JP2011099871A

JP2011099871A - 新規組成物

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Publication number: JP2011099871A
Application number: JP2011024073A
Authority: JP
Inventors: Faire Ulf De; ウルフデファイア; Johan Frostegaard; ヨハンフロストガード
Original assignee: Athera Biotechnologies AB
Current assignee: Athera Biotechnologies AB
Priority date: 2004-04-15
Filing date: 2011-02-07
Publication date: 2011-05-19
Anticipated expiration: 2025-04-15
Also published as: EP1797893B1; US8012483B2; JP5366987B2; US10222382B2; SI1735349T1; CN105699669A; CA2776927A1; US20070286868A1; CN103743898A; DK1735349T3; ES2362222T3; CN103743898B; SI1797893T1; CA2776927C; AU2011202334B2; PT1735349E; US20160131661A1; DE602005020474D1; US20140186360A1; EP1797893A3

Abstract

【課題】虚血性心臓血管疾患を発症する危険性を評価するために、ホスホリルコリンに対する抗体、特にＩｇＭ抗体のレベルを評価する
【解決手段】ホスホリルコリンに対する自己抗体、特にＩｇＭ自己抗体の有無は、虚血性心臓血管疾患を発症する危険の増減と関連している。動物実験は、中〜高レベルの抗体、特にＩｇＭ抗体は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ−ホスホリルコリン複合体）での能動免疫化後の血漿で検出できるということを示している。ホスホリルコリン複合体（能動免疫化）または抗体調製物、例えばホスホリルコリン複合体（受動免疫化）に対して特異性を有するモノクローナル抗体を含む薬剤組成物を提案し、能動または受動免疫原としてのこれらの組成物の使用は、アテローム性動脈硬化症の治療または予防である。
【選択図】なし

Description

本発明は、アテローム性動脈硬化症および虚血性心臓血管疾患の治療および危険評価の分野に関する。

アテローム性動脈硬化症は、大動脈および中動脈の最内側層（内膜）の肥厚を引き起こす慢性疾患である。これは血流を減少させ、影響を受けた血管によって供給されている組織において虚血および組織破壊を引き起こし得る。アテローム性動脈硬化症は、心筋梗塞、卒中および末梢動脈疾患をはじめとする心臓血管疾患の主な原因である。これは西欧諸国における死亡の主な原因であり、２０年以内に世界全体の主な死亡原因となると予測されている。

この疾患は、血管の細胞外マトリックスにおけるリポタンパク質、主として低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の蓄積によって始まる。こういったＬＤＬ粒子は凝集し、酸化的修飾を受ける。酸化ＬＤＬは炎症性、毒性であり、血管損傷を引き起こす。アテローム性動脈硬化症は、炎症および繊維症をはじめ、この損傷に対する応答を多くの点で表す。

１９８９年に、パリンスキ（Palinski）らは、ヒトにおいて酸化ＬＤＬに対する循環性自己抗体を同定した。この観察結果は、アテローム性動脈硬化症は酸化リポタンパク質に対する免疫応答によって引き起こされる自己免疫疾患であり得るということを示唆した。この時点でいくつかの研究所が酸化ＬＤＬに対する抗体力価と心臓血管疾患の間の関連性を捜し始めた。しかし、これらの研究から分かった状況は全く理解できないものであった。抗体は、酸化ＬＤＬ中の多数の種々のエピトープに対して存在したが、これらのエピトープの構造は分からなかった。したがって、用語「酸化ＬＤＬ抗体」とは、１種の特定の抗体ではなく種々の抗体の未知の混合物を指す。

アテローム性動脈硬化症病変には、免疫担当細胞の活性化および炎症性サイトカインの産生を特徴とする、進行中の炎症があることは十分に確証されている。高血圧症、血中脂質、糖尿病および喫煙のような確立された危険因子はこの炎症反応を促進する可能性が高いが、これが起こる機構は十分には特性決定されておらず、種々の互いに矛盾しない可能性が存在する。酸化された低密度リポタンパク質（ｏｘＬＤＬ）および熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）をはじめ、この免疫反応を引き起こし得るいくつかの異なる自己抗原が提案されている^２、３。アテローム性動脈硬化症における免疫反応の役割に関する入手可能なデータは複雑な関係を示している。この一例として、動物モデルにおけるアテローム発生に影響を及ぼす免疫化がある。ＨＳＰを用いる場合には、アテローム性動脈硬化症は増加するが、ｏｘＬＤＬが抗原である場合には減少する^４、５。

ヒト疾患におけるａＯｘＬＤＬの役割は複雑であるようである。ヒトでは、これまでに、ａＯｘＬＤＬは、境界域高血圧症、例えば初期心臓血管疾患の男性においてよりも、健常な対照において高いということが実証されている^７、８。最近の研究はこの観察結果と一致している^６。他方、何人かの著者が、ａＯｘＬＤＬはヒト心臓血管疾患（ＣＶＤ）、とりわけ後期段階のヒト心臓血管疾患において高まるということを報告している^{２、３、９、１０}。一例としては、ＣＶＤの極めて高い危険を伴う全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）および自己免疫疾患がある。ＣＶＤの病歴を有するＳＬＥ患者のａＯｘＬＤＬレベルは明らかに上昇していた^１１。これらのある程度矛盾する結果は、抗原性の相違をもたらす、種々の方法およびＬＤＬ酸化段階に応じて変わり得る。また、疾病段階および危険因子プロフィールが抗体レベルと関係していると思われる。

酸化された低密度リポタンパク質（ｏｘＬＤＬ）自体が、Ｔ細胞^{１２、１３}、単球／マクロファージおよび内皮細胞^{１４〜１６}の活性化をはじめ、多数の炎症誘発性特性を有している。ＯｘＬＤＬは、アテローム性動脈硬化症病変に由来する免疫担当細胞においても炎症を促進する^１７。しかし、ｏｘＬＤＬはまた、アテローム性動脈硬化症において見られるように、急性炎症反応を寛解させ、代わりにより軽度の慢性炎症を促進する場合があるということは留意しなければならない^１８。興味深いことに、ｏｘＬＤＬの多数の生化学的作用はｏｘＬＤＬ中の血小板活性化因子（ＰＡＦ）様脂質によって引き起こされる^{１９〜２１}。

ホスホリルコリン（ＰＣ）は、血小板活性化因子ＰＡＦ（これはＰＡＦ受容体との相互作用に必須である）のような炎症性リン脂質やｏｘＬＤＬにおいて主要な成分であるだけでなく、肺炎連鎖球菌（Ｓ．Pneumoniae）をはじめ多数の細菌の免疫原性成分としても主要な成分である。さらに、ＰＣはアポトーシス細胞によって発現される^２、２３。

ＵＳ５４５５０３２では、肺炎連鎖球菌などの感染に対する免疫保護を誘導するためのワクチンにホスホコリン複合体を用いている。バインダー（Binder）らによるマウスにおける肺炎球菌ワクチンに関する最近の研究では^２４、ワクチン接種はアテローム性動脈硬化症病変形成を低減させるということも分かった。アテローム性動脈硬化症マウスから得たｏｘＬＤＬに対する多数の自己抗体は、肺炎連鎖球菌をはじめとする一般的な感染性病原体に対して保護する抗体と構造上の同一性を共有しているということも分かった。ヒトではなくマウスにおけるこの研究からは特異性については何の情報も得られず、つまり、ＩｇＭ抗ホスホリルコリン抗体は、アテローム性動脈硬化症における保護因子として、対応するＩｇＧ抗体よりも有意により重要である。さらに、ホスホリルコリン複合体は肺炎球菌ワクチンに用いられていない。

別の研究では、抗ホスホリルコリン抗体レベルは歯周病を患うヒトでは上昇するということが分かった^２５。結論は、ホスホリルコリンは歯周細菌叢中の生物に関連する重要な経口抗原であり、抗ＰＣ抗体は歯周病の結果として高まるということである。アテローム性動脈硬化症の抗体および可能性ある保護またはアテローム性動脈硬化症の進行に関しては何の情報も示されていない。

