CN115768876A - 成体干细胞聚集组织结构体及其制造器械 - Google Patents

成体干细胞聚集组织结构体及其制造器械 Download PDF

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Abstract

本发明涉及组织结构体、其制造器械，以及收集来自组织结构体的成体干细胞的方法，组织结构体具有核心部和稀疏纤维性的成体干细胞聚集组织，其中，所述核心部具有凹部且由纤维性结缔组织构成，所述稀疏纤维性的成体干细胞聚集组织形成在所述凹部且含有III型胶原蛋白和成体干细胞。

Description

成体干细胞聚集组织结构体及其制造器械
技术领域
本发明涉及成体干细胞聚集组织结构体(体性幹細胞集積組織構造体，somaticstem cell-accumulated tissue construct)及其制造器械。
背景技术
排除异物的自我防御反应会让巨噬细胞等在侵入到生物体内的异物周围聚集。巨噬细胞吸附在异物表面将异物分解，同时通过单核细胞产生TGF-β，从而促使成纤维细胞产生胶原蛋白。结果，侵入到生物体内的异物会被含有成纤维细胞和胶原蛋白的结缔组织包覆，在生物体内隔离(包裹作用(カプセル化))。作为利用这种现象形成来自生物的组织的技术，报告有在生物体内埋入作为异物的基材形成结缔组织的技术(专利文献1～6等)。例如，专利文献5公开了在生物体内埋入沿棒状结构部件的外周形成为螺旋状的外围部件，由此制造形成在棒状结构部件的表面且包埋外围部件的结缔组织体。专利文献6公开了将在棒状体的外周嵌合支架的组件埋入到生物体中，由此在组件的外周形成结缔组织体，将其从生物体内取出，拔出棒状体，从而得到被结缔组织体包覆的支架。但是，通过包裹作用而在基材表面形成的组织一般只有几十μm到几百μm左右的厚度，其中包含的细胞几乎都是成纤维细胞。
近年来，作为使因疾病或外伤而受损的组织或器官的功能再生的技术，将体外培养的细胞或由此构建的组织移植到生物体内的再生医疗备受瞩目。干细胞是再生医疗中生成目的细胞或构建组织的至关重要的材料。另一方面，需要探讨伦理性的胚胎干细胞或需要建立安全性的人工多能干细胞尚未建立用于再生医疗的基础。因此，需要高效收集安全性更高、伦理问题少的成体干细胞的技术。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2007-312821号公报
专利文献2：日本特开2008-237896号公报
专利文献3：日本特开2010-094476号公报
专利文献4：日本特开2012-105860号公报
专利文献5：国际公布WO2016/076416号
专利文献6：日本特开2006-255288号公报
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题在于提供高效收集成体干细胞的技术。
用于解决问题的技术方案
本发明人为解决上述课题而进行了潜心研究，结果发现能够制造成体干细胞聚集的组织结构体，直至完成了本发明。
即，本发明包含如下内容。
[1]组织结构体，其具有核心部和稀疏纤维性的成体干细胞聚集组织，其中，所述核心部具有凹部且由纤维性结缔组织构成，所述稀疏纤维性的成体干细胞聚集组织形成在所述凹部且含有III型胶原蛋白和成体干细胞。
[2]根据上述[1]所述的组织结构体，其中，所述核心部具有1个或2个以上的所述凹部。
[3]根据上述[1]或[2]所述的组织结构体，其中，所述核心部具有至少3个所述凹部。
[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的组织结构体，其中，所述凹部具有至少2.5mm的开口宽度。
[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的组织结构体，其中，所述核心部具有至少2.5mm的直径。
[6]根据上述[1]～[5]中任一项所述的组织结构体，其中，成体干细胞包括间充质干细胞和多能干细胞中的至少一种。
[7]根据上述[1]～[6]中任一项所述的组织结构体，其中，组织结构体的形状为棒状，多于一个所述凹部沿周向配置。
[8]根据上述[1]～[7]中任一项所述的组织结构体，其中，组织结构体的形状为棒状，多于一个所述凹部沿轴向配置。
[9]根据上述[1]～[6]中任一项所述的组织结构体，其中，组织结构体的形状为大致多面体形状，多于一个所述凹部位于不同的面。
[10]根据上述[1]～[9]中任一项所述的组织结构体，其中，组织结构体的形状为非管状且非片状。
[11]组织结构体，其为根据上述[1]～[10]中任一项所述的组织结构体，其中，所述组织结构体通过在有生物组织材料存在的环境下安放具有中空部的组织结构体制造器械而形成，
所述组织结构体制造器械具有形成所述中空部的框体，
所述框体具有从所述中空部连通到所述组织结构体制造器械的外部空间的开口部，
所述框体限定在所述中空部形成的所述组织结构体的形状。
[12]根据上述[11]所述的组织结构体，其中，所述组织结构体为填补所述组织结构体制造器械内的所述中空部的状态，所述核心部与所述框体的表面紧贴。
[13]成体干细胞的收集方法，所述方法包括：从上述[1]～[12]中任一项所述的组织结构体中，分离成体干细胞聚集组织或成体干细胞。
[14]组织结构体制造器械，所述组织结构体制造器械具有：
中空部，以及形成所述中空部的框体，
所述框体具有从所述中空部连通到所述组织结构体制造器械的外部空间的开口部，
所述组织结构体具有核心部和稀疏纤维性的成体干细胞聚集组织，所述核心部具有凹部且由纤维性结缔组织构成，所述稀疏纤维性的成体干细胞聚集组织形成在所述凹部且含有III型胶原蛋白和成体干细胞。
[15]根据上述[14]所述的组织结构体制造器械，其用于通过安放在有生物组织材料存在的环境下来形成具有核心部和稀疏纤维性的成体干细胞聚集组织的组织结构体，所述核心部具有凹部且由纤维性结缔组织构成，所述稀疏纤维性的成体干细胞聚集组织形成在所述凹部且含有III型胶原蛋白和成体干细胞，
所述组织结构体制造器械具有中空部，以及形成所述中空部的框体，
所述框体具有从所述中空部连通到所述组织结构体制造器械的外部空间的开口部，
所述框体限定在所述中空部形成的所述组织结构体的形状，
所述组织结构体制造器械在安放在有生物组织材料存在的环境下时，以从所述框体的表面向所述中空部的内部扩展的形式形成纤维性结缔组织，由此生成具有从所述开口部向所述中空部凹陷的凹部的核心部，并且在所述凹部形成聚集了成体干细胞的稀疏纤维性组织。
[16]根据上述[14]或[15]所述的组织结构体制造器械，其中，所述开口部具有至少2.5mm的开口宽度。
[17]根据上述[14]～[16]中任一项所述的组织结构体制造器械，其中，所述开口部具有能够内接直径2.5mm或超过2.5mm的圆的开口形状。
[18]根据上述[14]～[17]中任一项所述的组织结构体制造器械，其中，所述框体由柱状部件和支撑部构成，所述支撑部将柱状部件固定以保持所述框体的形状。
[19]根据上述[18]所述的组织结构体制造器械，其中，多于一个柱状部件在其两端部被支撑部固定，并且周向配置在支撑部与支撑部之间的虚拟筒面上。
[20]根据上述[18]或[19]所述的组织结构体制造器械，其中，所述开口部由柱状部件和支撑部形成，或者由多于一个柱状部件形成。
[21]根据上述[14]～[20]中任一项所述的组织结构体制造器械，其中，所述开口部具有多边形、矩形、梯形、丸形、圆形或椭圆形的开口边缘。
[22]根据上述[18]～[21]中任一项所述的组织结构体制造器械，其中，支撑部还具有将所述中空部连通到所述器械的外部空间的开口部。
[23]组织结构体的制造方法，所述方法包括：在有生物组织材料存在的环境下，将上述[14]～[22]中任一项所述的组织结构体制造器械安放在例如生物体内或分离的生物组织中，所述组织结构体具有核心部和稀疏纤维性的成体干细胞聚集组织，所述核心部具有凹部且由纤维性结缔组织构成，所述稀疏纤维性的成体干细胞聚集组织形成在所述凹部且含有III型胶原蛋白和成体干细胞。
本说明书包含了作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2020-103747号的公开内容。
发明效果
根据本发明，能够高效收集成体干细胞。
附图简述
图1是表示组织结构体制造器械的一个实施方式的立体结构的立体图。
图2是表示组织结构体制造器械的一个实施方式的截面结构的剖面图。
图3是按照A、B、C、D的顺序示意性地表示成体干细胞通过组织结构体制造器械聚集的方式的示意图。
图4A～4D是表示组织结构体制造器械的一个实施方式的立体结构的立体图。
图5A和图5B是表示组织结构体制造器械的一个实施方式的立体结构的立体图。
图6A～6C是表示组织结构体制造器械的一个实施方式的立体结构的立体图。
图7是表示变形例中组织结构体制造器械的立体结构的立体图。
图8是表示变形例中组织结构体制造器械的立体结构的立体图。
图9是表示变形例中组织结构体制造器械的立体结构的立体图。
图10是表示使用组织结构体制造器械制作成体干细胞聚集的组织结构体的试验的结果的照片。A为使用的器械；B为埋设在生物体内之后取出的、在内部形成有组织结构体的器械；C为得到的组织结构体的截面。
图11是表示组织结构体的染色试验的结果的照片。A为HE染色；B为MT染色；C为EVG染色；D为SR染色。
图12是天狼星红染色切片的偏光显微镜照片。A为柱状部件周围；B为中心部；C为柱状部件之间。
图13是表示组织结构体的针对间充质干细胞标志物CD90和CD105的免疫组织化学染色的结果的照片。左列为CD90/DAPI；右列为CD105/DAPI。A、B为口袋部；C、D为柱状部件周围；E、F为中心部。
图14是表示组织结构体的针对多能干细胞标志物SSEA4和SSEA3的免疫组织化学染色的结果的照片。左列为SSEA4/DAPI；右列为SSEA3/DAPI。A、B为口袋部；C、D为柱状部件周围；E、F为中心部。
图15是表示组织结构体的针对生长因子即血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF)的免疫组织化学染色的结果的照片。左列为VEGF/DAPI；右列为HGF/DAPI。A、B为口袋部；C、D为柱状部件周围；E、F为中心部。
图16是表示组织结构体的干细胞标志物SSEA3和其他标志物的双重染色的结果的照片。A为CD90/SSEA3/DAPI；B为CD105/SSEA3/DAPI；C为SSEA3/SSEA4/DAPI；D为VEGF/SSEA3/DAPI。
图17是表示流式细胞仪分析的结果的图。
图18是表示细胞分离前和细胞分离后的细胞群体的流式细胞仪分析所示的CD90阳性细胞的比例增加的图。
图19是表示细胞分离前和细胞分离后的细胞群体的流式细胞仪分析所示的SSEA3阳性细胞的比例增加的图。
图20是表示从培养开始起第7天(上段)和第14天(下段)的细胞分离前的细胞群体(对照组，左列)、CD90阳性细胞群体(中央列)、SSEA3阳性细胞群体(右列)的从培养开始起第7天(上段)和第14天(下段)的细胞形态的照片。对利用MACS法分离的细胞进行培养，结果成纤维细胞样细胞与孔板粘附并增殖。
图21是表示使用支架制造组织结构体的试验的概要的照片和图。
图22是在组织结构体制造器械内形成的组织结构体的截面照片。
图23是用观察图像表示成体干细胞的细胞数量与安放期间的关系的图。
图24是表示在图4A的组织结构体制造器械内形成的组织结构体的切片的HE染色图像的照片。
图25是表示在图4B的组织结构体制造器械内形成的组织结构体的切片的HE染色图像的照片。
图26是表示在图4C的组织结构体制造器械内形成的组织结构体的切片的HE染色图像的照片。
图27是表示在图5A的组织结构体制造器械内形成的组织结构体的切片的HE染色图像的照片。
图28是表示在图5B的组织结构体制造器械内形成的组织结构体的切片的HE染色图像的照片。
图29是在图5B的组织结构体制造器械内形成的组织结构体的具有沿轴向Ax的截面的切片的HE染色照片的放大图像。
图30是表示在图6C的组织结构体制造器械内形成的组织结构体的外观和其两种切片的截面位置的照片。
图31是表示在图6C的组织结构体制造器械内形成的组织结构体的具有不同截面的切片的HE染色图像的照片。
具体实施方式
下面对本发明进行详细说明。
本发明涉及能够从生物组织中高效聚集成体干细胞的组织结构体制造器械，以及能够使用该器械制作的成体干细胞丰富的组织结构体。
本发明例如涉及一种组织结构体制造器械，具有(包含)：
中空部，以及形成所述中空部的框体，
所述框体具有开口部，优选具有从所述中空部连通到所述组织结构体制造器械的外部空间的开口部，
