엘라스토머성 요소로부터의 물질 및 제2 관형 요소의 인장 요소로부터의 물질을 포함하는 불균질성 천이 대역을 포함한다.

일부 실시태양에서, 본 발명은 TE 지지대 또는 TEBV의 제2 관형 요소가 연속성 인장 요소 또는 연속성 강직을 가지는, 본원에 게재된 방법 또는 다른 적당한 방법에 의해 제조된 조직 공학 지지대(TE 지지대) 또는 조직 공학적 혈관(TEBV)에 관한 것이다. 다른 실시태양에서는, 연속성 인장 요소가 상이한 변형 값으로 맞물린다. 한 실시태양에서, 연속성은 제2 관형 요소 물질의 개별 섬유의 변하는 모르폴로지에 기인하다.

일부 실시태양에서, 조직 공학 지지대(TE 지지대) 또는 조직 공학적 혈관(TEBV)은 제1 관형 요소와 제2 관형 요소 사이의 계면에서 대역 계조를 가지고, 제2 관형 요소는 연속성 인장 요소를 가진다. 다른 실시태양에서, 대역 계조는 제1 관형 요소의 엘라스토머성 요소로부터의 물질 및 제2 관형 요소의 인장 요소로부터의 물질을 포함하는 불균질성 천이 대역을 포함하고/포함하거나 인장 요소 연속체는 상이한 변형 값으로 맞물린다.

도 1은 천연 혈관, 콜라겐을 뺀 천연 혈관("엘라스틴"이라고 표지됨), 및 엘라스틴을 뺀 천연 혈관("콜라겐"이라고 표지됨)의 응력/변형 관계를 나타낸 도면이다.
도 2는 상이한 두 계수와 관련 있는 두 선형 영역을 구별함으로써 접근한 "J"형 곡선을 나타낸 도면이다.
도 3a - 3b는 전기방사 및 캐스팅으로부터 관형 구조물을 생성하는 것을 도시한 도면이다.
도 4는 전기방사에 의해 관형 구조물을 생성하는 것을 도시하는 것으로서, 도 4a - 4b는 조직 공학적 지지대를 제공하는 전기방사 기술을 도시하고, 도 4c는 박층(lamina)들의 돌발적 천이(위) 및 층들의 천이 혼합(아래)을 도시하고, 도 4d는 조직 공학 지지대에서 대역 계조를 달성하는 전기방사 기술을 도시한 도면이다.
도 5는 회전하는 동안 연속 직경 변화를 할 수 있는 확장성 심봉을 도시한 도면이다.
도 6은 확장된 탄성 박층 위에 얇은 인장 메쉬를 적용하는 것을 도시한 도면이다.
도 7은 펠트 물질로부터의 섬유 모르폴로지를 도시한 도면이다.
도 8은 라텍스/PDO 구조물의 응력/변형 관계를 도시한 도면이다.
도 9는 라텍스/비크릴 구조물의 응력/변형 관계를 도시한 도면이다.
도 10은 PDO 및 비크릴의 응력/변형 관계를 도시한 도면이다.
도 11은 라텍스의 응력/변형 관계를 도시한 도면이다.
도 12는 PGA 및/또는 PU를 함유하는 관의 응력/변형 관계를 도시한 도면이다.
도 13은 PU 및 PGA를 함유하는 관 및 천연 돼지 경동맥의 응력/변형 관계를 도시한 도면이다.
도 14a - 14b는 라텍스 관 둘레에 봉합된 물질의 대표적인 관형 지지대를 도시한 도면이다.
도 15a - 15b는 대표적인 주름진 지지대를 도시한 도면이다.
도 16a - 16b는 대표적인 주름진 지지대의 단면도이다.
도 17은 PLCL/PGA를 함유하는 관 및 PU/PGA를 함유하는 관의 응력/변형 관계를 나타낸 그래프이다.
도 18은 PLCL/PGA를 함유하는 관 및 PU/PGA를 함유하는 관의 압력/부피 관계를 나타낸 그래프이다.
도 19a - 19c는 관형 지지대의 조정가능성(tunability)의 개념을 도시하고, A는 인장 요소의 실패 및 탄성 요소의 실패가 일치하고, b는 인장 요소의 실패 전에 탄성 요소의 실패가 발생하고, c는 탄성 요소의 실패 전에 인장 요소의 가설적 실패가 발생하는 것을 도시한 도면이다.
도 20은 관형 지지대의 조직 화학을 나타내는 도면이다.
도 21은 세포 시딩 및 생체반응기 컨디셔닝 후에 관형 지지대의 세그먼트들의 세포 염색을 나타낸 도면이다.
도 22는 세포가 시딩되고 생체반응기에서 컨디셔닝된 관형 지지대의 전혈 응고 분석의 결과를 나타낸 도면이다.
도 23은 관형 지지대의 컨디셔닝에 이용되는 생체 반응기의 개략도이다.

본 발명은 조직 공학(TE) 지지대 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 천연 혈관의 성질과 실질적으로 유사한 성질을 가지는 TE 지지대를 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 TE 지지대는 응력 및 변형에 대해 천연 혈관의 역학적 반응과 실질적으로 유사한 역학적 반응, 즉 J형 응력/변형 곡선을 나타낸다.

1. 정의

달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술을 가진 자가 흔히 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다.

당업계 숙련자는 본 발명의 실시에 이용될 수 있는 본원에 기술된 것과 유사하거나 또는 동등한 많은 방법 및 물질을 인식할 것이다. 사실상, 본 발명은 기재된 방법 및 물질에 결코 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상, 다음 용어를 아래에서 정의한다.

다른 관련 정보는 조직 공학 분야의 교과서(예를 들어, Palsson, Bernhard O., Tissue Engineering, Prentice Hall, 2004 및 Principles of Tissue Engineering, 제3판(R Lanza, R Langer & J Vacanti 편집), 2007)에서 입수가능하다.

본원에서 사용되는 "조직 공학 지지대" 또는 "TE 지지대"라는 용어는 응력 및 변형에 대해 천연 혈관과 실질적으로 유사한 방식으로 반응할 수 있는 능력을 가짐을 특징으로 하는 적층 또는 다층 관형 구조물을 의미한다. 예를 들어, 응력 및 변형에 대한 지지대의 역학적 반응은 바람직하게는 J형 응력/변형 곡선임을 특징으로 한다. 본 발명의 지지대의 성질은 본 발명의 지지대를 혈관 지지대의 프레임으로 이용하기에 적당하게 한다.

본원에서 사용되는 "조직 공학적 혈관" 또는 "TEBV" 또는 "혈관 지지대"라는 용어는 필요로 하는 포유동물 대상자에게 이식하기에 적당하게 되도록 추가로 조작된 위에서 정의되고 본원에 기재된 조직 공학 지지대를 의미한다. 예를 들어, TEBV는 본원에 기술된 방법에 의해 또는 다른 적당한 어떠한 방법에 의해서든 조직 공학 지지대를 조작하여 하나 이상의 세포 군집을 첨가함으로써 생성될 수 있다. 당업계 통상의 기술을 가진 자는 본 발명이 경동맥, 쇄골하동맥, 복강동맥, 장간막동맥, 신동맥, 장골동맥, 소동맥, 모세관, 소정맥, 쇄골하정맥, 목정맥, 신정맥, 장골정맥, 대정맥을 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 유형의 천연 혈관에 적당하다는 것을 인식할 것이다. 추가로, 본 발명의 TEBV는 또한 동정맥 단락(AV 단락) 또는 간치 혈관 이식편일 수 있다.

"엘라스토머성 요소"라는 용어는 완전히 회복가능하고 반복가능한 대규모 변형으로 응력에 대해 반응할 수 있음을 특징으로 하는 물질을 의미한다. 엘라스토머성 요소는 천연 성분, 합성 성분, 또는 천연 성분 및 합성 성분의 혼합물을 포함할 수 있다.

"인장 요소"라는 용어는 응력을 받을 때 거의 늘어날 수 없음을 특징으로 하는 물질을 의미한다. 인장 요소는 천연 성분, 합성 성분, 또는 천연 성분 및 합성 성분의 혼합물을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 "합성 성분"이라는 용어는 정상적으로는 자연에 존재하지 않는 성분을 의미한다. 일반적으로, 합성 성분은 정상적으로는 천연 혈관에 존재하지 않지만, 그럼에도 불구하고, 역학 및 세포적 거동에 관해서 천연 혈관과 유사한 성질을 나타내는 잠재성을 가진다. 합성 성분은 임의로 천연 성분(아래에서 정의함)을 포함할 수 있는 본원에서 기술되는 조직 공학 지지대 및/또는 TEBV의 일부일 수 있다. 합성 성분은 본래 엘라스토머성 또는 인장성일 수 있다.

본원에서 사용되는 "천연 성분"은 자연에 존재하거나 또는 제조 방식과 상관 없이 자연에 존재하는 물질로부터 유래되는 물질을 의미한다. 따라서, 예를 들어, "천연 성분"은 천연 원천으로부터 단리되어 정제되거나 또는 재조합 및/또는 합성 수단에 의해 제조되는 천연 폴리펩티드일 수 있다. 천연 성분은 천연 혈관에 존재할 수 있고, 따라서 역학적 및 세포적 거동에 관해서 천연 혈관과 유사한 성질을 나타낼 잠재성을 가진다. 일부 실시태양에서, 천연 성분은 본래 엘라스토머성 또는 인장성일 수 있다.

본원에서 사용되는 "주름진"이라는 용어는 하나 이상의 표면 상에 주름, 기복 및/또는 꼬임이 있음을 특징으로 하는 인장 성분을 함유하는 구조를 의미한다. 이 구조는 일반적으로 섬유 방향이 일반적으로 원주방향으로 배향되는 섬유 망상구조로 이루어진 얇은 층 또는 박층 형태이다. 추가로, 주름의 축은 구조, 예를 들어 관형 조직 공학 지지대의 축방향에 대해 평행하도록 구성된다.

본원에서 사용되는 "역학적 반응" 또는 "생체역학적 반응"이라는 용어는 천연 혈관, 혈관 지지대, 또는 조직 공학 지지대가 응력 및 변형을 받을 때 나타내는 거동을 의미한다. 응력 및 변형에 노출될 때의 거동은 바람직하게는 (i) J형 응력/변형 곡선; (ii) 점탄성; 및 (iii) 내인열성 또는 내파괴성 중 하나 이상을 가짐을 특징으로 한다.

본원에서 사용되는 "천연 혈관과 실질적으로 유사한"이라는 용어는 천연 혈관의 역학적 성질을 비슷하게 모방하거나 또는 천연 혈관의 역학적 성질과 흡사한 역학적 성질을 가지는 지지대를 의미한다. 당업계 통상의 기술을 가진 자는 수 개의 매개변수를 특성화하고 측정해서 이러한 실질적 유사성을 입증할 수 있음을 인식할 것이다. J형 응력/변형 곡선을 포함하는 천연 혈관과 실질적으로 유사한 역학적 거동을 본 발명의 조직 공학 지지대에 제공하기 위한 중요한 매개변수는 지지대의 원주방향 관 탄성계수 1, 원주방향 관 탄성계수 2 및 원주방향 관 계수 천이이다. 바람직한 한 실시태양에서, 컴플라이언스, 영률 또는 탄성계수, 파열 압력, 벽 두께, 기공도, 기공 직경, 기공 구배, 섬유 직경, 파단 변형(축방향 및/또는 원주방향), 파단 응력(축방향 및/또는 원주방향), 인성(축방향 및/또는 원주방향), 축방향 관 탄성계수 1 및 2, 축방향 관 탄성계수 천이, 및 점탄성 성질, 예를 들어 특정 탄젠트 델타(탄 델타) 및 저장계수 값으로 입증되는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 매개변수가 또한 응력 및 변형에 대한 지지대의 요망되는 역학적 거동 또는 반응 및/또는 혈관 이식편으로 쓰일 수 있는 그의 능력에 기여한다.

본원에서 사용되는 "J형 곡선"이라는 용어는 응력(물질의 단위 면적 당 힘 또는 압력)이 y 축에 플롯팅되고, 변형(원래 길이에 대한 길이 변화 또는 변위)이 x 축에 플롯팅되는 곡선의 모양을 의미한다. J형 곡선은 도 1에 도시된 바와 같이 콜라겐 및 엘라스틴의 상승적 상호작용으로부터 생기는 천연 동맥에 고유한 응력 및 변형에 대한 역학적 반응이다.

본원에서 사용되는 "컴플라이언스"라는 용어는 압력(x 축)/부피(y 축) 곡선에서 C=Δ(델타)V/Δ(델타)Ρ(기울기)로 정의된다. 그것은 한 물질의 "연성"의 측정치이고, "강직성"의 반대이다. 대표적으로, C는 mL/㎜Hg이고, V는 부피(mL)이고, P는 압력(mmHg)이다.

본원에서 사용되는 "영률" 또는 "탄성계수"라는 용어는 강직성의 매개변수로 정의된다. 그것은 응력(y 축)/변형(x 축) 곡선의 기울기로부터 유래된다. 비선형 "J"형 곡선의 경우, 탄성계수는 2 개의 독립된 교차하는 기울기로 모델링될 수 있고, 이 경우, 제1 기울기는 초기 준선형 세그먼트로부터 유래되고(탄성계수 1), 제2 기울기는 후기 준선형 세그먼트로부터 유래된다(탄성계수 2). 도 2는 이러한 개념을 도시한다.

본원에서 사용되는 "탄성계수 1에서 탄성계수 2로의 천이" 또는 "계수 1에서 계수 2로의 천이"라는 용어는 탄성계수 1의 기울기가 탄성계수 2의 기울기로 천이하거나 또는 변하는 범위를 의미한다. 이 매개변수의 표현 단위는 기울기가 발생하는 변형 값이다. 이것은 계수(기울기) 1로 나타낸 직선 및 계수(기울기) 2로 나타낸 직선이 교차하는 도 2에 도시되어 있다. 천연 혈관에서의 반응을 나타내는 곡선에서, 천이는 계수(기울기) 1에서 계수(기울기) 2로 변함을 가리키는 곡선의 세그먼트에 의해 도시된다.

본원에서 사용되는 "컴플라이언스 불일치"라는 용어는 상이한 연성/강직성 측정값(즉, 컴플라이언스/영률 또는 탄성계수)을 가지는 두 물질의 결합을 의미한다.

본원에서 사용되는 "기공도"라는 용어는 지지대의 총 부피에 대한 지지대 내의 기공 부피의 비로 정의되고, 기공률(%)로 표현될 수 있다. 별법으로, 기공도는 지지대의 총면적에 대한 지지대 내의 기공 면적의 백분율 비일 수 있다.

본원에서 사용되는 "파열 압력"이라는 용어는 지지대의 적어도 부분 붕괴가 일어나기 전에 지지대가 견뎌낼 수 있는 관형 지지대의 내부와 외부 사이의 압력 차로 정의된다.

본원에서 사용되는 "벽 두께"는 관형 지지대의 외부 표면에서부터 그의 내부 관강 표면까지의 깊이 또는 크기로 정의된다.

본원에서 사용되는 "기공 직경"이라는 용어는 본 발명의 지지대 내의 기공의 평균 직경으로 정의된다.

본원에서 사용되는 "기공 구배"라는 용어는 한 표면에서부터 다른 한 표면까지의 기공 직경 크기의 선형 변화로 정의된다. 기공 직경 크기는 관형 요소의 한 층 내에서 점진적으로 감소할 것이다. 예를 들어, 크기는 한 표면, 예를 들어 관형 요소의 외막 또는 외부 표면에서부터 다른 한 표면, 예를 들어 관형 요소의 관강 또는 내부 표면으로 갈수록 감소할 수 있다.

본원에서 사용되는 "섬유 직경"이라는 용어는 본 발명의 지지대의 섬유의 평균 직경으로 정의된다.

본원에서 사용되는 "파단 변형"이라는 용어는 물질의 파괴시의 변형으로 정의된다.

본원에서 사용되는 "파단 응력"이라는 용어는 물질의 파괴시의 응력으로 정의된다.

본원에서 사용되는 "인성"이라는 용어는 물질 파괴에 요구되는 에너지, 즉 실패시까지의 응력/변형 곡선 아래의 계산된 면적으로 정의된다.