アテローム性動脈硬化症の免疫治療に関する２つの文書（例えば、ＷＯ２００２０８０９５４およびＷＯ０１６８１１９）が公開されているが、これらはアポリポタンパク質Ｂのペプチド断片またはＴ細胞受容体のα／β鎖に対する抗体のいずれかの使用に基づくものである。リポタンパク質上の酸化特異的エピトープに対するモノクローナル抗体を用いてアテローム斑を検出する方法も記載されている（ＷＯ９９０８１０９）。これは、被験体サンプルにおいて、抗体、例えばＩｇＭまたはＩｇＧ抗体を検出するためにホスホリルコリン複合体を用いる、本発明において提案される方法とは異なっている。

国際公開第２００２／０８０９５４号 Binder, ChristophJohannes, "Defininginnate and adaptive immune mechanisms in the atheroprotective effect ofimmunization with oxidized low-density lipoproteins"DISSERTATION ABSTRACTSINTERNATIONAL, ２００２年，V63 N09-B, p4109, ［online］Dialog accession no.01907366, Database accession no. AADAA-13064459 Binder, ChristophJ, NATURE MEDICINE, ２００３年６月，V9 N6, p736-743 ROSE N, NATUREMEDICINE,米国，２００３年６月１日，V9 N6, p641-642 BINDER C J,NATURE MEDICINE, 米国，２００２年１１月１日，V8 N11, p1218-1226 SHAW P X, JOURNALOF IMMUNOLOGY, 米国，２００３年６月１５日，V170 N12, p6151-6157 Binder, ChristophJ, CIRCULATION, ２０００年１０月３１日，V102 N18, Supplement ▲II▼,p114-115

本発明はホスホリルコリン複合体、または抗体調製物、例えばホスホリルコリン複合体に対して特異性を有するモノクローナル抗体を含む薬剤組成物の使用および、アテローム性動脈硬化症の治療または予防、例えばアテローム性動脈硬化症の治療、予防またはさらなる進行の低減における、これらの組成物の使用に関する。さらに、本発明はまた、適宜、アジュバントを含む薬剤組成物を製造するための、ホスホリルコリン複合体または前記抗体調製物、例えばモノクローナル抗体の使用に関する。さらに、本発明はまた、虚血性心臓血管疾患を発症する危険の増減に関連している抗体、例えばＩｇＭまたはＩｇＧ抗体の有無を診断することに関する。

本発明の第１の態様は、アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患に対して、ヒトをはじめとする哺乳類を免疫化および治療するための医薬の製造における、少なくとも１種のホスホリルコリン複合体、または抗体調製物、例えばホスホリルコリン複合体に対して特異性を有するモノクローナル抗体を含む薬剤組成物の使用を提供する。この医薬は、アテローム性動脈硬化症に対する免疫原性特性または治療特性を有する免疫化を提供することを目的とするものである。

本発明の第２の態様は、アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患に対して、ヒトをはじめとする哺乳類を免疫化および治療する方法を提供し、この方法は哺乳類に、少なくとも１種のホスホリルコリン複合体、または抗体調製物、例えばホスホリルコリン複合体に対して特異性を有するモノクローナル抗体を含む薬剤組成物を投与するステップを含む。この薬剤組成物は、アテローム性動脈硬化症に対する免疫原性特性または治療特性を有する免疫化を提供することを目的とするものである。

ホスホリルコリン複合体とは、好ましくは、スペーサーを介して担体と結合しているホスホリルコリン部分を意味する。構造要素ホスホリルコリンはホスホリルコリンの誘導体を含み得る。上述のように、適したホスホリルコリン複合体の例は、ＵＳ５，４５５，０３２に記載されている。例えば、ＵＳ５，４５５，０３２は、ホスホリルコリン部分が直鎖アルキルおよび種々の免疫学的担体とのアミド結合によって結合されているホスホリルコリン複合体を提供している。ホスホリルコリン複合体は、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）−もしくはキーホールリンペット（limpet）ヘモシアニン（ＫＬＨ）−ホスホリルコリン複合体またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−ホスホリルコリン複合体（例えば、実施例に記載されるようなもの）であり得る。ＰＣ−ＢＳＡ（ホスホリルコリン−ウシ血清アルブミン）はバイオサーチ・テクノロジーズ社（Biosearch Technologies, INC）（米国、カリフォルニア州）から購入できる。ＨＳＡ−ＢＳＡは化学手順、例えば以下の手順によって、結合できる：