组织结构体具有核心部和稀疏纤维性的成体干细胞聚集组织，所述核心部具有凹部且由纤维性结缔组织构成，所述稀疏纤维性的成体干细胞聚集组织形成在所述凹部且含有III型胶原蛋白和成体干细胞。本发明还涉及使用这种组织结构体制造器械制造的组织结构体。
根据本发明，通过将上述组织结构体制造器械安放在有生物组织材料存在的环境下(例如生物体内)，可以在组织结构体制造器械内聚集细胞，在组织结构体制造器械内诱导形成聚集了成体干细胞的组织结构体。
从安放在有生物组织材料存在的环境下的本发明的组织结构体制造器械的开口部，来自生物组织材料的细胞等进入该器械内的中空部(向该器械的外部空间开口)，在该中空部形成纤维性结缔组织。在组织结构体制造器械的开口部的正下方，产生从该开口部向器械内中空部凹陷的纤维性结缔组织的凹部，并且，具有该凹部且由纤维性结缔组织构成的核心部从面向器械中空部的器械表面向器械内中空部形成，进而，在该凹部内聚集大量成体干细胞，形成成体干细胞聚集组织。将组织结构体制造器械在有生物组织材料存在的环境下安放足以在组织结构体制造器械内的中空部以填补该中空部的形式形成组织(包含纤维性结缔组织和其凹部内的成体干细胞聚集组织)的时间，由此在该器械内形成组织结构体。从得到的组织结构体中的成体干细胞聚集组织，可以容易而高效地回收成体干细胞。本发明是基于本发明人发现的该见解的发明。
更具体地，本发明涉及的组织结构体制造器械具有形成器械内的中空部的框体(例如，由该框体构成)，该框体具有从上述中空部连通到组织结构体制造器械的外部空间的开口部。组织结构体制造器械优选配置为：在安放在有生物组织材料存在的环境下(例如生物体内)时，以从上述框体的表面向上述中空部的内部扩展的形式形成纤维性结缔组织，由此生成具有从上述开口部向上述中空部凹陷的凹部的核心部，并且在上述凹部形成聚集了成体干细胞的稀疏纤维性组织。当在组织结构体制造器械内以填补框体形成的中空部的形式形成组织结构体时，该框体会限定在上述中空部内形成的组织结构体的形状(整体形状、核心部的形状、成体干细胞聚集组织/凹部的位置和深度等)。
在一实施方式中，上述框体可以包含柱状部件和支撑部，例如可以由柱状部件和支撑部构成。该支撑部将柱状部件固定，以保持框体形状从而维持中空部形状。例如，多于一个柱状部件可以在其两端部被支撑部固定。多于一个柱状部件还可以在其中间部被支撑部固定。上述框体优选包含多于一个柱状部件，例如可包含但不限于以下数量的柱状部件：3～50根、4～40根、4～30根、5～30根、3～20根、3～15根、3～10根、4～15根，或5～15根。柱状部件可以具有圆柱形、椭圆柱形、棱柱形、锥台形、麻花形、螺纹形等任意形状。支撑部可以具有圆环形、圆盘形、椭圆环形、椭圆盘形、矩形框形或板状(例如多边形、梯形或不规则形状的板状)等任意形状。上述框体可以具有1个、2个、3个、4个或更多的支撑部。上述框体可以是多于一个柱状部件在其两端部以及视情况而在其中间部(例如中间部的一处或两处以上)被支撑部固定的结构在柱状部件的延伸方向上连接2个以上而成。这种情况下，1个支撑部上可以固定例如但不限于以下数量的柱状部件：3～20根、3～15根、3～10根、4～15根或5～15根。
在一实施方式中，在上述框体中，多于一个柱状部件可以在其两端部以及视情况在其中间部被支撑部固定，并且周向配置在支撑部与支撑部之间的虚拟筒面上(例如圆筒面上、椭圆筒面上或棱筒面上)。这种情况下，支撑部可以为圆环形、圆盘形、椭圆环形、椭圆盘形、矩形框形或板状(例如多边形、梯形或不规则形状的板状)等，但不限于此。多于一个柱状部件既可以在支撑部与支撑部之间的虚拟筒面上等间距配置，也可以不等间距配置。上述框体可以包含在柱状部件的延伸方向上连接的2个以上的结构，每个结构包含在其两端部以及视情况在其中间部被支撑部固定并且周向配置在支撑部与支撑部之间的虚拟筒面上的多于一个柱状部件。这种情况下，1个支撑部上可以固定例如但不限于以下数量的柱状部件：3～20根、3～15根、3～10根、4～15根或5～15根。
在另一实施方式中，上述框体可以包含多于一个柱状部件，例如可以由多于一个柱状部件构成，并且这些柱状部件彼此固定以保持框体的形状。
构成上述框体的柱状部件可以具有至少0.5mm、0.5mm～5mm，例如0.7mm～3mm或0.7mm～1.5mm的直径，但不限于此。
构成上述框体的支撑部可以具有5mm～30mm，例如5mm～25mm或6mm～20mm的直径，但不限于此。
在另一实施方式中，上述框体可以包含网眼形或线圈形等的线状部件，例如可以由线状部件构成。线状部件可以具有0.5mm～5mm，例如0.7mm～3mm或0.7mm～1.5mm的直径，但不限于此。上述框体可以包含线状部件和支撑部，例如可以由线状部件和支撑部构成。该支撑部将线状部件固定，以保持框体形状。
本发明中，如无另外说明，“直径”(一边到另一边的长度)定义为目标部件或区域的截面(一般是宽度方向的截面)中从其两侧相接的两条平行线间的最长距离。需要说明的是，该截面不限于圆形或椭圆形，也可以是多边形、梯形或不规则形状等。
组织结构体制造器械、框体以及它们的构成部件即柱状部件的长度方向的长可以为5mm～100mm，例如15mm～90mm、20mm～80mm、15mm～70mm或20mm～60mm，但不限于此。
组织结构体制造器械、框体和它们的构成部件即柱状部件、支撑部以及线状部件等，优选包含生物相容性材料或由生物相容性材料构成。作为生物相容性材料，可举出但不限于：丙烯酸树脂、硅树脂等树脂；陶瓷；不锈钢；钴铬合金；钛；镍钛等钛合金；铂、金等金属材料等。本发明中此处使用的生物相容性材料优选具有在生物体内至少在组织结构体的制造期间内不会变形程度的刚性。
上述框体可以具有1个、2个、3个或4个以上(例如4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个以上)的从器械中空部连通到组织结构体制造器械的外部空间并在其正下方形成有纤维性结缔组织的凹部的开口部，例如可以具有1～50个、3～50个、4～40个、4～30个、5～30个、3～20个、3～15个、3～10个、4～15个或5～15个开口部。这种开口部优选由柱状部件和支撑部形成，或者由多于一个柱状部件形成。或者，这种开口部也可以由线状部件形成，或由线状部件和支撑部形成。
上述框体的支撑部自身也可以具有将器械内中空部连通到上述器械的外部空间的开口部。例如，当支撑部为圆环形、椭圆环形、矩形框形等时，支撑部可以具有该开口部。
框体的上述开口部只要具有足够的开口宽度以形成纤维性结缔组织/核心部，以及纤维性结缔组织/核心部的凹部和该凹部内的成体干细胞聚集组织即可。本发明中，框体的上述开口部的“开口宽度”定义为该开口部的宽度方向的开口宽度。框体的上述开口部优选具有至少2.5mm的开口宽度，例如可以具有3.0mm以上的开口宽度。在一实施方式中，上述开口部可以具有2.5mm以上28mm以下、2.5mm以上25mm以下、2.5mm以上20mm以下，或3.0mm以上10mm以下的开口宽度。框体的上述开口部的开口宽度在本说明书中也记作开口宽度W。
需要说明的是，关于本发明，术语“长度方向”和“宽度方向”是对任意形状，或具有任意形状的物体使用的。例如，除了长方形或长方体以外，也对包括其他多边形、圆、椭圆、圆柱、棱柱、圆锥、棱锥、锥台等，以及具有这些形状的框体等在内的各种形状或物体使用。在圆、正方形或立方体等部分形状或物体中，“长度方向”和“宽度方向”的长可以相同。
框体的开口部的开口宽度可以在形成开口部的部件(柱状部件、支撑部、线状部件等)上的、定义在开口面积最小的同一面上的位置的开口边缘确定(例如参考图2的10F)。当框体由多于一个柱状部件和支撑部构成，或者由多于一个柱状部件或线状部件构成时，上述开口部的开口宽度也可以计算为包含框体的该开口部的宽度方向的截面上的相邻柱状部件或线状部件之间的最短距离。此时，框体的宽度方向的截面可以为与支撑部平行的截面。当相邻柱状部件或线状部件平行配置时，上述开口部的开口宽度也可以计算为该柱状部件或线状部件之间的单个的最短距离。
或者，除了上述以外，框体的开口部也优选具有能够内接直径2.5mm或超过2.5mm(例如直径3.0mm或超过3.0mm)的圆的开口形状(形状和大小)。框体的上述开口部例如可以具有能够内接直径2.5mm以上28mm以下、2.5mm以上25mm以下、2.5mm以上20mm以下或3.0mm以上10mm以下的圆的开口形状。具有这种开口形状的框体开口部特别适合于形成纤维性结缔组织的凹部以及该凹部内的成体干细胞聚集组织。在此，关于框体的开口部，“能够内接圆的开口形状”是指在该开口部的开口形状(例如矩形或多边形等)的内侧能够在一个以上的点相接和容纳具有规定直径的圆。例如，在具有20mm长边和2.5mm短边的长方形的开口形状的开口部，可以内接直径最大2.5mm的圆。在本发明中，框体的开口部的开口形状可以定在该开口部中开口面积最小的位置，例如可以定在包含上述开口边缘的面(例如平面)上。
在一实施方式中，框体的上述开口部可以具有多边形、矩形、梯形、丸形、圆形或椭圆形等任意形状的开口端。
关于本发明涉及的组织结构体制造器械的框体的上述开口部中的至少一个，各开口边缘的彼此相对的边可以在该边的延伸方向上具有不同大小的开口宽度。根据组织结构体制造器械的该配置，一个开口部可以包含不同大小的开口宽度。
框体形成的中空部优选具有足够深度以形成核心部。在框体中，中空部的从上述开口部的深度至少可以为2mm。中空部的从上述开口部的深度例如可以为2mm以上30mm以下、2mm以上26mm以下，或2mm以上12mm以下。框体中的中空部的从上述开口部的深度(本说明书中记作深度D)可以确定为框体的宽度方向的截面上的、从连接单个开口部的开口边缘上的点的直线的中点到中空部最深点的距离(图2)。在框体中，当多于一个柱状部件在其两端部以及视情况在其中间部被支撑部固定，并且周向(优选以环绕虚拟筒面上的周围的形式)配置在夹在支撑部与支撑部之间的虚拟筒面上(例如与虚拟筒面上内接或外接)时，可以将该筒面的宽度方向的截面的中心点作为中空部的最深点。宽度方向的截面的中心点可以是与在虚拟筒面上周向配置的各柱状部件的距离相等的点。宽度方向的截面的中心点可以是虚拟筒面的圆形截面的中心。本发明涉及的组织结构体制造器械可以具有至少一个深度D为2mm以上(优选在该开口部的深度D恒定的情况下)或深度D的最大值为2mm以上(在该开口部的深度D不恒定的情况下)的开口部。
需要说明的是，本发明的组织结构体制造器械的框体所具有的开口部中的至少一个是上述开口部即可，进一步优选为框体所具有的所有开口部都是上述开口部。
在本发明涉及的组织结构体制造器械的框体中，多于一个上述开口部也可以隔着柱状部件而彼此相邻地存在。多于一个上述开口部也可以沿框体的周向配置。或者，多于一个上述开口部也可以沿框体的轴向配置。再或者，多于一个上述开口部也可以分别沿框体的周向和轴向配置。根据这种开口部的配置，可以提高在组织结构体的外表面形成的、用于聚集成体干细胞的凹部的密度；在优选实施方式中，也可以提高成体干细胞的聚集效率，进而增加从一个聚集器械采集的成体干细胞的细胞数量。当使用这种组织结构体制造器械时，制造的组织结构体的核心部可以具有由凹部周缘部划分的多于一个凹部，此时，各凹部将相隔至少一个凹部周缘部而与其他凹部相邻。
本发明的组织结构体制造器械优选在框体形成的中空部内不具有棒状体等其他部件，或者，优选配置为在该中空部内容纳有棒状体等其他部件的状态下，不安放在有生物组织材料存在的环境下。
在一实施方式中，本发明涉及的组织结构体制造器械如图1所示。如图1所示，组织结构体制造器械10(以下也将本发明涉及的组织结构体制造器械称作器械10)具有3个圆环形的支撑部11。各支撑部11可以含有丙烯酸树脂或硅树脂等具有生物相容性的树脂，或由这些树脂构成，但不限于此。3个支撑部11具有2个第一支撑部11A，以及被2个第一支撑部11A夹在中间的1个第二支撑部11B，它们沿着一个轴向Ax排列。1个第一支撑部11A和第二支撑部11B位于一个虚拟的圆筒面S的两端部。2个第一支撑部11A具有在轴向Ax上连通器械外与器械内的贯通孔11H。第二支撑部11B具有在轴向Ax上连通一个圆筒面S的内部与另一个圆筒面S的内部的贯通孔11H。当器械10埋设和安放在有生物组织材料存在的环境下，例如生物体内的生物组织中时，以成纤维细胞为代表的细胞等会从这些贯通孔11H向器械内的中空部流入。
1个第一支撑部11A和第二支撑部11B将3根圆柱形的柱状部件13固定。3根柱状部件13在各圆筒面S上在其周向Ci上等间隔配置(等配)，与第一支撑部11A和第二支撑部11B一起划分和形成3个开口部10H。柱状部件13、2个第一支撑部11A和第二支撑部11B构成了器械10的框体。在器械10埋设在有生物组织材料存在的环境下，例如生物体内的生物组织中之前，柱状部件13和第一支撑部11A以及第二支撑部11B所围成的空间为中空部10S，各开口部10H从器械内的中空部10S连通到器械的外部空间。当器械10埋设在有生物组织材料存在的环境下，例如生物体内的生物组织中时，以成纤维细胞为代表的细胞等会从生物组织经由各开口部10H而向器械内的中空部10S流入。