본원에서 사용되는 "탄젠트 델타"라는 용어는 관형 지지대에 저장된 에너지와 손실된 에너지의 상대적인 양의 지시자로 정의되고, 대표적으로 분자 이완을 특성화하고 유변학적 변환을 확인하는 데 이용된다.

본원에서 사용되는 "저장계수"라는 용어는 물질이 역학적 에너지를 저장할 수 있는 능력으로 정의되고, 대표적으로 분자 이완을 특성화하는 데 이용된다.

본원에서 사용되는 "꼬임 반경"이라는 용어는 굴곡된 관형 구조에서 꼬임이 형성되는 반경으로 정의된다.

본원에서 사용되는 "대역 계조"라는 용어는 둘 이상의 상이한 층을 가지는 적층 구조에서의 점진적 구배로 정의되고, 여기서 각 층은 상이한 유형의 물질을 함유하고, 구배는 층들 사이에 존재하고 상이한 물질 사이의 불균질성 대역이다. 예를 들어, 불균질성 대역은 엘라스토머성 요소로부터의 물질 및 인장 요소로부터의 물질을 함유할 수 있다.

본원에서 사용되는 "평활근 세포"라는 용어는 중공 기관(예: 방광, 복강, 자궁, 위장관, 맥관 구조 등)의 벽에서 발견되고 수축 및 이완 능력을 가짐을 특징으로 하는 무늬가 없는 근육을 구성하는 세포를 의미한다. 혈관 평활근 세포는 중간막(혈관의 가장 두꺼운 층) 전체에 걸쳐서 발견되고, 원형으로 배열된 탄성 섬유 및 연결 조직을 함유한다. 하기하는 바와 같이, 평활근 세포 군집은 다양한 원천으로부터 단리될 수 있다.

본원에서 사용되는 "내피세포"라는 용어는 본 발명의 지지대에 내부 관강 표면 상에 또는 지지대 내에 시딩하는 데 적당한 세포를 의미한다. 내피세포는 천연 혈관의 내부 또는 관강 표면을 덮고, 혈전증 방지 및 조직 내부성장 및 원하지 않는 세포외 기질 생성 방지를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 기능을 한다. 하기하는 바와 같이, 본 발명의 지지대 상에 시딩하기 위한 내피세포 군집은 혈관 유조직, 순환 내피세포 및 내피세포 전구체, 예를 들어 골수 전구세포, 말초 혈액 줄기 세포 및 배아 줄기 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 원천으로부터 단리될 수 있다.

본원에서 사용되는 "세포 군집"이라는 용어는 보통은 포유동물의 적당한 조직 원천으로부터 직접 단리한 후 시험관 내에서 배양함으로써 얻어지는 많은 세포를 의미한다. 당업계 통상의 기술을 가진 자는 본 발명과 함께 사용하기 위한 세포 군집을 단리하고 배양하는 다양한 방법 및 본 발명에 사용하기에 적당한 다양한 많은 세포 군집을 인식할 것이다.

본원에서 사용되는 "포유동물"이라는 용어는 사람, 사람이 아닌 영장류, 가축, 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예를 들어 말, 돼지, 소, 개, 고양이 및 흰족제비 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물로 분류되는 어떠한 동물도 의미한다. 본 발명의 바람직한 한 실시태양에서, 포유동물은 사람이다.

본원에서 사용되는 "사람이 아닌 동물"이라는 용어는 예를 들어 사람이 아닌 영장류, 설치류(예: 생쥐 및 쥐), 및 비설치류 동물, 예를 들어 토끼, 돼지, 양, 염소, 소, 돼지, 말 및 당나귀 같은 포유동물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또, 그것은 조류(예: 닭, 칠면조, 오리, 거위 등)을 포함한다. 본원에서 사용되는 "영장류가 아닌 동물"이라는 용어는 위에서 구체적으로 기재한 포유동물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 영장류 이외의 다른 포유동물을 의미한다.

본원에서 "심혈관 질환" 또는 "심혈관 장애"는 넓은 일반적 의미로 사용되며 심혈관계에 영향을 주는 심장 또는 혈관(동맥 및 정맥)의 기능 이상을 특징으로 하는 포유동물의 장애 또는 병태, 특히 동맥경화증 관련 질환을 의미한다. 이러한 질환 또는 장애는 특히 본원에 기술된 TEBV를 우회 혈관 이식편으로 이용하는 치료 를 받을 수 있다. 이러한 이식편은 관상동맥 우회 이식편(CABG), 말초 우회 이식편, 또는 동정맥 단락을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 심혈관 장애의 예는 심근 허혈, 심장 발작, 뇌졸증, 경벽성 또는 비경벽성 심근 경색, 급성 심근 경색, 말초 혈관 질환, 관상동맥 질환, 관상동맥 심장 질환, 부정맥, 돌연 심장사, 뇌혈관 사고, 예를 들어 뇌졸증, 울혈성 심부전, 치명적 율동 부정, 심근병증, 일과성 허혈 발작, 급성 허혈 증후군, 또는 협심증, 급성 관상동맥 스텐트 부전, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 장애의 다른 예는 비제한적으로 혈전성 병태, 예를 들어 폐색전증, 관상동맥의 급성 혈전증, 심근 경색, 뇌동맥(뇌졸증) 또는 다른 기관의 급성 혈전증을 포함한다.

2. J형 곡선 응력/변형 반응

도 1은 2 개의 주요 구조 단백질인 콜라겐 및 엘라스틴의 상승적 상호작용으로부터 생기는 천연 동맥에 고유한 응력 및 변형에 대한 역학적 반응인 J형 곡선을 도시한다(로치(Roach) 등 (1957) Can. J. Biochem. Physiol. 35:681-690). 천연 혈관 역학은 비선형이고, 콜라겐 및 엘라스틴의 상승적 상호작용으로 인해 힘(응력)/변위(변형) 도표에서 "J"형 곡선임을 특징으로 한다(도 2). 동맥에 콜라겐 및 엘라스틴의 존재는 동맥에 난해한 비선형 거동을 제공한다. 천연 동맥에서 엘라스틴이 추출되어 콜라겐이 주된 구조 단백질로 남는다면, 역학적 반응은 훨씬 더 강직성을 가진다. 반대로, 천연 동맥이 처리되어 콜라겐을 제거하면, 우세한 구조 단백질은 엘라스틴이고, 역학은 선형 탄성 특성을 나타낸다. 천연 동맥의 "J"형 곡선은 동맥에 존재하는 주요 구조 단백질인 콜라겐 및 엘라스틴의 조합된 효과에 기인하는 비선형 거동이다(Gosline & Shadwick(1998) American Scientist. 86:535-541).

이 생물학적 복합체에서, 콜라겐은 고강직성 저탄성 성분으로 거동하고, 한편, 엘라스틴은 고탄성 저강직성 요소로 거동한다. 콜라겐은 응력을 받을 때 거의 늘어날 수 없는 인장 성분이고, 따라서 힘줄 및 인대 같은 조직에서의 역할이 특히 적합하다. 그러나, 엘라스틴은 응력에 대해 충분히 회복가능하고 반복가능한 대규모 변형으로 반응할 수 있음을 특징으로 한다. 엘라스틴의 이러한 특성은 엘라스틴을 어느 정도의 반동력 또는 회복력을 요구하는 조직, 예를 들어 피부, 동맥 및 폐에 적합하게 한다.

혈관 이식편에서 개통성 손실과 관련 있는 한가지 중요한 실패 방식은 봉합선에서 조직 내부성장이 일어남을 특징으로 하는 내막 과다증식(IH)이다. IH는 매우 상이한 역학적 성질을 가지는 두 혈관 세그먼트 사이의 계면의 컴플라이언스 불일치에 의해 유발되는 것으로 알려져 있다(오 도넬(O'Donnell) 등 (1984) J. Vasc. Surg. 1:136-148; 세이어스(Sayers) 등(1998) Br.J.Surg. 85:934-938; 스테펜(Stephen) 등(1977) Surgery. 81:314-318; 티브켄(Teebken) 등(2003) Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 23(6):475-85; 칸난(Kannan) 등(2005) J. Biomed. Mater. Res Part B - Appl Biomater 74B(1):570-81; 월포트(Walpoth) 등(2005) Expert Rev. Med. Dev.2(6):647-51). 이 계면 대역은 이식편의 병리학적 과정 및 그 결과로 생기는 폐색(개통성 상실)의 단계로 향하게 하는 부자연한 유체 역학적 상태를 나타낸다.

컴플라이언스 일치는 중요한 것으로 인식되어 왔지만, 천연 동맥이 비선형 거동을 나타낸다고 가정하면, 오직 하나의 기울기(역학적 반응 곡선의 일부)를 명시할 경우 상당한 일치가 발생할 수 있을 가능성이 없다. 컴플라이언스(및 강직성)을 결정하는 일반적인 동향은 각 그래프로부터 초기 준선형 세그먼트만을 고려하는 것으로 보인다(Sanders 등, 미국 특허 출원 공개 2003/0211130(도 16); Lee 등(2007) J Biomed Mater Res A.[Epub ahead of print PMID: 17584890]; 스미스 등(2007) Acta Biomater.[Epub ahead of print, PMID: 17897890]). 그러나, 이 초기 준선형 세그먼트 후에 발생하는 것을 무시함으로써, 중요한 정보가 손실된다. "J"형 곡선은 도 1에 나타낸 바와 같이 비선형이고, 따라서 두 개의 독립된 기울기가 교차하는 것으로 모델링될 수 있다. 도 2는 이 개념을 도시하고, 두 상이한 계수(강직성)와 관련 있는 두 선형 영역을 대략 구분함으로써 대략 하나의 "J"형 곡선을 나타낸다. 동일한 접근법은 컴플라이언스에 대한 압력/부피 그래프에 이용될 수 있다. 따라서, 컴플라이언스에 관한 한, 본 발명은 응력/변형 그래프 상의 초기 준선형 세그먼트 동안의 측정 뿐만 아니라 이 초기 세그먼트 후의 측정도 고려한다.

곡선의 "J"형은 단지 천연 혈관 제작에 이용된 물질의 특별한 선택에 기인하는 우연한 역학적 거동을 나타내는 것은 아니다. 오히려, 그 모양 자체는 동맥류 생성에 대해 특히 내성을 나타낸다(섀드윅(Shadwick)(1998) American Scientist. 86:535-541). 추가로, 천연 혈관의 역학적 거동을 모방하는 것은 거시적 이익, 즉 컴플라이언스 불일치의 조절을 제공한다. 일부는 많은 상이한 유형의 세포가 그것이 시딩되는 미시적 역학적 환경에 민감하다는 것을 보여준다. 이것은 세포가 시딩되는 기질의 역학적 성질 뿐만 아니라 조직에 영향을 미치는 요인, 예를 들어 압축(예: 무릎 관절의 연골), 주기적 변형(예: 맥동류를 경험하는 혈관) 등에 의해 세포에 부여되는 응력을 포함한다(조지(Georges) 등(2006) Biophys. J. 90(8):3012-18; 잉글러(Engler) 등(2004) J. Cell Biol. 13;166(6):877-87; 레펠트(Rehfeldt) 등 (2007) Adv. Drug. Deliv. Rev. Nov. 10;59(13):1329-39; 페이톤(Peyton) 등(2007) Cell Biochem. Biophys. 47(2):300-20). 예를 들어, 혈관 평활근 세포는 혈관 조직의 일부 변형 체제에 민감하다(리차드(Richard) 등 (2007) J. Biol. Chem. 282(32):23081-8). 추가로, 힘줄, 뼈, 및 신체의 거의 모든 조직의 세포는 그것이 존재하는 미시적 역학적 환경에 절묘하게 조정되고, 이것은 천연 조직의 거동을 비슷하게 모방해야 하는 또 하나의 어쩔 수 없는 이유를 제공한다. 예상되는 역학적 성질로부터의 이탈은 세포를 상이한 발달 경로로 보낼 수 있거나 또는 궁극적으로는 세포 괴사 또는 세포 사멸을 수반하는 치사 경로로 보낼 수 있다.

3. 조직 공학(TE) 지지대

천연 혈관은 다층 또는 적층 구조를 가진다. 예를 들어, 동맥은 3 개의 층, 즉 관강 표면을 라이닝하는 거대혈관 내피 세포를 포함하는 내막이라고 불리는 가장 안쪽 층, 평활근 세포의 시트를 다수 포함하는 중막이라고 불리는 중간층, 및 느슨한 연결 조직, 더 작은 혈관 및 신경을 함유하는 외막이라고 불리는 외부층을 가진다. 내막 및 중막은 기저막에 의해 분리된다.

천연 혈관의 특수한 구조 특징(기복, 주름, 꼬임)은 상이한 변형에서 상이한 정도로 역학적으로 맞물리는 콜라겐 및 엘라스틴 박층의 평행 배열을 촉진한다. 천연 동맥은 원주방향으로 동심형으로 배열되는 탄성 박층을 가진다. 이러한 박층은 주름진다. 이론상, 탄성 박층의 주름은 주변 콜라겐층을 연행하여 콜라겐층에 유사한 기하 구조를 부여할 수 있지만, 이것은 대표적으로 관찰되지 않는다. 게다가, 조직학은 탄성 박층이 대표적으로 어느 정도 농도의 글리코사미노글리칸(GAG)으로 둘러싸인다는 것을 보여준다. 예를 들어, 달(Dahl) 등의 2007년 보고서는 조직 공학적 혈관과 천연 동맥의 비교를 보고하고, 여기서는 대표적인 모바트(Movat)의 염색 및 베호프-반 기에슨(Verheoff-Van Gieson)의 염색(Annals of Biomedical Engineering 2007 Mar;35(3):348-55)을 이용해서 각각에서 주름진 엘라스틴 박층이 분명하게 시각화되었다. 따라서, 천연 동맥에서의 대표적 관찰은 탄성 박층의 주름이지만, 주변 콜라겐 층에는 주름이 없다. 이에 대한 예외는 참고래에서 증명된 보기 드문 구조이고, 여기에서는 인장 요소인 것으로 우연히 발견된 콜라겐 성분이 매우 주름진 새로운 연결 조직 디자인이 존재한다(고슬린(Gosline) 1998, 상기 문헌).

본원에서 기술하는 바와 같이, 본 발명은 천연 동맥에서 대표적으로 발견되는 것에 역으로 접근한, 즉 탄성층이 아니라 지지대의 인장층이 주름을 가지는 조직 공학 지지대 및 그의 제조 방법을 포함한다. 이 접근은 탄성층에 주름을 부여하는 것보다는 인장층 내에 주름을 부여하는 것이 더 쉽기 때문에 유리하다.

본 발명의 조직 공학 지지대는 다층 또는 적층 구조를 가진다. 한 실시태양에서, 지지대는 (a) 엘라스토머성 성분, 외부 표면 및 내부 관강 표면을 함유하는 제1 관형 요소; 및 (b) 제1 관형 요소의 외부 표면과 접촉하는, 인장 요소, 외부 표면 및 내부 관강 표면을 함유하는 제2 관형 요소를 포함한다.

다른 한 실시태양에서, 제2 관형 요소는 주름진다. 본원에서 기술하는 조직 공학 지지대에 존재하는 주름은 도 15a - 15b에서 예시되고, 여기서는 지지대의 외부 표면 상에서의 그의 외관을 나타낸다.

다른 실시태양에서, 주름진 제2 관형 요소는 섬유 방향이 원주방향으로 배향되는 섬유 망상구조를 가진다. 도 16a - 16b는 원주방향으로 균일한 성질의 주름의 단면도를 나타낸다.

추가의 관형 요소가 제1 관형 요소 및 제2 관형 요소 위에 첨가될 수 있다.

제1 관형 요소의 내부 관강 표면 및 제2 관형 요소의 외부 표면은 둘 모두 추가 조작을 위해 예를 들어 TEBV 생성시 접근할 수 있다. 아래에서 기술하는 바와 같이, 본 발명의 조직 공학 지지대는 지지대에 하나 이상의 세포 군집을 혼입함으로써 조직 공학적 혈관(TEBV)을 제조하는 데 이용될 수 있다. 지지대의 적층 구조는 세포 군집, 예를 들어 평활근 세포, 내피세포 및 섬유아세포의 예상되는 분배를 촉진할 수 있는 더 천연적인 혈관 모르폴로지를 제공한다.