Ｏ−（４−アミノフェニルホスホリル）−コリン（Ｉ）は、チーズブロ（Chesebro）,Ｂによってバイオケミストリー（Biochemistry）１１、（１９７２）７６６頁に記載された手順にしたがって、Ｏ−（４−ニトロフェニル−ホスホリル）−コリン（シグマ（Sigma）Ｎ５８７９）から、触媒として炭の１０％パラジウムを用い、１ａｔｍの水素ガスで還元することによって定量的収量で調製できる。

（Ｉ）は、パディリャ（Padilla），Ｎ．Ｄ．らによってジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッヅ（Journal of Immunological Methods）２９３（２００４）１〜１１頁に記載された手順に本質的にしたがって、ＭＥＳバッファーｐＨ４中、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）を用いてＨＳＡとカップリングすることができる。結合されたＨＳＡは、ｐＨ７．４の緩衝食塩水に対する透析によって単離できる。

担体は、例えば、タンパク質、脂質またはポリマーであり得る。担体は、例えば、実施例に記載されるようなラテックスビーズであり得る。

医薬は注射による投与を意図するものであり得る。

本発明のさらなる態様は、虚血性心臓血管疾患の治療のための免疫療法または療法のための薬剤組成物の製造における、適宜、アジュバントと組合せた、本発明の前記の態様に関連して定義される、１種以上のホスホリルコリン複合体の使用を提供する。

本発明のさらなる態様は、アテローム性動脈硬化症を患っているか、虚血性心臓血管疾患を発症する危険に直面している、ヒトなどの哺乳類の予防的または治療的処置方法であって、治療上有効な量の少なくとも１種のホスホリルコリン複合体、または抗体調製物、例えばホスホリルコリン複合体に対して特異性を有するモノクローナル抗体を投与する方法を提供する。

本発明はまた、虚血性心臓血管疾患を発症する危険の増減に関連しているホスホリルコリンに対する抗体、例えばＩｇＭまたはＩｇＧ抗体の有無を調べる方法に関する。

本発明のさらなる態様は、虚血性心臓血管疾患を発症する危険の増減に関連している抗体、例えばＩｇＭまたはＩｇＧ抗体の有無を、ホスホリルコリン複合体を用いて診断する方法を提供する。

したがって、本発明のさらなる態様は、患者の虚血性心臓血管疾患を発症するか、虚血性心臓血管疾患が進行する危険を評価する方法であって、患者の、ホスホリルコリン複合体に反応性の抗体、例えばＩｇＭまたはＩｇＧ抗体のレベルを評価する方法における、ホスホリルコリン複合体の使用を提供する。

ホスホリルコリン複合体は、上記に記載されている。ホスホリルコリンはスペーサーを介して担体と結合できる。担体はタンパク質であり得、これはＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）であり得る。担体はラテックスビーズであり得る。

患者の、ホスホリルコリン複合体に反応性の抗体、例えばＩｇＭまたはＩｇＧ抗体のレベルは、免疫分析評価を用いて評価できる。適した免疫分析評価の例を以下に記載するが、どんな場合も当業者には明らかであろう。

ｏｘＬＤＬまたはＭＤ−ＬＤＬと反応性の抗体を測定することと、ならびにホスホリルコリン複合体に反応性の抗体、例えばＩｇＭまたはＩｇＧ抗体を測定することが望ましい場合がある。あるいはまたはさらに、（実施例に論じられるように）ＨＳＰ７０、ＨＤＬ、ＴＮＦおよび／またはＨＳＰ６０のレベルを測定することと、ならびにホスホリルコリン複合体に反応性の抗体、例えばＩｇＭまたはＩｇＧ抗体を測定することが望ましい場合がある。

