JP2011184392A - メラニン産生抑制剤、エンドセリン−1mRNA発現抑制剤、幹細胞増殖因子(SCF)mRNA発現抑制剤、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)mRNA発現抑制剤、グルタチオン産生促進剤、過酸化水素に対するダメージ抑制剤、及びフィラグリン産生促進剤 - Google Patents
メラニン産生抑制剤、エンドセリン−1mRNA発現抑制剤、幹細胞増殖因子(SCF)mRNA発現抑制剤、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)mRNA発現抑制剤、グルタチオン産生促進剤、過酸化水素に対するダメージ抑制剤、及びフィラグリン産生促進剤 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】ヤクシマアジサイの抽出物を含有するメラニン産生抑制剤、エンドセリン−1mRNA発現抑制剤、幹細胞増殖因子(SCF)mRNA発現抑制剤、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)mRNA発現抑制剤、グルタチオン産生促進剤、過酸化水素に対するダメージ抑制剤、及びフィラグリン産生促進剤である。
【選択図】なし
Description
このように皮膚においてグルタチオンの産生を促進することは、加齢により衰える酸化ストレスの防御を高め、かつ紫外線による酸化ストレスに対する傷害を抑制することにつながり、皮膚の老化の予防、治療、あるいはシミ等の色素沈着に対する改善が期待できると考えられる。そこで、グルタチオン産生促進作用を有するものとして、例えばビルベリー抽出物又はウォルナット抽出物(特許文献1参照)、クチナシ属植物の抽出物(特許文献2参照)、などが開示されている。
近年、フィラグリンが皮膚の水分保持に非常に重要かつ必要不可欠であること、及び乾燥などの条件によってフィラグリンの合成力が低下し、角質層におけるアミノ酸量が低下することが報告されている(非特許文献5参照)。
このように表皮ケラチノサイトにおいて、プロフィラグリンmRNAの発現促進を通じて、フィラグリンの合成を促進させて角質層内のアミノ酸量を増大させ、角質層の水分環境を本質的に改善できることが期待される。
このため、フィラグリン合成促進剤としては、例えば、カンゾウ抽出物(特許文献3参照)、天然植物中に含まれるフラバノン配糖体として知られるリクイリチン(特許文献4参照)、プロフィラグリン及びフィラグリン蛋白産生促進剤の少なくともいずれかとして、Citrus属に属する植物エキス又は酵母エキス(特許文献5参照)、などが提案されている。
そこで、過酸化水素に対するダメージ抑制作用を有するものとして、例えば紅藤の抽出物(特許文献6参照)、ミリントニア・ホルテンシス(Millingtonia hortensis)の抽出物、リーア・マクロフィラ(Leea macrophylla)の抽出物、コダリオカリクス・モトリウス(Codariocalyx motorius)の抽出物、マルティニア・アンヌア(Martynia annua)の抽出物、ピットスポルム・ナパウレンセ(Pittosporum napaulense)の抽出物、ヘスペレトゥサ・クレヌラータ(Hesperethusa crenulata)の抽出物、プテロスペルムム・ディベルシフォリウム(Pterospermumu diversifolium)の抽出物、グレウィア・エリオカルパ(Grewia eriocarpa)の抽出物、ツンベルギア・ラウリフォリア(Thunbergia laurifolia)の抽出物、又はプレムナ・インテグリフォリア(Premna integrifolia)の抽出物(特許文献7参照)などが開示されている。
また、本発明は、第2に、優れたエンドセリン−1mRNA発現抑制作用を有し、かつ安全性の高いエンドセリン−1mRNA発現抑制剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第3に、優れた幹細胞増殖因子(SCF)mRNA発現抑制作用を有し、かつ安全性の高い幹細胞増殖因子(SCF)mRNA発現抑制剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第4に、優れた塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)mRNA発現抑制作用を有し、かつ安全性の高い塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)mRNA発現抑制剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第5に、優れたグルタチオン産生促進作用を有し、かつ安全性の高いグルタチオン産生促進剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第6に、優れた過酸化水素に対するダメージ抑制作用を有し、かつ安全性の高い過酸化水素に対するダメージ抑制剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、第7に、優れたフィラグリン産生促進作用を有し、かつ安全性の高いフィラグリン産生促進剤を提供することを目的とする。