본원에 기술된 지지대의 엘라스토머성 요소는 지지대에 완전히 회복가능하고 반복가능한 대규모 변형으로 응력에 대해 반응할 수 있는 능력을 제공한다. 엘라스토머성 요소는 천연 성분, 합성 성분, 하나 초과의 천연 성분의 혼합물, 하나 초과의 합성 성분의 혼합물, 천연 성분 및 합성 성분의 혼합물, 또는 이들의 조합일 수 있는 엘라스토머성 성분을 가진다. 일반적으로, 유기 또는 천연 성분은 천연 조직 구조에 정상적으로 존재하거나 또는 천연 조직 구조로부터 유래될 수 있거나, 또는 단백질 및/또는 그의 아미노산 서열을 코딩하는 공지의 핵산 서열을 기반으로 재조합에 의해 또는 합성에 의해 제조될 수 있는 단백질이다. 예를 들어, 엘라스틴은 본래 동맥에 존재하고, 본 발명의 혈관 지지대에서 천연 성분으로서 이용될 수 있다. 천연 성분은 합성 성분을 포함하거나 또는 포함하지 않는 본원에서 기술하는 TE 지지대 및/또는 TEBV의 일부일 수 있다.

일부 실시태양에서, 제1 관형 요소의 엘라스토머성 요소는 유기 또는 천연 성분, 예를 들어 엘라스틴, 글루텐, 글리아딘, 애브덕틴, 거미 실크, 및 레실린 또는 프로레실린(엘빈(Elvin) 등 (2005) Nature. Oct 12:437(7061):999-1002)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 탄성 단백질을 포함한다. 당업계 통상의 기술을 가진 자는 본 발명의 지지대에 사용하기에 적합할 수 있는 다른 천연 탄성 단백질을 인식할 것이다.

천연 물질의 사용은 원상태의 혈관 지지대가 조직 공학적 혈관 제작 목적으로 추가 조작될 때 이점을 제공한다. 예를 들어, 특정 세포 군집이 지지대 상에서 배양되거나 또는 지지대 상에 시딩될 때, 지지대에 존재하는 천연 엘라스틴 단백질은 세포와 지지대의 적절한 상호작용을 조장한다.

다른 실시태양에서, 엘라스토머성 요소는 합성 성분을 포함한다. 합성 엘라스토머성 성분의 예는 비제한적으로 라텍스, 폴리우레탄(PU), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리-L-락티드산(PLLA), 폴리디악사논(PDO), 폴리(L-락티드-코-카프로락톤)(PLCL) 및 폴리(에테르우레탄 우레아)(PEUU)를 포함한다.

한 실시태양에서, 본 발명은 엘라스토머성 요소가 천연 탄성 성분 및 합성 탄성 성분을 포함하는 제1 관형 요소를 고려한다.

본원에 기술되는 지지대의 인장 요소는 지지대가 응력에 대한 반응으로 늘어나는 것을 저항할 수 있게 하는 강성 또는 긴장성을 지지대에 제공한다. 인장 요소는 천연 성분, 합성 성분, 하나 초과의 천연 성분의 혼합물, 하나 초과의 합성 성분의 혼합물, 천연 성분 및 합성 성분의 혼합물, 또는 이들의 조합일 수 있는 인장 성분을 가진다.

다른 한 실시태양에서, 제2 관형 요소의 인장 요소는 유기 또는 천연 성분, 예를 들어 콜라겐, 셀룰로오스, 실크 및 케라틴을 비제한적으로 포함하지만 이에 제한되지 않는 섬유 단백질을 포함한다. 당업계 통상의 기술을 가진 자는 본 발명의 지지대에 사용하기에 적합할 수 있는 다른 천연 섬유 단백질을 인식할 것이다. 다른 실시태양에서, 인장 요소는 합성 성분이다. 합성 인장 성분의 예는 비제한적으로 나일론, 다크론(등록상표)(폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)), 고어텍스(등록상표)(폴리테트라플루오로에틸렌), 폴리에스테르, 폴리글리콜산(PGA), 폴리-락틱-코-글리콜 산(PLGA) 및 폴리(에테르우레탄 우레아)(PEUU)를 포함한다. 한 실시태양에서, 본 발명은 인장 요소가 천연 인장 성분 및 합성 인장 성분을 포함하는 제2 관형 요소를 고려한다.

지지대의 엘라스토머성 요소 및 인장 요소는 천연 성분 및 합성 성분의 상이한 조합을 함유할 수 있다. 예를 들어, 지지대는 천연 탄성 성분 및/또는 천연 인장 성분, 및 합성 탄성 성분 및/또는 합성 인장 성분을 함유할 수 있다.

본 발명의 한 양상에서, TE 지지대는 상기한 바와 같이, 제1 관형 요소 위에 제2 관형 요소를 가지는 2층 구조에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 지지대는 추가의 관형 요소, 예를 들어 제2 관형 요소 위에 제3 관형 요소, 제3 관형 요소 위에 제4 관형 요소, 제4 관형 요소 위에 제5 관형 요소, 기타 등등을 포함한다. 추가로, 본원에서 기술하는 바와 같이, 추가의 관형 요소는 엘라스토머성 요소(들)(예: 천연 및/또는 합성) 또는 인장 요소(들)(예: 천연 및/또는 합성)를 함유할 수 있다. 추가의 관형 요소는 본원에 기재된 기술에 의해 결합될 수 있다.

한 양상에서, 엘라스토머성 요소에 함유되는 엘라스토머성 성분 및 인장 요소에 함유되는 인장 성분은 각각 상이한 탄성계수를 가진다. 한 실시태양에서, 엘라스토머성 요소의 엘라스토머성 성분의 탄성계수는 제1 탄성계수를 가지고, 인장 요소의 인장 성분은 제2 탄성계수를 가진다. 한 바람직한 실시태양에서, 제2 탄성계수는 제1 탄성계수보다 약 10 배 이상 크다. 한 실시태양에서, 제2 탄성계수는 제1 탄성계수보다 약 10 배, 약 100 배, 약 1000 배, 또는 약 10000 배 크거나, 또는 그 초과이다. 예를 들어, 실시예 1은 엘라스토머성 성분인 라텍스의 탄성계수가 0.3 MPa 내지 0.5 MPa인 것에 비해, 인장 성분인 PDO 및 비크릴(Vicryl)이 각각 3 GPa 및 9 - 18 GPa의 탄성계수를 가진다는 것을 보여준다(또한, 도 10 및 11 참조).

다른 한 양상에서, 본 발명의 TE 지지대는 천연 혈관에서 발견되는 것과 실질적으로 유사한 구조적 및 기능적 성질을 나타낸다. 천연 혈관에서는 두 주요 단백질 성분인 콜라겐 및 엘라스틴의 상승적 상호작용이 J형 응력/변형 곡선임을 특징으로 하는 응력 및 변형에 대한 역학적 반응을 일으킨다(로치(Roach) 등 (1957) Can. J. Biochem. Physiol. 35:681-690). 당업계 통상의 기술을 가진 자는 응력 및 변형에 대한 반응, 컴플라이언스, 영률, 기공도, 강도 등을 비제한적으로 포함하는, 본 발명의 지지대가 천연 혈관을 모방하거나 또는 비숫하게 흡사하다는 것을 입증하는 데 이용될 수 있는 많은 매개변수를 인식할 것이다. 한 실시태양에서, 본 발명의 지지대는 비등방성 방식으로 응력 및 변형에 대해 역학적으로 반응할 수 있는 능력을 가짐을 특징으로 한다.

당 분야의 많은 잘 알려진 매개변수가 조직 공학 지지대의 거동을 특성화하는 데 유용하다. 표 1은 이러한 매개변수의 일부에 대해 보고된 값(및 각각의 간행물 인용)의 예를 제공한다.

표 2는 TE 지지대 또는 TEBV에 천연 혈관과 실질적으로 유사한 역학적 성질을 제공하는 것을 계획하는 표 1에 인용된 문헌을 근거로 하여 특성 명세를 제공한다.

이들 매개변수는 본 발명의 조직 공학 지지대의 역학적 거동을 특성화하는 데 유용하고, 특히, 지지대가 천연 혈관의 성질과 실질적으로 유사한 성질을 나타내는지를 결정하는 데 유용하다. 본 발명은 표 2의 값을 가짐을 특징으로 하고, 천연 혈관의 역학적 성질과 실질적으로 유사한 역학적 성질, 바람직하게는 (i) J형 응력/변형 곡선임을 특징으로 하는 응력 및 변형에 대한 역학적 반응, (ii) 내파괴성, (iii) 점탄성, 또는 (iv) (i) - (iii)의 조합을 나타내는 조직 공학 지지대에 관한 것이다. 추가로, 지지대는 TEBV를 생성하기 위해 세포를 시딩할 목적으로 다양한 세포 유형에 접근할 수 있는 능력을 가짐을 특징으로 한다.

한 실시태양에서, 본 발명의 조직 공학 지지대가 나타내는 J형 응력/변형 곡선의 특성은 (i) 약 0.1 MPa 내지 약 0.5 MPa의 원주방향 관 탄성계수 1, (ii) 약 3.0 MPa 내지 약 6.0 MPa의 원주방향 관 탄성계수 2, 및 (iii) 약 0.57 내지 약 1.12의 원주방향 계수 천이, 및 이들의 조합 때문이다. 다른 한 실시태양에서, 원주방향 관 탄성계수 1은 약 0.1 MPa, 0.13 MPa, 약 0.15 MPa, 약 0.17 MPa, 약 0.2 MPa, 약 0.22 MPa, 약 0.25 MPa, 약 0.27 MPa, 약 0.3 MPa, 약 0.32 MPa, 약 0.35 MPa, 약 0.37 MPa, 약 0.4 MPa, 약 0.42 MPa, 약 0.45 MPa, 약 0.47 MPa, 또는 약 0.5 MPa이다. 다른 한 실시태양에서, 원주방향 관 탄성계수 2는 약 3.0 MPa, 약 3.2 MPa, 약 3.5 MPa, 약 3.7 MPa, 약 4.0 MPa, 약 4.2 MPa, 약 4.5 MPa, 약 4.7 MPa, 약 5.0 MPa, 약 5.2 MPa, 약 5.5 MPa, 약 5.7 MPa, 또는 약 6.0 MPa이다. 다른 한 실시태양에서, 원주방향 계수 천이는 약 0.57, 약 0.59, 약 0.61, 약 0.63, 약 0.65, 약 0.67, 약 0.69, 약 0.71, 약 0.73, 약 0.75, 약 0.77, 약 0.79, 약 0.81, 약 0.83, 약 0.85, 약 0.87, 약 0.89, 약 0.91, 약 0.93, 약 0.95, 약 0.97, 약 0.99, 약 1.01, 약 1.03, 약 1.05, 약 1.07, 약 1.09, 약 1.11, 또는 약 1.12이다.

다른 한 실시태양에서, 내파괴성에 유리한 성질은 (i) 약 0.45 MJ/㎥ 내지 약 1.0 MJ/㎥의 원주방향 관 인성; (ii) 약 0.1 MJ/㎥ 내지 약 0.5 MJ/㎥의 축방향 관 인성; 또는 (iii) (i) 및 (ii)의 조합이다. 생체 물질의 인성은 그의 내파괴성 결정에 도움을 주는 매개변수이다. 분명한 것은, 내파괴성 또는 내인열성은 어떠한 TEBV 또는 그로부터 유래되는 혈관 이식편의 개통성 보장에 도움을 주기 때문에 TE 지지대에 요망되는 특징이다. 천연 혈관은 유체의 주기적 부하의 응력 및 변형에 대한 반응으로 변형된다. 이러해서, 그것은 종방향 또는 축방향 방식 및/또는 원주방향 방식으로 쪼개짐 또는 파괴의 위험이 있다. 천연 혈관과 유사하게, 본 발명의 TE 지지대 및 TEBV로부터 유래되는 혈관 이식편도 또한 파괴의 위험이 있다. 본 발명은 특정 축방향 인성 및/또는 특정 원주방향 인성이 내파괴성 또는 내인열성 TE 지지대에 기여한다는 발견에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 원주방향 관 인성은 약 0.45 MJ/㎥, 약 0.50 MJ/㎥, 약 0.55 MJ/㎥, 약 0.60 MJ/㎥, 약 0.65 MJ/㎥, 약 0.70 MJ/㎥, 약 0.75 MJ/㎥, 약 0.80 MJ/㎥, 약 0.85 MJ/㎥, 약 0.90 MJ/㎥, 약 0.95 MJ/㎥, 약 1.0 MJ/㎥이다. 다른 한 실시태양에서, 축방향 관 인성은 약 0.1 MJ/㎥, 약 0.15 MJ/㎥, 약 0.20 MJ/㎥, 약 0.25 MJ/㎥, 약 0.30 MJ/㎥, 약 0.35 MJ/㎥, 약 0.40 MJ/㎥, 약 0.45 MJ/㎥, 또는 약 0.50 MJ/㎥이다. 다른 한 실시태양에서, 본 발명의 TE 지지대는 i) J형 응력/변형 곡선임을 특징으로 하는 응력 및 변형에 대한 역학적 반응을 가지는 지지대; ii) 내파괴성 지지대; 및 iii) 점탄성 지지대 중 하나 이상임을 특징으로 한다.

다른 한 실시태양에서, TE 지지대의 점탄성 성질은 (i) 약 0.05 내지 약 0.3의 탄젠트 델타; (ii) 약 400 MPa 내지 약 0.12 MPa의 저장계수; 또는 (iii) (i) 및 (ii)의 조합을 특징으로 한다. 점탄성 물질은 변형에 대한 반응으로 점성 및 탄성 특성 둘 모두를 나타낸다. 응력이 적용될 때, 점성 물질은 시간이 지남에 따라 선형적으로 변형에 저항하지만, 탄성 물질은 응력에 대해 반응하여 즉시 변형하고, 일단 응력이 제거되면 신속하게 원래의 상태로 복귀한다. 점탄성 물질은 응력에 대해 반응하여 시간 의존성 변형을 나타내고, 이것은 대표적으로 무정형 물질 내의 원자 또는 분자의 확산을 수반한다. 탄성 물질은 부하가 적용된 후 제거될 때 에너지를 소산하지 않지만, 점탄성 물질은 부하가 적용된 후 제거될 때 사실상 에너지를 손실한다. 천연 혈관은 점탄성을 나타내어 유체의 주기적 부하에 대처하기 때문에, 이러한 특성이 TEBV 또는 혈관 이식편을 생성하는 데 이용되는 본 발명의 TE 지지대에 바람직하다. 본 발명은 본 발명의 TE 지지대의 점탄성이 특정 탄젠트 델타 값 및/또는 특정 저장계수 값을 가짐을 특징으로 한다는 발견에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 탄젠트 델타는 약 0.05, 약 0.06, 약 0.07, 약 0.08, 약 0.09, 약 0.10, 약 0.11, 약 0.12, 약 0.13, 약 0.14, 약 0.15, 약 0.16, 약 0.17, 약 0.18, 약 0.19, 약 0.20, 약 0.21, 약 0.22, 약 0.23, 약 0.24, 약 0.25, 약 0.26, 약 0.27, 약 0.28, 약 0.29, 또는 약 0.30이다. 다른 실시태양에서, 저장계수는 약 400 MPa, 약 350 MPa, 약 300 MPa, 약 250 MPa, 약 200 MPa, 약 150 MPa, 약 100 MPa, 약 90 MPa, 약 80 MPa, 약 70 MPa, 약 60 MPa, 약 50 MPa, 약 40 MPa, 약 30 MPa, 약 20 MPa, 약 10 MPa, 약 9 MPa, 약 8 MPa, 약 7 MPa, 약 6 MPa, 약 5 MPa, 약 4 MPa, 약 3 MPa, 약 2 MPa, 약 1 MPa, 약 0.9 MPa, 약 0.8 MPa, 약 0.7 MPa, 약 0.6 MPa, 약 0.5 MPa, 약 0.4 MPa, 약 0.3 MPa, 약 0.2 MPa, 약 0.19 MPa, 약 0.18 MPa, 약 0.17 MPa, 약 0.16 MPa, 약 0.15 MPa, 약 0.14 MPa, 약 0.13 MPa, 또는 약 0.12 MPa이다.