图2表示包含图1所示的器械的上述开口部的宽度方向的截面的模式图。如图2所示，可以是在圆筒面S的周向上相邻的柱状部件13的最短距离的、在该截面上连接开口边缘10F上的点的直线的长，相当于开口宽度W。当相邻的柱状部件13平行时，在轴向Ax上开口宽度W恒定。当相邻的柱状部件13不平行时，在轴向Ax的各部位上开口宽度W各不相同。器械10的上述开口部可以具有开口宽度W为2.5mm以上，例如2.5mm以上28mm以下、2.5mm以上25mm以下、2.5mm以上20.0mm以下，或3.0mm以上10mm以下的开口形状。从进一步提高成体干细胞聚集效率的观点看，横跨器械10的整个轴向Ax，开口宽度W优选至少为2.5mm。或者，除了上述以外，器械10的上述开口部也优选具有能够内接直径2.5mm以上28mm以下、2.5mm以上25mm以下、2.5mm以上20mm以下，或3.0mm以上10mm以下的圆的开口形状。
图2所示的截面上的圆筒面S的中心(中心点)Ct与连接位于开口边缘10F上的点的直线的中点之间的距离，相当于中空部10S从开口部10H的深度D。器械10可以具有深度D或深度最大值至少为2mm，例如2mm以上30mm以下、2mm以上26mm以下，或2mm以上12mm以下的开口部10H。
埋设在有生物组织材料存在的环境下，例如生物体内的生物组织中的组织结构体制造器械10中，会像图3概述的那样形成组织，但本发明不限于该理论。如图3A所示，在器械10埋设在有生物组织材料存在的环境下，例如生物体内的生物组织中时，生物组织21会位于中空部10S的外侧。接着，如图3B所示，来自生物组织的液体成分会通过开口部10H和贯通孔11H，侵入到中空部10S中。器械10埋设到生物组织中之后，经过适当的时间，例如3小时以上6小时以下后，器械10的中空部10S会被来自生物组织的液体成分填满。如图3C所示，当器械10的中空部10S被液体成分填满时，生物组织内的成纤维细胞22C会通过开口部10H和贯通孔11H，侵入到中空部10S中。侵入中空部10S的成纤维细胞22C会从柱状部件13的表面，开始向着中空部10S的内部形成纤维性结缔组织22。
如图3D所示，在面向柱状部件13的中空部10S的表面上开始形成的纤维性结缔组织，会向中空部10S的内部扩展生长。然后，从各柱状部件13的表面扩展的纤维性结缔组织22在中空部10S的内部相互连接，由此，从开口部10H向中空部10S凹陷的凹部22H在纤维性结缔组织22的表面形成。需要说明的是，纤维性结缔组织22也会从组织结构体制造器械10的构成元件即支撑部11，例如图2所示器械的第一支撑部11A和第二支撑部11B的表面，向中空部10S的内部形成并生长，并与从柱状部件13的表面扩展的纤维性结缔组织22连接。从各柱状部件13和支撑部11(例如图2所示器械的第一支撑部11A和第二支撑部11B)的表面扩展形成的纤维性结缔组织22相互连接，从而形成核心部25。即，由纤维性结缔组织22构成的核心部25在其外表面具有凹部。随着具有凹部的纤维性结缔组织22和核心部25的不断形成，生物组织所包含的成体干细胞23C会通过开口部10H向凹部22H移动。将埋设在有生物组织材料存在的环境下，例如生物体内的生物组织中的组织结构体制造器械10安放适当期间，由此在凹部会形成包含成体干细胞23C的成体干细胞聚集组织(也称作口袋部)。
在组织结构体制造器械10的另一实施方式中，如图4A所示，器械10可以具有：柱状部件13；外径(外侧圆的直径)为6mm的圆环形的2个第一支撑部11A；被该2个第一支撑部11A夹在中间配置的、外径为6mm的圆环形的1个第二支撑部11B。在上段的1个第一支撑部11A和第二支撑部11B之间，固定有3根直径1mm的柱状部件13(长25mm)，使得开口宽度W为3.0mm，深度D为2mm。在下段的第一支撑部11A和第二支撑部11B之间，固定有4根直径1mm的柱状部件13(长25mm)，使得开口宽度W为2.5mm，深度D为2.2mm。在图4A所示的该器械10中，由上段的第一支撑部11A、第二支撑部11B和柱状部件13形成的各开口部，具有最大能够内接直径3.0mm(与开口宽度W相等)的圆的开口形状；由下段的第一支撑部11A、第二支撑部11B和柱状部件13形成的各开口部，具有最大能够内接直径2.5mm(与开口宽度W相等)的圆的开口形状。
在组织结构体制造器械的再一实施方式中，如图4B所示，器械10可以具有：柱状部件13；外径为11mm的圆环形的2个第一支撑部11A；被该2个第一支撑部11A夹在中间配置的、外径为11mm的圆环形的2个第二支撑部11B。在上段的1个第一支撑部11A和第二支撑部11B之间，固定有6根直径1mm的柱状部件13(长20mm)，使得开口宽度W为4.0mm，深度D为4.6mm。在下段的第一支撑部11A和第二支撑部11B之间，支撑有8根直径1mm的柱状部件13(长20mm)，使得开口宽度W为3.0mm，深度D为4.8mm。在中段的2个第二支撑部11B之间，固定有4根直径1mm的柱状部件13(长20mm)，使得开口宽度W为6.0mm，深度D为4.0mm。在图4B所示的该器械10中，由上段的第一支撑部11A、第二支撑部11B和柱状部件13形成的各开口部，具有最大能够内接直径4.0mm(与开口宽度W相等)的圆的开口形状；由下段的第一支撑部11A、第二支撑部11B和柱状部件13形成的各开口部，具有最大能够内接直径3.0mm(与开口宽度W相等)的圆的开口形状；由中段的2个第二支撑部11B和柱状部件13形成的各开口部，具有最大能够内接直径6.0mm(与开口宽度W相等)的圆的开口形状。
在组织结构体制造器械的再一实施方式中，如图4C所示，器械10可以具有：柱状部件13；外径为16mm的圆环形的2个第一支撑部11A；被该2个第一支撑部11A夹在中间配置的、外径为16mm的圆环形的2个第二支撑部11B。在上段的1个第一支撑部11A和第二支撑部11B之间，固定有8根直径1mm的柱状部件13(长20mm)，使得开口宽度W为5.0mm，深度D为7.1mm。在下段的第一支撑部11A和第二支撑部11B之间，固定有10根直径1mm的柱状部件13(长20mm)，使得开口宽度W为3.5mm，深度D为7.3mm。在中段的2个第二支撑部11B之间，固定有6根直径1mm的柱状部件13(长20mm)，使得开口宽度W为6.5mm，深度D为6.8mm。在图4C所示的该器械10中，由上段的第一支撑部11A、第二支撑部11B和柱状部件13形成的各开口部，具有最大能够内接直径5.0mm(与开口宽度W相等)的圆的开口形状；由下段的第一支撑部11A、第二支撑部11B和柱状部件13形成的各开口部，具有最大能够内接直径3.5mm(与开口宽度W相等)的圆的开口形状；由中段的2个第二支撑部11B和柱状部件13形成的各开口部，具有最大能够内接直径6.5mm(与开口宽度W相等)的圆的开口形状。
在组织结构体制造器械10的再一实施方式中，如图4D所示，器械10可以具有：柱状部件13；外径为11mm的圆环形的2个第一支撑部11A；被该2个第一支撑部11A夹在中间配置的、外径为10mm的圆环形的1个第二支撑部11B。在2个第一支撑部11A之间，固定有6根直径1mm的柱状部件13(长60mm)，使得开口宽度W为4.0mm，深度D为4.6mm，这些柱状部件13在其长度方向的大致中央还被第二支撑部11B固定。在图4D所示的该器械10中，由第一支撑部11A、第二支撑部11B和柱状部件13形成的各开口部，具有最大能够内接直径4.0mm的圆的开口形状。
在组织结构体制造器械的再一实施方式中，如图5A所示，器械10可以具有柱状部件13，以及外径为11mm的圆环形的2个第一支撑部11A。在2个第一支撑部11A之间，从一个第一支撑部11A向另一个第一支撑部11A，以开口宽度W从1.0mm到5.0mm连续变化，且深度D从5.0mm到4.3mm连续变化的形式，固定有8根直径1mm的柱状部件13。开口宽度W在器械10的与支撑部11A平行的宽度方向的截面上测定。图5A所示的器械10的长(长度方向的大小)为40mm。
在组织结构体制造器械的再一实施方式中，如图5B所示，器械10可以具有柱状部件13，以及外径为16mm的圆环形的2个第一支撑部11A。在2个第一支撑部11A之间，从一个第一支撑部11A向另一个第一支撑部11A，以开口宽度W从1.0mm到8.0mm连续变化，且深度D从7.5mm到6.3mm连续变化的形式，固定有8根直径1mm的柱状部件13。开口宽度W在器械10的与支撑部11A平行的宽度方向的截面上测定。图5B所示的器械10的长(长度方向的大小)为60mm。
在组织结构体制造器械的再一实施方式中，如图6A所示，器械10可以具有由作为支撑部一例的大矩形框11C、作为支撑部一例的小矩形框11D和柱状部件13(直径1mm)构成的大致多面体形状。大矩形框11C具有(垂直)20mm×(水平)15mm的大小[均为内部尺寸，矩形框的厚度为1mm，外部尺寸为(垂直)22mm×(水平)17mm]；小矩形框11D具有(垂直)3mm×(水平)15mm的大小[均为内部尺寸，矩形框的厚度为1mm，外部尺寸为(垂直)5mm×(水平)17mm]。图6A所示的器械10具有固定在大矩形框11C上的4个顶点部和小矩形框11D上的4个顶点部的4根柱状部件13。另外，图6A所示的器械10还具有连接大矩形框11C上的1条长边的中点和小矩形框11D上的1条短边的中点的1根柱状部件13。
图6A所示的器械10具有2个梯形的开口部10H，该开口部10H由大矩形框11C上的1条长边、小矩形框11D上的1条短边，以及与这些边连接的3根柱状部件13(与大矩形框11C和小矩形框11D成直角连接的最短的柱状部件13的长为55mm)划分而形成。图6A所示的器械10具有由大矩形框11C上的1条长边、小矩形框11D上的1条短边，以及与这些边连接的2根柱状部件13划分而形成的1个梯形的开口部10H。另外，图6A所示的器械10还具有由大矩形框11C上的1条短边、小矩形框11D上的1条长边，以及与这些边连接的2根柱状部件13划分而形成的长方形的开口部10H。图6A所示的器械10还具有分别由大矩形框11C的2条长边和2条短边，以及小矩形框11D的2条长边和2条短边划分而形成的2个贯通开口部12H。图6A所示的器械10中，开口宽度为1.0mm至20.0mm，深度D为2.0mm至10.5mm。开口宽度W在器械10的与大矩形框11C的长边平行的宽度方向的截面上测定。
如图6B所示，器械10与图6A所示的器械10相同，可以具有由作为支撑部一例的大矩形框11C、作为支撑部一例的小矩形框11D和柱状部件13(直径1mm)构成的大致多面体形状。大矩形框11C具有(垂直)20mm×(水平)15mm的大小[均为内部尺寸，矩形框的厚度为1mm，外部尺寸为(垂直)22mm×(水平)17mm]；小矩形框11D具有(垂直)3mm×(水平)15mm的大小[均为内部尺寸，矩形框的厚度为1mm，外部尺寸为(垂直)5mm×(水平)17mm]。图6B所示的器械10具有固定在大矩形框11C上的2个顶点部和小矩形框11D上的2个顶点部的2根柱状部件13。另外，图6B所示的器械10通过1个具有狭缝26S(宽1mm)的板状体26，将大矩形框11C上的1条短边和小矩形框11D上的1条长边连接。
图6B所示的器械10具有由大矩形框11C上的1条长边、小矩形框11D上的1条短边，以及与这些边连接的2根柱状部件13划分而形成的梯形的开口部10H。图6B所示的器械10还具有由大矩形框11C上的1条短边、小矩形框11D上的1条长边，以及与这些边连接的2根柱状部件13划分而形成的长方形的开口部10H。另外，图6B所示的器械10具有由大矩形框11C上的1条长边、小矩形框11D上的1条短边、连接这些边的板状体26的边缘，以及柱状部件13划分而形成的2个梯形的开口部10H。图6B所示的器械10还具有分别由大矩形框11C的2条长边和2条短边，以及小矩形框11D的2条长边和2条短边划分而形成的2个贯通开口部12H。图6B所示的器械10中，开口宽度为1.0mm至20.0mm，深度D为2.0mm至20.5mm。开口宽度W在器械10的与大矩形框11C的长边平行的宽度方向的截面上测定。
如图6C所示，器械10可以具有由作为支撑部一例的大矩形框11C、作为支撑部一例的小矩形框11D、作为支撑部一例的中矩形框11E和柱状部件13(直径1mm)构成的大致多面体形状。大矩形框11C具有(垂直)20mm×(水平)15mm的大小[均为内部尺寸，矩形框的厚度为1mm，外部尺寸为(垂直)22mm×(水平)17mm]；中矩形框11E具有(垂直)15mm×(水平)15mm的大小[均为内部尺寸，矩形框的厚度为1mm，外部尺寸为(垂直)17mm×(水平)17mm]；小矩形框11D具有(垂直)3mm×(水平)15mm的大小[均为内部尺寸，矩形框的厚度为1mm，外部尺寸为(垂直)5mm×(水平)17mm]。图6C所示的器械10具有固定在大矩形框11C上的4个顶点部和小矩形框11D上的4个顶点部的4根柱状部件13，4根柱状部件13还用中矩形框11E固定。图6C所示的器械10还具有连接大矩形框11C上的1条长边的中点和小矩形框11D上的1条短边的中点、且中间部再用中矩形框11E固定的1根柱状部件13。