<1> ヤクシマアジサイの抽出物を含有することを特徴とするメラニン産生抑制剤である。
<2> ヤクシマアジサイの抽出物を含有することを特徴とするエンドセリン−1mRNA発現抑制剤である。
<3> ヤクシマアジサイの抽出物を含有することを特徴とする幹細胞増殖因子(SCF)mRNA発現抑制剤である。
<4> ヤクシマアジサイの抽出物を含有することを特徴とする塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)mRNA発現抑制剤である。
<5> ヤクシマアジサイの抽出物を含有することを特徴とするグルタチオン産生促進剤である。
<6> ヤクシマアジサイの抽出物を含有することを特徴とする過酸化水素に対するダメージ抑制剤である。
<7> ヤクシマアジサイの抽出物を含有することを特徴とするフィラグリン産生促進剤である。
即ち、本発明によると、第1に、優れたメラニン産生抑制作用を有し、かつ安全性の高いメラニン産生抑制剤を提供することができる。
また、本発明によると、第2に、優れたエンドセリン−1mRNA発現抑制作用を有し、かつ安全性の高いエンドセリン−1mRNA発現抑制剤を提供することができる。
また、本発明によると、第3に、優れた幹細胞増殖因子(SCF)mRNA発現抑制作用を有し、かつ安全性の高い幹細胞増殖因子(SCF)mRNA発現抑制剤を提供することができる。
また、本発明によると、第4に、優れた塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)mRNA発現抑制作用を有し、かつ安全性の高い塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)mRNA発現抑制剤を提供することができる。
また、本発明によると、第5に、優れたグルタチオン産生促進作用を有し、かつ安全性の高いグルタチオン産生促進剤を提供することができる。
また、本発明によると、第6に、優れた過酸化水素に対するダメージ抑制作用を有し、かつ安全性の高い過酸化水素に対するダメージ抑制剤を提供することができる。
また、本発明によると、第7に、優れたフィラグリン産生促進作用を有し、かつ安全性の高いフィラグリン産生促進剤を提供することができる。
抽出原料として使用する前記ヤクシマアジサイの部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、花、蕾、茎、葉、枝、枝葉、幹、又はこれらの混合物などが挙げられ、これらの中でも、葉が特に好ましい。
具体的には、抽出溶媒を満たした処理槽内に、前記抽出原料を投入し、更に必要に応じて時々攪拌しながら、30分間〜4時間静置して可溶性成分を溶出した後、ろ過して固形物を除去し、得られた抽出液から抽出溶媒を留去し、乾燥することにより抽出物を得ることができる。抽出溶媒量は、通常、抽出原料の5倍量〜15倍量(質量比)である。抽出条件は、抽出溶媒として水を用いた場合には、通常50℃〜95℃にて1時間〜4時間程度である。また、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いた場合には、通常40℃〜80℃にて30分間〜4時間程度である。なお、溶媒で抽出することにより得られる抽出液は、抽出溶媒が安全性の高いものであれば、そのまま本発明のメラニン産生抑制剤、エンドセリン−1mRNA発現抑制剤、幹細胞増殖因子(SCF)mRNA発現抑制剤、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)mRNA発現抑制剤、グルタチオン産生促進剤、過酸化水素に対するダメージ抑制剤、及びフィラグリン産生促進剤の有効成分として用いることができる。
また、前記メラニン産生抑制剤、エンドセリン−1mRNA発現抑制剤、幹細胞増殖因子(SCF)mRNA発現抑制剤、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)mRNA発現抑制剤、グルタチオン産生促進剤、過酸化水素に対するダメージ抑制剤、及びフィラグリン産生促進剤は、前記その他の成分として、メラニン産生抑制剤、エンドセリン−1mRNA発現抑制剤、幹細胞増殖因子(SCF)mRNA発現抑制剤、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)mRNA発現抑制剤、グルタチオン産生促進剤、過酸化水素に対するダメージ抑制剤、及びフィラグリン産生促進剤を有する、前記ヤクシマアジサイの抽出物以外の天然抽出物等を含んでいてもよい。前記メラニン産生抑制剤、エンドセリン−1mRNA発現抑制剤、幹細胞増殖因子(SCF)mRNA発現抑制剤、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)mRNA発現抑制剤、グルタチオン産生促進剤、過酸化水素に対するダメージ抑制剤、及びフィラグリン産生促進剤中の前記その他の成分の含有量にも、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記エンドセリン−1mRNA発現抑制剤は、有効成分として含有されるヤクシマアジサイの抽出物の作用により、エンドセリン−1mRNA発現抑制作用を発揮する。
前記幹細胞増殖因子(SCF)mRNA発現抑制剤は、有効成分として含有されるヤクシマアジサイの抽出物の作用により、幹細胞増殖因子(SCF)mRNA発現抑制作用を発揮する。
前記塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)mRNA発現抑制剤は、有効成分として含有されるヤクシマアジサイの抽出物の作用により、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)mRNA発現抑制作用を発揮する。
前記グルタチオン産生促進剤は、有効成分として含有されるヤクシマアジサイの抽出物の作用により、グルタチオン産生促進作用を発揮する。
前記過酸化水素に対するダメージ抑制剤は、有効成分として含有されるヤクシマアジサイの抽出物の作用により、過酸化水素に対するダメージ抑制作用を発揮する。
前記フィラグリン産生促進剤は、有効成分として含有されるヤクシマアジサイの抽出物の作用により、フィラグリン産生促進作用を発揮する。
ヤクシマアジサイの葉の乾燥物を粗砕したもの100gに対し、水2,000mLを加え、還流抽出器により90℃で1時間加熱抽出を2回行い、熱時濾過した。その後、得られた抽出液を40℃で減圧下に濃縮し、凍結乾燥機で乾燥して、ヤクシマアジサイの水抽出物(粉末)を得た。得られたヤクシマアジサイの水抽出物の収率を表1に示す。
ヤクシマアジサイの葉の乾燥物を粗砕したもの100gに対し、50質量%エタノール2,000mLを加え、還流抽出器により、1時間加熱抽出を2回行い、熱時濾過した。その後、得られた抽出液を40℃で減圧下に濃縮し、凍結乾燥機で乾燥して、ヤクシマアジサイの50質量%エタノール抽出物(粉末)を得た。得られたヤクシマアジサイの50質量%抽出物の収率を表1に示す。
−B16メラノーマ細胞に対するメラニン産生抑制作用試験−
B16メラノーマ細胞を、10質量%のFBS含有ダルベッコMEM培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を10質量%FBS及び1mmol/Lのテオフィリン含有ダルベッコMEM培地で25.0×104cells/mLの濃度に希釈した後、48wellプレートに1well当たり300μLずつ播種し、6時間培養した。培養終了後、10質量%FBS及び1mmol/Lのテオフィリン含有ダルベッコMEM培地で溶解した被験試料を各wellに300μL添加し、4日間培養した。培養終了後、各wellから培地を取り除き、1mol/LのNaOH溶液200μLを添加して超音波破砕器により細胞を破壊し、波長475nmにおける吸光度を測定し、メラニン産生量とした。
空試験として、10質量%のFBS及び1mmol/Lのテオフィリン含有ダルベッコMEM培地のみで培養した細胞を同様の方法で試験した。
そして、これらの結果から、下記数式1により、メラニン産生抑制作用を算出した。試料濃度12.5μg/mL、25μg/mLでの結果を表2に示す。
<数式1>
メラニン産生抑制率(%)={1−(B/D)/(A/C)}×100
ただし、前記数式1中、Aは、被験試料無添加での475nmにおける吸光度、Bは、被験試料添加での475nmにおける吸光度、Cは、被験試料無添加での540nmにおける吸光度、Dは、被験試料添加での540nmにおける吸光度を表す。
−エンドセリン−1mRNA発現上昇抑制作用試験−
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞(normal human epidermal keratinocyte;NHEK)を80cm2フラスコで正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地(EpiLife−KG2)において、37℃、5%CO2下で前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。
EpiLife−KG2を用いて35mmシャーレ(FALCON社製)に40×104cells/2mL/シャーレずつ播き、37℃、5%CO2下で一晩培養した。24時間後に培養液を捨て、HEPES緩衝液1mLを加え、UV−B照射(50mJ/cm2)を行い、その後EpiLife−KG2で必要濃度に溶解した試験試料を各シャーレに2mLずつ添加し、37℃、5%CO2下で24時間培養した。培養後、培養液を捨て、ISOGEN(NIPPON GENE;Cat.No.311−02501)にてtotal RNAを抽出し、それぞれのRNA量を分光光度計にて測定し、200ng/μLになるようにtotal RNAを調製した。
このtotal RNAを鋳型とし、エンドセリン−1及び内部標準であるGAPDHのmRNAの発現量を測定した。検出はリアルタイムPCR装置Smart Cycler(R)(Cepheid社製)を用いて、TaKaRa SYBR(R) PrimeScriptTM RT−PCR Kit(Perfect Real Time)(code No.RR063A)によるリアルタイム2ステップRT−PCR反応により行った。
エンドセリン−1のmRNAの発現量は、「紫外線未照射、被験試料無添加」、「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」でそれぞれ培養した細胞から調製した総RNA標品を基にして、GAPDHの値で補正値を求め、更に「紫外線未照射、被験試料無添加」の補正値を100とした時の「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」の補正値を算出した。
そして、これらの結果から、下記数式2により、エンドセリン−1mRNA発現上昇抑制率を算出した。試料濃度1μg/mL、10μg/mLでの結果を表3に示す。
<数式2>
エンドセリン−1mRNA発現上昇抑制率(%)
={(A−B)−(A−C)}/(A−B)×100
ただし、前記数式2中、Aは、紫外線未照射・被験試料無添加時の補正値、Bは、紫外線照射・被験試料無添加時の補正値、Cは、紫外線照射・被験試料添加時の補正値である。
−幹細胞増殖因子(SCF)mRNA発現上昇抑制作用試験−
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞(normal human epidermal keratinocyte;NHEK)を80cm2フラスコで正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地(EpiLife−KG2)において、37℃、5%CO2下で前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。
EpiLife−KG2を用いて35mmシャーレ(FALCON社製)に40×104cells/2mLシャーレずつ播き、37℃、5%CO2下で一晩培養した。24時間後に培養液を捨て、HEPES緩衝液1mLを加えUV−B照射(50mJ/cm2)を行った。その後、EpiLife−KG2で必要濃度に溶解した試験試料を各シャーレに2mLずつ添加し、37℃、5%CO2下で24時間培養した。培養後、培養液を捨て、ISOGEN(NIPPON GENE;Cat.No.311−02501)にてtotal RNAを抽出し、それぞれのRNA量を分光光度計にて測定し、200ng/μLになるようにtotal RNAを調製した。
このtotal RNAを鋳型とし、SCF(Stem Cell Factor)及び内部標準であるGAPDHのmRNAの発現量を測定した。検出はリアルタイムPCR装置Smart Cycler(R)(Cepheid社製)を用いて、TaKaRa SYBR(R) PrimeScriptTM RT−PCR Kit(Perfect Real Time)(code No.RR063A)によるリアルタイム2ステップRT−PCR反応により行った。
SCFのmRNAの発現量は、「紫外線未照射、被験試料無添加」、「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」でそれぞれ培養した細胞から調製した総RNA標品を基にして、GAPDHの値で補正値を求め、更に「紫外線未照射、被験試料無添加」の補正値を100とした時の「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」の補正値を算出した。
そして、これらの結果から、下記数式3により、幹細胞増殖因子(SCF)mRNA発現上昇抑制率を算出した。試料濃度1μg/mL、10μg/mLでの結果を表4に示す。
<数式3>
幹細胞増殖因子(SCF)mRNA発現上昇抑制率(%)
={(A−B)−(A−C)}/(A−B)×100
ただし、前記数式3中、Aは「紫外線未照射、被験試料無添加」時の補正値、Bは「紫外線照射、被験試料無添加」時の補正値、Cは「紫外線照射、被験試料添加」時の補正値をそれぞれ表す。
−塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)mRNA発現上昇抑制作用試験−
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞(normal human epidermal keratinocyte;NHEK)を80cm2フラスコで正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地(EpiLife−KG2)において、37℃、5%CO2下で前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。
EpiLife−KG2を用いて35mmシャーレ(FALCON社製)に40×104cells/2mLシャーレずつ播き、37℃、5%CO2下で一晩培養した。24時間後に培養液を捨て、HEPES緩衝液1mLを加えUV−B照射(50mJ/cm2)を行った。その後、EpiLife−KG2で必要濃度に溶解した試験試料を各シャーレに2mLずつ添加し、37℃、5%CO2下で24時間培養した。培養後、培養液を捨て、ISOGEN(NIPPON GENE;Cat.No.311−02501)にてtotal RNAを抽出し、それぞれのRNA量を分光光度計にて測定し、200ng/μLになるようにtotal RNAを調製した。
このtotal RNAを鋳型とし、bFGF(basic Fibroblast Growth Factor;塩基性線維芽細胞増殖因子)及び内部標準であるGAPDHのmRNAの発現量を測定した。検出はリアルタイムPCR装置Smart Cycler(R)(Cepheid社製)を用いて、TaKaRa SYBR(R) PrimeScriptTM RT−PCR Kit(Perfect Real Time)(code No.RR063A)によるリアルタイム2ステップRT−PCR反応により行った。
bFGFのmRNAの発現量は、「紫外線未照射、被験試料無添加」、「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」でそれぞれ培養した細胞から調製した総RNA標品を基にして、GAPDHの値で補正値を求め、更に「紫外線未照射、被験試料無添加」の補正値を100とした時の「紫外線照射、被験試料無添加」、及び「紫外線照射、被験試料添加」の補正値を算出した。
そして、これらの結果から、下記数式4により、bFGFmRNA発現上昇抑制率を算出した。試料濃度1μg/mLでの結果を表5に示す。
<数式4>
bFGFmRNA発現上昇抑制率(%)
={(A−B)−(A−C)}/(A−B)×100
ただし、前記数式4中、Aは、紫外線未照射・被験試料無添加時の補正値、Bは、紫外線照射・被験試料無添加時の補正値、Cは、紫外線照射・被験試料添加時の補正値を表す。
−グルタチオン産生促進作用試験(ヒト正常皮膚線維芽細胞)−
ヒト正常皮膚線維芽細胞(NB1RGB)を10質量%FBS含有α−MEM培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を2.0×105cells/mLの濃度に10質量%FBS含有α−MEM培地で希釈した後、48wellプレートに1well当たり200μLずつ播種し、一晩培養した。培養後、1質量%FBS含有α−MEM培地で溶解した被験試料を各wellに200μL添加し、24時間培養した。培養終了後、各wellから培地を抜き、400μLのPBS(−)にて洗浄後、150μLのM−PER(R)(PIERCE社)を用いて細胞を溶解した。このうちの100μLを用いて総グルタチオンの定量を行った。
即ち、96wellプレートに溶解した細胞抽出液100μL、0.1Mのリン酸緩衝液50μL、2mMのNADPHを25μL及びグルタチオンレダクターゼ25μL(終濃度17.5unit/mL)を加え、37℃で10分間加温した後、10mMの5,5’−dithiobis(2−nitorobenzoic acid)25μLを加え、5分間後までの波長412nmにおける吸光度を測定し、OD/minを求めた。総グルタチオン濃度は酸化型グルタチオンを用いて作成した検量線をもとに算出した。
得られた値は総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記数式5に従いグルタチオン産生促進率を算出した。試料濃度12.5μg/mL、50μg/mL、及び200μg/mLでの結果を表6に示す。
<数式5>
グルタチオン産生促進率(%)=(B/A)×100
ただし、前記数式5中、Aは、被験試料を添加しない細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量(対照)、Bは、被験試料を添加した細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量を表す。
−グルタチオン産生促進作用試験(B16メラノーマ細胞)−
B16メラノーマ細胞を10質量%FBS含有ダルベッコMEM培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を10質量%FBS含有ダルベッコMEM培地で10×104cells/mLの濃度に希釈した後、48wellプレートに1well当たり200μLずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、1質量%FBS含有ダルベッコMEM培地で溶解した被験試料を各wellに200μL添加し、24時間培養した。培養後、1質量%FBS含有α−MEM培地で溶解した被験試料を各wellに200μL添加し、24時間培養した。培養終了後、各wellから培地を抜き、400μLのPBS(−)にて洗浄後、150μLのM−PER(R)(PIERCE社製)を用いて細胞を溶解した。このうちの100μLを用いて総グルタチオンの定量を行った。即ち、96wellプレートに溶解した細胞抽出液100μL、0.1Mリン酸緩衝液50μL、2mMのNADPHを25μL及びグルタチオンレダクターゼ25μL(終濃度17.5unit/mL)を加え、37℃で10分間加温した後、10mMの5,5’−dithiobis(2−nitrobenzoic acid)25μLを加え、5分間後までの波長412nmにおける吸光度を測定し、OD/minを求めた。総グルタチオン濃度は酸化型グルタチオンを用いて作成した検量線をもとに算出した。得られた値は総タンパク量当たりのグルタチオン量に補正した後、下記数式6に従いグルタチオン産生促進率を算出した。結果を表7に示す。
<数式6>
グルタチオン産生促進率(%)=(B/A)×100
