JP2011504726A - バイサルファイト修飾された核酸を増幅およびコピーするための酵素 - Google Patents
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Abstract
Description
核酸をバイサルファイト処理する工程と、
天然Taqポリメラーゼと比較して、実質的に同一の条件下で、バイサルファイト処理された核酸をコピーまたは増幅するのに、より効率的である酵素を使用して、バイサルファイト処理された核酸をコピーまたは増幅する工程と
を含む方法を提供する。
核酸試料を変性する工程と、
核酸試料を、バイサルファイト試薬を用いて処理する工程および試料をインキュベートして、処理された核酸試料を形成する工程であり、試料中のいかなるメチル化ヌクレオチドも変化しないままであり、一方、メチル化されていないヌクレオチドは、別の形態に変換される工程と、
処理された核酸試料を脱塩または単離する工程と、
バイサルファイト修飾または処理された核酸を効率的にプロセシングする能力において、より効率的である酵素を使用して、バイサルファイト修飾された核酸を増幅、逆転写、消化またはそうでなければ酵素的にプロセシングする工程と
を含む方法を提供する。
処理された核酸をプロセシングまたは分析して、ヌクレオチド配列またはメチル化状態を決定する工程
をさらに含む。
コンパートメント化自律複製(CSR)またはin vitroコンパートメント化(IVC)という最近開発された技術は、操作して、特定の特徴を有する新規酵素を作製できる1つの技術である(Tawfik, D.SおよびGriffiths, A.D.(1998) Nature Biotech. 16、652-656;Ghadessy, F.J.、Ong, J.L.およびHolliger, P.(2001) PNAS. 98(8)、4552-4557;d' Abbadie, M.、Hofreiter, M.、Vaisman, A.、Loakes, D.、Gasparutto, D.、Cadet, J.、Woodgate, R.、Paabo, S.およびHolliger, P.(2007) Nature Biotech. 25(8)、939-943)。さらに、新規特性を有する、今日まで、古代DNAの増幅のためにしか利用されてこなかった、3つの生物界すべてに見られるDinBファミリーのポリメラーゼ(Boudsocq, F.、Iwai, S.、Hanaoka, F.およびWoodgate, R.(2001) Nucl. Acids. Res. 29、(22)、4607-4616)などの新規酵素が報告されており、これらは、バイサルファイト処理された核酸をコピーまたは増幅するのに有用であり得る。
本発明は、バイサルファイト修飾された核酸をプロセシングする能力が増強された酵素を利用するための方法を提供する。本方法は、それらが、例えば、それだけには限らないが、バイサルファイト修飾されたDNAのPCR増幅効率の改善およびアンプリコン長の増大を可能にする、また、バイサルファイト修飾されたRNAの効率的逆転写および/またはワンステップの逆転写PCRを可能にする、新規な多くの酵素を同定できるという点で有利である。本発明の方法は、試料を脱スルホン化する必要なく、一般的な分子生物学的技術を使用して、バイサルファイト修飾された核酸を操作できる簡易な手順を提供し、これは、これまでに知られている方法に対して、収率を大幅に改善し、高い分子量DNAを維持する。バイサルファイト修飾技術と結び付けられたこれらの酵素は、少数の細胞中のゲノムの、保存された核酸の、および大きな範囲の核酸の、または遺伝子全体のメチル化状態を成功裏に分析することができる。これらのすべてがこれまでは不可能であった。
(i)遺伝病、
(ii)生物起源であろうと非生物起源であろうと、環境によって誘発される因子によって引き起こされる非遺伝的または後成的疾患(この意味で、環境的は、妊娠のすべての段階の間の、または稔性および不稔性処置の条件下の生物内の環境自体も含むととられる)、
(iii)遺伝病または非遺伝病の素因、例えば、「プリオン」クラスの因子によって、圧力変化および無重力に対する曝露によって、または放射線の影響によって引き起こされる作用、
(iv)すべての細胞種、組織、臓器系および生体ネットワークにおける加齢の過程における5−メチルシトシン変化、例えば、年齢関連鬱病、疼痛、精神神経および神経変性状態および閉経前および閉経後状態、(例えば、男女ともの受精能の低下)、
(v)癌における5−メチルシトシン変化、(例えば、DNA増幅、欠失、再編、転座および挿入事象から生じる異常な核型を有する細胞における変化)、および種々の細胞周期現象におけるそれらの変動または変化(例えば、日周リズム、光周期、睡眠、記憶、および「時差ぼけ」に対する細胞周期の効果)、
