JP2011162476A - セリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進剤及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤 - Google Patents

Abstract

【課題】天然由来成分を含有したセリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進剤及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤を提供する。
【解決手段】セリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進剤又はアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤に、ローヤルゼリー蛋白加水分解物を有効成分として含有せしめる。
【選択図】なし

Description

本発明は、セリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進剤及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤に関するものである。

セラミドは、表皮細胞の角化の過程においてセリンとパルミトイル−ＣｏＡとを基に、セラミド合成の律速酵素として知られるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）をはじめとする酵素の働きにより生成される。セラミドは、皮膚最外層を覆う角質細胞間脂質の主成分として特異的に存在し、皮膚本来が持つ生体と外界とのバリア膜としての機能維持に重要な役割を果たしている。

角層の構造は、レンガとモルタルとに例えられ、１５層ほどに積み重なった角層細胞を細胞間脂質が繋ぎ止める形で強固なバリア膜を形成している。角層細胞は、アミノ酸を主成分とする天然保湿因子を細胞内に含有することによって水分を保持し、一方、角質細胞間脂質は、約５０％のセラミドを主成分とし、コレステロール、脂肪酸等の両親媒性脂質から構成されており、疎水性部分と親水性部分とが交互に繰り返される層板構造、いわゆるラメラ構造を特徴としている。

様々な内的・外的要因による皮膚のバリア機能の低下は、経表皮水分蒸散量を増加させ、皮膚のかさつき、落屑、掻痒感等を惹き起こし、いわゆる乾燥肌に陥る。また、皮膚のバリア機能の低下は、皮膚の炎症を増大させ、外界からの様々な刺激に対する防御機能が低下するという悪循環に陥る。最近の研究において、加齢により、又はバリア障害として知られるアトピー性皮膚炎患者において、角層セラミド成分（いわゆる細胞間脂質）の減少や組成変化が報告されており（非特許文献１参照）、皮膚のバリア機能の維持、改善にセラミドが重要であることが広く知られるようになっている。このような考え方に基づいて、皮膚のバリア機能を改善する方法として、セラミドを外部から補う方法（非特許文献２参照）や皮膚内部においてセラミド産生能を高める方法（非特許文献３参照）等が知られている。

皮膚細胞では、水チャンネルとして知られるアクアポリンが、細胞膜上に発現して、細胞間隙の水をはじめとする低分子物質を細胞内へ取り込む役割を担っていることが知られている。

ヒトでは、１３種類のアクアポリン（ＡＱＰ０〜ＡＱＰ１２）の存在が知られている。表皮細胞においては、主としてＡＱＰ３が存在しており、水に加えて、水分保持作用に関与するグリセロールや尿素等の低分子化合物をも取り込む役割を担っていると考えられている。

しかしながら、ＡＱＰ３は加齢とともに減少し、このことが水分保持機能の低下の一因であることが示唆されているため、ＡＱＰ３の発現を促進することにより、加齢による水分保持能やバリア機能等を制御することが可能であると考えられる（非特許文献４参照）。このような考えに基づき、ＡＱＰ３発現促進作用を有するものとして、例えば、トコフェリルレチノエート（特許文献１参照）、ノウゼンハレン科植物より得られる抽出物（特許文献２参照）等が知られている。

特開２００６−２９０８７３号公報 特開２００４−１６８７３２号公報

Akimoto K et al.，"J. Dermatol."，1993，Vol.20，p.1 Kenya I et al.，"フレグランスジャーナル"，2004，Vol.11，p.23-32 Tanno O et al.，"Br. J. Dermatol."，2000，Vol.143，p.524 "フレグランスジャーナル"，2006，Vol.34，No.10，p.19-23

本発明は、安全性の高い天然物に由来する成分の中からセリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進作用及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進作用を有するものを見出し、それを有効成分とするセリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進剤及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤を提供することを目的とする。

上記課題を解決するため、本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進剤又はアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤は、ローヤルゼリー蛋白加水分解物を有効成分として含有することを特徴とする。

本発明によれば、天然物に由来する成分であるローヤルゼリー蛋白加水分解物を有効成分として含有し、安全性に優れたセリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進剤及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤を提供することができる。

以下、本発明について説明する。
本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進剤及びアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤は、ローヤルゼリー蛋白加水分解物を有効成分として含有する。

ローヤルゼリー蛋白加水分解物に含有されるＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用及びＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用を有する物質の詳細は不明であるが、下記の方法によって、ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用及びＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用を有するローヤルゼリー蛋白加水分解物を得ることができる。

上記ローヤルゼリー蛋白加水分解物は、ローヤルゼリーに水及び蛋白質分解酵素（プロテアーゼ）を添加し、加温及び加圧下で反応させることにより製造することができる。

ローヤルゼリーは、ミツバチ科ヨーロッパミツバチ（学名：Apis melifera L.）のうちの若い働き蜂の咽頭腺からの分泌物であり、女王蜂となる幼虫や成虫となった女王蜂に給餌されるものである。本発明において使用し得るローヤルゼリーとしては、生ローヤルゼリー、乾燥ローヤルゼリー等が例示される。