본 발명의 지지대의 바람직한 성질을 확인하고 특성화하는 데 적당한 당업계 통상의 기술을 가진 자에게 잘 알려진 몇 가지 기술이 있다. 이 기술은 파열 압력 검사; 원주방향에서 준정적 역학적 검사(a.k.a 인장 검사)(결과는 응력/변형 그래프로 제공됨); 기공도 및 기공 크기 결정(예: 수은 압입 공극 측정에 의해); 세포 부착 분석; 및 열화 속도; 이식편 컴플라이언스 측정을 위한 압력/부피 곡선을 비제한적으로 포함한다.

4. TE 지지대 제조 방법

본 발명의 방법은 천연 혈관과 동등한 적당한 장기 지속적인 생체역학적 성질을 가지는 TE 지지대 제작에 관한 것이다. 한 양상에서, 본 발명의 방법은 적층된 구조, 즉 엘라스토머성 요소, 외부 표면 및 내부 관강 표면을 포함하는 제1 관형 요소; 및 제1 관형 요소의 외부 표면과 접촉하는, 인장 요소, 외부 표면 및 내부 관강 표면을 포함하는 제2 관형 요소를 가지는 혈관 지지대 제조 방법을 제공한다. 도 3에 도시된 바와 같이, 제1 관형 요소는 전기방사(도 3a) 및 캐스팅(도 3b), 및 이들의 어떠한 조합도 비제한적으로 포함하는 당업계에 알려진 기술에 의해 심봉 상에 생성될 수 있다. 엘라스토머성 요소, 예를 들어 엘라스틴 및/또는 엘라스토머성 중합체가 생체내 응용에 필요한 공칭 크기 이상인 제1 직경을 가지는 제1 관형 요소를 생성하는 데 이용될 수 있다. 전기방사는 (i) 하나 이상의 엘라스토머성 천연 성분 및/또는 하나 이상의 엘라스토머성 합성 성분을 함유하고/하거나, (ii) 하나 이상의 인장 천연 성분 및/또는 하나 이상의 인장 합성 성분을 함유하는 용액을 적용함으로써 수행될 수 있다. 전기방사는 엘라스토머성 요소의 섬유의 원주방향 배열의 이점을 제공하고, 따라서 혈관의 강도를 증가시킨다.

엘라스토머성 요소를 함유하는 제1 관형 요소가 일단 생성되면, 그것을 가변 직경을 가지는 심봉의 이용 또는 제1 관형 요소의 제거 및 더 큰 심봉 상에의 배치의 이용을 비제한적으로 포함하는 당업계에 알려진 기술에 의해 제2 직경으로 확장시킨다. 가변 직경을 가지는 심봉의 사용은 마찰 때문에 문제가 될 수 있는 심봉으로부터 제1 관형 요소의 제거를 피한다는 이점을 가진다. 제1 관형 요소를 제2 직경으로 확장시키는 것은 동맥이 정상 기능 동안에 겪는 물리적 변형의 정도, 즉 약 5% 내지 약 35%를 고려하는 것을 의도한다.

한 실시태양에서, 제1 관형 요소는 본원에 기재된 기술에 의해 약 1 ㎜, 약 2 ㎜, 약 3 ㎜, 약 4 ㎜, 약 5 ㎜, 약 6 ㎜, 약 7 ㎜, 약 8 ㎜, 약 9 ㎜, 또는 약 10 ㎜의 제1 직경을 가지도록 생성된다. 한 바람직한 실시태양에서, 제1 직경은 약 3 ㎜ 내지 약 8 ㎜, 더 바람직하게는 약 4 ㎜ 내지 약 7 ㎜, 가장 바람직하게는 약 5 ㎜ 내지 약 6 ㎜이다.

다른 한 실시태양에서, 제1 관형 요소가 본원에 기재된 기술에 의해 확장되는 제2 직경은 약 4 ㎜, 약 5 ㎜, 약 6 ㎜, 약 7 ㎜, 약 8 ㎜, 약 9 ㎜, 약 10 ㎜, 약 11 ㎜, 약 12 ㎜, 약 13 ㎜, 약 14 ㎜, 약 15 ㎜, 또는 약 16 ㎜이다. 한 바람직한 실시태양에서, 제2 직경은 약 5 ㎜ 내지 약 10 ㎜, 더 바람직하게는 약 6 ㎜ 내지 약 9 ㎜, 가장 바람직하게는 약 7 ㎜ 내지 약 8 ㎜이다.

일단 제2 직경으로 확장되면, 캐스팅 또는 전기방사를 비제한적으로 포함하는 당업계에 알려진 기술에 의해 제1 관형 요소의 외부 표면 상에 제2 관형 요소가 생성되거나 또는 층화된다. 인장 요소, 예를 들어 콜라겐 및/또는 인장 중합체가 제2 관형 요소를 생성하는 데 이용될 수 있다. 전기방사는 다양한 길이의 인장 섬유를 생성할 수 있기 때문에 제2 관형 요소를 제공하거나 또는 생성하는 방법으로 유리하다.

제1 관형 요소 위에 제2 관형 요소를 생성한 후, 당업계 통상의 기술을 가진 자에게 알려진 다양한 기술에 의해 층들을 결합할 수 있다. 이러한 기술은 외과용 접착제, 예를 들어 피브린 기반 접착제의 이용, 또는 존재하는 합성 중합체의 비율을 이용한 용매 상호작용의 이용을 비제한적으로 포함한다.

한 실시태양에서, 결합 단계는 제2 관형 요소를 제1 관형 요소 위에 생성하거나 또는 놓은 후에 수행되고, 제2 관형 요소의 외부 표면 상에 추가의 물질 층을 적용하여 제1 관형 요소와 추가의 물질 층 사이에 제2 관형 요소의 접착 삽입을 할 수 있게 하는 단계를 포함한다. 다른 한 실시태양에서, 추가의 층은 제1 관형 층을 생성하는 데 이용된 것과 동일한 유형의 물질을 함유한다. 다른 한 실시태양에서, 결합은 엘라스토머성 요소를 함유하는 추가의 층(예: 예를 들어, 하기하는 천연/합성 엘라스토머성 물질 혼합물을 함유하는 용액 1)을 전기방사에 의해 적용함으로써 달성된다.

당업계 통상의 기술을 가진 자는 층 내에서의 가교 및 층 사이의 가교를 달성하는 데 다른 기술이 이용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 열 처리가 축합 반응을 기반으로 인장 요소(예: 콜라겐)에 가교를 생성하는 것으로 밝혀져 있다. 다른 생체적합성 화학적 가교 처리도 이 분야에서 효과적인 것으로 밝혀져 있다.

도 4a는 본원에 기술된 신규 지지대 구조물을 생성하는 전기방사 방법을 예시한다. 예를 들어, 천연/합성 엘라스토머성 물질 혼합물을 함유하는 용액 1을 회전하는 심봉 상에 방사하여 제1 직경 D_o를 가지는 제1 관형 요소를 생성한다. 이어서, 심봉의 직경을 천연 혈관에서의 생리학적 변형과 동등한 값인 제2 직경 D_f로 증가시키고(별법으로, 지지대를 더 큰 직경의 심봉 상에 놓고), 예를 들어 천연/합성 인장 물질 혼합물을 함유하는 용액 2를 용액 1로 생성된 제1 관형 요소 상에 전기방사하여 제2 직경 D_f를 가지는 제1 관형 요소 위에 제2 관형 요소를 생성한다. 이 결과로, 미리 응력을 받은 적층체 구조가 생성된다. 도 4b에 나타낸 마지막 단계는 심봉을 제1 직경 D_o로 복귀시키고, 이제 제1 관형 요소 및 제2 관형 요소 둘 모두를 포함하는 지지대를 제거하는 것을 포함한다. 용액 2로 이루어진 외부 적층체의 구조 분석은 도 4b의 확대한 부분에 나타낸 바와 같이 원주방향으로 섬유 구조에 주름이 있음을 밝힌다.

도 4e는 확장성 심봉 공정의 별법의 실시태양을 도시한다. 상기한 용액 1로부터 제1 관형 요소를 생성하여 제1 직경 D_o를 가지는 제1 관형 요소를 생성한다(A). 심봉의 직경을 제2 직경 D_f로 증가시키고(B), 이 시점에서, 확장된 심봉 상에 있는 동안에 제1 관형 요소 위에 천연/합성 인장 물질을 함유하는 제2 관형 요소를 놓는다(C). 제2 관형 요소를 놓은 후, 제2 관형 요소 위에 용액 1로부터 추가의 얇은 층을 전기방사하여 용액 1로부터의 각 층 사이에 제2 관형 요소의 접착 삽입을 허용할 수 있다(D). 용액 1로부터의 얇은 층을 적용한 후, 확장된 심봉의 직경을 제1 직경 D_o로 복귀시킨다(E). 제1 관형 요소의 수축은 제2 관형 요소를 연행하여 주름진 또는 꼬인 균일 표면 특징을 발생한다. 한 실시태양에서, 제2 관형 요소는 메쉬 형태이다.

상기한 바와 같이, 천연 혈관에 혈관 이식편이 접합되는 계면에서의 컴플라이언스 불일치로 인해 내막 과다증식이 발생할 수 있고, 이것이 혈관 이식편에서의 개통성 상실과 연관된 중요한 실패 양식이라는 것은 잘 알려져 있다. 이러한 내막 과다증식은 이식편의 동맥류 생성 및 비대를 초래할 수 있다고 알려져 있다. 각 박층이 상이한 컴플라이언스를 가지는 다중적층체 구조에서 생기는 문제는 층간박리이다. 이것은 박층들 사이에 갑작스런 천이가 있고 따라서 상응해서 높은 응력집중이 일어날 잠재성이 있는 구조에서 특별히 문제가 될 수 있다. 이것을 제거하기 위해, 연속하는 각 층이 연속하는 다음 대역과 충돌하는 불균질성 대역을 가지는 것을 보장함으로써 박층 사이의 갑작스런 천이를 감소시킬 수 있다.

도 4c는 이 개념을 도시한다. 층들 사이의 천이에 접근할 때, 이웃 층을 이루는 두 물질 사이에 혼합시 점진적 구배가 존재한다. 이 대역 계조는 많은 방법으로 달성될 수 있지만, 가장 분명하게는, 다수의 시린지 및 용액 구배를 이용해서 달성될 수 있다.

도 4d는 대역 계조를 달성하기 위한 전기방사 방법을 도시한다. 이 방법은 두 물질로부터 제작된 박층 사이에 점진적 천이를 발생시키기 위해 2 개의 방사구, 두 물질 용액, 및 연속 적용(겹침이 있음)을 이용한다. 예를 들어, 천연/합성 엘라스토머성 물질 혼합물을 함유하는 용액 1을 회전하는 심봉 상에 방사하여 제1 직경 D_o를 가지는 제1 관형 요소를 생성하지만(A), 용액 1의 적용이 완료되기 전에 심봉을 제2 직경 D_f로 확장시키고, 예를 들어 천연/합성 인장 물질 혼합물을 함유하는 용액 2를 적용하여(B) 제1 관형 요소 위에 제2 관형 요소를 생성한다(C). 바람직하게는, 용액 2의 적용은 용액 1의 적용이 종료되는 시점 가까이에서 시작한다. 용액 1 및 용액 2의 적용은 용액 1의 적용이 완료될 때까지(B) 동시에 연속한다. 따라서, 제1 관형 요소와 제2 관형 요소 사이의 대역에서 용액 1의 물질 및 용액 2의 물질의 점진적 블렌딩이 생성된다. 이 결과로, 대역 계조를 가지는 미리 응력을 받은 적층체 구조가 생성된다.

한 실시태양에서, 대역 계조를 포함하는 본 발명의 조직 공학적 지지대는 엘라스토머성 요소를 함유하는 제1 관형 요소, 제1 관형 요소의 외부와 접촉하는 인장 요소를 함유하는 제2 관형 요소, 및 제1 관형 요소의 엘라스토머성 요소 및 제2 관형 요소의 인장 요소의 점진적 천이 또는 구배 혼합 대역으로 이루어진다. 다른 한 실시태양에서, 조직 공학적 지지대의 대역 계조는 제1 관형 요소 및 제2 관형 요소 각각으로부터의 물질을 가지는 불균질성 천이 대역을 함유한다.

상기한 바와 같이, 본 발명은 심봉의 직경을 제1 직경 (D_o)로부터 불연속적 제2 직경 (D_f)로 증가시킨 다음, 후속해서 제1 직경(D_o)로 복귀시키는 방법을 제공한다. 다른 한 실시태양에서, 본 발명은 전기방사 동안에 연속 직경 증가로 심봉 직경을 제1 직경 (D_o)로부터 제2 직경 (D_f)로 증가시키는 방법을 제공한다. 연속 직경 증가를 달성하기 위해서는, 제1 관형 요소 위에 용액 2를 전기방사하여 제2 관형 요소를 생성하는 동안 심봉을 직경이 제1 직경(D_o)로부터 제2 직경(D_f)로 연속 변화율로 증가하도록 프로그래밍할 수 있다. 이러한 접근은 2 층 박층 구조가 원주방향으로 신장되는 동안 외부 인장 층이 상이한 변형 값으로 맞물리는 것을 보장하고, 더 천연적인 "J"형 곡선과 관련 있는 더 점진적인 곡률을 보장할 것이다.

도 5는 회전하는 동안 연속 직경 변화가 가능한 확장성 심봉 장치를 도시한다. 도 5A는 전기방사된 관이 심봉의 직경을 수축시킴으로써 쉽게 제거될 수 있는 근사 최소 직경을 나타낸다. 도 5B는 최대 직경 구성의 심봉을 나타낸다. 심봉 구역들은 방사하는 동안 프로그래밍된 변화율로 연속 이동하는 것을 허용하는 나사 구동 트랙에 있다.

한 실시태양에서, 신규 지지대 구조물의 직경 증가 및 감소 단계는 전기방사 단계와 동시에 수행된다. 한 바람직한 실시태양에서는, 예를 들어 천연/합성 엘라스토머성 물질 혼합물을 함유하는 용액 1로부터 생성되는 제1 관형 요소의 제1 직경 D_o를 정상 연속 변화율로 제2 직경 D_f로 증가시키고, 동시에, 예를 들어 천연/합성 인장 물질 혼합물을 함유하는 용액 2를 제1 관형 요소 상에 전기방사한다. 최종 결과는 인장 요소가 신규 지지대 구조물에 연속성 인장 섬유로서 존재하도록 탄성 요소를 함유하는 제1 관형 요소 상에 인장 요소를 함유하는 제2 관형 요소가 침착되는 것이다. 신규 지지대 구조물을 통해서 점진적으로 증가하는 부피의 유체를 순환할 때, 제1 관형 요소의 제1 직경 D_o는 제1 관형 요소에 함유된 탄성 요소 때문에 반응시 점진적으로 증가할 것이고, 그것이 그렇게 하기 때문에, 유체 순환으로 인해 제1 직경 D_o가 제2 직경 D_f로 점진적으로 증가할 때 이러한 연속성에 제2 관형 요소에 존재하는 연속성 인장 섬유가 맞물릴 것이다. 이러해서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 연속성 인장 섬유는 통과하는 유체 부피가 증가하기 때문에 인장 섬유의 점진적 맞물림 성질을 신규 지지대 구조물에 주입시킨다. 이러한 성질은 본 발명의 조직 공학 지지대가 나타내는 천연 혈관과의 실질적 유사성에 추가로 기여한다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 방법은 제1 관형 요소 위에 제2 관형 요소를 생성하기 위해 전기방사를 이용할 수 있다. 한 실시태양에서, 제2 관형 요소는 전기방사에 의해 생성되는 것이 아니라, 오히려, 제1 관형 요소 위에 놓일 수 있는 모노필라멘트(반지름 방향에서 하나의 필라멘트 두께를 가짐)의 편성, 제직 또는 메쉬 구조물이다. 이 실시태양에서는, 제1 관형 요소를 생성하고, 제1 관형 요소를 둘러싸서 편성/제직/메쉬 제2 관형 요소를 배치하기 전에 선택된 변형 값을 가지는 요망되는 직경으로 확장시킨다. 편성/제직/메쉬 제2 관형 요소의 크기는 도 6에 나타낸 바와 같이 요망되는 확장 크기에서 제1 관형 요소와 꼭 맞도록 미리 선택될 수 있다. 배치 후, 제2 관형 요소를 상기한 결합 기술을 통해서 제1 관형 요소에 체결할 수 있다.