［図１ａ］β２ＧＰＩ、ＰＳおよびＣＬによる、抗体（ＩｇＭ）の、ＰＣアルブミンでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートとの結合の阻害を示す図である。種々の抗原によるＰＣアルブミンコーティングされたプレートとの結合の阻害。ａＰＣの特異性を調べるために、実験の項に記載されたように競合分析評価イを実施した。結果は平均値±ＳＤとして示されている。
［図１ｂ］β２ＧＰＩ、ＰＳおよびＣＬによる、抗体（ＩｇＧ）の、ＰＣアルブミンでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートとの結合の阻害を示す図である。種々の抗原によるＰＣアルブミンコーティングされたプレートとの結合の阻害。ａＰＣの特異性を調べるために、実験の項に記載されたように競合分析評価を実施した。結果は平均値±ＳＤとして示されている。
［図２ａ］ｏｘＬＤＬおよびＭＤＡ−ＬＤＬによる、抗体（ＩｇＭ）の、ＰＣアルブミンでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートとの結合の阻害を示す図である。種々の抗原によるＰＣアルブミンコーティングされたプレートとの結合の阻害。ａＰＣの特異性を調べるために、実験の項に記載されたように競合分析評価を実施した。結果は平均値±ＳＤとして示されている。
［図２ｂ］ｏｘＬＤＬおよびＭＤＡ−ＬＤＬによる、抗体（ＩｇＧ）の、ＰＣアルブミンでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートとの結合の阻害を示す図である。種々の抗原によるＰＣアルブミンコーティングされたプレートとの結合の阻害。ａＰＣの特異性を調べるために、実験の項に記載されたように競合分析評価を実施した。結果は平均値±ＳＤとして示されている。
［図３］ＩＧＩＶから抽出したａＰＣによる、マクロファージにおけるｏｘＬＤＬ取り込みに対する作用を示す図である。
本発明者らは２つのグループを試験した。：１つは、ｏｘＬＤＬとマクロファージを共にし、もう１つは、ｏｘＬＤＬとマクロファージを共にし、＋ＩＧＩＶから抽出したａＰＣとともにプレインキュベーションした。
マクロファージ＋ｏｘＬＤＬ（全１０７細胞）：弱い染色３７／１０７＝３４．５８％、強い染色１０／１０７＝９．３５％全染色陽性４７／１０７＝４３．９３％
マクロファージ＋Ｄｉｌ−ｏｘＬＤＬ＋ａＰＣ群（１５６細胞を調査）：弱い染色３７／１５６＝２３．７２％、強い染色２／１５６＝１．２８％全染色陽性３９／１５６＝２５％。
［図３Ａ］Ｄｉｌ標識ｏｘＬＤＬでの染色を示す図である。
［図３Ｂ］未標識ｏｘＬＤＬでの染色を示す図である。
［図４］高抗リン脂質抗体（ａＰＬ）力価血清を、ヒトのプールされた免疫グロブリンガンマガード（Gammagard）（登録商標）とともにプレインキュベーションしたことのアネキシンＶとヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）との結合に対する効果：２４時間培養後のフローサイトメトリー解析を示す図である。

［図５］内皮細胞におけるＩＣＡＭ誘導に対するａＰＣの作用を示す図である。内皮細胞の培養物に１μｇ／ｍｌのＰＡＦを加え、ａＰＣＩｇＭとともにプレインキュベーションを行うか行わなかった。ＩＣＡＭ−１の発現を、ＦＡＣＳｃａｎによって調べた。緑色の線はＰＡＦ作用を表し、赤色はＰＡＦ＋ａＰＣＩｇＭを表し、黒色は対照を表す。データは、ａＰＣＩｇＭを添加した場合のヒストグラムの左への移動を明確に示す。

以下に開示する実施例は、単に本発明を例示する目的で提供されるものであって、添付の特許請求の範囲に概説される範囲の何らかの制限と考えてはならない。本明細書において記載された文書は、参照により本明細書に組込まれる。

虚血性心臓血管疾患を発症する危険の増減と関連している、ホスホリルコリンに対するＩｇＭ抗体の有無（またはレベル）を調べる方法の一例を記載する。当技術分野で公知の他の方法も使用できる。同様の方法を用いてホスホリルコリンに対するＩｇＧ抗体の有無（またはレベル）を調べることができる。

ホスホリルコリンに対するＩｇＭ抗体の有無を調べる方法
ＰＣ−ＢＳＡに対するＩｇＭ抗体を、酵素結合免疫測定法によって調べた。

マイクロタイタープレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に入れたＰＣ−ＢＳＡ（１０μｇ／ｍｌ；例えばバイオサーチ・テクノロジー社（Biosearch Technologies, INC）（米国、カリフォルニア州）製）でコーティングした。