图6C所示的器械10具有由大矩形框11C上的1条短边、中矩形框11E上的1条边，以及与这些边连接的2根柱状部件13划分而形成的长方形的开口部10H。图6C所示的器械10具有由中矩形框11E上的1条边、小矩形框11D上的1条长边，以及与这些边连接的2根柱状部件13划分而形成的长方形的开口部10H。另外，图6C所示的器械10具有由大矩形框11C上的1条长边、中矩形框11E上的1条边，以及与这些边连接的3根柱状部件13划分而形成的2个梯形的开口部10H。图6C所示的器械10具有由中矩形框11E上的1条边、小矩形框11D上的1条短边，以及与这些边连接的3根柱状部件13划分而形成的2个梯形的开口部10H。图6C所示的器械10具有由大矩形框11C上的1条长边、中矩形框11E上的1条边，以及与这些边连接的2根柱状部件13划分而形成的长方形的开口部10H。图6C所示的器械10具有由中矩形框11E上的1条边、小矩形框11D上的1条短边，以及与这些边连接的2根柱状部件13划分而形成的长方形的开口部10H。图6C所示的器械10还具有分别由大矩形框11C的2条长边和2条短边，以及小矩形框11D的2条长边和2条短边划分而形成的2个贯通开口部12H。图6C所示的器械10中，开口宽度为1.0mm至20.0mm，深度D为2.0mm至10.5mm。开口宽度W在器械10的与大矩形框11C的长边平行的宽度方向的截面上测定。
开口部10H的位置不限于在器械10的周向和/或轴向Ax上排列的位置，也可以设置成在器械10的长度方向上延伸的螺旋上周期性固定的位置。另外，开口部10H的位置不限于每个开口部10H在规定方向上重复的配置，例如也可以是多于一个开口部10H构成一个开口组，多于一个开口组在规定方向上重复的配置。
在组织结构体制造器械的再一实施方式中，器械10或框体的形状没有特别限制，可以是棒状，也可以是大致多面体形(例如立方体形、长方体形等)，还可以是大致球形或大致半球形。器械10或框体的形状不限于直线棒状，例如也可以是曲线形。
在组织结构体制造器械的再一实施方式中，如图7所示，构成器械10的框体可以是线圈形，且可以是开口边缘10F在线圈的周向上连接的1个以上的螺旋形。可以将开口宽度W测定为卷绕成线圈形的线状部件16的相邻圆周部分间的最短距离。器械10优选具有开口宽度W至少为2.5mm，例如2.5mm以上28mm以下、2.5mm以上25mm以下、2.5mm以上20mm以下，或3.0mm以上10mm以下的开口形状的开口部。另外，线圈形的器械10的中心轴与卷绕成线圈形的线状部件16的最短距离也可以计算为深度D，器械10也可以具有深度D至少为2mm，例如2mm以上30mm以下、2mm以上26mm以下，或2mm以上12mm以下的区域。
在组织结构体制造器械的再一实施方式中，如图8所示，器械10例如也可以由具有中空部的立方体形或长方体形的框体构成。立方体形或长方体形的侧面17具有开口部10H，可以将开口宽度W测定为构成侧面17的相邻柱状部件之间的最短距离。器械10或框体优选具有至少1个开口宽度W为至少2.5mm，例如2.5mm以上28mm以下、2.5mm以上25mm以下、2.5mm以上20mm以下，或3.0mm以上10mm以下的开口部。另外，也可以将深度D计算为立方体形或长方体形的器械10或框体的中心点与器械10的侧面的最短距离。器械10也可以具有深度D至少为2mm，例如2mm以上30mm以下、2mm以上26mm以下，或2mm以上12mm以下的区域。
器械10的框体所具有的形状例如可以是图8所示的立方体形或长方体形的结构在一个面上连接的形状。
在组织结构体制造器械的再一实施方式中，器械10也可以是支架形。图9所示的支架形的器械10可以具有能够扩张和收缩的网眼形的筒形态，该网眼形成开口部10H，两端具有用于插入球囊的端部开口部14H。本发明例如可以将图9所示的支架形的器械用作组织结构体制造器械。在典型的实施方式中，在有生物组织材料存在的环境下，例如生物体内的生物组织中，插入挂载有收拢的支架的球囊导管，在皮下施加水压使球囊扩张，扩大支架直径，然后解除水压，使球囊收缩并拔出球囊，由此可以容易地埋设支架。
本发明也涉及使用本发明涉及的组织结构体制造器械制造成体干细胞聚集的组织结构体的方法。上述使用组织结构体制造器械制造成体干细胞聚集的组织结构体的方法包括：在有生物组织材料存在的环境下，例如生物体内或生物组织中安放该组织结构体制造器械；更具体地，包括：在有生物组织材料存在的环境下，例如生物体内或生物组织中配置(例如埋设)该组织结构体制造器械，并安放一定期间。有生物组织材料存在的环境，例如生物体内的生物组织或分离的生物组织可以包含成纤维细胞。生物组织可以是外胚层组织、中胚层组织或内胚层组织。安放组织结构体制造器械的生物组织可以是在健康状态下有成体干细胞存在的组织，也可以是像受伤部或缺失部那样需要进行组织修复的有成体干细胞存在的组织。有成纤维细胞存在的生物组织的一个优选示例是皮下组织。
组织结构体制造器械可以埋设并安放在生物体内的生物组织中。或者，组织结构体制造器械也可以安放在模拟生物体内的生物组织的人工环境，即包含从生物体内取出的生物组织的体外培养体系，或者模拟生物体内的生物组织而在生物体外构建的环境下。作为模拟生物体内的生物组织的人工环境，可以举出通过分离的细胞或组织的三维培养而制作的人造组织或人造器官等。
在将组织结构体制造器械埋设安放在生物体内的生物组织中时，根据需要在麻醉状态下切开生物体或生物组织，形成插入口。然后在插入口中插入组织结构体制造器械。埋设好组织结构体制造器械后，将切开的伤口缝合。
配置(例如埋设)组织结构体制造器械的生物组织可以是能够成为成体干细胞获得来源的任何动物的组织。组织结构体制造器械可以配置(例如埋设)安放在任何动物的体内。作为这些动物，例如可举出但不限于：包括人、猴、黑猩猩等灵长类动物，以及狗、猫、牛、猪、马、山羊、绵羊、大鼠、小鼠等的哺乳动物；以及鸟类、鱼类、两栖类等动物。在一实施方式中，这些动物可以是人，也可以是非人动物，例如非人哺乳动物。在一实施方式中，可以将组织结构体制造器械安放在预备移植从使用组织结构体制造器械制造的组织结构体中回收的成体干细胞或从该成体干细胞分化的细胞的动物个体(人或非人动物等作为上述动物的受试者个体)，或其遗传学上近缘的个体的生物体内的生物组织或从生物体分离的生物组织中。由此，可以移植来自自身或来自近缘个体的成体干细胞。本发明中，埋设组织结构体制造器械的生物体内的部位没有特别限制，可以是腹部、胸部、肩部、背部、四肢或腹腔内等。
配置在有生物组织材料存在的环境下的组织结构体制造器械一直安放到在器械内中空部形成具有凹部且由纤维性结缔组织构成的核心部，以及在该凹部内聚集了成体干细胞的组织。
组织结构体制造器械安放在有生物组织材料存在的环境下，例如生物体内的生物组织或分离的生物组织中的时间，优选为不会在生物组织引起过度炎症且能够聚集足够的个体干细胞的期间，可以根据埋设部位、活体生物种类、器械的大小等适当设定。该安放时间一般可以为5天～4个月，优选为1周(7天)以上3个月以下，例如可以是1周以上2个月以下、1周以上5周以下、9天以上5周以下、9天以上4周以下、2周以上5周以下、2周以上4周以下、2周以上3周以下，或3周以上5周以下。
安放期间过后，从有生物组织材料存在的环境下取出组织结构体制造器械。在取出的组织结构体制造器械内，形成了具有含有成体干细胞聚集的组织的凹部、且具有含有纤维性结缔组织的核心部的组织结构体。
在从生物体中取出器械10时，根据需要在麻醉状态下切开组织结构体制造器械的埋设部位。从切开部取出组织结构体制造器械之后，优选对伤口实施缝合。
如此从有生物组织材料存在的环境下，例如生物体内的生物组织中取出组织结构体制造器械，由此可以分离组织结构体。也可以通过从取出的组织结构体制造器械中分离组织结构体，来回收组织结构体。如此，可以使用组织结构体制造器械制造组织结构体。
本发明也提供可以用上述组织结构体制造器械制造的本发明涉及的组织结构体。更具体地，本发明涉及具有核心部和稀疏纤维性的组织(成体干细胞聚集组织)的组织结构体，该核心部具有凹部且由纤维性结缔组织构成，该稀疏纤维性的组织形成在该凹部且含有III型胶原蛋白和成体干细胞。
本发明中，构成组织结构体的核心部25的纤维性结缔组织22是以胶原蛋白纤维和成纤维细胞为主要成分且纤维密度高的强韧组织。本发明中的构成核心部的纤维性结缔组织也可称为致密结缔组织，与脂肪组织或疏松结缔组织不同。本发明中的构成核心部的纤维性结缔组织优选主要含有I型胶原蛋白作为胶原蛋白。另一方面，本发明核心部中的III型胶原蛋白的含量一般较少，特别是其中心部，只有极少的III型胶原蛋白存在。在优选实施方式中，本发明核心部中的总胶原蛋白中的I型胶原蛋白的比例为65重量％～90重量％左右，例如为70重量％～85重量％左右；III型胶原蛋白的比例为5重量％～30重量％左右，例如为10重量％～25重量％左右(例如，图12A和图12B)。在优选实施方式中，在本发明中由纤维性结缔组织构成的核心部中，在凹部附近可以存在成体干细胞，而远离凹部的区域(特别是核心部的中心部)则完全或大致不存在成体干细胞。
另一方面，在凹部形成的成体干细胞聚集组织23(口袋部)是含有成体干细胞，特别是成体干细胞23C富集的稀疏纤维性组织。本发明中在凹部形成的成体干细胞聚集组织含有III型胶原蛋白，该III型胶原蛋白含量多于核心部的III型胶原蛋白含量。在凹部形成的成体干细胞聚集组织也可以含有成纤维细胞、血管内皮细胞等其他细胞，还可以含有其他种类的胶原蛋白或其他物质。在优选实施方式中，本发明的成体干细胞聚集组织中的总胶原蛋白中的I型胶原蛋白的比例为30重量％～75重量％左右，例如为35重量％～65重量％左右；总胶原蛋白中的III型胶原蛋白的比例为20重量％～65重量％左右，例如为30重量％～60重量％左右(例如，图12C)。在凹部形成的成体干细胞聚集组织中的纤维量较少，且纤维随机取向。在凹部形成的成体干细胞聚集组织23由于只稀疏地含有胶原蛋白纤维，因此是稀疏纤维性的软组织。需要说明的是，形成有成体干细胞聚集组织23的凹部通常存在于核心部的外表面。
在优选实施方式中，在本发明的组织结构体的凹部形成的成体干细胞聚集组织(口袋部)中的总胶原蛋白中的III型胶原蛋白的比例，高于该组织结构体的核心部中的总胶原蛋白中的III型胶原蛋白的比例。在一实施方式中，前者(口袋部中的III型胶原蛋白的比例)可以为30重量％～60重量％，后者(核心部中的III型胶原蛋白的比例)可以为10重量％～25重量％。
在优选实施方式中，在本发明的组织结构体的凹部形成的成体干细胞聚集组织(口袋部)中的总胶原蛋白中的I型胶原蛋白的比例，低于该组织结构体的核心部中的总胶原蛋白中的I型胶原蛋白的比例。在一实施方式中，前者(口袋部中的I型胶原蛋白的比例)可以为35重量％～65重量％，后者(核心部中的I型胶原蛋白的比例)可以为70重量％～85重量％。
本发明涉及的组织结构体，特别是核心部和成体干细胞聚集组织实质上不含弹性纤维。本发明中，“实质上不含弹性纤维”是指通过Elastica van Gieson(EVG)染色完全检测不到或者实质上检测不到。
本发明涉及的组织结构体在组织结构体制造器械的中空部形成时，由于会以填补器械内中空部的形式形成，因此会变成沿着器具内中空部的形状的形状。例如，当使用图4D所示的组织结构体制造器械制造组织结构体时，由纤维性结缔组织构成的核心部按照柱状部件13的配置，从组织结构体的中心部向6根柱状部件13的表面放射状延伸，并且在柱状部件13与柱状部件13之间的各开口部的正下方各形成一个凹部(合计6个凹部)，在该6个凹部中分别形成成体干细胞聚集组织，如图11的组织结构体截面照片所示。因此，本发明涉及的组织结构体的形状由形成中空部的框体来限定。即，本发明涉及的组织结构体通过组织结构体制造器械来成型。
本发明中由纤维性结缔组织构成的“核心部”是指组织结构体的核心，用来支撑在其凹部形成的成体干细胞聚集组织。在优选实施方式中，本发明的核心部从组织结构体的中心部向组织结构体的最外面连续扩展。本发明中，例如当组织结构体为棒状时，组织结构体的“中心部”是指组织结构体的中心轴(长度方向中心轴)的全长或者一部分和/或其周向附近的区域；该中心轴是指连接组织结构体的宽度方向的各截面(与长度方向正交的截面)的中心点(几何中心)的线。或者，例如当组织结构体为大致多面体形时，本发明中的组织结构体的“中心部”是指组织结构体的中心轴(长度方向中心轴)的全长或者一部分和/或其周向附近的区域；该中心轴是指连接组织结构体的宽度方向的各截面的中心点(几何中心)的线。