본원에 기술된 바와 같이, 혈관 지지대는 외부 표면 및 내부 관강 표면을 포함하는 제1 관형 요소, 및 외부 표면 및 내부 관강 표면을 포함하는 제2 관형 요소를 포함한다. 결합 후, 제1 관형 요소의 외부 표면은 제2 관형 요소의 내부 관강 표면과 접촉한다. 이 시점에서, 제1 관형 요소의 내부 관강 표면 및 제2 관형 요소의 외부 표면은 둘 모두 추가 조작을 위해 접근가능하다.

결합이 완료된 후, 제1 관형 요소의 제2 직경을 원래의 제1 직경으로 감소시킨다. 이것은 가변 심봉을 제1 직경으로 감소시킴으로써 수행될 수 있거나, 또는 캐스팅의 경우에는, 단순히 지지대를 큰 심봉으로부터 제거함으로써 수행될 수 있다. 제1 관형 요소를 그의 제1 직경으로 도로 축소시키는 것은 인장 요소를 함유하는 제2 관형 요소의 섬유에 일련의 주름을 부여한다.

다른 한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 가변적인 꼬임 정도를 가지는 제1 관형 요소(엘라스토머성 요소를 함유함)에 섬유, 특히 고유 꼬임 정도를 가지는 인장 필라멘트를 적용하는 것을 포함한다. 이러한 섬유는 예를 들어 방광 치환 지지대 생성에 이용되는 부직 펠트로부터 단리될 수 있다. 이 섬유는 12 - 18 ㎛의 직경(길이: ~ 2 ㎝)을 가지고, 부직 펠트 생성에서 니들링 공정을 위해 이러한 기하구조에 대한 필수 요구에 근거하는 꼬인 모르폴로지를 가진다.

도 7은 펠트 물질로부터 실현될 수 있는 섬유 모르폴로지를 도시한다. 변하는 모르폴로지는 제1 관형 요소(엘라스토머성 요소 함유)가 확장할 때의 연속성 강직에 기여한다. 한 실시태양에서는, 이러한 비연속 섬유가 요망되는 확장된 크기의 제1 관형 요소에 부착되고, 임의로, 일반적으로 원주방향으로 배향된다. 일단 적용되면, 섬유는 상기 결합 기술 중 하나를 적용함으로써 제1 관형 요소에 밀봉되거나 또는 제1 관형 요소에 결합된다. 다른 한 실시태양에서는, 도 7에 도시된 바와 같이, 물질 자체에 섬유-섬유 연결을 제공하여 다양한 상이한 정도의 개별 섬유 모르폴로지를 기반으로 연속성 강직을 부여한다. 이러한 섬유-섬유 연결은 결합 전에 수행될 수 있다. 역학적으로, 이러한 섬유(제1 관형 요소에 일단 연결되고/되거나 결합되면)의 적용의 유리한 효과는 변형시 최소량의 꼬임을 가지는 섬유들이 먼저 곧게 펴져서 맞물린다는 것이다. 적용된 섬유의 꼬임 정도에 연속성이 있기 때문에, 변형이 증가할 때, 섬유는 변하는 간격으로 맞물리고, 결국은 응력/변형 그래프가 점진적으로 둥그스름해지고, 천연 물질과 훨씬 더 비슷한 반응을 제공한다.

한 바람직한 실시태양에서, 조직 공학적 혈관 지지대의 제조 방법은 (a) 외부 표면, 내부 관강 표면 및 제1 직경을 포함하는 엘라스토머성 관형 요소를 제공 또는 생성하는 단계; (b) 엘라스토머성 관형 요소를 제2 직경으로 확장시키는 단계; (c) 단계 (b)의 엘라스토머성 관형 요소의 외부 표면에 외부 표면 및 제2 직경을 포함하는 인장 관형 요소를 제공 또는 생성하는 단계; (d) 인장 관형 요소를 엘라스토머성 관형 요소의 외부 표면에 결합시키는 단계; 및 (e) 엘라스토머성 관형 요소의 제2 직경을 제1 직경으로 감소키는 단계를 포함한다.

한 양상에서, 본원에 제공된 방법은 당업계 통상의 기술을 가진 자가 높은 정도의 조정가능성을 연습할 수 있게 하여 TE 지지대를 제조한다. 이 방법의 상이한 양상을 변화시킴으로써, 본원에 기술된 역학적 성질은 숙련자가 원하는 방식으로 조정된다. 한 실시태양에서, 역학적 성질의 조정은 관형 지지대 제공에 이용되는 물질 선택, 관형 요소의 확장 직경, 전기방사 동안의 바늘과 심봉 사이 거리, 및 이용된 관형 요소의 두께 중 하나 이상의 변화를 포함한다. 다른 한 실시태양에서, 조정은 상기 표 2에 기재된 하나 이상의 매개변수의 변경을 포함한다. 당업계 숙련자는 TE 지지대의 역학적 성질을 조정하기 위해 변경될 수 있는 다른 매개변수를 인식할 것이다.

5. 조직 공학적 혈관(TEBV)

다른 한 양상에서, 본 발명은 본 발명의 TE 지지대로부터 유래되는 조직 공학적 혈관(TEBV)를 제공한다. 천연 혈관과 실질적으로 유사하다고 가정하면, 지지대는 TEBV를 생성하기 위한 개질을 특히 받아들일 수 있고, 이것은 심혈관 장애 치료를 위한 혈관 우회 이식편으로 이용될 수 있다. 혈관 우회 이식편은 동정맥(AV) 단락을 포함한다. 한 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 지지대는 심혈관 장애 치료에 이용하기 위한 작은 직경, 대표적으로 6 ㎜ 미만의 직경을 가지는 TEBV를 생성하는 데 이용될 수 있다.

본원에서 논의되는 바와 같이, TE 지지대의 일부 실시태양은 어느 일정 범위의 탄성계수 및 계수 천이, 및 이들의 조합에 기인하는 J형 응력/변형 곡선임을 특징으로 하는 응력 및 변형에 대한 역학적 반응을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 계수 매개변수 이외에도, TE 지지대가 혈관 이식편 제조에의 이용에 주목받도록 하는 TE 지지대가 나타내는 다른 성질이 있다. 한 양상에서, 본 발명의 TE 지지대는 그것이 우선 TEBV 또는 혈관 이식편을 제조하고 혈관 이식편이 일단 이식된 후 개통성을 보유하는 것을 보장하는 데 특히 적당하게 하는 일부 성질을 나타낸다. 이러한 성질은 지지대 상에 세포 시딩을 허용하는 것, 지지대의 내파괴성을 제공하는 것, 및 지지대에 점탄성을 제공하는 것을 비제한적으로 포함한다.

한 실시태양에서, TE 지지대 상에 세포를 시딩하는 데 유리한 성질은 기공 직경이 관강 요소의 외막측 또는 외부측에서의 약 100 ㎛에서 관강측 또는 내부측에서의 약 5 내지 약 15 ㎛로 점진적으로 감소하는 기공 구배에 기인한다. 당업계에서는 기공 직경이 TE 지지대 상에 및 TE 지지대 내에 세포를 성공적으로 시딩하기 위한 중요 요인이라는 것이 잘 알려져 있다. 예를 들어, 기공 직경은 다양한 세포 유형이 지지대의 표면으로 이동하고 지지대를 통과하기에 충분할 정도로 커야 하고, 이렇게 함으로써, 생체내에서 관찰되는 것과 유사한 방식으로 그것은 다른 이동하는 세포와 상호작용할 수 있다. 본 발명은 특정 기공 구배가 세포의 성공적 시딩에 기여한다는 발견에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 기공 구배는 TE 지지대가 세포에 접근할 수 있게 함으로써 그의 세포 시딩 능력을 증진시킨다. 다른 한 실시태양에서, 기공 구배는 약 100 ㎛(외부측) 내지 약 5 ㎛(내부측), 약 100 ㎛(외부측) 내지 약 6 ㎛(내부측), 약 100 ㎛(외부측) 내지 약 7 ㎛(내부측), 약 100 ㎛(외부측) 내지 약 8 ㎛(내부측), 약 100 ㎛(외부측) 내지 약 9 ㎛(내부측), 또는 약 100 ㎛(외부측) 내지 약 10 ㎛(내부측)이다.

한 양상에서, 기공 구배는 TE 지지대의 관강 내부측에 세포를 시딩하고 TE 지지대의 외부 외막측에 세포를 시딩하는 데 유리한 구조를 제공한다. 한 실시태양에서, 관강 내부 표면의 작은 기공 크기는 내부 표면 상에 및 내부 표면 내에 내피세포를 시딩하는 데 적당하고, 외부 외막측의 큰 기공 크기는 외부 표면 상에 및 외부 표면 내에 평활근 세포를 시딩하는 데 적당하다. 다른 한 실시태양에서는, 내피세포가 TE 지지대의 내부 관강 표면 상에 및 내부 관강 표면 내에 시딩되어 단층 또는 편평 시트 유사 구조를 생성하고/하거나 평활근 세포가 TE 지지대의 외부 외막 표면 상에 및/또는 외부 외막 표면 내에 시딩된다.

일부 실시태양에서, TE 지지대의 내부 관강 표면 상에 및 내부 관강 표면 전체에 시딩되는 내피세포는 일정 기공 크기를 넘는 외부 외막 표면 쪽으로 이동할 수 없다. 한 바람직한 실시태양에서, 기공 크기는 약 15 내지 약 20 ㎛이다. 다른 한 바람직한 실시태양에서, 기공 크기는 약 15 ㎛, 약 16 ㎛, 약 17 ㎛, 약 18 ㎛, 약 19 ㎛ 또는 약 20 ㎛이다.

다른 한 실시태양에서, 내파괴성에 유리한 성질은 (i) 약 0.45 MJ/㎥ 내지 약 1.0 MJ/㎥의 원주방향 관 인성; (ii) 약 0.1 MJ/㎥ 내지 약 0.5 MJ/㎥의 축방향 관 인성; 또는 (iii) (i) 및 (ii)의 조합이다. 생체물질의 인성은 그의 내파괴성 결정에 도움을 주는 매개변수이다.

다른 한 실시태양에서, TE 지지대의 점탄성에 유리한 성질은 (i) 약 0.05 내지 약 0.3의 탄젠트 델타; (ii) 약 400 MPa 내지 약 0.12 MPa의 저장계수; 또는 (iii) (i) 및 (ii)의 조합이다.

다른 한 양상에서, 본 발명은 본원에 기술된 TE 지지대로부터 유래된 조직 공학적 혈관(TEBV)을 제공한다. 따라서, TEBV는 천연 혈관에서 발견되는 것과 실질적으로 유사한 구조적 및 기능적 성질을 나타낸다. 위에서 논의한 바와 같이, 혈관에서 두 주요 단백질 성분, 즉 콜라겐 및 엘라스틴의 상승적 상호작용은 J형 응력/변형 곡선(로치(Roach) 등(1957) Can. J. Biochem. Physiol. 35:681-690)임을 특징으로 하는 응력 및 변형에 대한 역학적 반응을 일으킨다. 한 실시태양에서, 본 발명의 TEBV는 비등방성 방식으로 응력 및 변형에 대해 역학적으로 반응할 수 있는 능력을 가짐을 특징으로 한다. 다른 한 실시태양에서, TEBV는 (i) 지지대의 내파괴성에 유리한 성질; 및/또는 (ii) 지지대의 점탄성에 유리한 성질을 가진다.

다른 한 양상에서, 본 발명의 조직 공학적 혈관(TEBV)은 이식 후 관찰되는 혈관 이식편과 관련된 일부 귀찮은 문제를 조절될 수 있다. 한 실시태양에서, TEBV는 이식 후의 컴플라이언스 불일치를 조절한다. 다른 한 실시태양에서, 조절은 다음 중 하나 이상을 포함한다: 동맥류 생성에 대한 내성, 확장에 대한 내성, 내파괴성, 혈전증에 대한 내성, 문합부 과다증식에 대한 내성, 및 내막 과다증식에 대한 내성. 당업계 숙련자는 TEBV에 의해 조절되는 추가의 인자를 인식할 것이다.

한 실시태양에서, 본 발명의 TEBV는 본원에 기술된 TE 지지대를 포함한다. 본 발명의 TE 지지대는 필요로 하는 포유동물에게 이식하기에 적당한 TEBV를 생성하기 위해 추가로 조작될 수 있다. 예를 들어, TE 지지대는 본원에 기술된 방법에 의해 하나 이상의 세포 군집을 첨가함으로써 조작될 수 있다. 당업계 통상의 기술을 가진 자는 본 발명이 경동맥, 쇄골하 동맥, 복강 동맥, 장간막 동맥, 신동맥, 장골 동맥, 소동맥, 모세관, 소정맥, 쇄골하 정맥, 목정맥, 신정맥, 장골 정맥, 대정맥을 비제한적으로 포함하는 많은 유형의 혈관에 적당하다는 것을 인식할 것이다.

한 실시태양에서, TEBV는 TEBV의 제2 관형 요소 내에 및/또는 제2 관형 요소의 외부 표면 상에 제1 세포 군집을 더 포함한다. 한 바람직한 실시태양에서, 제1 세포 군집은 평활근 세포 군집이다. 당업계 숙련자는 사람 대동맥 평활근 세포, 사람 제대 동맥 평활근 세포, 사람 폐동맥 평활근 세포, 사람 관상동맥 평활근 세포, 사람 기관지 평활근 세포, 사람 요골 동맥 평활근 세포, 및 사람 복재 정맥 또는 목정맥 평활근 세포를 비제한적으로 포함하는 다양한 유형의 평활근 세포(SMC)가 본 발명에 사용하기에 적당할 수 있다는 것을 인식할 것이다(참조: 베르트램(Bertram) 등, 미국 특허 출원 공개 20070190037, 이 문헌은 전체를 본원에 참고로 인용함). 베르트램 등의 미국 특허 출원 공개 20070190037에 기술된 바와 같이, SMC는 예를 들어 생존 대상자로부터의 생검 및 시체로부터의 전장기 회수를 포함하는 다양한 원천으로부터 단리될 수 있다. 단리된 세포는 바람직하게는 수여자가 될 예정인 대상자로부터 생검에 의해 얻은 자가 세포이다.

다른 한 실시태양에서, TEBV는 TEBV의 내부 또는 관강 표면 상의 제2 세포 군집을 포함한다. 한 바람직한 실시태양에서, 제2 세포 군집은 내피세포 군집이다. 당업계 숙련자는 동맥 및 정맥 EC, 예를 들어 사람 관상동맥 내피세포, 사람 대동맥 내피세포, 사람 폐동맥 내피세포, 피부 미세혈관 내피세포, 사람 제대정맥 내피세포, 사람 제대동맥 내피세포, 사람 복재정맥 내피세포, 사람 목정맥 내피세포, 사람 요골 동맥 내피세포, 및 사람 내유동맥 내피세포를 비제한적으로 포함하는 다양한 유형의 내피세포(EC)가 본 발명에 사용하기에 적당할 수 있다는 것을 인식할 것이다(참조: 미국 특허 출원 공개 20070190037, 이 문헌은 전체를 본원에 참고로 인용함). EC는 혈관 유조직, 순환 내피세포 및 내피세포 전구체, 예를 들어 골수 전구세포, 말초혈액 줄기세포 및 배아 줄기세포를 비제한적으로 포함하는 다양한 원천으로부터 단리될 수 있다(참조: 비스코프(Bischoff) 등, 미국 특허 출원 공개 20040044403 및 래피(Raffi) 등, 미국 특허 6,852,533, 각 문헌은 전체를 본원에 참고로 인용함).

당업계 숙련자는 본원에 기술된 하나 이상의 세포 군집의 시딩 또는 침착이 당업계에 알려진 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 생체반응기 인큐베이션 및 배양(베르트램(Bertram) 등, 미국 특허 출원 공개 20070276507; 맥앨리스터(McAllister) 등, 미국 특허 7,112,218; 오저(Auger) 등, 미국 특허 5,618,718; 니클라손(Niklason) 등, 미국 특허 6,537,567); 압력 유도 시딩(토리고(Torigoe) 등 (2007) Cell Transplant. 16(7):729-39; 왕(Wang) 등 (2006) Biomaterials. May:27(13):2738-46); 및 정전 시딩(보울린(Bowlin) 등, 미국 특허 5,723,324)이 이용될 수 있다. 추가로, 전기방사된 섬유를 세포의 에어로졸로 동시에 코팅하는 최근 기술이 시딩 또는 침착에 적당할 수 있다(Stankus 등 (2007) Biomaterials, 28:2738 - 2746).

한 실시태양에서, 세포의 침착은 관형 지지대와 세포 부착 증진 단백질을 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 한 실시태양에서, 증진 단백질은 피브로넥틴, 콜라겐 및 매트리겔(등록상표)(MATRIGEL™) 중 하나 이상이다. 다른 한 실시태양에서, 관형 지지대는 세포 부착 증진 단백질이 없다. 다른 한 실시태양에서, 세포 침착은 관형 지지대와 하나 이상의 세포 군집을 접촉시킨 후 배양하는 단계를 포함한다. 다른 한 실시태양에서, 배양은 생체반응기에서 맥동류 및/또는 정상류에 의한 컨디셔닝을 포함할 수 있다.

한 양상에서, 본 발명은 필요로 하는 대상자의 심혈관 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 이 방법은 필요로 하는 대상자를 확인하는 단계를 포함한다. 다른 한 실시태양에서, 이 방법은 대상자로부터 하나 이상의 생검 샘플을 얻는 단계를 포함한다. 다른 한 실시태양에서, 이 방법은 샘플로부터 하나 이상의 세포 군집을 단리하고 그 하나 이상의 세포 군집을 TE 지지대 상에서 배양하여 TEBV를 제공하는 단계를 포함한다. 다른 한 실시태양에서, 배양은 생체 반응기에서 세포가 시딩된 TEBV 지지대를 컨디셔닝하는 것을 포함한다. 한 실시태양에서, 컨디셔닝은 생체반응기에서 정상류 및/또는 맥동류를 포함한다. 다른 한 실시태양에서, 이 방법은 필요로 하는 대상자에게 세포가 시딩되고 컨디셔닝된 TEBV를 이식하여 심혈관 질환 또는 장애를 치료하는 것을 포함한다.

당업계 통상의 기술을 가진 자는 본 발명의 방법으로 치료하기에 적당한 다양한 심혈관 장애를 인식할 것이다.

다른 한 실시태양에서, 본 발명은 필요로 하는 대상자의 심혈관 장애 치료에 유용한 의약을 제조하기 위한 본원에 기술된 TE 지지대 및/또는 TEBV의 용도를 제공한다.

다음 실시예는 오직 예시 목적으로 제공되고, 본 발명의 범위를 제한하는 것을 결코 의도하지 않는다.

본 명세서에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 참고 문헌은 전체를 본원에 참고로 인용한다.

<실시예>

실시예 1 - 라텍스 관 위의 봉합 랩

이성분 관형 구조물에서 "J"형 역학적 반응의 발생

이성분 시스템에서 "J"형 역학적 거동의 발생이 가능한 방법은 몇 가지 있다. 강직성 외부층(인장 요소)에 커플링된 탄성 내부층의 조합으로부터 얻은 결과가 아래에서 제시된다. 이 경우, 내부층은 라텍스이고, 외부층은 봉합재, 즉 랩핑된 폴리디옥사논(PDO) 또는 스티칭된 비크릴(등록상표)(VICRYL™)(90:10 PLGA)이다. 도 14a - 14b는 라텍스 관의 외부 원주 둘레에 봉합된 비크릴(등록상표)로부터 제조된 지지대를 나타낸다. 라텍스 관이 더 큰 직경으로 확장된 동안에 봉합재를 적용하였다. 라텍스 관을 그의 휴지 직경에서 사진 촬영하였고, 이 때문에 더 큰 직경으로 적용되는 봉합재가 라텍스 관의 원주 둘레에 루프를 형성한다. 기준자(scale bar)는 0.5 ㎝이다. A)는 축방향 도면이고, B)는 횡방향 도면이다.

방법

내경이 3.175 ㎜(D₁)인 얇은 벽을 가지는 라텍스 관(프리멜라인 인더스트리즈(Primeline Industries)를 외경이 8.0 ㎜(D₂)인 심봉 상에서 신장시켜서 원주방향 길이를 151% 증가시켰다. 새로운 큰 원주에서, PDO 봉합재(1.0 m, 에티콘(Ethicon))를 라텍스 관의 길이 아래로 나선 방식으로 손으로 감았다. 봉합재 위에 액체 라텍스(인바이런멘탈 테크놀로지즈, 인크.(Environmental Technologies, Inc.))의 얇은 층을 적용함으로써 PDO 봉합재를 적소에 고정시켰다.

실온 및 표준 압력(대기압)에서 경화한 후, 심봉으로부터 복합체를 제거하고, 이때, 직경이 초기 직경(D₁)으로 복귀하였다. 이어서, 복합체를 MTS 바이오닉스(Bionix) 인장 검사 시스템(엠티에스, 인크.(MTS, Inc.))으로 표준 관행에 따라 검사하였다. 간략하게 말하면, 관을 특별 목적의 구속 장치에 탑재하고, 실패할 때까지 5 ㎜/초의 변화율로 변형을 적용하였다.

동일한 얇은 벽을 가지는 라텍스 관(D₁)을 더 큰 직경(D₂)의 심봉 상에서 신장시켜서 원주방향 길이를 151% 증가시켰다. 새로운 원주에서, 비크릴 봉합 재료(1.5 m, 에티콘)를 관의 원주 둘레에 나선 방식으로 관 벽 두께의 1/2 넘게 꿰뚫지 않으면서 손으로 봉합하였다. 접착제 코팅이 필요하지 않았다. 앞에서 기술한 바와 같이 실패할 때까지 검사를 수행하였다.

결과

이들 검사 시편에 각각 인장 부하를 가한 결과, 초기의 낮은 계수(강직성) 영역에 뒤따라서 초기 계수로부터 10 배 이상 증가한 계수로 가파르게 상승함을 특징으로 하는 "J"형 곡선을 얻었다. 도 8은 얻은 라텍스/PDO 구조물의 거동을 나타낸다. 초기 계수 및 최종 계수의 계산값은 각각 0.3 MPa 및 2 MPa이다. 도 9는 얻은 라텍스/비크릴 구조물의 거동을 나타낸다. 이 시편의 계수는 곡선의 초기 영역 및 최종 영역에 대해 각각 2 MPa 및 20 MPa인 것으로 계산되었다. 도 10은 PDO 및 비크릴의 각각의 응력/변형 거동을 나타내고, 각각 3 GPa 및 9 GPa - 18 GPa의 탄성계수를 가진다. 도 11은 라텍스의 응력/변형 관계를 나타내고, 이것은 0.3 MPa - 0.5 MPa의 탄성계수를 가진다.

이러한 결과는 인장 성분 침착 전에 탄성 성분을 신장시키는 것을 포함하는 핵심 요인으로 "J"형 역학적 거동을 발생하는 이성분 시스템을 이용하는 것의 타당성을 예시한다. 층 침착의 다른 변화도 가능하다. 예를 들어, 하나 이상의 층이 랩핑, 캐스팅, 전기방사 또는 이들의 어떠한 조합으로도 생성된다.

또, 한 물질이 낮은 계수를 가지고 높은 탄성을 가지며, 다른 한 물질이 높은 계수(다른 물질보다 최소 10 배 더 큼)를 가지고 낮은 탄성을 가지기만 하면, 물질 선택은 이용가능한 물질을 토대로 넓은 범위의 조합에 개방되어 있다. 물질의 가능한 선택은 본원에 기술된다.

상이한 물질, 상이한 예비변형 값, 및 상이한 층 두께의 선택으로, 지지대 설계에서 "J"형 역학적 거동이 고도의 방어가능성을 얻을 수 있다.

실시예 2

강직성 외부층(인장 요소)에 커플링된 탄성 내부층의 조합도 또한 검사하였다. 내부층은 전기방사된 폴리우레탄(PU)이고, 외부층은 전기방사된 폴리글리콜산(PGA)이다.

방법

1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올(HFIP) 중의 10% PU 및 HFIP 중의 10% PGA가 전기방사에 이용된 기본 용액이었다. 약 2 ㎖의 10% PU를 5 ㎜ OD 심봉 상에 표준 전기방사 절차를 이용해서 전기방사하였다. 완료 후, PU 관을 5 ㎜ OD 심봉으로부터 펴서, 8 ㎜ OD 심봉 상에 둥글게 말았다. 5 ㎜ OD 및 8 ㎜ OD 심봉의 사용은 원주방향 길이 60% 증가와 동등하다.

이어서, 확장된 PU 관 표면 상에 10% PGA를 완전히 코팅될 때까지 전기방사하였고, 이것은 전체 부피 약 1 ㎖의 PGA 용액과 동등하였다. 코팅 후, 혼성 관을 층간박리를 최소화하도록 조심하면서 제거하였다.

순수 PU 및 PGA 관으로부터 하위 샘플을 취하고, MTS 바이오닉스 인장 검사 시스템(엠티에스, 인크.)으로 표준 관행에 따라서 적층 혼성물과 함께 검사하였다. 간략하게 말하면, 관을 특별 목적의 구속 장치에 탑재하고, 5 ㎜/초의 변화율로 실패할 때까지 변형을 적용하였다.

결과

도 12는 순수 PGA 및 순수 PU로부터 제작된 관의 응력/변형 거동 뿐만 아니라 상기한 바와 같이 제작된 두 물질의 혼성물로부터 얻은 응력/변형 거동을 도시한다. 혼성물에 인장 부하를 가한 결과, 초기의 계수가 낮은(강직성) 영역에 뒤따라서 초기 계수의 값의 약 2 배의 계수로 가파르게 상승함(0.5 MPa 대 0.24 MPa)을 특징으로 하는 "J"형 곡선을 얻었다.

도 13은 PU/PGA 혼성물의 응력/변형 거동을 천연 돼지 경동맥과 비교해서 나타낸다.

이러한 결과는 인장 성분 침착 전에 탄성 성분을 신장시키는 것을 포함하는 중요 요인으로 "J"형 역학적 거동을 생성하는 데 적어도 이성분 시스템을 이용하는 것의 타당성을 지지한다. 이성분 시스템의 다른 재현은 물질 선택의 변화 및 추가 층 침착을 포함할 것이다. 예를 들어, 두 층은 미리 형성된 층으로서 제공될 수 있거나, 또는 랩핑, 캐스팅, 전기방사 및 이들의 조합에 의해 생성될 수 있다.

실시예 3 - 확장성 심봉을 이용한 지지대 생성

여기서는 다성분 구조 변형물을 통해서 천연 혈관의 복잡한 응력/변형 거동을 성공적으로 재현하는 신규 방법을 기술한다. 추가로, 이 방법은 물질 선택 및 생성 과정 변화의 조합을 통해 이러한 복잡한 생체역학적 성질의 "조정" 기회를 제시한다. 테코탄(Tecothane) 1074 또는 폴리(L-락티드-코-ε-카프로락톤), 및 폴리글리콜산 편성 메쉬 관으로 제조된 관형 지지대가 0.5 MPa - 3.97 MPa의 계수 및 평균 1676 ㎜Hg의 파열 압력을 가지는 천연 혈관의 특징적 응력/변형 거동을 생성하였다.

10% 폴리우레탄(PU: 테코탄 1074, 루브리졸, 인크.(Lubrizol, Inc.)) 및 12% 폴리(L-락티드-코-ε-카프로락톤)(PLCL: 레이크쇼어 바이오머티리얼즈(Lakeshore Biomaterials))을 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올(HFIP: 시그마(Sigma)) 중의 원액으로 유지하였다. 이들 물질의 12 ㎝ 길이 관(4 ㎜ - 6 ㎜ 내경, ~ 4-5 ㎖의 원액)을 본원의 다른 곳(달(Dahl) 2007, 상기 문헌)에서 기술한 바와 같이 전기방사를 통해서 생성하였다. PU 및 PLCL의 전기방사 매개변수를 표 3에 나타내었다.

전기방사 후, 맞춤 심봉을 관 안에 삽입하였다. 맞춤 심봉은 원형 단면을 유지하면서 단부 쐐기에 의해 떨어져서 구동되는 다수의 구역으로 이루어졌다(도 5 참조). 이러한 방식에서는, 중합체 관이 짧은 시간 동안에 더 큰 내경/외경으로 될 수 있다. 예를 들어, 심봉은 관의 내경(ID)을 6 ㎜ ID를 가지는 관의 경우에는 160%까지, 또는 4 ㎜ ID를 가지는 관의 경우에는 250%까지 증가할 수 있게 한다. ID를 증가시킨 후, 심봉을 그의 원래 설정값으로 복귀시켜 관이 그의 원래 직경으로 탄성적으로 반동하게 한다.

6 ㎜ ID의 PU 또는 PLCL 관을 그의 원래 직경의 140%(새로운 직경)로 확장시킨 후, 8 ㎜ ID 폴리글리콜산(PGA) 편성 메쉬 관(콘코디아(Concordia)) 안에 삽입하였다. 이 새로운 직경에서, PU 또는 PLCL 관리 편성 메쉬 PGA 관에 의해 단단히 결합되었다. 이 시점에서, 각 합성물질(PU 또는 PLCL) 층 사이에 메쉬를 접착 삽입할 수 있게 하는 방식으로 PU 또는 PLCL의 추가의 얇은 층(~1 ㎖ 중합체 용액)을 메쉬 및 관 상에 전기방사하였다. PU 또는 PLCL 관/PGA 메쉬 복합체가 원래 이용된 PU 또는 PLCL 관의 원래 직경으로 복귀하게 하였다. 아래에 있는 관의 수축은 메쉬 관을 연행해서, 주름진(꼬임이 있는) 균일 표면 특징을 발생할 것이다. 이러한 "확장성 심봉" 공정의 한 예가 도 4e에 제시되었다.

지지대 생성

도 15a - 15b는 확장성 심봉 기술을 이용하여 제작된 지지대에 대표적인 전반적인 외관을 도시한다. 이 PU/PGA 지지대의 길이를 따라서 생긴 주름은 낮은 배율 A) 및 높은 배율 (B)에서 볼 수 있다. 지지대의 크기는 ~12 ㎝이다.

도 16a - 16b는 PU/PGA 지지대의 5X 단면도를 나타내고, 확장성 심봉 기술의 결과로 생성된 원주방향으로 균일한 주름을 추가로 도시한다. 도 15a에 나타낸 기준자는 700 ㎛이다. 도 16a에서는 PGA는 존재하지 않지만, 생성 공정이 PGA 메쉬가 존재하는 도 16b에서 행한 것과 동일하다. 두 사진에서, 생성 공정의 결과로 주름을 볼 수 있고, 도 16b에서는 메쉬 존재의 결과로 주름이 증진되었다. 도 16a의 더 적은 정도의 주름은 PU 관 확장 후 적용된 추가의 PU 층 때문이다. 지지대의 벽 두께 및 길이는 대표적으로 각각 700 ㎛ 및 12 ㎝ 정도였다.

실시예 4 - 역학적 검사

파열 압력 검사

자체 제작된 파열 검사 장치는 고압 시린지 펌프(콜-파머(Cole-Parmer)), 스테인리스 스틸 20 ㎖ 시린지(콜-파머), 및 보정된 100 psi 최대 액체/기체 압력 게이지(오메가(Omega))로 이루어졌다. 이 시스템은 랩뷰(Labview) v8.5 및 콤팩 필드 포인트(내셔날 인스트루먼츠(National Instruments))를 이용해서 조절하였다. 검사 동안에 누출이 일어나지 않도록 보장하기 위해, 관형 지지대의 내부 관강을 원통형 5 ㎜ ID 표준 라텍스 벌룬(유니크 인더스트리즈, 인크.(Unique Industries, Inc.))으로 라이닝하였다. 실패할 때까지 액체 부피를 1 ㎖/분의 정상 속도로 지지대에 전달하였다. 역학적 실패 직전의 최대값이 보고된 파열 압력 값이다.

원주방향 검사(고리 시험): 이어서, 지지대를 MTS 바이오닉스 인장 검사 시스템(엠티에스, 인크.)으로 표준 관행에 따라서 검사하였다. 간략하게 말하면, 지지대를 특수 목적의 구속 장치에 탑재하고, 실패할 때까지 5 ㎜/초의 변화율로 변위를 적용하였다. 얻은 원래의 힘/변위 데이터를 시험한 지지대의 치수(두께, 시작 길이, 폭)를 조심스럽게 측정하여 응력/변형 곡선으로 전환하였다.