ローヤルゼリーに添加される水としては、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが挙げられる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が挙げられる。したがって、本発明においてローヤルゼリーに添加される水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。

ローヤルゼリーに添加されるプロテアーゼとしては、ローヤルゼリー中のタンパク質を分解し得るものであれば特に限定されるものではなく、例えば、酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼ等を例示することができ、これらのうち、中性プロテアーゼを好適に用いることができる。

ローヤルゼリーに添加する水の添加量は、特に限定されるものではなく、ローヤルゼリー１質量部に対して２〜１０質量部程度であればよい。また、プロテアーゼの添加量は、使用するプロテアーゼの種類にもよるが、例えば、プロテアーゼとして中性プロテアーゼ（デナチームＡＰ，ナガセケムテックス社製）を使用した場合、ローヤルゼリー１質量部に対して０．００５〜０．０２質量部程度であればよい。

反応時における加温条件としては、例えば、４０〜８０℃程度であればよく、特に５０℃程度であるのが好ましい。また、加圧条件としては、例えば、５０〜１５０ＭＰａ程度であればよく、特に６０ＭＰａ程度であるのが好ましい。

このようにして得られる酵素分解液に１，３−ブチレングリコールを添加し、所定期間冷所に放置し、生成したオリや沈殿を濾過することで、ローヤルゼリー蛋白加水分解物を得ることができる。

このようにして得られたローヤルゼリー蛋白加水分解物は、そのままＳＰＴｍＲＮＡ発現促進剤及びＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進剤の有効成分として使用してもよいし、当該ローヤルゼリー蛋白加水分解物を常法により希釈、濃縮、乾燥した希釈物、濃縮物、乾燥物、又は得られた乾燥物を所定の粒径に粉砕した粉砕物を上記有効成分として使用してもよい。

なお、このようにして得られるローヤルゼリー蛋白加水分解物は特有の匂いを有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、皮膚化粧料又は飲食品に配合する場合には大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。

以上のようにして得られるローヤルゼリー蛋白加水分解物は、ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用及びＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用を有しているため、それらの作用を利用してＳＰＴｍＲＮＡ発現促進剤及びＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進剤の有効成分として用いることができる。

また、ローヤルゼリー蛋白加水分解物は、上記ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、セラミドの合成を促進し、皮膚バリア機能を改善することができるため、皮膚バリア機能改善剤の有効成分としても用いることができる。具体的にはアトピー性皮膚炎等の炎症性疾患による皮膚バリア機能障害の予防、治療又は改善剤等の有効成分として用いることができる。さらに、ローヤルゼリー蛋白加水分解物は、上記ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、セラミドの合成を促進することができるため、セラミドの合成障害に起因する疾患（例えば、アトピー性皮膚炎等）の予防又は治療剤の有効成分としても用いることができる。

本発明のＳＰＴｍＲＮＡ発現促進剤及びＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進剤は、ローヤルゼリー蛋白加水分解物のみからなるものであってもよいし、ローヤルゼリー蛋白加水分解物を製剤化したものであってもよい。

ローヤルゼリー蛋白加水分解物は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯臭剤等を用いることができる。ローヤルゼリー蛋白加水分解物は、他の組成物（例えば、皮膚化粧料等）に配合して使用することができるほか、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等として使用することができる。

なお、本発明のＳＰＴｍＲＮＡ発現促進剤又はＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進剤は、必要に応じて、ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用又はＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用を有する他の天然抽出物や天然物に由来する成分等を配合して有効成分として用いることができる。

本発明のＳＰＴｍＲＮＡ発現促進剤及びＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進剤の投与方法としては、一般に経皮投与、経口投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。また、本発明のＳＰＴｍＲＮＡ発現促進剤及びＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。

本発明のＳＰＴｍＲＮＡ発現促進剤は、ローヤルゼリー蛋白加水分解物が有するＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、セラミドの合成を促進することができ、これにより、しわ、弾力性の低下等の皮膚の老化症状を予防又は改善することができるとともに、アトピー性皮膚炎等の炎症性疾患による皮膚バリア機能障害やアトピー性皮膚炎等のセラミド合成障害に起因する疾患を予防、治療又は改善することができる。ただし、本発明のＳＰＴｍＲＮＡ発現促進剤は、これらの用途以外にもＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。

本発明のＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進剤は、ローヤルゼリー蛋白加水分解物が有するＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、ＡＱＰ３の発現を促進することができるため、皮膚の水分保持能やバリア機能を改善することができ、それにより皮膚の乾燥、しわの形成、弾力性の低下等の皮膚の老化症状を予防又は改善することができる。ただし、本発明のＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進剤は、これらの用途以外にもＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。