(vi)接合子から、胚発生、胎児発達、誕生、青年期、成人期および老齢期までの最も広義に定義される代謝ネットワークにおける5−メチルシトシン変化(例えば、低酸素症、無酸素症、任意の種類の照射(イオン化であろうと、非イオン化であろうと、または化学療法薬治療、近距離の岩などの自然源からの、または軍もしくは政府支援の活動から得た「放射性降下物」からの高高度曝露照射から生じるものであろうと)、ストレスによって、またはミトコンドリア、核またはオルガネラゲノム間の不均衡によって引き起こされる代謝効果、
(vii)タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよびDNA、RNA、PNA、INA、ANA、HNA、LNA、CNAなど、またはペプチドアプタマー(例えば、翻訳後付加物、翻訳後切断産物、翻訳後修飾(例えば、インテインおよびエキセイン、ユビキネーション(ubiquination)および分解産物)を含む任意のもの;稀な天然アミノ酸ならびに単一の稀なアミノ酸、例えば、学習、脳成長および細胞死に関与するD−セリンを含有するタンパク質、ポリペプチドおよびペプチド;薬物、生物薬剤、化学物質(化学物質および生物薬剤の定義は、G.Ashton、2001、Nature Biotechnology 19、307-3111のものである))、既存の化合物の代謝産物、新規塩、プロドラッグ、エステル、ワクチン、抗原、ポリケチド、非リボソームペプチド、ビタミン、および任意の自然源に由来する分子(例えば、植物由来シクロパミン)に対する分子、細胞、組織、臓器および生物全体レベルでの応答による5−メチルシトシン変化、
(viii)外部供給源に由来する、または内因性トランスポゾンまたはレトロトランスポゾンにおいてなど(SINESおよびLINES)、内部で活性化された、一本鎖であろうと二本鎖であろうとも、RNAおよびDNAウイルスに対する、分子、細胞、組織、臓器および生物全体レベルでの応答による5−メチルシトシンまたはシトシン変化、
(ix)遺伝子起源であろうと非遺伝子起源であろうとも(またはイントロンを含有するか否か)、RNA転写物の逆転写されたコピーに対する、分子、細胞、組織、臓器および生物全体レベルでの応答による5−メチルシトシン変化、
(x)(a)血液および脳脊髄液ならびに妊娠の前、妊娠中および妊娠後の母体の液体をはじめとするすべての液体中で循環する、DNA、RNA、PNA、INA、ANA、HNA、LNA、CNAなど(またはすべての組合せ中のいずれかのDNA、RNA、PNA、INA、ANA、HNA、LNA、CNA、アプタマー);例えば、DNA、RNA、PNA、INA、ANA、HNA、LNA、CNAなどの分子、(b)ペプチドと核酸のキメラである、またはコレステロール部分、ホルモンなどの天然分子と核酸のキメラであるコンジュゲートしている生体分子の組合せに対する、分子、細胞、組織、臓器および生物全体レベルでの応答による5−メチルシトシン変化、
(xi)上記の(i)から(x)に記載される混乱のいずれかに対する、ヒトおよび動物起源の幹細胞の応答による5−メチルシトシン変化(in vivo、ex vivoまたは新規環境または天然および合成基質(またはそれらの組合せ)と関連してのいずれか。
核酸物質を得るための任意の適した方法を使用してよい。例として、それだけには限らないが、市販のDNA、RNAキットまたは試薬、ワークステーション、プロテアーゼ試薬を含有する標準細胞溶解バッファーおよび有機抽出手順が挙げられ、これらは当業者に周知である。
通常、バイサルファイト試薬は、メタ重亜硫酸ナトリウムである。バイサルファイト試薬は、シトシン塩基の、スルホン酸シトシンへのスルホン化と、それに続く、スルホン酸シトシンの、スルホン酸ウラシルへの加水分解脱アミノ化を引き起こすために使用される。しかし、当然のことながら、任意のその他の適したバイサルファイト試薬、例えば、亜硫酸イオンまたは酢酸イオンを使用してよい(Shapiro,R.、DiFate,V.、およびWelcher,M、(1974) J. Am. Chem. Soc 96: 906-912を参照のこと)。
化学薬品は、以下のとおりに入手した:Aldrich製エタノール(St. Louis MO;200プルーフ:E702−3);Sigma製イソプロパノール(St. Louis MO;99%+Sigma I−9516);Sigma製鉱油(M-5904);BDH製キノール(AnalaR番号103122E);Sigma製3M酢酸ナトリウム溶液(S-7899);Sigma製塩化ナトリウム(ACS試薬S9888);およびBDH製水酸化ナトリウム(AnalaR番号10252.4X);BDH製メタ重亜硫酸ナトリウム(AnalaR番号10356);Sigma製ジエチルエーテル(St.Louis MO;309958);Sigma製ヘキサン(St. Louis MO;650420);Oxoid製Luria培養液(Liverpool;CM0996B);Sigma製塩化マグネシウム(St.Louis MO;63069);Sigma製鉱油(M-5904);Sigma製塩化カリウム(St. Louis MO;60142);Fluka製Span80(Buchs CH;85548);Sigma製塩酸テトラサイクリン(St. Louis MO;T8032);Sigma製Triton X−100(St. Louis MO;93426);Sigma製トリズマ塩酸塩(St. Louis MO;T5941);Sigma製Tween 80(St. Louis MO;P8074)。
核酸のバイサルファイト処理のための例示的プロトコールを以下に示し、これを使用して、本発明の酵素によって増幅またはコピーするための鋳型核酸を作製できる。このプロトコールによって、実質的にすべての処理されたDNAを保持することが成功裏にもたらされる。当然のことではあるが、試料または試薬の容積または量は変更してもよい。
バイサルファイト変換されたDNAの増幅において使用するための熱安定性DNAポリメラーゼを作製する方法の一例を、技術を例示するために示し、以下に記載されるように、バイサルファイト修飾された核酸をプロセシングするその能力において優れている酵素を作製するのに特異的な適応を施したd’Abbadieらの方法(d' Abbadie, M.、Hofreiter, M.、Vaisman, A.、Loakes, D.、Gasparutto, D.、Cadet, J.、Woodgate, R.、Paabo, S.およびHolliger, P.(2007) Nature Biotech. 25(8)、939-943)に従って実施する。
HIV−RT酵素
HCV RNAは、OptiQual(登録商標)HCV RNA高陽性対照(Acrometrixカタログ番号96−0203)から、QiAmp UltraSens(Qiagen)ウイルスキットを、製造業者の使用説明書に従って使用して単離し、5,000IU/μlの最終濃度で再懸濁した。
亜硫酸水素ナトリウム(Sigma 59000 500g;ロット番号116K0761)3.3gを、Xceed試薬1 5mlに溶解した。この試薬を、十分に溶解するまで80℃に加熱し、放冷した。
10μl 変換RNA
10mM dNTPS1μl
ランダムHプライマー(300ng/μl)1μl
HIV−RT 対照RT
10×HIV−RTバッファー 2μl 5×FSバッファー 4μl
HIV RT(1U/μl) 1μl 0.1M DTT 1μl
RNアーゼ OUT 1μl スーパースクリプトIII 1μl
水 4μl RNアーゼ OUT 1μl
Promegaマスターミックス 36.5μl
F1プライマー(100ng/μl) 1.0μl
R0プライマー(100ng/μl) 1.0μl
水 6.5μl
注:プライマーは、「Herbert」中のオレンジ色の枠内の標識RNAプライマーである。
95℃ 3分
95℃ 10秒
52℃ 1分 40×
68℃ 1分
68℃ 7分
バイサルファイト変換反応
鋳型物質1μgを、最終容積20μlに作製した。3M NaOH2μlを37℃で15分間加えることによってこの鋳型を変性した。次いで、MethylEasy Xceedバイサルファイト変換キット(Human Genetic Signatures、Sydney、Australia)に従って、DNAをバイサルファイト処理した。脱スルホン化のために、変換されたDNAを、80℃で20分間加熱し、次いで、−20℃で必要とされるまで保存した。非脱スルホン化バイサルファイト処理DNAを、水(MethylEasyキットからの試薬番号5の代わり)に再懸濁し、直ちに使用した。
反応液を、100μMの鋳型オリゴヌクレオチド2μl、2.5μMのCy3標識オリゴヌクレオチド2μl、ポリメラーゼバッファー5μl、dNTP 4μl(各625μMが、50μMの最終濃度を与える)および全量49μlまでの蒸留水を含有する容積50μlで調製した。
BStempC8 5’−CCCCCCCCTGGGTATAGTGAGTGGTATTA (配列番号2)
プライマー 5’−7C6C5CTATACCCA (配列番号3)
7=Cy3
6=LNA T
5−=LNA A
(CTCACTATACCC (配列番号4))
増幅反応液は、×10 SuperTaqバッファー2.5μl、10mM dNTP 1μl、100ng/μl各プライマー1μl、SuperTaq0.5μl(Cambio Ltd、Cambridge、United Kingdom)および蒸留水18μlを含有する最終反応容積25μlで調製した。1μlの鋳型を加えた。
F1 5’−GAGGTTTGGAAGTTTTATTTTATT (配列番号5)
R1 5’−TAACTTATCATCAAAATAAAC (配列番号6)
R3 5’−TATACTACCTCAAAAATATAAATA (配列番号7)
R5 5’−AAAAATCCTTACAAAACTTATAAC (配列番号8)
94℃ 1分30秒
94℃ 20秒