ＰＢＳで洗浄した後、２％ＢＳＡ溶液でプレートをブロッキングした。血清サンプルは０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した（１：３０）。プレートを４０℃で一晩インキュベートし、洗浄した。アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＭ（サンプルバッファーで１：７０００希釈したもの）を１００μｌ／ウェル（well）で加え、４０℃で一晩インキュベートした。洗浄後、アルカリホスファターゼ基質を加え、プレートを室温、暗所で６０分間インキュベートすることによって色を発現させた。吸光度は分光光度計において４０５ｎｍで読み取った。

ホスホリルコリンに対して種々の担体およびスペーサーを試験した。例示した担体はこれらに制限するものではない。その他のタンパク質、脂質またはポリマー、例えば当技術分野で公知であるラテックスビーズなどのその他の担体も使用できる。担体は、上述のようにＵＳ５，４５５，０３２に開示されている。

本発明の方法によって検出されるＩｇＭまたはＩｇＧ抗体はまた、ＰＣが露出しているＰＣ含有化合物中、例えばリゾホスファチジルコリン（リゾＰＣ；例えば、キム（Kim）ら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Journal of Experimental Medicine）、２００２年９月２日、１９６（５）、６５５〜６５頁参照）中に存在するホスホリルコリン（ＰＣ）と結合できる。したがって、本発明の方法は、リゾホスファチジルコリンと結合するＩｇＭまたはＩｇＧ抗体を検出できる。

ホスホリルコリン複合体の合成および薬剤組成物の調製
ラテックスビーズ（０．２０μｍまたは０．８１μｍ）をＰＢＳに懸濁し、ホスホリルコリン−ＢＳＡの１０μｇ／ｍl溶液と一晩混合した。次いで、このビーズを遠心分離し、バッファーで数回洗浄し、ＢＳＡの１０μｇ／ｍｌ溶液でブロッキングした。さらに洗浄を反復した後、ビーズを適したバッファーで適した濃度に再懸濁し、使用まで冷蔵保存した。

リンカーアームを有するホスホリルコリンはまた、ジアゾフェニル基を介してＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）に結合できる。チーズボロ（Chesebro），Ｂおよびメッツガー（Metzger）,Ｈ、（１９７２）バイオケミストリー（Biochemistry）１１：７７６頁にしたがい、ＰＣのｐ−ニトロフェニル−６−（Ｏ−ホスホコリン）ヒドロキシヘキサノエート誘導体を合成できることがより好ましい。ｐ−ニトロフェニル−６−（Ｏ−ホスホコリン）ヒドロキシヘキサノエートは、これをＫＬＨに添加する直前に乾燥アセトニトリルに溶解した（１００ｍｇ／ｍｌ）。誘導体およびＫＬＨを４℃で一晩混合し、次いで、結合していないスペーサーと脱離基であるｐ−ニトロフェニレートを透析して除去した。

適したバッファーに懸濁した、調製したホスホリルコリン複合体の注射溶液は、免疫化に直接使用できる。

ホスホリルコリン複合体での免疫化
２００μｇ［ｐ−ニトロフェニル−６−（Ｏ−ホスホコリン）ヒドロキシヘキサノエート−ＫＬＨ］腹腔内で免疫化した後にＢＡＬＢ／ｃマウスから得た血漿において、提案された免疫分析評価法を用い、ホスホリルコリンを認識する高力価のＩｇＭ抗体を調べた。

ホスホリルコリン複合体に対するモノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、当技術分野で公知のいずれかの標準的な方法を用いて作製できる。例えば、「ブリルス（Briles）ＤＥ、フォアマン（Forman）Ｃ、ヒュダック（Hudak）Ｓ、クラフリン（Claflin）ＪＬ．Ｔ１５インディオタイプの抗ホスホリルコリン抗体はストレプットコッカス肺炎に対し最適に保護する（Anti-phosphorylcholine antibodies of the T15 idiotype are optimally
protective against Streptococcus pneumoniae）。ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Journal of
Experimental Medicine）、１９８２、１５６、１１７７〜８５頁」または「モノクロナル抗体に結合しているＴ１５ＰＣは、ＩｇＭからＩｇＧに変換されたときに特異性を維持する（T15 PC binding monoclonal antibodies retain specificity when they
switch from IgM to IgG）。スピラ，ギャド（Spira, Gad）、アギラ，ヘクター（Aguila, Hector）Ｌ、シャーフ，マシュー（Scharff, Matthew）Ｄ．テクニオン−イスラエル工科大学、医学部（Fac. Med. , Techniton-Israel Inst. Technol.）、イスラエル、ハイファ、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Journal of Immunology）（１９８８）、１４０（８）、２６７５〜８０頁。

ホスホリルコリン複合体に対するその他の抗体は当業者に周知の方法を用いて調製できる。例えば、以下に記載のように、例えば、ホスホリルコリン複合体を用いるアフィニティー精製によって、ヒト免疫グロブリン製剤のａＰＣ活性を有するサブフラクションを調製できる。静脈内免疫グロブリン投与製剤（例えば、ＩＧＩＶ；バクスター（Baxter）他）は、市販されているＩｇＧの高度に精製された製剤であり、抗体産生がないか、抗体産生レベルが極めて低い患者の治療に用いられている。免疫グロブリン製剤としては、以下の製造業者から入手できるものが挙げられる；バクスター（Baxter）（米国）例えばガンマガード（Gammagard）（登録商標）、イシベン（Isiven）（イタリア、アンティモナプレス（Antimo Naples））、オムリックス（Omrix）（イスラエル、テルアショメル（Tel-Hashomer））、マイルス（Miles）（生化学製品部門（Biological Products Division）、コネチカット州、ウェストヘブン）、スクラボ（Sclavo）（イタリア、ルッカ）、サンド（Sandoz）（スイス、バーゼル、ノバウティス（Novautis））、例えばサンドグロブリン（Sandoglobulin）（登録商標）、ビオテスト・ダイアグノスティック社（Biotest Diagnostic Corporation）（ニュージャージー州、ダビール（Deville））。免疫グロブリン製剤の例としては、ガンマガード（Gammagard）Ｓ／Ｄ（登録商標）、ガンマー（Gammar）ＩＶ（登録商標）、ガンマー（Gammar）-ＰＩＶ（登録商標）、ガムイミュン（Gammimune）Ｎ（登録商標）、イベガム（Iveegam）（登録商標）、パングロブリン（Panglobulin）（登録商標）、ポリガム（Polygam）Ｓ／Ｄ（登録商標）、サンドグロブリン（Sandoglobulin）（登録商標）、ベノグロブリン（Venoglobulin）（登録商標）がある。免疫グロブリン製剤は、通常、数種のＩｇＭならびにＩｇＧを含む。ガンマーガード（Gammagard）（登録商標）中には微量のＩｇＭが存在する。ペンタグロビン（ビオテスト（Biotest））は、ＳＡＲＳの治療に用いられている濃縮ＩｇＭ製剤である。ａＰＣ活性を有するサブフラクションはＩｇＧとＩｇＭの双方を含む場合もあり、または主にＩｇＧを含むよう選択することもでき（例えば、ガンマーガード（Gammagard）（登録商標）などのＩｇＧが豊富な製剤で出発することによって、および／またはＩｇＧについて選択することによって）、もしくは主にＩｇＭを含むように選択することもできる（例えば、ペンタグロビンなどのＩｇＭが豊富な製剤で出発することによって、および／またはＩｇＭについて選択することによって）。

ホスホリルコリン複合体に対して特異性を有する抗体調製物は、結合していないホスホリルコリンと結合し、また、ＰＣが露出しているＰＣ含有化合物中に、例えば、リゾホスファチジルコリン（リゾＰＣ；例えば、キム（Kim）ら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Journal of Experimental Medicine）、２００２年９月２日、１９６（５）、６５５〜６５頁参照）中に存在するホスホリルコリン（ＰＣ）とも結合し得る。したがって、ホスホリルコリン複合体に対して特異性を有する抗体調製物は、また、リゾホスファチジルコリンと結合し得る。

アテローム性動脈硬化症の被験体におけるＩｇＭ免疫グロブリンレベル
高血圧症の被験体（拡張期血圧＞９５ｍｍＨｇ）において、ホスホリルコリンに対するＩｇＭ自己抗体レベルを、ベースラインおよび４年後にアテローム性動脈硬化症の危険因子の相関研究において調べた。結果を以下に要約する。