本发明涉及的组织结构体的核心部优选具有至少2.5mm的直径。核心部的“直径”如上述定义所述，确定为相对于核心部的宽度方向的截面，从两侧相接的两条平行线之间的最长距离。典型地，核心部的直径可以是核心部的宽度方向的截面上的、相隔核心部的中心部而存在于相对侧的2个凹部周缘部24的端部24E(图22)之间的最长距离
在一实施方式中，本发明涉及的组织结构体或其核心部可以是实心的，也可以不是实心的。关于组织结构体或其核心部，“实心”是指到组织结构体或其核心部的中心部为止充满了组织。需要说明的是，在从安放在有生物组织材料存在的环境下之后的组织结构体制造器械内取出的组织结构体中，柱状部件的外侧有时也会形成薄组织膜，但这种薄组织膜的存在并不意味着本发明涉及的组织结构体或其核心部不是实心的。
本发明的组织结构体在核心部具有在其内部形成有成体干细胞聚集组织的至少一个凹部，优选具有2个以上，更优选可以具有3个以上的该凹部。本发明的组织结构体在核心部例如可以具有4、5、6、7、8、9或10个以上的形成有成体干细胞聚集组织的凹部。本发明的组织结构体的核心部所具有的、形成有成体干细胞聚集组织的凹部，在每个组织结构体中，例如可以是1～50、3～50、4～40、4～30、5～30、3～20、3～15、3～10、4～15，或5～15个。凹部由纤维性结缔组织形成。典型地，核心部中的各凹部的内表面配置为大致曲面形(例如研钵形)。
在本发明的组织结构体中，形成有成体干细胞聚集组织的凹部优选但不限于具有至少2.5mm的开口宽度WW。凹部的开口宽度WW可以视为与其组织结构体的制造所使用的组织结构体制造器械的框体的开口部的开口宽度W相同而计算。或者，本发明的组织结构体中的凹部的开口宽度WW在取出组织结构体制造器械之后的组织结构体的宽度方向的截面上，可以确定为：在组织结构体制造器械的框体(例如柱状部件、支撑部、线状部件等)的周围形成的凹部周缘部24的、框体(例如柱状部件、支撑部、线状部件等)表面上的端部(对应于框体开口部的开口边缘)之间的最短距离。在本发明的组织结构体中，核心部的上述凹部优选具有开口宽度WW为2.5mm以上，例如2.5mm以上28mm以下、2.5mm以上25mm以下、2.5mm以上20.0mm以下，或3.0mm以上10mm以下的开口形状。
或者，除了上述以外，本发明的组织结构体的核心部的、形成有成体干细胞聚集组织的凹部也优选具有能够内接直径2.5mm或超过2.5mm(例如直径3.0mm或超过3.0mm)的圆的开口形状(形态和大小)。上述凹部的开口例如可以具有能够内接直径2.5mm以上28mm以下、2.5mm以上25mm以下、2.5mm以上20mm以下，或3.0mm以上10mm以下的圆的形状和大小。具有这种形状和大小的上述凹部的开口，对应于特别适合于形成纤维性结缔组织的凹部以及该凹部内的成体干细胞聚集组织的框体的开口部的开口形状。在此，关于本发明的组织结构体的核心部的凹部的开口，“能够内接圆”是指在该开口的开口形状(例如矩形或多边形)的内侧，能够在该开口的一个以上的点相接和容纳具有规定直径的圆。例如，在20mm长边和2.5mm短边的长方形的开口形状，可以内接直径最大2.5mm的圆。
在一实施方式中，本发明的组织结构体中，纤维性结缔组织或核心部可以具有由凹部周缘部划分的多于一个凹部。
在一实施方式中，本发明的组织结构体的纤维性结缔组织或核心部的外表面，可以由多于一个凹部和多于一个凹部周缘部构成。
本发明涉及的组织结构体可以具有棒状(例如大致圆柱形或大致多棱柱形等)、大致多面体形、大致锥台形、大致球形等任意形状。在一实施方式中，本发明的组织结构体的形状为棒状，多于一个上述凹部可以沿其周向配置。在另一实施方式中，本发明的组织结构体的形状为棒状，多于一个上述凹部也可以沿其轴向配置。在另一实施方式中，本发明的组织结构体的形状为棒状，多于一个上述凹部也可以沿其轴向和周向配置。
在再一实施方式中，本发明的组织结构体的形状为大致多面体形，多于一个上述凹部可以位于大致多面体的不同面。
本发明的组织结构体的形状优选为非管状，还优选为非片状。
本发明的组织结构体具有在核心部的凹部形成的稀疏纤维性组织。在本发明的组织结构体的凹部形成的该组织中聚集有成体干细胞(成体干细胞聚集组织)。成体干细胞聚集组织所含有的成体干细胞优选包括间充质干细胞和多能干细胞中的至少一种，进一步优选同时包括间充质干细胞和多能干细胞。成体干细胞聚集组织可以含有表达干细胞标志物的干细胞，例如表达至少一个多能干细胞标志物的多能干细胞和/或表达至少一个间充质干细胞标志物的间充质干细胞。成体干细胞聚集组织优选含有同时表达多能干细胞标志物SSEA4和SSEA3的多能干细胞。成体干细胞聚集组织还可以含有表达SSEA3和SSEA4中任一种标志物的干细胞，例如多能干细胞。成体干细胞聚集组织还可以含有表达间充质干细胞标志物CD90和CD105的二者或其中一种的间充质干细胞。成体干细胞聚集组织还可以含有表达间充质干细胞标志物CD90，或CD90和SSEA3二者的干细胞。成体干细胞聚集组织还可以含有表达间充质干细胞标志物CD105，或CD105和SSEA3二者的干细胞。成体干细胞聚集组织还可以含有表达生长因子标志物VEGF，或VEGF和SSEA3二者的干细胞。这种干细胞是具有高血管生成能力的干细胞。成体干细胞聚集组织还可以含有表达生长因子标志物HGF的干细胞。本发明的组织结构体的成体干细胞聚集组织除了上述标志物以外，或者作为上述标志物的替代，也可以含有表达不同标志物的成体干细胞，例如多能干细胞、间充质干细胞。
在优选实施方式中，本发明的组织结构体相对于其含有的全部细胞数，可以含有1％以上、5％以上、10％以上，或30％以上，以及，60％以下、50％以下、40％以下，或30％以下的比例，例如1％～60％、5％～40％、5％～30％，或5％～20％的比例(基于细胞数的干细胞比例)的成体干细胞(包括间充质干细胞和多能干细胞)。
在优选实施方式中，本发明的成体干细胞聚集组织相对于其含有的全部细胞数，可以含有20％以上、30％以上或50％以上，以及，90％以下、80％以下或70％以下的比例，例如20％～90％、30％～90％、30％～80％，或50％～90％(基于细胞数的干细胞比例)的比例的成体干细胞(包括间充质干细胞和多能干细胞)。
在优选实施方式中，在像实施例4所述的那样，将本发明的组织结构体和/或成体干细胞聚集组织在0.25％的胶原酶I型溶液中在37℃处理了1.5小时时，从由此分解的组织(成体干细胞聚集组织及其周围)回收的细胞，相对于其全部细胞数，可以含有20％以上、30％以上或50％以上，以及，90％以下、80％以下或70％以下的比例，例如20％～90％、30％～90％、30％～80％，或50％～90％(基于细胞数的干细胞比例)的比例的成体干细胞(包括间充质干细胞和多能干细胞)。
以上的干细胞比例可以将表达至少一个干细胞标志物(例如但不限于：选自于由CD90、CD105、SSEA3和SSEA4构成的组的至少一个，或者选自于由CD90、SSEA3和SSEA4构成的组的至少一个)的细胞的数用作干细胞数(成体干细胞数)而计算得出。
在一实施方式中，本发明的组织结构体和成体干细胞聚集组织可以以间充质干细胞:多能干细胞＝60～95:5～40、60～80:10～30，或65～75:15～25的比例含有间充质干细胞和多能干细胞，但不限于上述比例。该间充质干细胞与多能干细胞之比，可以将表达至少一个间充质干细胞标志物(例如但不限于：CD90或CD105)的细胞数用作间充质干细胞数，将表达至少一个多能干细胞标志物(例如但不限于：SSEA3或SSEA4)的细胞数用作多能干细胞数而计算得出。
本发明的组织结构体中，在凹部形成的成体干细胞聚集组织，除了该成体干细胞以外，也可以含有III型胶原蛋白，进一步地，可以含有成纤维细胞、血管内皮细胞等其他细胞，还可以含有其他种类的胶原蛋白或其他物质。血管内皮细胞的存在，例如可以通过检测血管内皮细胞标志物vWF的表达来研究。成纤维细胞的存在，例如可以通过检测成纤维细胞标志物波形蛋白(vimentin)的表达来研究。
关于本发明的组织结构体，尤其在其相对外侧的区域，可以观察到VEGF的高表达。另一方面，典型的是，在本发明的组织结构体的中心部所较多含有的成纤维细胞中，VEGF的表达较弱。
本发明的组织结构体，可以通过在有生物组织材料存在的环境下，例如生物体内的生物组织中安放上述组织结构体制造器械来形成。
本发明的组织结构体，可以在有生物组织材料存在的环境下，使用上述组织结构体制造器械制造之后，保持放入在该器械内的状态。这种情况下，组织结构体为填补(充满)组织结构体制造器械内的中空部的状态，其核心部优选与该器械的框体(例如柱状部件、支撑部、线状部件等)的表面紧贴。或者，本发明的组织结构体也可以是形成后从组织结构体制造器械分离的组织结构体。
在本发明的组织结构体的纤维性结缔组织(核心部)的凹部形成的成体干细胞聚集组织可以从纤维性结缔组织容易地采集。例如，可以从本发明的组织结构体的纤维性结缔组织22(核心部25)的凹部22H中容易地刮取成体干细胞聚集组织23。或者，可以通过从凹部22H刮取含有聚集的成体干细胞23C的成体干细胞聚集组织23，或者将该成体干细胞聚集组织23酶解，来从取自有生物组织材料存在的环境下，例如生物体内的生物组织的器械10中回收成体干细胞聚集组织23或成体干细胞23C。也可以通过将从有生物组织材料存在的环境下取出的器械10直接利用胶原酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶、TrypLETM(赛默飞世尔科技公司)、Accutase(R)(Innovative Cell Technologies，Inc.)、分散酶等分解酶进行酶处理，来在器械内中空部中从在凹部形成的成体干细胞聚集组织23中分离成体干细胞23C。或者，也可以通过将从凹部22H刮取的成体干细胞聚集组织23利用胶原酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶、TrypLETM(赛默飞世尔科技公司)、Accutase(R)(Innovative Cell Technologies，Inc.)、分散酶等分解酶进行酶处理，来从成体干细胞聚集组织23中分离成体干细胞23C。酶处理时间取决于处理物的量，典型地，可以为0.5～2小时左右。也可以将酶处理后所剩余的细胞从纤维性结缔组织22中分离，从中回收成体干细胞23C。
也可以通过进一步的分离纯化步骤，来增加成体干细胞23C的纯化度。例如，也可以通过使用膜过滤器或网状过滤器等的过滤处理，来将含有成体干细胞23C的细胞分离。成体干细胞23C的分离纯化可以使用干细胞标志物(多能干细胞标志物和/或间充质干细胞标志物)等在成体干细胞的细胞表面特异性表达的标志物来进行。例如，可以将多能干细胞标志物SSEA4和SSEA3中的一种或两种、间充质干细胞标志物CD105和CD105中的一种或两种用作干细胞标志物。例如，可以通过以磁性细胞分选(MACS，Magnetic cell sorting)、荧光激活细胞分选(FACS，fluorescence-activated cell sorting)等细胞分选法为代表的常规方法，容易地将成体干细胞从成体干细胞聚集组织中分离和/或浓缩。
本发明也涉及成体干细胞23C的收集方法，该方法包括：从本发明的组织结构体中，分离成体干细胞聚集组织或成体干细胞。
从本发明的组织结构体的成体干细胞聚集组织中分离的成体干细胞既可以根据需要进行适当的培养和增殖，也可以不这样做。或者，也可以根据需要对成体干细胞聚集组织或含有从成体干细胞聚集组织中部分纯化的成体干细胞的细胞群体进行适当的培养和增殖，也可以不这样做。成体干细胞聚集组织、含有成体干细胞的细胞群体，或成体干细胞可以用于体外(in vitro)或离体(ex vivo)的组织构建或细胞分化。成体干细胞聚集组织、含有成体干细胞的细胞群体，或成体干细胞可以向受试者(例如患者)施用，用于再生医疗，例如组织修复(组织再生)、预防或治疗(例如修复或改善)组织或器官障碍(例如先天性或后天性缺失、先天性或后天性功能不全或功能异常、损伤等)或功能低下；或者用于提升组织或器官的功能。即，本发明中得到的成体干细胞聚集组织、含有成体干细胞的细胞群体，或含有成体干细胞的细胞制剂可以用于再生医疗，例如组织修复(组织再生)、预防或治疗(例如修复或改善)组织或器官障碍或功能低下；或者用于提升组织或器官的功能。本发明也提供含有从本发明的组织结构体得到的成体干细胞聚集组织，或来自该成体干细胞聚集组织的成体干细胞或含有成体干细胞的细胞群体的细胞制剂(或药物组合物)。本发明还提供细胞制剂(或药物组合物)的制造方法，该方法包括：使用从本发明的组织结构体得到的成体干细胞聚集组织或来自该成体干细胞聚集组织的成体干细胞或含有成体干细胞的细胞群体制备细胞制剂(或药物组合物)。本发明中的细胞制剂或药物组合物还可以含有药学上可接受的添加剂(例如但不限于：载体、溶剂、赋形剂、湿润剂、稳定剂、等渗剂、缓冲剂、防腐剂、着色剂、冷冻保护剂等)。