なお、本発明のＳＰＴｍＲＮＡ発現促進剤及びＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。

以下、製造例及び試験例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。

〔製造例１〕ローヤルゼリー蛋白加水分解物の製造
生ローヤルゼリー１０ｇに水１００ｍＬを加え、さらにプロテアーゼ（製品名：デナチームＡＰ，ナガセケムテックス社製）０．１ｇを添加し、圧力酵素分解機（ヤンマー社製）を用いて５０℃、６０ＭＰａで２４時間反応させた。

このようにして得られた酵素分解液に１，３−ブチレングリコール１１０ｍＬを加え、３日間冷所に放置し、それにより生じたオリ及び沈殿物を濾過し、得られた濾液を減圧下にて濃縮し、乾燥することでローヤルゼリー蛋白加水分解物２．４ｇを得た（実施例１）。

〔試験例１〕ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用試験
上述のようにして得られたローヤルゼリー蛋白加水分解物（実施例１）及びローヤルゼリーの極性溶媒（５０容量％１，３−ブチレングリコール水溶液）による抽出処理にて得られたローヤルゼリー抽出物（ローヤルゼリー抽出液ＢＧ，丸善製薬社製）の凍結乾燥物（比較例１）について、以下のようにしてＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。

正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、８０ｃｍ^２フラスコで正常ヒト表皮角化長期培養用増殖培地（EpiLife-KG2）を用い、３７℃、５％ＣＯ_２−９５％ａｉｒの条件下にて前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。

回収した細胞を３５ｍｍシャーレ（FALCON社製）に４０×１０^４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ_２−９５％ａｉｒの条件下で、Epilife-KG2を用いて一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、Epilife-KG2で溶解した試料溶液（実施例１，比較例１，試料濃度は下記表１を参照）を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２−９５％ａｉｒの条件下にて２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製，Cat. No. 311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるように総ＲＮＡを調製した。

この総ＲＮＡを鋳型とし、ＳＰＴ及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR Prime Script RT-PCR kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム２Step RT-PCR反応により行った。ＳＰＴの発現量は、「試料無添加」及び「試料添加」でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、さらに「試料無添加」の補正値を１００としたときの「試料添加」の補正値を算出した。得られた結果から、下記式によりＳＰＴｍＲＮＡ発現促進率（％）を算出した。

ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
上記式において、Ａは「試料添加時の補正値」を表し、Ｂは「試料無添加時の補正値」を表す。
結果を表１に示す。

表１に示すように、ローヤルゼリー抽出物（比較例１）は、ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用を有しなかったが、ローヤルゼリー蛋白加水分解物（実施例１）は、優れたＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用を有し、特に低濃度（１２．５μｇ／ｍＬ）において優れたＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用を奏し得ることが確認された。

〔試験例２〕ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用試験
上述のようにして得られたローヤルゼリー蛋白加水分解物（実施例１）及びローヤルゼリーの極性溶媒（５０容量％１，３−ブチレングリコール水溶液）による抽出処理にて得られたローヤルゼリー抽出物（ローヤルゼリー抽出液ＢＧ，丸善製薬社製）の凍結乾燥物（比較例１）について、以下のようにしてＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。

正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、８０ｃｍ^２フラスコで正常ヒト表皮角化長期培養用増殖培地（EpiLife-KG2）を用い、３７℃、５％ＣＯ_２−９５％ａｉｒの条件下にて前培養し、トリプシン処理により細胞を集めた。

回収した細胞を３５ｍｍシャーレ（FALCON社製）に４０×１０^４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ_２−９５％ａｉｒの条件下で、Epilife-KG2を用いて一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、Epilife-KG2で溶解した試料溶液（実施例１，比較例１，試料濃度は下記表２を参照）を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２−９５％ａｉｒの条件下にて２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製，Cat. No. 311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるように総ＲＮＡを調製した。

この総ＲＮＡを鋳型とし、ＡＱＰ３及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR Prime Script RT-PCR kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム２Step RT-PCR反応により行った。ＡＱＰ３の発現量は、「試料無添加」及び「試料添加」でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、さらに「試料無添加」の補正値を１００としたときの「試料添加」の補正値を算出した。得られた結果から、下記式によりＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進率（％）を算出した。

ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
上記式において、Ａは「試料添加時の補正値」を表し、Ｂは「試料無添加時の補正値」を表す。
結果を表２に示す。

表２に示すように、ローヤルゼリー抽出物（比較例１）は、ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用を有しなかったが、ローヤルゼリー蛋白加水分解物（実施例１）は、優れたＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用を有することが確認された。

本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進剤は、皮膚のバリア機能等の改善に大きく貢献することができ、本発明のアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤は、皮膚の水分保持能やバリア機能の改善に大きく貢献することができる。

Claims (2)

1. ローヤルゼリー蛋白加水分解物を有効成分として含有することを特徴とするセリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進剤。
2. ローヤルゼリー蛋白加水分解物を有効成分として含有することを特徴とするアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤。