JP6813923B1 - 体性幹細胞集積組織構造体及びその製造器具 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]凹部を有し線維性結合組織で構成されたコア部と、前記凹部に形成されたIII型コラーゲン及び体性幹細胞を含む疎線維性の体性幹細胞集積組織とを有する、組織構造体。
[2]前記コア部が1つ又は2つ以上の前記凹部を有する、上記[1]に記載の組織構造体。
[3]前記コア部が少なくとも3つの前記凹部を有する、上記[1]又は[2]に記載の組織構造体。
[4]前記凹部が少なくとも2.5mmの開口幅を有する、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の組織構造体。
[5]前記コア部が少なくとも2.5mmの径を有する、上記[1]〜[4]のいずれかに記載の組織構造体。
[6]体性幹細胞が間葉系幹細胞及び多能性幹細胞の少なくとも一方を含む、上記[1]〜[5]のいずれかに記載の組織構造体。
[7]組織構造体の形状が棒状であり、複数の前記凹部が周方向に沿って位置する、上記[1]〜[6]のいずれかに記載の組織構造体。
[8]組織構造体の形状が棒状であり、複数の前記凹部が軸方向に沿って位置する、上記[1]〜[7]のいずれかに記載の組織構造体。
[9]組織構造体の形状が略多面体形状であり、複数の前記凹部が異なる面に位置する、上記[1]〜[6]のいずれかに記載の組織構造体。
[10]組織構造体の形状が非管状かつ非シート状である、上記[1]〜[9]のいずれかに記載の組織構造体。
[11]上記[1]〜[10]のいずれかに記載の組織構造体であって、生体組織材料が存在する環境下に、中空部を有する組織構造体製造器具を留置することによって形成され、
前記組織構造体製造器具が、前記中空部を形成する枠体を有し、
前記枠体が、前記中空部から前記組織構造体製造器具の外部空間に連通する開口部を有し、
前記枠体が、前記中空部において形成される前記組織構造体の形状を規定する、
組織構造体。
[12]前記組織構造体が前記組織構造体製造器具内の前記中空部を埋めた状態であり、前記コア部が前記枠体の表面に密着している、上記[11]に記載の組織構造体。
[13]上記[1]〜[12]のいずれかに記載の組織構造体から、体性幹細胞集積組織又は体性幹細胞を分離することを含む、体性幹細胞の収集方法。
前記中空部を形成する枠体を有し、
前記枠体が、前記中空部から前記組織構造体製造器具の外部空間に連通する開口部を有し、
前記枠体が、前記中空部において形成される前記組織構造体の形状を規定し、
生体組織材料が存在する環境下に留置したときに、前記枠体の表面から前記中空部の内方に広がるように線維性結合組織が形成されることによって、前記開口部から前記中空部に向かって窪む凹部を有するコア部が生成するとともに、前記凹部に体性幹細胞が集積した疎線維性組織が形成される、組織構造体製造器具。
[15]前記開口部が少なくとも2.5mmの開口幅を有する、上記[14]に記載の組織構造体製造器具。
[16]前記開口部は2.5mm又はそれを超える直径の円が内接可能な開口形状を有する、上記[14]又は[15]に記載の組織構造体製造器具。
[17]前記枠体が、柱状部材と支持部から構成され、前記支持部が、前記枠体の形状を保持するように柱状部材を固定している、上記[14]〜[16]のいずれかに記載の組織構造体製造器具。
[18]複数の柱状部材が、その両端部で支持部に固定され、かつ、支持部と支持部に挟まれた仮想的な筒面上に周方向に配置されている、上記[17]に記載の組織構造体製造器具。
[19]前記開口部が、柱状部材と支持部によって形成されているか、又は複数の柱状部材によって形成されている、上記[17]又は[18]に記載の組織構造体製造器具。
[20]前記開口部が、多角形状、矩形状、台形状、丸形状、円形状、又は楕円形状の開口縁を有する、上記[14]〜[19]のいずれかに記載の組織構造体製造器具。
[21]支持部が、前記中空部と前記器具の外部空間とを連通する開口部をさらに有する、上記[17]〜[19]のいずれかに記載の組織構造体製造器具。
本発明は、生体組織から体性幹細胞を効率よく集積可能な組織構造体製造器具と、その器具を用いて作製することができる体性幹細胞に富む組織構造体に関する。
本願明細書の実施例では、以下の被験動物、試薬及び機器を使用した。
− 被験動物:ビーグル犬、雌、3歳齢、体重10kg
− 図4〜6に示す組織構造体製造器具
− 図9に示す形状のステント、及びバルーンカテーテル
− 組織保存液HypoThermosol(R)FRS(BioLIfe Solutions,101102)
− コラゲナーゼタイプI(Worthington,LS004214)
− ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(DMEM−LG(低グルコース);Wako,041−29775)
− 細胞凍結保存液バンバンカー(R)(日本ジェネティクス,CS−02−001)
− 4%パラホルムアルデヒド(PFA;Wako,163−20146)
− 溶血試薬VersaLyse Lysing Solution(Beckman Coulter,A09777)
− ウシ胎児血清(FBS)(Biosera,FB−1365)
− リン酸緩衝生理食塩水(PBS)
− キシレン(武藤化学,4313)
− 100%エタノール(武藤化学,4026)
− 媒染剤(武藤化学,4006−1)
− 第二媒染剤(武藤化学,8141−1)
− ワイゲルト鉄ヘマトキシリン液1(武藤化学,4034−1)
− ワイゲルト鉄ヘマトキシリン液2(武藤化学,4035−1)
− 0.75%オレンジG(武藤化学,4023−1)
− 1%酢酸(武藤化学,4017−1)
− マッソン染色液B(武藤化学,4025−1)
− 2.5%リンタングステン酸液(武藤化学,4018−1)
− アニリン青液(武藤化学,4020−1)
− 前田変法レゾルシル・フクシン液(武藤化学,4032−1)
− ワンギーソン液A(武藤化学,4036−1)
− ワンギーソン液B(武藤化学,4037−1)
− 1%シリウスレッド液(武藤化学,3306−1)
− クエン酸バッファー(Sigma,C9999−1000ML)
− ウシ血清アルブミン(BSA)(Wako,013−25773)
− 抗CD90抗体(abcam,ab123511)
− 抗CD105抗体(abcam,ab156756)
− 抗SSEA4抗体(abcam,ab16287)
− 抗VEGFA抗体(abcam,ab1316)
− 抗HGF抗体(abcam,ab83760)
− 抗SSEA3抗体(Bioss,bs−3575R)
− 抗Von Willebrand Factor(vWF)抗体(abcam,ab6994)
− 抗vimentin抗体(abcam,ab8069)
− ヤギ抗マウスIgG H&L(Alexa Fluor(R)488)(abcam,ab150113)
− ヤギ抗ウサギIgG H&L(Alexa Fluor(R)594)(abcam,ab150080)
− ProLongTM Gold Antifade Mountant with DAPI(4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール)(Thermo Fisher Scientific,P36931)
− 細胞染色バッファー(Cell Staining Buffer;BioLegend,420201)
− FITC標識抗CD90抗体(BioLegend,328107)
− 抗FITCマイクロビーズ(Miltenyi Biotec,130−048−700)
− ヤギ抗ウサギIgGマイクロビーズ(Miltenyi Biotec,130−048−600)
− MACSバッファー(autoMACS(R)Rinsing Solution;Miltenyi Biotec,130−091−222)
− MACS分離カラム(MSカラム;Miltenyi Biotec,130−042−201)
− 蛍光顕微鏡(Nikon,ECLIPSE Ti−U)
− 偏光顕微鏡(Nikon,ECLIPSE E1000)
ビーグル犬を麻酔し、右側腹部から背部にかけて5ヶ所の皮膚を電気メスで切開した後、皮下に、図4D及び図10Aに示す形状の組織構造体製造器具を各箇所に1つずつ挿入して埋設し、傷口を縫合した。3週間留置した後、ビーグル犬を麻酔し、皮膚を切開し、皮下の組織構造体製造器具を取り出した。使用した組織構造体製造器具は、直径1mm、長さ60mmの円柱状の6本の柱状部材13をその両端部と中間部で直径11mmの円環状の支持部により固定したものであり、その開口幅Wは4.0mm、深さDは4.6mmである。
実施例1で生体内から取り出した組織構造体製造器具を、4%PFAで4℃で24時間処理することにより組織を固定し、次いで器具を取り外して組織構造体のパラフィン包埋ブロックを作製した。
組織構造体中に存在する細胞種及びその分布を調べるため、組織構造体の免疫組織化学染色を行った。組織構造体の厚さ3〜5μmの切片について、間葉系幹細胞マーカーとしてCD90及びCD105、多能性幹細胞マーカーとしてSSEA4及びSSEA3、増殖因子として血管内皮増殖因子(VEGF)及び肝細胞増殖因子(HGF)を、対応する一次抗体及び二次抗体を用いた免疫組織化学染色により検出した。さらに、細胞核染色のためにDAPI(4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール)を用いた染色処理を行った。その結果を図13〜15に示す。
バイアル中のコラゲナーゼタイプI(50mg)にDMEM(無血清)を20mL加え、0.25%コラゲナーゼ溶液を調製した。調製したコラゲナーゼ溶液を6mL入れた15mL遠心管に、実施例1で生体内から取り出された、組織構造体を内部に有する組織構造体製造器具を入れ、恒温槽で37℃で振盪した。1.5時間振盪した後、当該器具とコラゲナーゼで未分解の組織とを取り除き、遠心管を4℃で1000rpm、5分遠心し、上清を除去した。DMEMを6mL添加し、ピペッティングし、50mL遠心管に細胞を回収した(4本分、24mL)。回収画分を4℃で1000rpm、5分遠心し、上清を除去した。
実施例4と同様の方法で組織構造体をコラゲナーゼ処理し回収した細胞集団から、CD90又はSSEA3陽性の幹細胞を単離及び濃縮した。回収した細胞集団について抗CD90抗体(BioLegend,328107)又は抗SSEA3抗体(Bioss,bs−3575R)で標識し、磁気ビーズ抗体(抗FITCマイクロビーズ(Miltenyi Biotec,130−048−700)及びヤギ抗ウサギIgGマイクロビーズ(Miltenyi Biotec,130−048−600))を反応させ、磁気細胞分離(Magnetic cell sorting;MACS)法により細胞分離を行った。
ビーグル犬の皮膚を穿刺し、皮下に、閉じたステント(拡径時の長さ29mm x 直径20mm)をマウントしたバルーンカテーテルを挿入した(図21A、D)。皮下で水圧を付加してバルーンを拡張させ(図21B)、ステントを拡径させた(図21C)。
様々な形状を有する本発明に係る組織構造体製造器具を用い、組織構造体の製造を行った。図4A〜C、及び図5A及びBに示す5種類の形状の組織構造体製造器具10を準備した。使用した5種類の組織構造体製造器具の柱状部材13は、いずれも直径1mmの円柱状であった。十分な麻酔下のビーグル犬に切開術を施して、腹部の皮下に組織構造体製造器具を埋設して傷口を縫合した。器具埋設の3日、10日、2週間(14日)、17日、又は3週間(21日)後、ビーグル犬に切開術を施して、腹部の皮下から組織構造体製造器具を取り出した。
図4〜6に示す組織構造体製造器具の構造と、結合組織の凹部及び体性幹細胞集積組織の形成との関係について、実施例7と同様の方法で3週間の留置期間にわたり製造された組織構造体を線維染色(HE染色)処理した切片を調べた。
Claims (18)
- 凹部を有し線維性結合組織で構成されたコア部と、前記凹部に形成されたIII型コラーゲン及び体性幹細胞を含む疎線維性の体性幹細胞集積組織とを有する、組織構造体であって、
前記凹部が少なくとも2.5mmの開口幅を有し、
前記体性幹細胞が、間葉系幹細胞、並びに多能性幹細胞マーカーSSEA4及びSSEA3の少なくとも一方を発現する多能性幹細胞を含む、
組織構造体。 - 前記コア部が1つ又は2つ以上の前記凹部を有する、請求項1に記載の組織構造体。
- 前記コア部が少なくとも3つの前記凹部を有する、請求項1又は2に記載の組織構造体。
- 前記コア部が少なくとも2.5mmの径を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組織構造体。
- 組織構造体の形状が棒状であり、複数の前記凹部が周方向に沿って位置する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組織構造体。
- 組織構造体の形状が棒状であり、複数の前記凹部が軸方向に沿って位置する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組織構造体。
- 組織構造体の形状が略多面体形状であり、複数の前記凹部が異なる面に位置する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組織構造体。
- 組織構造体の形状が非管状かつ非シート状である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組織構造体。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の組織構造体であって、生体組織材料が存在する環境下に、中空部を有する組織構造体製造器具を留置することによって形成され、
前記組織構造体製造器具が、前記中空部を形成する枠体を有し、
前記枠体が、前記中空部から前記組織構造体製造器具の外部空間に連通する開口部を有し、
前記枠体が、前記中空部において形成される前記組織構造体の形状を規定し、
前記開口部が少なくとも2.5mmの開口幅を有し、
前記開口部からの前記中空部の深さが少なくとも2mmである、
組織構造体。 - 前記組織構造体が前記組織構造体製造器具内の前記中空部を埋めた状態であり、前記コア部が前記枠体の表面に密着している、請求項9に記載の組織構造体。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の組織構造体から、体性幹細胞集積組織又は体性幹細胞を分離することを含む、体性幹細胞の収集方法。
- 生体組織材料が存在する環境下に留置することにより、凹部を有し線維性結合組織で構成されたコア部と前記凹部に形成されたIII型コラーゲン及び体性幹細胞を含む疎線維性の体性幹細胞集積組織とを有する組織構造体を形成するための、中空部を有する組織構造体製造器具であって、
前記中空部を形成する枠体を有し、
前記枠体が、前記中空部から前記組織構造体製造器具の外部空間に連通する開口部を有し、
前記枠体が、前記中空部において形成される前記組織構造体の形状を規定し、
前記開口部が少なくとも2.5mmの開口幅を有し、
前記開口部からの前記中空部の深さが少なくとも2mmであり、
前記体性幹細胞が、間葉系幹細胞、並びに多能性幹細胞マーカーSSEA4及びSSEA3の少なくとも一方を発現する多能性幹細胞を含む、
生体組織材料が存在する環境下に留置したときに、前記枠体の表面から前記中空部の内方に広がるように線維性結合組織が形成されることによって、前記開口部から前記中空部に向かって窪む凹部を有するコア部が生成するとともに、前記凹部に前記体性幹細胞が集積した疎線維性組織が形成される、組織構造体製造器具。 - 前記開口部は2.5mm又はそれを超える直径の円が内接可能な開口形状を有する、請求項12に記載の組織構造体製造器具。
- 前記枠体が、柱状部材と支持部から構成され、前記支持部が、前記枠体の形状を保持するように柱状部材を固定している、請求項12又は13に記載の組織構造体製造器具。
- 複数の柱状部材が、その両端部で支持部に固定され、かつ、支持部と支持部に挟まれた仮想的な筒面上に周方向に配置されている、請求項14に記載の組織構造体製造器具。
- 前記開口部が、柱状部材と支持部によって形成されているか、又は複数の柱状部材によって形成されている、請求項14又は15に記載の組織構造体製造器具。
- 前記開口部が、多角形状、矩形状、台形状、丸形状、円形状、又は楕円形状の開口縁を有する、請求項12〜16のいずれか1項に記載の組織構造体製造器具。
- 支持部が、前記中空部と前記器具の外部空間とを連通する開口部をさらに有する、請求項14〜16のいずれか1項に記載の組織構造体製造器具。
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