결과

시험한 관형 지지대는 이성분 시스템과 동등한 응력-변형 거동을 일관되게 생성하였다(도 17). 모든 지지대는 역학적 실패 이전에 374±229%의 천이 변형으로 고강직성 대역(E = 3.97±1.6 MPa)을 발생시키는 초기 저강직 거동(E = 0.5±0.24 MPa)으로 이루어지는 역학적 거동을 나타내었다. 도 18은 관형 지지대의 파열 압력 시험으로부터의 결과를 도시한다. 전체 파열 압력은 1676±676 ㎜Hg이었다. 요약 데이터를 표 4에 제시하였다.

지지대 조정가능성: 관형 지지대는 생성 매개변수, 예를 들어 이용된 확장성 심봉의 최종 직경, PGA 메쉬 신장 및 전기방사된 층 두께와 관련된 다양한 자유도를 가지는 다성분 시스템이다. 도 19는 이러한 지지대 제작의 가능한 변하는 요소인 전체 역학적 성질의 가변성 중 일부를 나타낸다. 이것은 관형 지지대의 역학적 성질이 조정가능하다는 것을 가리킨다. 도 19a는 PGA 메쉬 관의 실패가 합성 전기방사된 관의 실패와 일치하는 유리한 역학을 도시한다.

도 19b는 강화 PGA 메쉬 관의 맞물림 전에 전기방사된 탄성 관의 실패를 도시한다. 이 경우, 확장된 심봉 상의 제1 관형 요소 위에 끼워 맞출 때 제2 관형 요소 위에 적용된 PU 또는 PLCL의 얇은 층은 정상 거리의 약 1/2, 즉, PU의 경우 약 5 ㎝ 내지 약 7 ㎝, PLCL의 경우 약 6 ㎝ 내지 약 8 ㎝의 심봉/바늘 거리에서 전기방사하였다. 바늘이 아주 근접한다는 것은 PU/PLCL 용액이 바늘로부터 제2 관형 요소의 표면으로 이동할 때 PU/PLCL 용액이 공기에 노출되는 시간이 감소한다는 것을 의미하고, 이것은 정상 거리에서 전기방사하는 경우에 비해서 더 많은 양의 용매가 제2 관형 요소 및 그 아래의 제1 관형 요소와 접촉하는 결과를 초래한다. 용매 접촉 증가는 제1 관형 요소의 용융을 일으키고, 이것은 제1 관형 요소를 더 취성이 되게 한다.

도 19c는 전기방사된 내부 관이 실패하기 전의 PGA 메쉬 관의 가설적 맞물림 및 실패를 도시한다.

실시예 5 - 전기방사된 PLCL 또는 PU와 세포의 상호작용

유리 커버슬립을 전기방사된 PLCL 또는 PU의 얇은 층으로 코팅한 후 세포외 기질 단백질로 코팅하였다. 피브로넥틴 코팅을 위해, 지지대를 4 ℃에서 PBS 중의 5 ㎍/㎖ 사람 피브로넥틴 I(케미콘(Chemicon) FC010)에 하룻밤 동안 담갔다. 저농도 콜라겐 코팅을 위해, 지지대를 실온에서 0.1% 아세트산 중의 50 ㎍/㎖ 쥐 꼬리 콜라겐 I(BD 354236)에 1 시간 동안 담갔다. 저농도 콜라겐 지지대를 시딩 전에 공기 건조시켰다. 고농도 콜라겐 지지대는 3 ㎎/㎖ 쥐 꼬리 콜라겐 I(BD 354236)의 얇은 층을 적용한 후 지지대를 폐쇄된 챔버에서 암모니아 증기에 3 분 동안 노출시켰다. 이어서, 고농도 콜라겐 지지대를 물로 간단히 세척한 후, PBS 중에서 하룻밤 동안 세척하였다. 마지막으로, 매트리겔(등록상표) 코팅을 위해, 지지대를 매트리겔(등록상표) 용액(BD 356234)의 얇은 층으로 덮고, 단백질 중합을 위해 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다.

시딩 전에, 모든 지지대를 6-웰 세포 배양 접시 바닥에 피브린 접착제(퀵실(Quixil))로 부착하였다. 사람 대동맥 내피세포(캐스케이드 바이올로직스 (Cascade Biologicis) C-006)를 250 ㎕ 성장 배지에 재현탁하고, 40000 세포/㎠의 밀도로 지지대 표면 상에 직접 시딩하였다. 시딩된 지지대를 충분한 세포 부착을 위해 37 ℃에서 5% CO₂에서 3 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 웰에 LSGS 키트 성분(캐스케이드 바이올로직스, S-003)이 보충된 3 ㎖ 메디아(Media) 200(캐스케이드 바이올로지시스, M-200)을 채웠다. 시딩된 지지대를 3일마다 배지를 교체하여 14 일 동안 배양하였다.

시딩된 지지대를 4 ℃에서 하룻밤 동안 PBS 중의 4% 파라포름알데히드에 고정시켰다. 세포를 2 ㎍/㎖ CD31(다코(Dako) M0823) 일차 항체로 염색한 후, 2 ㎍/㎖의 알렉사488 염소 항-마우스 IgG1 이차 항체로 염색하였다. 마지막으로, 3 μM DAPI(인비트로겐(Invitrogen))로 핵을 염색하였다.

도 20은 정적 배양에서 관형 지지대의 내부 구조물로 이용되는 두 합성물질(PU/PLCL) 상에 세포 부착 및 도말을 도시한다. 세포 부착 증진 단백질, 즉 피브로넥틴, 콜라겐 및 매트리겔(등록상표)로 처리한 후 이 연구에 이용된 전기방사된 합성 중합체의 조직화학을 나타내었다. 코팅이 전혀 없는 경우에는, PLCL이 PU보다 더 많은 세포를 보유하였다. 세 코팅, 즉 피브로넥틴, 콜라겐 I 및 매트리겔(등록상표) 중, 매트리겔(등록상표) 및 콜라겐 1(용량 의존 반응)이 가장 많은 수의 세포를 보유하는 것으로 나타났다. 게다가, 콜라겐 1 및 매트리겔(등록상표) 코팅의 경우, CD31의 경우에 강하게 염색되었고, 컨플루언시(confluency)가 명백하였다.

실시예 6 - 세포 시딩 및 생체반응기 컨디셔닝

각각의 길이가 6 ㎝ 및 10 ㎝인 각각 짧은 지지대 및 긴 지지대라고 부르는 2 개의 관형 지지대를 PLCL 및 PGA 메쉬로부터 상기한 바와 같이 제작하였다.

세포 시딩: 일차 사람 대동맥 내피세포(HAEC; 캐스케이드 바이올로직스, C-006)를 2% 소 태아 혈청, 1 ㎍/㎖ 히드로코르티손, 10 ng/㎖ hEGF, 3 ng/㎖ bFGF, 10 ㎍/㎖ 헤파린 및 1X 농도의 젠타마이신/암포테리신 B 용액(캐스케이드 바이올로직스, S-003)으로 보충된 미디엄 200(캐스케이드 바이올로직스, M-200)에서 유지시켰다. 지지대를 시딩하기 위해, 5 - 10 계대의 세포를 0.05% 트립신-EDTA(깁코(Gibco), 25300)로 트립신화하고, 보충된 M-200에 12 x 10⁶/㎖로 재현탁하였다. 세포 현탁액을 혈관 생체반응기에 원위 입구를 통해 충분한 부피로 주입하여 모든 관강 표면을 덮었다. 모든 관을 밀봉한 후, 생체반응기를 롤러 병 장치에 옮기고, 37 ℃에서 2 시간 동안 0.2 rpm으로 회전시켰다. 이 단계 후, 생체반응기 챔버를 하기하는 흐름 회로에 무균 연결하였다.

생체반응기 컨디셔닝: 도 23에 도시된 바와 같이, 생체반응기 시스템을 맥동류를 부여할 수 있는 맞춤 설계 제어 시스템으로 자체 제작하였다. 저장기 (A)로부터의 흐름이 연동 펌프 (B)를 통하고 역행적 흐름을 제한하기 위한 1 방향 점검 밸브 (D)를 가지는 맥류 감쇄기 (C) 안으로 통과하였다. 지지대가 보유된 생체 반응기 챔버 (F) 전방에 있는 압력 변환기 (E)에 뒤따라서 후방 압력 변환기 (G)를 거치고 핀치 밸브 (H)를 거친 후 저장기(그림으로 나타내지 않음; 콤팩 필드 포인트에 의한 컴퓨터 제어)에 복귀하였다.

시딩된 구조물이 쉽게 생리학적 맥동성 및 전단에 익숙해지도록 설계된 프로토콜(표 5)을 기반으로 8일에 걸쳐서 컨디셔닝이 일어났고, 따라서 세포 부착 및 통합의 기회를 최대화하였다.

8 일간의 컨디셔닝 프로토콜 후, 일련의 세포 분석을 이용해서 세포와 구조물의 상호작용을 평가하였다.

실시예 7 - 컨디셔닝된 지지대 세포 분석

생세포/사세포 염색(인비트로겐(Invitrogen), L3224): 형광 염색을 위해 각 혈관의 원위 및 근위 부분으로부터 대표적인 시편을 준비하였다. 구조물 부분을 과량의 DPBS로 세척하였다. DPBS를 제거하고 2.5 ㎖의 준비된 염색액(10 ㎖ DPBS, 20 ㎕ 칼세인 AM(녹색), 5 ㎕ 에티듐 동형이량체-1(적색))으로 대체하였다. 10 분 동안 인큐베이션한 후, 역형광 현미경을 이용하여 지지대 부분들을 시각화하였다. 시편은 상당한 정도의 곡률을 유지하여 시각화가 꽤 어려웠다. 시편을 편평하게 하는 데 도움을 주기 위해 둥근 커버 슬립을 웰의 구조물 부분 위에 놓았다.

도 21은 실험에 이용된 시딩 밀도에서 세포가 대부분 컨플루언시하여 활성 세포의 죽음이 거의 나타나지 않았다(a-짧은 근위 세그먼트; b-짧은 근위 세그먼트; c-긴 근위 세그먼트; d-긴 원위 세그먼트; e-짧은 원위 세그먼트). 긴 세그먼트 샘플에서는, 세포가 둥그스름해져서 원상태의 내피가 뚜렷하게 생성되지 않았다. 짧은 세그먼트 샘플은 세포가 지지대 상에 퍼져 있고, 흔적 내피를 암시하는 세포-세포 연결을 뚜렷하게 형성하고 있음을 나타내었다.

생체반응기에서의 세포 시딩 및 컨디셔닝 후 긴 PLCL/PGA 메쉬 혈관 관형 지지대 및 짧은 PLCL/PGA 메쉬 혈관 관형 지지대로부터의 근위 및 원위(흐름 유입 및 유출과 관련됨) 세그먼트의 생세포/사세포 염색을 나타내었다. 생존불능 세포는 적색으로 강조되었다.

전혈 응고 분석: 425 ㎕의 염화칼슘(0.1M)을 첨가하여 4.25 ㎖의 ACD 전혈을 활성화하였다. 잘 혼합된 활성화된 혈액의 10 ㎕ 분취량을 대조군 또는 지지대 표면에 놓고, 다양한 시간 동안 인큐베이션하였다. 소정의 시점에서, 혈병에 혼입되지 않은 RBS를 용해하는 증류수 300 ㎕를 첨가하였다. 얻은 물/헤모글로빈 용액의 흡광도를 판독하였고, 이것은 응고 양에 반비례한다. 유리 커버 슬립은 응고를 위한 양성 대조군 표면으로 쓰였고, 코스타(CoStar) 저결합 6-웰 플레이트는 음성 대조군 표면으로 쓰였다.

도 22에 시딩된 이식편 지지대의 혈병 발달을 대조군과 비교해서 시간의 함수로 나타내었다. 시딩되고 컨디셔닝된 지지대 세그먼트, 양성 대조군 및 음성 대조군 뿐만 아니라 시딩되지 않고/컨디셔닝되지 않은 지지대 물질에서의 전혈 응고를 나타내었다. 양성 대조군은 최대치 근사 응고(85%)가 35분에서 나타났고, 45분에서도 그다지 많이 증가하지 않았다. 시딩되지 않은 대조군은 35분 시점 내지 45분 시점에서 40% 응고에서 최대 응고(~75%)로 증가함을 보였다. 음성 대조군은 실험 시작 시점에서 흔적량의 응고를 나타내지만, 나머지 모든 시점에서는 응고가 없음을 일관되게 나타내었다. 마지막으로, 시딩된 이식편은 15분 시점에서 최대 응고(~30%)를 나타내지만, 45분까지 ~10% 응고로 감소하였다.

eNOS 검출 : eNOS 생성은 건강한 원상태의 내피임을 가리킨다. 세포 관련 eNOS는 제조자 프로토콜에 따라서 알 앤 디 시스템즈(R & D Systems) eNOS ELISA 시스템을 이용해서 정량화하였다. 지지대 시편, 즉 각 구조물로부터 4 개의 시편(원위로부터 2 개, 근위로부터 2 개)를 150 ㎕의 세포 용해 완충제가 있는 마이크로 원심분리기 관에 넣었다. 이어서, 용해물을 분석될 때까지 -80 ℃에서 냉동시켰다. 해동 후, 용해물을 원심분리하여 세포 부스러기를 제거하고, 각 샘플로부터 100 ㎕를 분석에 이용하였다.

표 6은 시딩되고 컨디셔닝된 이식편 관형 지지대로부터의 eNOS 생성의 결과를 나타낸다. 시딩되고 컨디셔닝된 긴 관형 지지대 및 시딩되고 컨디셔닝된 짧은 관형 지지대로부터 단리된 세그먼트에서의 eNOS 생성의 검출을 나타내었다. eNOS를 이식편의 표면적으로 정규화하였다. 짧은 이식편은 두 샘플 모두에서 다량의 eNOS(~500 pg eNOS/0.25 ㎠)가 검출되었다. 짧은 지지대는 각 샘플에서 62.5 pg 미만 eNOS/0.25 ㎠가 검출되었고, 양성 eNOS 보고의 경우에는 문턱값 아래에 짧은 그래프를 두었다.

대사 분석 : 각 지지대는 8 일간의 인큐베이션/컨디셔닝 동안 900 ㎖의 배지를 가졌다. 글루코스 사용량은 긴 지지대가 짧은 지지대에 비해서 약간 적었고(각각 0.07 g/L 및 0.008 g/L), 각 이식편에서 락테이트 생성은 0.053 g/L이었지만, 짧은 지지대 및 긴 지지대에서 글루코스 및 락테이트의 검출된 전체 변화는 대등하였다. 암모니아 생성은 긴 이식편이 짧은 이식편에 비해서 약간 더 높았다(각각 0.880 mmol/L 대 0.783 mmol/L).

표 7은 소모된 생체반응기 배지의 대사 분석을 나타낸다. 각 생체반응기로부터 준비한 배지를 노바 바이오프로필(Nova BioProfile) 400으로 분석하고, 그 결과를 신선 배지 대조군과 비교하였다.

실시예 1 - 7은 천연 혈관을 상기시키는 "J"형 역학적 거동의 생성에 인장 성분(PGA 메쉬 관) 침착 전에 탄성 성분(PU 또는 PLCL)이 신장된 다성분 시스템 이용의 타당성을 예시한다. 이 기술은 (더 큰 크기임에도 불구하고) 혈관에서 볼 수 있는 것과 유사한 방식으로 기능을 하는 주름진/꼬인 구조를 제공한다.

관형 지지대의 역학적 검사는 천연 혈관에서 흔히 볼 수 있는 계수 1과 계수 2 사이에 10 배의 차이가 있음을 나타내었다(도 1 참조). 게다가, 천연 혈관에서 볼 수 있는 값(표 1)과 정확히 일치시키기 위해, 인장 물질로서 PGA, 탄성 물질로서 PLCL 또는 PU를 선택하였다. 사실상, 관형 지지대의 제공 또는 생성 기술은 한 물질이 낮은 계수를 가지고 고탄성이며, 다른 한 물질이 높은 계수를 가지고(다른 물질보다 최소 10 배 큼) 저탄성이기만 하면, 많은 상이한 합성 또는 천연 물질 선택에 적용될 수 있다.

평균 변곡점 위치(즉, 계수 1에서 계수 2로의 천이가 발생하는 변형)는 ~374% 변형 단위였다. 대표적으로, 천연 혈관은 이러한 천이가 ~100% 변형 단위에 더 가깝다는 것을 보여준다(표 1). 이 값에 대한 설명은 실험에 이용된 편성 PGA 메쉬 관의 휴지 직경 및 성질, 및 이에 상응해서, 확장성 심봉의 직경 증가 능력과 관련 있다. 예를 들어, 관형 지지대의 변곡점을 더 낮은 값으로 이동시키기 위해서는, 섬유가 부하를 경험하기 시작하기 전에 편성된 관이 휴지 직경을 지나서 얼마나 많이 확장되는가를 이해해야 한다. 부하 전의 편성 메쉬의 확장 성질 및 그의 내부 휴지 직경을 조정할 수 있기 때문에, 이 값에서 메쉬가 내부 탄성 관과 맞물리고, 결과적으로 그와 결합하는 변형이 얼마인지를 선택할 수 있다.

PGA 메쉬는 상당한 양의 부하를 견딜 수 있다. 사실상, 이것은 1676 ㎜Hg의 평균 생리학적 관련 파열 압력이 관찰될 수 있다는 관찰에 의해 입증된다. 그러나, 이 방법은 메쉬에 제한되지 않는다. 상기한 바와 같이, 상이한 물질이 이용될 수 있지만, 인장 외부층(뿐만 아니라 내부 탄성층)을 적용하는 상이한 기술도 또한 다룰 수 있다. 예를 들어, 장차의 재현은 랩핑된 층, 캐스팅된 층, 전기방사된 층 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

세포 시딩 및 생체반응기 컨디셔닝 실험은 관형 지지대가 생체내에서 어떻게 작동하는지에 대한 통찰력을 제공하였다. 도 20에 나타낸 바와 같이, 지지대를 콜라겐 1, 매트리겔(등록상표) 또는 피브로넥틴으로 예비 코팅하는 것 같은 세포 부착 증진을 위한 표준 처리는 세포:세포 및 세포:생체물질과 합성 물질의 상호작용의 현저한 개선을 나타내었다. 세포 부착을 증진시키는 다른 방법은 이 연구에 이용되는 벌크 합성 중합체의 화학적 개질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

컨디셔닝된 지지대의 생세포/사세포 분석은 생존불능 세포가 거의 존재하지 않음을 나타내었다. 사실상, 긴 이식편 및 짧은 이식편은 둘 모두 세포 밀도에 있어서 동일한 범위를 가지는 것으로 나타났다. 그러나, 긴 이식편에서는 세포 모르폴로지 차이가 분명하였다. 도 22에서 총괄적으로 다룬 응고 결과는 이식편에 세포가 존재함으로 인한 이익을 분명히 나타내지만, 긴 지지대에는 eNOS(표6)가 결여되었다. eNOS 생성이 건강한 원상태의 내피임을 가리킨다는 것이 알려져 있고, 긴 이식편에 세포가 분명히 존재하긴 하지만, 짧은 지지대에서 볼 수 있는 것과 동일한 방식으로 세포가 퍼져서 이웃 세포와 연결을 형성하지는 않는다. 이러한 두 지지대가 동일한 물질로 이루어지고 동일한 방식으로 제조된다고 가정하면, 이것은 이러한 지지대의 컨디셔닝이 다소 상이하다는 것을 암시한다. 사실상, 두 이식편에 동일한 컨디셔닝 프로토콜이 주어졌지만, 한가지 가능한 설명은 기하학적 고려 사항이 결국은 상이한 지지대 내에서 흐름의 차이를 초래할 수 있다는 것이다. 유체역학적 요인에 대한 세포 민감도를 가정하면, 그것은 와류 흐름 조건이 긴 지지대에서 볼 수 있는 세포의 둥근 모르폴로지를 초래하고 결과적으로 eNOS 발현의 결여를 초래한다는 것일 수 있다. 게다가, 8 일간의 컨디셔닝 프로토콜 과정 동안에 긴 지지대와 짧은 지지대 사이에 글루코스 소비가 약간 차이 있음(긴 지지대가 약간 덜 소비함)을 보여주는 eNOS 발현에서 볼 수 있는 모순이 대사 데이터(표 7)에서 나타날 수 있다. 긴 이식편이 eNOS를 생성하지 않는다는 것과 함께 이러한 발견은 긴 이식편에 세포의 덜 활성인 표현형이 있음을 가리킬 것이다.

본원에서는 천연 혈관의 복잡한 역학을 모방할 수 있는 능력을 가지는 다성분 관형 지지대 생성을 위한 신규 구조적 기술을 기재한다. 기술 및 물질 선택 둘 모두의 융통성은 혈관 성질의 제법 정밀한 조정 및 따라서 정밀한 일치를 허용한다. 앞으로, 혈관 이식편 환경에서의 컴플라이언스 불일치의 최소화 또는 제거의 장기간 이익을 평가하는 생체내 동물 실험을 수행할 수 있다.

실시예 8 - 지지대 상에 시딩된 세포의 보유

생체내 이식 후 TEBV 상에 시딩된 세포의 보유는 플루겔만(Flugelman)의 미국 특허 출원 공개 20070190037의 실시예 26을 변경해서 평가할 수 있다.

조직 공학적 지지대에 관강측에는 내피세포를, 외막측에는 평활근 세포를 시딩함으로써 본 발명의 조직 공학적 혈관(TEBV)을 제조하였다.

토끼를 마취시킨 후 삽관하였다. 실험하는 동안 모니터링 시스템은 혈압 측정기, 맥박 산소 계측기 및 ECG를 포함하였다. 이식편 이식을 위해 TEBV의 노출 및 제조 후 전신 항응고를 위해 헤파린을 정맥내 주사하였다. 이 과정 동안 규칙적으로(예를 들어, 30 분마다) 혈액 샘플을 채취하여 부분 트롬보플라스틴 시간(PTT)을 측정함으로써 헤파린화의 효능을 평가하였다.

이어서, TEBV를 경동맥 및 대퇴 동맥에 좌우 양방향으로 단측 이식하였다. 이식된 TEBV를 혈류에 노출한 지 30분 후 수거 전에, 직접 촉진, 도플러 유량계(트랜소닉 애니멀 리서치 플로우미터(Transonic Animal Research Flowmeter), 미국 뉴욕)를 이용한 유량 측정, 및 선택적 혈관조영술 수행에 의해 TEBV의 개통성을 평가하였다.

대퇴동맥 및 경동맥에 이식된 TEBV를 이식한 지 2 시간 후에 수거하였다. 수거된 TEBV의 내부 표면 상의 세포 보유를 형광 현미경으로 분석하였다.

실시예 9 - 생체내 동정맥 단락(A-V 단락)

본 발명의 TEBV의 생체내 효과성은 "생체내 토끼 동정맥 단락 혈전증 모델"(In Vivo Rabbit Arterio-Venous Shunt Thrombosis Model)(코트(Corte) 등의 미국 특허 7,459,564에 기술됨)을 변경해서 검사할 수 있다.

적정 체중의 토끼를 마취시켰다. 염수로 충전된 본 발명의 TEBV를 대퇴동맥 캐뉼러와 대퇴정맥 캐뉼러 사이에서 연결하였다. 혈액은 대퇴동맥으로부터 동정맥 단락(AV-단락)으로서 작용하는 TEBV를 경유하여 대퇴정맥으로 흐를 것이다. 생체 내에서 이 모델을 이용해서 당업계에 알려진 다양한 기술을 이용하여 TEBV의 개통성을 평가할 수 있다. 예를 들어, 유의한 협착 없이 이식편을 통과하는 혈류의 존재 및 폐색의 부재를 평가한다. 이식된 TEBV를 관찰하기 위해 초음파 기술을 이용할 수 있다. TEBV가 바늘 천공으로부터 회복할 수 있는 능력도 개통성 검사에 이용된다. 연구 종료시, 추가 검사, 예를 들어 TEBV 상의 세포 수, 및 시딩된 세포가 생체내에 있는 동안 재생 과정을 개시한 정도의 검사를 위해, 동물들을 희생시키고 이식된 TEBV를 제거하였다. 추가로, TEBV의 역학적 성질을 평가하고, 이식 전의 천연 혈관 이식편 및/또는 TEBV의 역학적 성질과 비교하였다.

간치 혈관 이식편에 사용된 TEBV의 개통성 검사에 동일 유형의 AV-단락 모델을 이용할 수 있다.

Claims

(a) 엘라스토머성 요소, 외부 표면, 내부 관강 표면, 및 제1 직경을 포함하는 제1 관형 요소를 제공하는 단계;
(b) 제1 관형 요소를 제2 직경으로 확장시키는 단계;
(c) 인장 요소, 외부 표면 및 내부 관강 표면을 포함하는 제2 관형 요소를 단계 (b)의 확장된 제1 관형 요소의 표면 상에 제공하는 단계;
(d) 단계 (b)의 확장된 제1 관형 요소와 제2 관형 요소를 결합시키는 단계; 및
(e) 제1 관형 요소의 제2 직경을 단계 (a)의 제1 직경으로 감소시켜서 TE 지지대를 생성하는 단계
를 포함하는 조직 공학(TE) 지지대 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 제2 관형 요소가 주름진 것인 방법.
제 2 항에 있어서, 주름진 제2 관형 요소가 섬유 방향이 원주방향으로 배향된 섬유 망상구조를 포함하는 것인 방법.
제 1 항에 있어서, (a)의 제공 단계가 심봉 상에 전기방사하는 것을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, (c)의 제공 단계가 심봉 상에 전기방사하는 것을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, (c)의 제공 단계가 미리 생성된 제2 관형 요소를 단계 (b)의 확장된 제1 관형 요소 위에 놓는 것을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 엘라스토머성 요소가 제1 탄성계수를 가지는 엘라스토머성 성분을 포함하고, 인장 요소가 제1 탄성계수보다 큰 제2 탄성계수를 가지는 인장 성분을 포함하는 것인 방법.
제 7 항에 있어서, 제2 탄성계수가 제1 탄성계수보다 10 배 이상 큰 방법.
제 1 항에 있어서, 엘라스토머성 요소가 천연 엘라스토머성 성분을 포함하는 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 엘라스토머성 요소가 합성 엘라스토머성 성분을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 엘라스토머성 요소가 천연 엘라스토머성 성분 및 합성 엘라스토머성 성분을 포함하는 것인 방법.
제 9 항 또는 제 11 항에 있어서, 천연 엘라스토머성 성분이 엘라스틴, 레실린, 애브덕틴 및 실크로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 합성 엘라스토머성 성분이 라텍스, 폴리우레탄(PU), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리-L-락티드산(PLLA), 폴리디악사논(PDO), 폴리(L-락티드-코-카프로락톤)(PLCL) 및 폴리(에테르우레탄 우레아)(PEUU)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 인장 요소가 천연 인장 성분을 포함하는 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 인장 요소가 합성 인장 성분을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 인장 요소가 천연 인장 성분 및 합성 인장 성분을 포함하는 것인 방법.
제 14 항 또는 제 16 항에 있어서, 천연 인장 성분이 콜라겐, 셀룰로오스, 실크 및 케라틴인 방법.
제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 합성 인장 성분이 나일론, 다크론(등록상표)(폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)), 고어텍스(등록상표)(폴리테트라플루오로에틸렌), 폴리에스테르, 폴리글리콜산(PGA), 폴리-락틱-코-글리콜 산(PLGA) 및 폴리(에테르우레탄 우레아)(PEUU)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
(a) 엘라스토머성 요소, 외부 표면 및 내부 관강 표면을 포함하는 제1 관형 요소, 및 (b) 제1 관형 요소의 외부 표면과 접촉하는, 인장 요소, 외부 표면 및 내부 관강 표면을 포함하는 제2 관형 요소를 포함하고, 응력 및 변형에 대한 그의 역학적 반응이 J형 응력/변형 곡선임을 특징으로 하는, 응력 및 변형에 대해 천연 혈관의 역학적 반응과 실질적으로 유사한 역학적 반응을 가지는 조직 공학 지지대.
(a) 엘라스토머성 요소, 외부 표면 및 내부 관강 표면을 포함하는 제1 관형 요소, 및 (b) 제1 관형 요소의 외부 표면과 접촉하는, 인장 요소, 외부 표면 및 내부 관강 표면을 포함하는 제2 관형 요소를 포함하고, (i) 약 0.1 MPa 내지 약 0.5 MPa의 원주방향 관 탄성계수 1, (ii) 약 3.0 MPa 내지 약 6.0 MPa의 원주방향 관 탄성계수 2, 및 (iii) 약 0.57 내지 약 1.12의 원주방향 계수 천이 중 하나 이상을 가지는, 응력 및 변형에 대해 천연 혈관의 역학적 반응과 실질적으로 유사한 역학적 반응을 가지는 조직 공학 지지대.
제 20 항에 있어서, 지지대가 J형 응력/변형 곡선을 가짐을 특징으로 하는 것인 조직 공학 지지대.
제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 제2 관형 요소가 주름진 것인 조직 공학 지지대.
제 22 항에 있어서, 주름진 제2 관형 요소가 섬유 방향이 원주방향으로 배향된 섬유 망상구조를 포함하는 것인 조직 공학 지지대.
제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 엘라스토머성 요소가 제1 탄성계수를 가지는 엘라스토머성 성분을 포함하고, 인장 요소가 제1 탄성계수보다 큰 제2 탄성계수를 가지는 인장 성분을 포함하는 것인 조직 공학 지지대.
제 24 항에 있어서, 제2 탄성계수가 제1 탄성계수보다 10 배 이상 큰 조직 공학 지지대.
제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 엘라스토머성 요소가 천연 엘라스토머성 성분을 포함하는 것인 조직 공학 지지대.
제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 엘라스토머성 요소가 합성 엘라스토머성 성분을 포함하는 것인 조직 공학 지지대.
제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 엘라스토머성 요소가 천연 엘라스토머성 성분 및 합성 엘라스토머성 성분을 포함하는 것인 조직 공학 지지대.
제 26 항 또는 제 28 항에 있어서, 천연 엘라스토머성 성분이 엘라스틴, 레실린, 애브덕틴 및 실크로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 조직 공학 지지대.
제 27 항 또는 제 28 항에 있어서, 합성 엘라스토머성 성분이 라텍스, 폴리우레탄(PU), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리-L-락티드산(PLLA), 폴리디악사논(PDO), 폴리(L-락티드-코-카프로락톤)(PLCL), 및 폴리(에테르우레탄 우레아)(PEUU)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 조직 공학 지지대.
제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 인장 요소가 천연 인장 성분을 포함하는 것인 조직 공학 지지대.
제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 인장 요소가 합성 인장 성분을 포함하는 것인 조직 공학 지지대.
제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 인장 요소가 천연 인장 성분 및 합성 인장 성분을 포함하는 것인 조직 공학 지지대.
제 31 항 또는 제 33 항에 있어서, 천연 인장 성분이 콜라겐, 셀룰로오스, 실크 및 케라틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 조직 공학 지지대.
제 32 항 또는 제 33 항에 있어서, 합성 인장 성분이 나일론, 다크론(등록상표)(폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)), 고어텍스(등록상표)(폴리테트라플루오로에틸렌), 폴리에스테르, 폴리글리콜산(PGA), 폴리-락틱-코-글리콜 산(PLGA) 및 폴리(에테르우레탄 우레아)(PEUU)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 조직 공학 지지대.
제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, (i) 기공 직경이 제2 관형 요소의 외부 표면에서의 약 100 ㎛에서부터 제1 관형 요소의 내부 표면에서의 약 5 내지 약 15 ㎛으로 점진적으로 감소하는 기공 구배; (ii) 약 0.45 MJ/㎥ 내지 약 1.0 MJ/㎥의 원주방향 관 인성; (iii) 약 0.1 MJ/㎥ 내지 약 0.5 MJ/㎥의 축방향 관 인성; (iv) 약 0.05 내지 약 0.3의 탄젠트 델타; 및 (v) 약 400 MPa 내지 약 0.12 MPa의 저장계수 중 하나 이상을 가지는 조직 공학 지지대.