ただし、前記数式6中、Aは、被験試料を添加しない細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量(対照)、Bは、被験試料を添加した細胞中における総タンパク量当たりのグルタチオン量を表す。
−過酸化水素に対するダメージ抑制作用試験−
ヒト正常皮膚線維芽細胞(NB1RGB)を10質量%のFBS含有α−MEM培地を用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を2.5×105cells/mLの濃度になるように5質量%のFBS含有α−MEM培地で希釈した後、48wellプレートに1well当たり200μLずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、1質量%のFBS含有α−MEM培地で溶解した被験試料を各wellに200μL添加し、24時間培養した。培養終了後、培地を抜き、400μLのPBS(−)で洗浄した。洗浄後、ハンクス緩衝液に溶解した過酸化水素(1mmol/L)或いはハンクス緩衝液のみを各wellに200μL添加し、2時間培養した。培養後、400μLのPBS(−)で洗浄し、終濃度0.05mg/mLで1質量%のFBS含有α−MEM培地に溶解したニュートラルレッドを各wellに200μL添加した。2.5時間培養した後、ニュートラルレッド溶液を捨て、エタノール・酢酸溶液(エタノール:酢酸:水=50:1:49)を各wellに300μL添加し、色素を抽出した。抽出後、波長540nmにおける吸光度を測定した。
そして、これらの結果から、下記数式7により、過酸化水素ダメージ抑制率を算出した。試料濃度25μg/mL、100μg/mL、及び400μg/mLでの結果を表8に示す。
<数式7>
過酸化水素ダメージ抑制率(%)={1−(C−A)/(C−B)}×100
ただし、前記数式7中、Aは、過酸化水素処理・被験試料処理の波長540nmにおける吸光度、Bは、過酸化水素処理・被験試料無処理の波長540nmにおける吸光度、Cは、過酸化水素無処理・被験試料無処理の波長540nmにおける吸光度を表す。
−プロフィラグリン及びフィラグリン産生促進作用試験−
正常ヒト新生児皮膚表皮角化細胞(NHEK)を80cm2のフラスコで正常ヒト表皮角化細胞培地(KGM)にて37℃、5%CO2下で培養し、常法により細胞を集めた。得られた細胞を同培地にて1.5×105個/mLになるように調整し、2mLずつ6穴コラーゲンコートプレートに播種して5%CO2下、37℃で3日間培養した。培養後、0.5質量%のDMSOに溶解した試験試料を含む、又は含まない(コントロール)KGMを2mLに交換し、37℃、5%CO2下で5日間培養した。培養終了後、常法により総タンパクの調製を行った。
10μg/laneに調整したサンプルをSDS−PAGEにより展開し、PVDF膜に転写した。5質量%のスキムミルクを含むPBS(−)でブロッキングを行った後、抗ヒトフィラグリンモノクローナル抗体(Harbor Bio−Products)、ビオチン標識抗マウスIg(Whole Ab)(Amersham Biosciences)、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体(CALBIOCHEM社製)を0.1質量%のTween20、0.3質量%のスキムミルクを含むPBS(−)で1,000倍に希釈して順次反応させ、ECL Western blotting detection reagents and analysis system(Amersham Biosciences社製)の発光によりプロフィラグリン及びフィラグリンを検出した。検出したバンドをKODAK 1D Image Analysis Software EDAS290 Version3.5にて定量的に測定した。結果は、試験試料添加及び無添加で培養した細胞のそれぞれから調製したタンパク10μg中のプロフィラグリン及びフィラグリンのNet intensity(バンド強度)を用いて、試料濃度12.5μg/mL、及び50μg/mLでのプロフィラグリン及びフィラグリン産生促進率を、下記数式8から求めた。結果を表9に示す。
<数式8>
プロフィラグリン及びフィラグリン産生促進率(%)=(A/B)×100
ただし、前記数式8中、Aは、被験試料添加時のNet intensity、Bは、被験試料無添加時(コントロール)のNet intensityである。
Claims (7)
- ヤクシマアジサイの抽出物を含有することを特徴とするメラニン産生抑制剤。
- ヤクシマアジサイの抽出物を含有することを特徴とするエンドセリン−1mRNA発現抑制剤。
- ヤクシマアジサイの抽出物を含有することを特徴とする幹細胞増殖因子(SCF)mRNA発現抑制剤。
- ヤクシマアジサイの抽出物を含有することを特徴とする塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)mRNA発現抑制剤。
- ヤクシマアジサイの抽出物を含有することを特徴とするグルタチオン産生促進剤。
- ヤクシマアジサイの抽出物を含有することを特徴とする過酸化水素に対するダメージ抑制剤。
- ヤクシマアジサイの抽出物を含有することを特徴とするフィラグリン産生促進剤。
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