45℃ 30秒 24回反復
68℃ 1分
鋳型: バイサルファイト処理されたTgoプラスミド
プライマー: セット1は、250bp断片を増幅する
セット2は、600bp断片を増幅する
セット3は、1050bp断片を増幅する
94℃−20秒
45℃−30秒;25サイクル
68℃−1分
Claims (21)
- バイサルファイト修飾または処理された核酸をコピーまたは増幅するための酵素の使用であって、該酵素が、天然Taqポリメラーゼと比較して、実質的に同一の条件下で、核酸をコピーまたは増幅するのにより効率的である、使用。
- 前記酵素が、脱塩基部位を有する核酸、スルホン酸基を含む嵩高い付加物を有する核酸、実質的にA、T、GおよびU塩基のみを有する核酸、または実質的にA、TおよびG塩基のみを有する核酸をコピーまたは増幅できる、請求項1に記載の使用。
- 前記酵素が、好熱性ポリメラーゼ、中温性ポリメラーゼ、逆転写酵素、エンドヌクレアーゼおよびそれらの修飾体およびキメラ体からなる群から選択される、請求項1または2に記載の使用。
- 前記酵素が、キメラ酵素、本明細書に定義される5D4、HIV−RTおよびそれらの修飾体から選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用。
- 前記酵素が、5D4またはその修飾体である、請求項4に記載の使用。
- 前記酵素が、HIV−RTまたはその修飾体である、請求項4に記載の使用。
- バイサルファイト処理された核酸をコピーまたは増幅する方法であって、
核酸をバイサルファイト処理する工程と、
天然Taqポリメラーゼと比較して、実質的に同一の条件下で、バイサルファイト処理された核酸をコピーまたは増幅するのにより効率的である酵素を使用して、バイサルファイト処理された核酸をコピーまたは増幅する工程と
を含む方法。 - 前記バイサルファイト処理が、亜硫酸水素ナトリウムまたはメタ重亜硫酸ナトリウムを使用する、請求項7に記載の方法。
- 前記バイサルファイト処理が、脱スルホン化工程を実質的に伴わない、請求項7または8に記載の方法。
- 前記バイサルファイト処理に先立って、核酸を変性させる工程をさらに含む、請求項7〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変性工程を、アルカリ環境を提供することまたは核酸を加熱することによって実施する、請求項10に記載の方法。
- 前記バイサルファイト処理によって、試料中のいかなるメチル化ヌクレオチドも変化しないままであり、一方、メチル化されていないヌクレオチドはウラシルに変換される、請求項7〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記処理された核酸試料を脱塩または単離する工程をさらに含む、請求項7〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵素が、脱塩基部位を有する核酸、スルホン酸基を含む嵩高い付加物を有する核酸、実質的にA、T、GおよびU塩基のみを有する核酸、または実質的にA、TおよびG塩基のみを有する核酸をコピーまたは増幅できる、請求項7〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵素が、好熱性ポリメラーゼ、中温性ポリメラーゼ、逆転写酵素、エンドヌクレアーゼおよびそれらの修飾体およびキメラ体からなる群から選択される、請求項14に記載の方法。
- 前記酵素が、キメラ酵素、本明細書において定義される5D4、HIV−RTおよびそれらの修飾体から選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記酵素が、5D4またはその修飾体である、請求項16に記載の方法。
- 前記酵素が、HIV−RTまたはその修飾体である、請求項16に記載の方法。
- 前記処理された核酸をプロセシングまたは分析して、ヌクレオチド配列、メチル化状態を決定するか、核酸の供給源を同定するか、または微生物を検出する工程をさらに含む、請求項7〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バイサルファイト処理された核酸の増幅を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写PCR、qPCR、等温増幅またはシグナル増幅によって行う、請求項7〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記処理された核酸が、バイサルファイト修飾されたDNA、バイサルファイト修飾されたRNA、またはバイサルファイト修飾されたDNAとバイサルファイト修飾されたRNAの組合せを含む、請求項7〜20のいずれか一項に記載の方法。
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