CN112915255B - 一种多尺度生物支架及其制造方法与应用 - Google Patents

一种多尺度生物支架及其制造方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种多尺度生物支架及其制造方法与应用，其中生物支架包括交错设置的若干轴向纤维和若干周向纤维，所述轴向纤维的直径为2～20μm，所述周向纤维的直径为50μm～2mm，且相邻周向纤维之间的排列间距大于相邻轴向纤维之间的排列间距。上述制造方法采用3D打印、静电纺丝、浇注成型或前述任一方法与卷膜工艺结合。上述应用为上述多尺度生物支架在制造组织工程支架中的应用。本发明的生物支架兼顾了比表面积以及孔隙大小，很好的模拟了体内定向组织，细胞负载在该种支架上可以展现出定向生长的状态，并很好得实现功能化，有利于进一步引用于组织工程修复。

Description

一种多尺度生物支架及其制造方法与应用
技术领域
本发明属于生物制造与设计技术领域，具体涉及一种多尺度生物支架及其制造方法与应用。
背景技术
近年来，组织工程理念用于组织修复越来越引起人们的关注，其有效性也得到越来多研究的验证。组织工程方法在于将支架，细胞以及相关的细胞因子营养物质，载体外进行混合或者预培养，在实现一定组织功能之后移植进入体内，进行快速修复。因此，组织工程支架的设计对于最终的修复效果，以及预培养组织的功能实现至关重要。
在人体组织中，有很多定向的纤维组织，例如神经系统中的神经纤维，肌肉组织中的肌肉纤维，心肌组织中的定向心肌纤维，都是细胞依附定向纤维生长的情景。因此，具有定向纤维结构的组织工程仿生支架的设计以及制造一直是生物制造领域的重点问题。理想组织工程支架的特点包括支架结构很好模拟体内环境，孔隙大小适合营养渗透以及细胞迁移，与此同时比表面积尽可能大，从而能负载尽可能多的细胞。
目前现存的仿生定向支架设计往往存在孔隙大小与比表面积矛盾的局面，很多设计中，整体支架由纳米孔和纳米纤维组成，虽然营养渗透没问题，但是过小的孔径不利于细胞的迁移。另一部分设计中，整体支架都由几百微米的孔和几百微米的纤维组成，与体内的环境以及细胞尺寸相差甚远，且其比表面积也大大降低。此外，支架在体内长期植入，其形态保持和力学支撑对于给组织长入和细胞的渗透同样重要。目前大部分的组织工程支架设计无法同时满足上述要求。
发明内容
为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供一种多尺度生物支架，具有适宜的孔径和比表面积，能够很好地模拟人体组织微环境，并能够在人体内长期维持形貌，达到较好的组织修复效果。
本发明提供了一种多尺度生物支架的制造方法，该方法突破了传统组织工程支架无法很好模拟人体组织微环境(尺度与细胞尺度相差甚远)，无法兼顾合适孔径以及合适的比表面积，以及在体内无法长期维持形貌提供力学支撑的限制。最终将其用于负载不同细胞，细胞会在该支架上展现出沿轴向定向生长的形态。
一种多尺度生物支架，包括交错设置的若干轴向纤维和若干周向纤维，所述轴向纤维的直径为2～20μm，所述周向纤维的直径为50μm～2mm，且相邻周向纤维之间的排列间距大于相邻轴向纤维之间的排列间距。
上述生物支架中，轴向纤维用于模拟人体组织中普遍存在的定向纤维结构，如神经纤维，胶原纤维，肌纤维等等；周向纤维用于为整个生物支架提供力学支撑，从而长期维持生物支架的形貌。
上述生物支架中，沿生物支架周向排列的轴向细纤维(即轴向纤维)，其排列间距较小，排列较密，纤维直径在两微米至二十微米之间。周向粗纤维(即周向纤维)的直径可在五十微米至几毫米，其排列间距较大。整体上，在同一结构中，轴向细纤维的排列间距要小于周向粗纤维。
上述生物支架剔除了传统组织工程学支架无法兼顾比表面积以及空隙大小的问题，很好的模拟了体内定向组织，细胞负载在该种支架上可以展现出定向生长的状态，并很好得实现功能化，有利于进一步引用与组织工程修复。
作为优选，所述轴向纤维的直径为5～15μm，所述周向纤维的直径为50μm～500μm；作为进一步优选，所述轴向纤维的直径为5μm、8μm、10μm、12μm、15μm等，所述周向纤维的直径为50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm等。
作为优选，所述生物支架为柱状结构，多个所述轴向纤维与所述生物支架的轴线平行，并与多个所述周向纤维垂直；此处的“柱状”并不限定其一定是沿某一直线布置的几何柱体结构，仅仅说明其径向尺寸变化不大(当然实际需要是，可以加工不同径向尺寸变化的结构)。比如其可以是具有一定弯曲或者折角等。生物支架的横截面可以是圆形、正方形、三角形、长方形、正六边形或者类似上述图形的结构等等。同时既可以是空心结构(比如管状或筒状等)，也可以是具有一定间隙分布的“实心”结构(比如卷层结构)。
作为优选，所述生物支架为筒状结构(或者管状结构)或者卷层结构。
作为进一步优选，所述多尺度生物支架为卷层结构，所述周向纤维沿卷层结构的卷绕方向设置。
作为优选，相邻轴向纤维的排列间距为1～200μm；相邻周向纤维的排列间距为200μm～2mm。
作为进一步优选，所述轴向纤维的排列间距为50～150μm，所述周向纤维的排列间距为300μm～1000μm；作为更进一步优选，所述轴向纤维的排列间距为50μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm等等，所述周向纤维的排列间距为300μm、400μm、500μm、600μm、700μm等等。
作为进一步优选，多个所述轴向纤维沿所述生物支架周向等间距排列，多个所述周向纤维沿所述生物支架轴向等间距排列。
作为优选，所述轴向纤维由可降解材料或生物兼容性材料制成；
所述周向纤维由可降解材料或生物兼容性材料制成。其中，所述轴向纤维与周向纤维可以采用相同的材料制成，也可以不同的材料制成。
作为进一步优选，所述可降解材料为可降解聚合物或可降解水凝胶；作为更进一步优选，所述可降解聚合物为聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)中的一种或多种；所述可降解水凝胶为明胶、壳聚糖、水杨酸中的一种或多种。
一种如上述任一项技术方案所述的多尺度生物支架的制造方法，所述制造方法采用3D打印、静电纺丝、浇注成型或前述任一方法与卷膜工艺结合。
作为优选，所述3D打印为近场直写打印、熔融沉积或光固化成型；所述3D打印为近场直写打印时，其所用打印材料为聚己内酯(PCL)。
作为进一步优选，所述3D打印为平面近场直写打印，其打印参数为：喷嘴-基板距离为1～3mm，挤出压力为7.5～400KPa，打印速度为10～5000mm/min，电压值为3.3～4.7kv，料筒加热器温度为65～105℃。采用平面近场直写打印可以预先打印出生物支架的平面结构。然后通过卷绕得到最终的筒状或者卷层结构。
作为具体优选，所述生物支架采用平面近场直写打印与卷膜工艺相结合的方式制造，具体步骤包括：
利用近场直写3D打印机，输入事先设定好的路径文件，经过xyz轴的联合移动，一次性或者多次打印出平面的纤维支架，随后将打印好的纤维支架从基板上取下来，利用卷膜工艺将纤维支架卷成卷层结构，最终形成卷层结构的生物支架。
上述路径文件是生物支架在二维平面的形态，需要保证其在成卷之后，轴向纤维和周向纤维的排列，因此需要路径文件，在一个方向上的平行线，对应成卷后的轴向纤维；另外一个垂直方向上的平行线，对应成卷后的周向纤维。
上述采用平面近场直写打印与卷膜工艺相结合的方式制造的生物支架为卷层结构，且该卷层结构的直径以及相邻层之间的间隙可根据实际需要进行调节。卷层结构的生物支架的轴向纤维和周向纤维的直径分别通过控制挤出压力和针头移动速度进行调节。
作为具体的优选，用平面近场直写打印制造纤维支架时，采用分步法进行打印，具体操作如下：
设定近场直写3D打印的参数：喷嘴-基板距离为1～3mm，喷头直径为100～200μm，挤出压力为7.5KPa-400KPa，电压值为3.3～4.7kv，料筒加热度为105℃，针头加热温度为105℃；
首先进行轴向纤维的沉积，挤出气压设定为50～150kpa，移动速度设定为500～2000mm/min。
然后进行周向纤维的沉积，挤出气压设定为200～400kpa，移动速度设定为400～600mm/min。
作为进一步优选，上述步骤中，将纤维支架从基板上取下时，采用酒精浸泡法使纤维支架与基板自动脱离。
具体讲，上述酒精浸泡法中，采用75％酒精，浸泡时间为3～10min。
作为进一步优选，上述步骤中，将纤维支架卷膜时可采用钢针辅助进行，具体步骤为：利用钢针靠在纤维支架的一边，然后手捏住纤维支架边缘与钢针，缓慢搓动钢针，带动纤维支架成卷。
作为优选，所述3D打印为旋转轴近场直写打印，其打印参数为：喷嘴-转轴距离为1～3mm，挤出压力为7.5～400KPa，喷嘴平移打印速度为10～5000mm/min，转轴转速为10～100r/min，电压值为3.3～4.7kv，料筒加热器温度为65～105℃。
作为进一步优选，上述旋转轴近场直写打印的打印参数为：喷嘴-转轴距离为2～3mm，挤出压力为50～200KPa，喷嘴平移打印速度为100～2000mm/min，转轴转速为10～50r/min，电压值为4～4.7kv，料筒加热器温度为75～105℃。
上述采用旋转轴近场直写打印制造的生物支架为管状结构(比如圆管形)或者筒状结构，该结构中轴向纤维的直径通过控制挤出压力和喷嘴移动速度进行调节，周向纤维的直径通过控制挤出压力和转轴转速进行调节。
作为具体优选，所述生物支架采用旋转轴近场直写打印的方法进行制造，步骤如下：
利用旋转3D打印机，输入事先设定好的路径文件，经过xz轴以及转轴转动的联合作用，一次性直接打印出圆筒形生物支架。
上述的路径文件中，主轴方向上轴向纤维打印的路径主要由x轴的平移实现，而周向纤维打印的路径主要是由转轴的转动实现。
作为优选，旋转3D打印的参数为：喷嘴-转轴距离为1～3mm，喷头直径为100～200μm，气压大小为7.5～400kPa，电压值3.3～4.7kv，料筒加热度为65～105℃，针头加热温度为65～105℃。当打印轴向纤维时，平移速度为200～1000mm/min，当打印周向纤维时，转轴转速为10～100r/min。
作为优选，采用旋转轴近场直写打印法打印完成后，采用酒精浸泡法经打印好的生物支架从转轴上取下。
具体讲，上述酒精浸泡法中，采用75％酒精，浸泡时间为3～10min。
一种如上述任一项技术方案所述的多尺度生物支架在制造组织工程支架中的应用。所述组织工程支架为上述生物支架载细胞后的仿生支架，能够模拟相应的活体组织。
下面以所述组织工程支架为神经支架为例，说明组织工程支架的制作方法。
所述神经支架的制作方法包括：
将生物支架进行消毒等预处理，随后将培养好的神经细胞种植在生物支架上，待神经细胞在生物支架上黏附，功能化之后，形成整体仿生神经支架。
上述神经支架包含神经细胞、功能化的轴突和髓鞘结构，可以用于医学上的神经移植，用于修复坐骨神经等。
作为具体优选，所述神经支架的制作方法包括：
(1)先将生物支架浸泡在75％的酒精中，并用紫外灯照射2小时以上；随后用PBS缓冲液冲洗，去除残留酒精；
(2)将神经干细胞首先在培养基中重悬4至6个小时，随后会形成40-200微米的团簇细胞球，随后神经干细胞团簇会被用多鸟氨酸培养基收集和重悬；
(3)将上述神经干细胞团簇悬液注射进孔板与预处理过的生物支架共同培养1～4小时，待细胞贴附后，再加入多鸟氨酸溶液进行培养8～12小时，最终形成功能化的伸进支架。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明的多尺度生物支架由直径和排列间距均不同的轴向纤维和周向纤维组成，轴向纤维用于模拟人体组织中普遍存在的定向纤维结构，周向纤维用于为整体结构提供力学支撑，使支架长期维持形貌；该结构同时满足了很好地模拟人体组织环境和生物支架本身的力学支撑。