本发明中得到的成体干细胞聚集组织、含有成体干细胞的细胞群体，或成体干细胞既可以在生物组织外诱导分化成目标细胞之后向受试者(例如患者)施用，也可以无需分化诱导而直接对适当的生物组织(发生组织或器官障碍或功能低下的部位等)施用。本发明中得到的成体干细胞聚集组织、含有成体干细胞的细胞群体或成体干细胞可以按照常规方法冷冻保存，在必要的时期进行施用。分化诱导的处理可以通过用于细胞分化诱导的常规方法或公知的任意方法进行。本发明也提供含有经过了分化诱导处理的本发明的成体干细胞聚集组织，或来自该成体干细胞聚集组织的成体干细胞或含有成体干细胞的细胞群体(例如，从来自本发明的成体干细胞聚集组织的成体干细胞分化的细胞)的细胞制剂(或药物组合物)。本发明还提供细胞制剂(或药物组合物)的制造方法，该方法包括：使用经过了分化诱导处理的本发明的成体干细胞聚集组织或来自该成体干细胞聚集组织的成体干细胞或含有成体干细胞的细胞群体制备细胞制剂(或药物组合物)。这些细胞制剂或药物组合物还可以含有药学上可接受的添加剂(例如但不限于：载体、溶剂、赋形剂、湿润剂、稳定剂、等渗剂、缓冲剂、防腐剂、着色剂、冷冻保护剂等)。
本发明也涉及包括向受试者(例如患者)施用本发明的成体干细胞聚集组织、来自该成体干细胞聚集组织的成体干细胞或含有成体干细胞的细胞群体，或从该成体干细胞分化的细胞的向受试者实施再生医疗的方法，例如，组织修复(组织再生)方法、预防或治疗(例如修复或改善)组织或器官障碍或功能低下的方法，或者提升组织或器官的功能的方法。作为受试者(例如患者)，例如可举出但不限于：包括人、猴、黑猩猩等灵长类动物，以及狗、猫、牛、猪、马、山羊、绵羊、大鼠、小鼠等的哺乳动物；以及鸟类、鱼类、两栖类等动物。在一实施方式中，受试者(例如患者)可以是人，也可以是非人动物，例如非人哺乳动物。在一实施方式中，受试者(例如患者)可以需要再生医疗，例如组织修复(组织再生)，或者预防或治疗(例如修复或改善)组织或器官障碍或功能低下，或者提升组织或器官的功能。受试者(例如患者)可以有期待通过移植成体干细胞或从成体干细胞分化的细胞来治疗的组织或器官障碍或功能低下等。
根据本发明，可以制造成体干细胞聚集的组织结构体，由此能够高效收集成体干细胞，使成体干细胞的获取和利用更加容易。
实施例
下面使用实施例对本发明进行更具体的说明。但是，本发明的技术范围并不限于这些实施例。
[材料和器械]
本申请说明书的实施例使用了以下受试动物、试剂和仪器。
-受试动物：比格犬，雌性，3岁龄，体重10kg
-图4～6所示的组织结构体制造器械
-图9所示的形状的支架和球囊导管
-组织保存液HypoThermosol(R)FRS(BioLIfe Solutions，101102)
-胶原酶I型(Worthington，LS004214)
-达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)[DMEM-LG(低葡萄糖)；日本和光纯药工业株式会社，041-29775]
-细胞冷冻保存液BAMBANKER(R)(NIPPON Genetics，CS-02-001)
- 4％多聚甲醛(PFA；日本和光纯药工业株式会社，163-20146)
-溶血试剂VersaLyse Lysing Solution(美国贝克曼库尔特有限公司，A09777)
-胎牛血清(FBS)(Biosera，FB-1365)
-磷酸盐缓冲盐水(PBS)
-二甲苯(武藤化学，4313)
- 100％乙醇(武藤化学，4026)
-媒染剂(武藤化学，4006-1)
-第二媒染剂(武藤化学，8141-1)
-魏格特氏铁苏木素染色液1(武藤化学，4034-1)
-魏格特氏铁苏木素染色液2(武藤化学，4035-1)
- 0.75％橙G(武藤化学，4023-1)
- 1％醋酸(武藤化学，4017-1)
-马松染色液B(武藤化学，4025-1)
- 2.5％磷钨酸溶液(武藤化学，4018-1)
-苯胺蓝染色液(武藤化学，4020-1)
-前田改良的间苯二酚品红液(武藤化学，4032-1)
-VAN GIESON染色液A (武藤化学，4036-1)
-VAN GIESON染色液B(武藤化学，4037-1)
-1％天狼星红染色液(武藤化学，3306-1)
-柠檬酸缓冲液(Sigma，C9999-1000ML)
-牛血清白蛋白(BSA)(日本和光纯药工业株式会社，013-25773)
<一抗>
-抗CD90抗体(abcam，ab123511)
-抗CD105抗体(abcam，ab156756)
-抗SSEA4抗体(abcam，ab16287)
-抗VEGFA抗体(abcam，ab1316)
-抗HGF抗体(abcam，ab83760)
-抗SSEA3抗体(Bioss，bs-3575R)
-抗血管性血友病因子(vWF，Von Willebrand Factor)抗体(abcam，ab6994)
-抗波形蛋白(vimentin)抗体(abcam，ab8069)
<二抗(荧光标记)>
-山羊抗小鼠IgG H&L(Alexa Fluor(R)488)(abcam，ab150113)
-山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor(R)594)(abcam，ab150080)
-ProLongTM Gold抗淬灭封片剂(含DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚))(赛默飞世尔科技公司，P36931)
-细胞染色缓冲液(Cell Staining Buffer；BioLegend，420201)
-FITC标记抗CD90抗体(BioLegend，328107)
-抗FITC微珠(Miltenyi Biotec，130-048-700)
-山羊抗兔IgG微珠(Miltenyi Biotec，130-048-600)
-MACS缓冲液(autoMACS(R)冲洗液；Miltenyi Biotec，130-091-222)
-MACS分离柱(MS层析柱；Miltenyi Biotec，130-042-201)
-荧光显微镜(尼康，ECLIPSE Ti-U)
-偏光显微镜(尼康，ECLIPSE E1000)
[实施例1]通过生物体内组织形成技术(iBTA)制作组织结构体
对比格犬实施麻醉，用电动手术刀将从右侧腹部到背部的5处皮肤切开之后，在皮下，在每个部位各插入并埋设1个图4D和图10A所示形状的组织结构体制造器械，将伤口缝合。安放3周后，对比格犬实施麻醉，切开皮肤，取出皮下的组织结构体制造器械。使用的组织结构体制造器械在两端部和中间部，通过直径11mm的圆环形支撑部将6根直径1mm、长60mm的圆柱形柱状部件13固定，其开口宽度W为4.0mm，深度D为4.6mm。
从皮下取出的器械大致整体被软组织覆盖。观察截面可以看到，器械内的中空部(中空空间)直到中心充满了组织。可以认为埋设并安放在生物体内的组织结构体制造器械内的中空部聚集有细胞，从而形成了组织。埋设部位的不同对组织的形成几乎没有影响。
图10示例性的表示使用的器械(A)、埋设在生物体内3周之后取出的器械(B)，以及得到的组织结构体的截面(C)的照片。
由此表明，通过在生物体内埋设安放本发明涉及的组织结构体制造器械，能够制作组织结构体。
将从皮下取出的组织结构体制造器械放入到装有组织保存液HypoThermosol(R)FRS的15mL离心管中并置于冰上，在4℃保存，在24小时以内进行后面的处理。
在超净台内，将内部具有形成的组织结构体的组织结构体制造器械从组织保存液中取出，用放入有PBS的离心管轻轻洗涤后，将器械周围的多余组织剔除。剔除后，拍照，将该器械保存在DMEM中。
[实施例2]组织结构体的组织学分析
用4％ PFA，在4℃将实施例1中从生物体内取出的组织结构体制造器械处理24小时，由此将组织固定，然后拆除器械，制作组织结构体的石蜡包埋块。
在宽度方向上用切片机将石蜡包埋块制作成3～5μm厚的切片。对切片进行苏木精伊红(HE)染色、马松三色(MT)染色、Elastica van Gieson(EVG)染色，以及天狼星红(SR)染色，用显微镜观察。
染色结果显示，组织结构体整体通过HE染色染成了粉色(图11A)，通过MT染色染成了蓝色(图11B)，因此表明得到的组织结构体富含胶原蛋白纤维。另外，组织结构体整体通过SR染色染成了红色，因此表明富含胶原蛋白(图11D)。组织结构体中，特别是从组织结构体制造器械的柱状部件周围到中心部的区域被浓染，由此表明胶原蛋白密集存在。因此表明，组织结构体的上述柱状部件周围和中心部形成有纤维性的结缔组织。与此相对，在组织结构体的处于上述柱状部件之间的位置，存在HE、MT和SR染色全部淡染的区域，该区域中只极为稀疏地存在胶原蛋白纤维。在得到的组织结构体中，上述柱状部件周围和中心部形成的结缔组织在上述柱状部件之间具有大致曲面形的凹部，表明在该凹部形成有相当于淡染区域(口袋部)的软组织(稀疏纤维性组织)。
需要说明的是，由于不存在通过EVG染色染成黑色的区域，因此表明组织结构体几乎不含弹性纤维(图11C)。
为了考察组织结构体中存在的胶原蛋白的类型，用偏光显微镜对经过了天狼星红(SR)染色的切片进行了观察。用偏光显微镜会观察到I型胶原蛋白为黄色～橙色，III型胶原蛋白为绿色。
结果观察到，在用天狼星红浓染的区域(器械柱状部件周围和中心部)紧密排列的胶原蛋白纤维是黄色或橙色，因此表明主要存在I型胶原蛋白(图12A和图12B)。另一方面，观察到柱状部件之间的淡染区域是绿色，表明与器械柱状部件周围和中心部相比，更多地存在III型胶原蛋白(图12C)。柱状部件之间的淡染区域(口袋部)所含有的纤维较少，随机取向(图12C)。
[实施例3]免疫组织化学染色
为了考察组织结构体中存在的细胞种类及其分布，进行了组织结构体的免疫组织化学染色。关于组织结构体的3～5μm厚的切片，通过使用对应的一抗和二抗的免疫组织化学染色，检测出了作为间充质干细胞标志物的CD90和CD105、作为多能干细胞标志物的SSEA4和SSEA3、作为生长因子的血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF)。另外，为了对细胞核进行染色，使用DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)进行了染色处理。将结果示于图13～15。
在间充质干细胞标志物CD90和CD105的检测中，口袋部中多数细胞被染色。在上述柱状部件周围，在接近口袋部的区域也能够确认到阳性细胞。图13中，用箭头符号表示代表性的染色部位。另一方面，在组织结构体的中心部则完全不存在阳性细胞。
在多能干细胞标志物SSEA4和SSEA3的检测中，与间充质干细胞标志物一样，在口袋部中多数细胞被染色。图14A和14B中，用箭头符号表示代表性的染色部位。另一方面，在组织结构体的中心部则不存在阳性细胞。
关于组织结构体内部的生长因子的表达，VEGF在组织结构体整体的相对外侧的区域高表达，特别是在口袋部内存在的圆形细胞更强地表达VEGF(图15)。HGF表达细胞在口袋部更多地被看到，与VEGF相同，圆形细胞高表达HGF(图15)。需要说明的是，圆形细胞一般是未分化性高的细胞。另一方面，成纤维细胞中的VEGF的表达较弱。
为了考察干细胞的性质，进行了干细胞标志物SSEA3与其他标志物的双重染色(CD90与SSEA3、CD105与SSEA3、SSEA4与SSEA3、VEGF与SSEA3)。
双重染色的结果，除了双阳性细胞(白色箭头)以外，还看到了各标志物的单阳性的细胞(横条纹箭头、点箭头)(图16)。横条纹箭头表示CD90、CD105、SSEA4或VEGF阳性的绿色染色。点箭头表示SSEA4阳性的红色染色。这表明，构成口袋部的组织的细胞是未分化程度不同的、具有层次性的细胞群体。另外，一部分细胞同时表达多能干细胞标志物SSEA4和SSEA3(图16C)，这与ES细胞等未分化程度更高的多能干细胞的特征(Henderson J.K.，etal.，Stem cels，2002；20：329-337)一致。另外，从VEGF在SSEA3阳性细胞中特别高地表达这点来看(图16D)，在口袋部的组织中存在的未分化性高的干细胞具有高血管生成能力。实际上，通过使用抗vWF抗体的免疫组织化学染色，在以口袋部与核心部的边界为中心的区域，检测到了较强的血管内皮细胞标志物vWF的表达，从而表明在该边界附近和口袋部存在血管内皮细胞。需要说明的是，通过使用抗波形蛋白(vimentin)抗体的免疫组织化学染色，在口袋部也检测到了成纤维细胞标志物波形蛋白(vimentin)。
以上结果表明，为了促进组织形成，干细胞聚集在了口袋部并活化。即，在凹部形成的组织(口袋部)可以称作是成体干细胞聚集而成的组织(成体干细胞聚集组织)。制作具有这种口袋部的组织结构体，由此可以高效地获得和利用活化状态的干细胞。
[实施例4]细胞分离和分析
向小瓶中的I型胶原酶(50mg)加入20mL的DMEM(无血清)，制备0.25％胶原酶溶液。向装入了6mL制备的胶原酶溶液的15mL离心管中，放入实施例1中从生物体内取出的、内部具有组织结构体的组织结构体制造器械，在恒温槽中在37℃进行振荡。振荡1.5小时后，除去该器械和未被胶原酶分解的组织，在4℃以1000rpm将离心管离心5分钟，除去上清液。加入6mL的DMEM，移液，在50mL离心管中回收了细胞(4支的量，24mL)。将回收组分在4℃以1000rpm离心5分钟，除去上清液。
为了使红细胞溶血，在回收的细胞中加入1mL溶血试剂VersaLyse LysingSolution，移液，在室温培养10分钟。加入10mL含10％ FBS的DMEM，在4℃以1000rpm离心5分钟，除去上清液。加入5mL细胞冷冻保存液BAMBANKER(R)进行悬浮，分离10μL该细胞悬浮液，加入等量台盼蓝染色液进行染色，测量细胞数。分别以1mL分注到低温保存管中，保存在液氮罐中。
5mL的BAMBANKER(R)悬浮液的细胞浓度为6.25×106细胞/mL，细胞存活率为98.4％。因此，每一个组织结构体可以回收大约4×106细胞。需要说明的是，在独立进行的其他实验中也回收到了大致同等的细胞数。在本实施例的处理条件下，成体干细胞聚集组织的大致整体与其周围的结缔组织(组织结构体的周边部)虽然被分解，但组织结构体(核心部)的中心部未被分解。
为了考察回收的细胞群体中的细胞的存在比例，使用流式细胞仪分别测量了CD90阳性细胞、SSEA3阳性细胞、SSEA4阳性细胞的数量。
结果显示，回收的细胞群体中，CD90阳性细胞为73％，SSEA3阳性细胞为23％，SSEA4阳性细胞为18％(图17)；回收的细胞群体中表达干细胞标志物的细胞为80％左右。基于标志物表达，则大约70％为间充质干细胞(2.8×106细胞)，大约20％为多能干细胞(8.0×105细胞)。
在胶原酶处理中，由于组织结构体从外侧被分解，细胞被分离，因此在胶原酶处理初期分离的细胞几乎都是来自成体干细胞聚集组织的成体干细胞。这表明成纤维细胞的比例会随着胶原酶处理时间而增加。
普通的间充质干细胞的来源即骨髓只含有10～100细胞/mL的间充质干细胞，脂肪组织只含有5×103细胞/g的间充质干细胞。本发明涉及的细胞结构体含有较高比例的干细胞，因此本发明与现有回收干细胞的方法相比，能够以更高的效率回收干细胞。
[实施例5]CD90或SSEA3阳性细胞的浓缩
通过与实施例4相同的方法对组织结构体进行胶原酶处理，从回收的细胞群体中分离和浓缩CD90或SSEA3阳性的干细胞。关于回收的细胞群体，用抗CD90抗体(BioLegend，328107)或抗SSEA3抗体(Bioss，bs-3575R)进行标记，与磁珠抗体[抗FITC微珠(MiltenyiBiotec，130-048-700)和山羊抗兔IgG微珠(Miltenyi Biotec，130-048-600)]反应，通过磁性细胞分选(MACS，Magnetic cell sorting)法进行了细胞分离。
结果，能够将CD90阳性细胞的比例从分离前的62％浓缩到分离后的90％(图18)。另外，能够将SSEA3阳性细胞的比例从分离前的29％浓缩到分离后的84％(图19)。
将用MACS法进行细胞分离前的细胞群体(对照组)和细胞分离后的细胞群体以3000细胞/cm2的密度接种到6孔板上，用含有10％ FBS的DMEM进行培养，观察细胞形态。结果表明，成纤维细胞样细胞与孔板底面粘附并增殖(图20)。通过干细胞标志物分离的细胞也是成纤维细胞样的形态，但观察到很多比分离前的细胞群体更小型的细胞(图20)。
通过将本发明涉及的细胞结构体作为来源，能够高效浓缩目标干细胞。
[实施例6]
对比格犬进行皮肤穿刺，向皮下插入挂载有收拢的支架(扩径时，长29mm×直径20mm)的球囊导管(图21A、21D)。在皮下施加水压使球囊扩张(图21B)，扩大支架直径(图21C)。
解除水压，使球囊收缩并拔出球囊，在扩径状态下将支架安放在皮下。3周后，对比格犬实施麻醉，切开皮肤，取出安放在皮下的支架。
在支架内部，组织充满到了中心部(图21E)。取出在支架内部形成的组织结构体(图21F)。在支架的金属框架周围和中心部形成有纤维性结缔组织，在相邻的金属框架和金属框架之间，结缔组织形成了曲面形的凹部。在该凹部形成有干细胞聚集的口袋部(成体干细胞聚集组织)(图21G，箭头)。另外，与金属框架之间相同，在支架两端的贯通开口部12H也确认到了形成有成体干细胞聚集组织的凹部。使用图9所示形状的支架，也能够由此表面制造本发明涉及的组织结构体。
[实施例7]
使用具有各种形状的本发明涉及的组织结构体制造器械，进行了组织结构体的制造。准备了图4A～图4C、图5A和图5B所示的5种形状的组织结构体制造器械10。使用的5种组织结构体制造器械的柱状部件13均为直径1mm的圆柱形。对充分麻醉下的比格犬实施切开手术，在腹部的皮下埋设组织结构体制造器械并缝合伤口。在埋设器械后3天、10天、2周(14天)、17天或3周(21天)，对比格犬实施切开手术，从腹部的皮下取出组织结构体制造器械。
从皮下取出的组织结构体制造器械，几乎整体都被软组织覆盖，该器械内的中空部(中空空间)中充满了组织，观察到与上述实施例同样地形成有组织结构体。
关于从上述器械中得到的组织结构体，通过与实施例2相同的方法进行纤维染色处理，以将胶原蛋白纤维染色。作为一例，将使用图4B的组织结构体制造器械(开口部的开口宽度W＝6.0mm)形成的组织结构体的位于长度方向中央附近的切片的HE染色图像示于图22。显示出了与实施例2非常类似的结果。从各柱状部件的周围到组织结构体的中心部存在结缔组织，在柱状部件之间，结缔组织形成凹部22H，在该凹部存在稀疏纤维性的成体干细胞聚集组织(口袋部)23。需要说明的是，结缔组织的主要成分为致密的胶原蛋白纤维。
从组织结构体的组织分析结果可知，以从组织结构体制造器械的各柱状部件的表面向该器械的中空部的内部扩展的形式逐渐形成纤维性结缔组织，相邻柱状部件的周围形成的结缔组织彼此相连，从而形成外表面具有从上述器械的开口部向器械中空部凹陷的凹部的核心部，同时在该凹部聚集来自生物体的成体干细胞，形成成体干细胞聚集组织。
另外，与实施例3同样地进行了免疫组织化学染色。在核心部的结缔组织确认到了经过DAPI染色的许多细胞核的存在，而间充质干细胞标志物CD90的表达为阴性，而且多能干细胞标志物SSEA-4的表达也为阴性。另一方面，在成体干细胞聚集组织(口袋部)确认到了CD90阳性的许多成体干细胞，以及SSEA-4阳性的许多成体干细胞的存在。
当组织结构体制造器械的体内埋设后的安放期间为3天时，虽然确认到了有外表面具有凹部的核心部形成，但在成体干细胞聚集组织和核心部没有检测到CD90阳性细胞和SSEA-4阳性细胞的存在。当安放期间为10天、2周、17天和3周时，在核心部显示出了CD90阳性细胞和SSEA-4阳性细胞的存在
如图23所示，根据HE染色的结果确认到，当安放期间为10天时，成体干细胞聚集组织中含有许多纤维蛋白(fibrin)。另一方面，当安放期间为3周时，确认到与安放期间为10天的情况相比，成体干细胞聚集组织所含有的纤维蛋白较少。与之对照，确认到与安放期间为10天的情况相比，在安放期间为3周时，在成体干细胞聚集组织中检测到的CD90阳性的细胞数和SSEA-4阳性的细胞数非常多。
安放期间为2周时的成体干细胞聚集组织中的CD90阳性的细胞数，是安放期间为10天时与安放期间为3周时的中间值左右。与此相对，安放期间为2周时的成体干细胞聚集组织中的SSEA-4阳性的细胞数，是比安放期间为10天时多出若干的程度。即表明，在从体内埋设的2周后到3周后这段期间的时间点，成体干细胞聚集组织中的SSEA-4阳性细胞大幅增加。
以上结果表明，成体干细胞聚集组织中的成体干细胞的细胞数会随着组织结构体制造器械的体内安放期间而增加。
[实施例8]
关于图4～6所示的组织结构体制造器械的结构与结缔组织的凹部和成体干细胞聚集组织的形成之间的关系，考察了通过与实施例7相同的方法对经历3周的安放期间制造的组织结构体进行了纤维染色(HE染色)处理的切片。
在组织结构体的制造中使用了图4A所示形状的组织结构体制造器械时，制造的组织结构体(图24)具有在所有以下(i)和(ii)中的核心部25，以及在其凹部形成的成体干细胞聚集组织23，其中：(i)3根柱状部件13之间的开口宽度W为3.0mm，深度D为2.0mm的器械的中空部10S(器械上段)和(ii)4根柱状部件13之间的开口宽度W为2.5mm，深度D为2.2mm的器械的中空部10S(器械下段)；其中，关于核心部25，在各柱状部件13、支撑部11A和11B的周围以及中心部具有纤维性结缔组织，并且具有从由2根相邻柱状部件13、支撑部11A和支撑部11B所围成(形成)的各开口部向器械中空部凹陷的凹部22H。构成核心部25的纤维性结缔组织22扩展到组织结构体制造器械的两个支撑部11A的各贯通孔11H内。组织结构体还具有从贯通孔(支撑部开口部)11H向器械中空部凹陷的凹部22H，在该凹部中也确认到了有成体干细胞聚集组织23形成。分别在上述(i)和(ii)的器械中空部中形成的纤维性结缔组织，经由在支撑部11B的贯通孔内形成的纤维性结缔组织而连接。
在组织结构体的制造中使用了图4B所示形状的组织结构体制造器械时，制造的组织结构体(图25)具有在所有以下(i)、(ii)和(iii)中的核心部25，以及在其凹部形成的成体干细胞聚集组织23，其中：(i)6根柱状部件13之间的开口宽度W为4.0mm，深度D为4.6mm的器械的中空部10S(器械上段)、(ii)4根柱状部件13之间的开口宽度W为6.0mm，深度D为4.0mm的器械的中空部10S(器械中段)，以及(iii)8根柱状部件13之间的开口宽度W为3.0mm，深度D为4.8mm的器械的中空部10S(器械下段)；其中，关于核心部25，在各柱状部件13、支撑部11A和11B的周围以及中心部具有纤维性结缔组织，并且具有从由2根相邻柱状部件13和2个相对的支撑部(支撑部11A和支撑部11B，或2个支撑部11B)所围成(形成)的各开口部向器械中空部凹陷的凹部22H。构成核心部25的纤维性结缔组织22扩展到组织结构体制造器械的两个支撑部11A的各贯通孔11H内。组织结构体还具有从贯通孔(支撑部开口部)11H向器械中空部凹陷的凹部22H，在该凹部中也确认到了有成体干细胞聚集组织23形成。分别在上述(i)～(iii)的器械中空部中形成的纤维性结缔组织，经由在2个支撑部11B的贯通孔11H内形成的纤维性结缔组织而连接。
在组织结构体的制造中使用了图4C所示形状的组织结构体制造器械时，制造的组织结构体(图26)具有在所有以下(i)、(ii)和(iii)中的核心部25，以及在其凹部形成的成体干细胞聚集组织23，其中：(i)8根柱状部件13之间的开口宽度W为5.0mm，深度D为7.1mm的器械的中空部10S(器械上段)、(ii)6根柱状部件13之间的开口宽度W为6.5mm，深度D为6.8mm的器械的中空部10S(器械中段)，以及(iii)10根柱状部件13之间的开口宽度W为3.5mm，深度D为7.3mm的器械的中空部10S(器械下段)；其中，关于核心部25，在各柱状部件13、支撑部11A和11B的周围以及中心部具有纤维性结缔组织，并且具有从由2根相邻柱状部件13和2个相对的支撑部(支撑部11A和支撑部11B，或2个支撑部11B)所围成(形成)的各开口部向器械中空部凹陷的凹部22H。核心部25的纤维性结缔组织22扩展到组织结构体制造器械的两个支撑部11A的各贯通孔11H内。组织结构体还具有从贯通孔(支撑部开口部)11H向器械中空部凹陷的凹部22H，在该凹部中也确认到了有成体干细胞聚集组织23形成。分别在上述(i)～(iii)的器械中空部中形成的纤维性结缔组织，经由在2个支撑部11B的贯通孔11H内形成的纤维性结缔组织而连接。
在组织结构体的制造中使用了图5A所示形状的组织结构体制造器械时，制造了具有核心部25，以及在其凹部形成的成体干细胞聚集组织23的组织结构体；其中，关于核心部25，在各柱状部件13和支撑部11A的周围以及中心部具有纤维性结缔组织，并且具有从由2根相邻柱状部件13和2个相对的支撑部11A所围成(形成)的各开口部向器械中空部凹陷的凹部22H。关于各开口部，在柱状部件13之间的开口宽度W为2.5mm以上5.0mm以下的范围内确认到有凹部22H形成，在该凹部22H中确认到有成体干细胞聚集组织23存在。在开口宽度W窄于2.5mm的范围内，未确认到有凹部22H形成。例如，图27A是位于组织结构体的长度方向的大致中央的切片的HE染色照片。在开口宽度W为3.0mm，深度D为4.8mm的部位确认到凹部22H，在该凹部22H中也确认到了有成体干细胞聚集组织23存在。图27B是位于组织结构体的长度方向的端部附近的切片的HE染色照片。在开口宽度W为4.0mm，深度D为4.6mm的部位确认到凹部22H，在该凹部22H中也确认到了有成体干细胞聚集组织23存在；但在开口宽度W为2.0mm，深度D为4.9mm的部位则未确认到有凹部22H形成(图27B)。核心部25的纤维性结缔组织22扩展到组织结构体制造器械的两个支撑部11A的各贯通孔11H内。组织结构体还具有从贯通孔(支撑部开口部)11H向器械中空部凹陷的凹部22H，在该凹部中也确认到了有成体干细胞聚集组织23形成。
在组织结构体的制造中使用了图5B所示形状的组织结构体制造器械时，制造了具有核心部25，以及在其凹部形成的成体干细胞聚集组织23的组织结构体；其中，关于核心部25，在各柱状部件13和支撑部11A的周围以及中心部具有纤维性结缔组织，并且具有从由2根相邻柱状部件13和2个相对的支撑部11A所围成(形成)的各开口部向器械中空部凹陷的凹部22H。关于各开口部，在柱状部件13之间的开口宽度W为2.5mm以上8.0mm以下的范围内确认到有凹部22H形成，在该凹部22H中确认到有成体干细胞聚集组织23存在。在开口宽度W窄于2.5mm的范围内，未确认到有凹部22H形成。例如，图28A是位于组织结构体的长度方向的大致中央的切片的HE染色照片。在开口宽度W为4.0mm，深度D为7.2mm的部位确认到凹部22H，在该凹部22H中也确认到了有成体干细胞聚集组织23存在。图28B是位于组织结构体的端部附近的切片的HE染色照片。在开口宽度W为7.0mm，深度D为6.6mm的部位确认到凹部22H，在该凹部22H中也确认到了有成体干细胞聚集组织23存在；但在开口宽度W为2.0mm，深度D为7.4mm的部位则未确认到有凹部22H形成(图28B)。核心部25的纤维性结缔组织22扩展到组织结构体制造器械的两个支撑部11A的各贯通孔11H内。组织结构体还具有从贯通孔(支撑部开口部)11H向器械中空部凹陷的凹部22H，在该凹部中也确认到了有成体干细胞聚集组织23形成。
图29是使用图5B所示形状的组织结构体制造器械制造的组织结构体的具有沿轴向Ax的截面的切片的纤维染色处理后的照片的放大图像。该图像表示在开口宽度W从2.0mm连续变化到5.0mm的范围的开口部正下方形成的组织的结构。如图29所示，在开口宽度W为2.0mm以上5.0mm以下的范围内，开口宽度W越大，在其正下方形成的凹部22H的深度也越大，随着开口宽度W的增加，在其正下方的凹部22H形成的成体干细胞聚集组织23的大小(体积)也越大。特别是，由于凹部22H的深度以开口宽度W＝3.0mm为边界急剧增加，因此成体干细胞聚集组织23的大小也会在开口宽度W＝3.0mm以上时急剧增加。
在组织结构体的制造中使用了图6A所示形状的组织结构体制造器械时，制造了具有核心部25，以及在其凹部形成的成体干细胞聚集组织23的组织结构体；其中，关于核心部25，在各柱状部件13、大矩形框11C和小矩形框11D的周围以及中心部具有纤维性结缔组织，并且具有从由2根相邻柱状部件13和大矩形框11C、小矩形框11D所围成(形成)的各开口部向器械中空部凹陷的凹部22H。另外，在组织结构体的制造中使用了图6B所示形状的组织结构体制造器械时，制造了具有核心部25，以及在其凹部形成的成体干细胞聚集组织23的组织结构体；其中，关于核心部25，在各柱状部件13、大矩形框11C、小矩形框11D和板状体26的周围以及中心部具有纤维性结缔组织，并且具有：(i)由2根相邻柱状部件13和大矩形框11C、小矩形框11D所围成(形成)的开口部，以及(ii)从由1根柱状部件13、大矩形框11C、小矩形框11D和板状体26所围成(形成)的开口部分别向器械中空部凹陷的凹部22H。在板状体26的狭缝26S(开口宽1mm)的开口部中没有形成凹部。关于各开口部，在柱状部件13之间的开口宽度W为3.0mm以上20.0mm以下的范围内确认到有凹部22H形成，在该凹部22H中确认到有成体干细胞聚集组织23存在。需要说明的是，图6A所示形状的组织结构体制造器械的深度D为2.0mm至10.5mm的范围。另外，图6B所示形状的组织结构体制造器械的深度D为2.0mm至20.5mm的范围，这是因为该器械底部是封闭的，且中空部的最深点位于底部上。核心部25的纤维性结缔组织22扩展到组织结构体制造器械的大矩形框11C和小矩形框11D的框内。组织结构体还具有分别从大矩形框11C和小矩形框11D(均为支撑部)的开口部向器械中空部凹陷的凹部22H，在该凹部中也确认到了有成体干细胞聚集组织23形成。
在组织结构体的制造中使用了图6C所示形状的组织结构体制造器械时，制造了具有核心部25，以及在其凹部形成的成体干细胞聚集组织23的组织结构体(图30)；其中，关于核心部25，在各柱状部件13、大矩形框11C、中矩形框11E和小矩形框11D的周围以及中心部具有纤维性结缔组织，并且具有：(i)由2根相邻柱状部件13、大矩形框11C和中矩形框11E所围成(形成)的开口部，以及(ii)从由2根柱状部件13、中矩形框11E和小矩形框11D所围成(形成)的开口部分别向器械中空部凹陷的凹部22H。关于各开口部，在柱状部件13之间的开口宽度W为3.0mm以上20.0mm以下的范围内确认到有凹部22H形成，在该凹部22H中确认到有成体干细胞聚集组织23存在。需要说明的是，图6C所示形状的组织结构体制造器械的深度D为2.0mm至10.5mm的范围。核心部25的纤维性结缔组织22扩展到组织结构体制造器械的大矩形框11C、中矩形框11E和小矩形框11D的框内。组织结构体还具有分别从大矩形框11C和小矩形框11D(均为支撑部)的开口部向器械中空部凹陷的凹部22H，在该凹部中也确认到了有成体干细胞聚集组织23形成。
将使用图6C所示形状的组织结构体制造器械而得到的组织结构体(图30)的切片的HE染色结果示于图31。在图30所示的位置，将组织结构体切断。图31A是在大矩形框11C的开口部正下方形成的成体干细胞聚集组织23的纵截面(a-a’)的染色图像。图31B是在小矩形框11D的开口部正下方形成的成体干细胞聚集组织23的纵截面(宽度方向；b-b’)的染色图像。在任何开口部，均观察到了向器械中空部凹陷的凹部22H，以及在凹部有成体干细胞聚集组织23形成。在大矩形框11C或小矩形框11D的周围的纤维性结缔组织中，胶原蛋白纤维密集存在。
以上实施例在组织结构体制造器械的开口宽度W为2.5mm以上的范围内，确认到了在组织结构体上有凹部22H形成。另一方面，在开口宽度W低于2.5mm的开口部的正下方，则未确认到有凹部22H形成。当深度D，或深度D的最大值至少为2mm以上时，未确认到对凹部22H的形成有影响。
以上表明，使用本发明涉及的组织结构体制造器械10，能够制造即使安放期间短，例如1个月以内，甚至2～3周左右，也会在凹部22H聚集和富集成体干细胞23C的组织结构体。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过直接引用而并入本说明书。
符号说明
Ax…轴向；Ci…周向；Ct…中心点；D…深度；S…圆筒面；W…开口宽度；10…组织结构体制造器械；10F…开口边缘；10H…开口部；10S…中空部；11…支撑部；11A…第一支撑部；11B…第二支撑部；11H…贯通孔；12H…贯通开口部；13…柱状部件；16…线状部件；21…生物组织；22…纤维性结缔组织；22C…成纤维细胞；22H…凹部；23…成体干细胞聚集组织；23C…成体干细胞；24…凹部周缘部；25…核心部。

Claims (23)

1.组织结构体，其具有核心部和稀疏纤维性的成体干细胞聚集组织，其中，所述核心部具有凹部且由纤维性结缔组织构成，所述稀疏纤维性的成体干细胞聚集组织形成在所述凹部且含有III型胶原蛋白和成体干细胞。
2.根据权利要求1所述的组织结构体，其中，所述核心部具有1个或2个以上的所述凹部。
3.根据权利要求1或2所述的组织结构体，其中，所述核心部具有至少3个所述凹部。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的组织结构体，其中，所述凹部具有至少2.5mm的开口宽度。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的组织结构体，其中，所述核心部具有至少2.5mm的直径。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的组织结构体，其中，成体干细胞包括间充质干细胞和多能干细胞中的至少一种。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的组织结构体，其中，组织结构体的形状为棒状，多于一个所述凹部沿周向配置。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的组织结构体，其中，组织结构体的形状为棒状，多于一个所述凹部沿轴向配置。
9.根据权利要求1～6中任一项所述的组织结构体，其中，组织结构体的形状为大致多面体形状，多于一个所述凹部位于不同的面。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的组织结构体，其中，组织结构体的形状为非管状且非片状。
11.组织结构体，其为根据权利要求1～10中任一项所述的组织结构体，其中，所述组织结构体通过在有生物组织材料存在的环境下安放具有中空部的组织结构体制造器械而形成，
所述组织结构体制造器械具有形成所述中空部的框体，
所述框体具有从所述中空部连通到所述组织结构体制造器械的外部空间的开口部，
所述框体限定在所述中空部形成的所述组织结构体的形状。
12.根据权利要求11所述的组织结构体，其中，所述组织结构体为填补所述组织结构体制造器械内的所述中空部的状态，所述核心部与所述框体的表面紧贴。
13.成体干细胞的收集方法，所述方法包括：从权利要求1～12中任一项所述的组织结构体中分离成体干细胞聚集组织或成体干细胞。
14.组织结构体制造器械，所述组织结构体制造器械具有：
中空部，以及形成所述中空部的框体，
所述框体具有从所述中空部连通到所述组织结构体制造器械的外部空间的开口部，
所述组织结构体具有核心部和稀疏纤维性的成体干细胞聚集组织，所述核心部具有凹部且由纤维性结缔组织构成，所述稀疏纤维性的成体干细胞聚集组织形成在所述凹部且含有III型胶原蛋白和成体干细胞。
15.根据权利要求14所述的组织结构体制造器械，其用于通过安放在有生物组织材料存在的环境下来形成具有核心部和稀疏纤维性的成体干细胞聚集组织的组织结构体，所述核心部具有凹部且由纤维性结缔组织构成，所述稀疏纤维性的成体干细胞聚集组织形成在所述凹部且含有III型胶原蛋白和成体干细胞，
所述组织结构体制造器械具有中空部，以及形成所述中空部的框体，
所述框体具有从所述中空部连通到所述组织结构体制造器械的外部空间的开口部，
所述框体限定在所述中空部形成的所述组织结构体的形状，
所述组织结构体制造器械在安放在有生物组织材料存在的环境下时，以从所述框体的表面向所述中空部的内部扩展的形式形成纤维性结缔组织，由此生成具有从所述开口部向所述中空部凹陷的凹部的核心部，并且在所述凹部形成聚集了成体干细胞的稀疏纤维性组织。
16.根据权利要求14或15所述的组织结构体制造器械，其中，所述开口部具有至少2.5mm的开口宽度。
17.根据权利要求14～16中任一项所述的组织结构体制造器械，其中，所述开口部具有能够内接直径2.5mm或超过2.5mm的圆的开口形状。
18.根据权利要求14～17中任一项所述的组织结构体制造器械，其中，所述框体由柱状部件和支撑部构成，所述支撑部将柱状部件固定以保持所述框体的形状。
19.根据权利要求18所述的组织结构体制造器械，其中，多于一个柱状部件在其两端部被支撑部固定，并且周向配置在支撑部与支撑部之间的虚拟筒面上。
20.根据权利要求18或19所述的组织结构体制造器械，其中，所述开口部由柱状部件和支撑部形成，或者由多于一个柱状部件形成。
21.根据权利要求14～20中任一项所述的组织结构体制造器械，其中，所述开口部具有多边形、矩形、梯形、丸形、圆形或椭圆形的开口边缘。
22.根据权利要求18～21中任一项所述的组织结构体制造器械，其中，支撑部还具有将所述中空部连通到所述器械的外部空间的开口部。
23.组织结构体的制造方法，所述方法包括：在有生物组织材料存在的环境下，将权利要求14～22中任一项所述的组织结构体制造器械安放在例如生物体内或分离的生物组织中，所述组织结构体具有核心部和稀疏纤维性的成体干细胞聚集组织，所述核心部具有凹部且由纤维性结缔组织构成，所述稀疏纤维性的成体干细胞聚集组织形成在所述凹部且含有III型胶原蛋白和成体干细胞。
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