2、本发明的多尺度生物支架不管是孔径(轴向纤维和周向纤维共同限定的网格)尺寸，还是纤维直径，都接近细胞尺度，不仅有利于引导细胞生长，还能更好模拟组织微环境，促进细胞的迁移和渗透。
3、本发明提供的生物支架克服了传统设计中空隙大小与比表面积不能兼顾的缺点。
4、本发明提供的生物支架采用了轴向仿生诱导，周向力学支撑的结构设计，有利于长期植入体内维持形貌。
5、由本发明的生物支架制得的组织工程支架，能够有效促进组织损伤的愈合。
附图说明
图1为本发明实施例1中3D打印系统的示意图；
图2为本发明实施例1中多尺度纤维支架的实物图；
图3为本发明实施例1中多尺度纤维支架的局部细节的电镜图。
图4a为本发明实施例1中卷层结构的生物支架的制造工艺示意图；
图4b为本发明实施例1中筒状生物支架的制造工艺示意图；
图5为本发明实施例1中卷层结构的神经支架的结构示意图；
图6为本发明实施例1中神经支架应用于神经移植的应用示意图；
图7为本发明实施例1中神经干细胞在生物支架上的生长情况的免疫荧光图。
具体实施方式
以制作一个长度为10mm，直径为1mm的仿生神经支架为例，对本发明中的设计理念以及制造工艺做进一步说明。
实施例1：卷层结构
利用CAD技术设计出平面结构的图案，然后导出可供3D打印识别的Gcode文件。
将生成好的Gcode文件输入进如图1所示的近场直写3D打印系统(主要包括打印喷嘴、料筒、料筒加热器、喷嘴加热头、基板等)，通过调控喷嘴-基板距离、挤出压力、打印速度，电压值大小，加热器温度等参数，在基板的承载面(本实施例中，基板采用玻璃板)上沉积平面支架结构。预设结构中，粗的纤维直径(即周向纤维)在50-60微米，细的纤维(即轴向纤维)直径在10微米，因此将打印参数设置如下：喷嘴-基板距离2.5mm，喷头直径为150微米，电压值4.7kv，料筒加热度为105℃，针头加热温度为105℃。
采用分步法进行打印，首先进行轴向纤维的沉积，挤出气压设定为100kpa，移动速度设定为1000mm/min；然后进行周向纤维的沉积，挤出气压设定为300kpa，移动速度设定为500mm/min。首先打印出如图2和图3所示的平面纤维支架。之后，将带有平面纤维支架的玻璃板浸没在75％的酒精里5min，使得平面纤维支架脱落。上述打印所用的材料为聚己内酯(PCL)，型号为CAPA6800。
随后，使用卷膜工艺，将平面纤维支架卷曲，最终形成如图4a所示的卷层结构的生物支架。
按照如图6所示的利用上述卷层结构的生物支架载神经细胞后进行神经修复的总体流程图，进行神经修复实验。
首先，本实例中所使用的细胞为小鼠的神经干细胞。该细胞从小鼠胚胎中提取，并在体外事先纯化成高程度的神经干细胞。
生物支架在使用前首先浸泡在75％的酒精中紫外照射2小时以上，随后使用PBS缓冲液，冲洗3次，去除残留酒精，并用多鸟氨酸浸泡生物支架，使得细胞贴附。
纯化后的神经干细胞首先在培养基中重悬5小时，随后会形成40～200微米的团簇细胞球，随后神经干细胞团簇用多鸟氨酸培养基收集和重悬。将神经干细胞团簇悬液注射进孔板与生物支架共培养两个小时。等细胞贴附之后，再加入2毫升的多鸟氨酸溶液进行培养10小时，最终形成功能化的卷层结构的神经支架。
图5为上述卷层结构的神经支架的结构示意图，并且阐述了该支架在神经修复中的几个优势。
左上角的子图①是该神经支架的结构设计图，展现其设计理念，利用周向粗纤维做力学支撑，利用轴向细纤维做细胞引导。
右上角的子图②是展示该神经支架第一优点的示意图，由图中可以看出，该神经支架即拥有高效的物质传递特性，由于孔径较大，因此易于营养物质，氧气等物质的传递，以及废物的代谢。
左下角的子图③为展示该神经支架第二优点的示意图，由图可知，由于纤维直径细，比表面积高，因此给细胞提供的粘附面积大，细胞负载量高。
右下下角的子图④为展示该神经支架第三优点的示意图，由图可知，最终雪旺细胞包裹纤维的这种结构很好的模拟体内神经纤维的髓鞘结构，具有很好的仿生性。
如图7所示是神经干细胞在生物支架上黏附以及功能化的免疫荧光图片，图7(i)是神经干细胞在支架上定向生长的荧光图片，图7(ii)是图7(i)的局部放大，图7(iii)是图7(ii)的相位图。图7下面两排图片显示轴向纤维上承载着S100β+(中枢神经特异蛋白)和GFAP+(胶质纤维酸性蛋白)细胞，表明神经干细胞在生物支架上已经分化为雪旺细胞祖细胞，很好地模拟了髓鞘包裹神经纤维的基础结构。EGFP是所用细胞自带的绿色荧光。
随后使用大鼠坐骨神经截断模型来评估载细胞仿生神经生物支架的修复能力，设置组别分别为神经干细胞组，生物支架组，神经支架(生物支架+神经干细胞)组。操作过程包括，对大鼠实施麻醉，将麻醉状态下大鼠的左坐骨神经切除6毫米，操作过程中注意不能将神经的外膜完全切断。切除完毕之后，分别将神经干细胞、生物支架、神经支架置入断口损伤处，再将神经外膜以及伤口进行缝合，进行分组实验，观察术后恢复状态。结果显示细胞+生物支架组(神经支架组)修复效果最佳，纯支架组(生物支架组)也展现出一定的修复能力。
实施例2：筒状结构
如图4b所示，利用旋转3D打印机，输入事先设定好的路径文件，经过xz轴以及转轴转动的联合作用，一次性直接打印出圆筒形生物支架。
上述的路径文件中，主轴方向上细纤维(轴向纤维)打印的路径主要由x轴的平移实现，而周向的粗纤维打印的路径主要是由转轴的转动实现。
设置旋转3D打印的参数为：喷嘴-转轴距离为2.5mm，喷嘴直径为150微米，气压大小为100kPa，电压值为4.7kv，料筒加热度为105℃，喷嘴加热温度为105℃。
打印轴向纤维时，x轴的平移速度为500mm/min，打印周向纤维时，转轴的转动速度为30r/min。完成轴向纤维和周向纤维的打印后即在转轴上打印出圆管形生物支架。上述旋转打印所用的材料为聚己内酯(PCL)，型号为CAPA6800。
将上述带有生物支架的转轴浸没在75％酒精中的方法，浸泡5min之后，生物支架会自动脱离转轴，得筒状生物支架。

Claims (11)

1.一种多尺度生物支架，其特征在于，包括交错设置的若干轴向纤维和若干周向纤维，所述轴向纤维的直径为2～20μm，所述周向纤维的直径为50μm～2mm，且相邻周向纤维之间的排列间距大于相邻轴向纤维之间的排列间距。
2.根据权利要求1所述的多尺度生物支架，其特征在于，所述生物支架为柱状结构，多个所述轴向纤维与所述生物支架的轴线平行，并与多个所述周向纤维垂直。
3.根据权利要求1所述的多尺度生物支架，其特征在于，相邻轴向纤维的排列间距为1～200μm；相邻周向纤维的排列间距为200μm～2mm。
4.根据权利要求2所述的多尺度生物支架，其特征在于，多个所述轴向纤维沿所述生物支架周向等间距排列，多个所述周向纤维沿所述生物支架轴向等间距排列。
5.根据权利要求1所述的多尺度生物支架，其特征在于，所述轴向纤维由可降解材料或生物兼容性材料制成；所述周向纤维由可降解材料或生物兼容性材料制成。
6.根据权利要求5所述的多尺度生物支架，其特征在于，所述可降解材料为可降解聚合物。
7.根据权利要求6所述的多尺度生物支架，其特征在于，所述可降解材料为可降解水凝胶。
8.根据权利要求1～7任一项所述的多尺度生物支架，其特征在于，所述多尺度生物支架为卷层结构，所述周向纤维沿卷层结构的卷绕方向设置。
9.一种如权利要求1～8中任一项所述的多尺度生物支架的制造方法，其特征在于，所述制造方法采用3D打印、静电纺丝、浇注成型或前述任一方法与卷膜工艺结合。
10.根据权利要求9所述的制造方法，其特征在于，所述3D打印为近场直写打印、熔融沉积打印或光固化成型打印；所述3D打印为近场直写打印时，所用打印材料为聚己内酯。
11.一种如权利要求1～7中任一项所述的多尺度生物支架在制造组织工程支架中的应用。
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