登録時に７７人の被験体（３５％）で、４年後の追跡調査では８４人の被験体（３８％）で頸動脈プラークが検出された。この研究には全部で２１８人のヒト被験体がいた。追跡調査時の内膜−中膜肥厚（ＩＭＴ）の増加は、登録の時点でＰＣに対するＩｇＭの高血清レベルを有する被験体（７５または９０パーセンタイル）ではあまり広まっていなかった。ＩＭＴが増加した個体とＩＭＴが低下した個体間のＩｇＭ抗ホスホリルコリン抗体レベルの平均値間には有意な相違がある（６３８．８±２１９．６対７３４．８±２６６．９、ｐ＝．００４）。

ＰＣに対するＩｇＭ自己抗体とＩＭＴの変化の間の関係は、年齢、喫煙習慣、アテノロールまたはラシジピン（lacidipine）での治療および血中脂質とは無関係であった。ＩｇＭ自己抗体はまたＩｇＧ値とも無関係であった。

したがって、本発明の一実施形態は、アテローム性動脈硬化症の治療または予防に用いられる薬剤組成物の調製のために、ホスホリルコリン複合体を使用することである。複合体は、タンパク質またはポリマーに結合したホスホリルコリンであり得る。薬剤組成物は注射によって与えられることが好ましい。

能動免疫化という提案される方法は、自己抗体力価を調節し、これが順にアテローム性動脈硬化症の発症に対して正の作用を有することとなる。

本発明のもう１つの実施形態は、アテローム性動脈硬化症の治療または予防に用いられる薬剤組成物の調製のために、ホスホリルコリン複合体を認識する抗体調製物、例えば、モノクローナル抗体を使用することである。モノクローナル抗体は当技術分野で公知の方法を用いて作製できる。

本発明のさらなる実施形態は、ホスホリルコリン複合体を用いて、ホスホリルコリンに対する抗体、例えばＩｇＭまたはＩｇＧ抗体の有無を診断する方法を提供することであり、この因子は虚血性心臓血管疾患を発症する危険の増減と関連している。好ましい方法は免疫分析評価である。この方法は、患者の、虚血性心臓血管疾患を発症するか、虚血性心臓血管疾患が進行する危険の評価に使用できる。

被験体
血清サンプルは、２２６人の確立した高血圧症の被験体（拡張期血圧＞９５ｍｍＨｇ）から得、その後、それらをアテローム性動脈硬化症に対する欧州のラシジピン研究（the European Lacidipine Study on Atherosclerosis）（ＥＬＳＡ）^{２５、２６}のスウェーデン成分に登録した。サンプルは、測定されるパラメーターに対する治療の作用を最小にするために、投薬を全くしない４週間の休薬期間の後に集めた。血圧、コレステロールおよびトリグリセリドレベルを先に記載された通りに調べた^{２５、２６}。その後、１１５人の被験体をβ遮断薬アテノロールでの処置に割り当て、１１１人の被験体をカルシウムアンタゴニストラシジピンでの処置に割り当てた。この研究はカロリンスカ病院（Ｋarolinska Hospital）の倫理委員会によって承認され、ヘルシンキ宣言にしたがって実施した。すべての被験体にはインフォームドコンセントを与えた。

頸動脈超音波
頸動脈超音波測定を実施し、他で詳細に記載された通りに分析した^{２５、２６}。ベースラインおよび４年後追跡調査で全部で２１８人の患者が有効な超音波測定値を有していた。簡単に言えば、８．０ＭＨｚ環状アレイトランスデューサを用いるＢｉｏｓｏｕｎｄ２０００ＩＩＡデュプレクス（duplex）スキャナーで、左右の頸動脈を調べた。奥の壁において、内膜−中膜（Ｉ−Ｍ）肥厚を、内腔−内膜エコーの前縁と中膜−外膜エコーの前縁間の距離として測定した。アテローム性動脈硬化症の代用指標としての結果判定は、４年後追跡調査での末梢側総頸動脈と頸動脈両側分岐部中の４箇所の奥の壁の平均最大内膜−中膜肥厚（ＩＭＴ）の変化（ＣＢＭｍａｘ）とした。研究に登録した時点でのＰＣに対する抗体レベルと、４年後追跡調査時のＩＭＴの増減の間の関連を評価した。

試薬
ポリソープ（Polysorp）Ｆ９６マイクロタイターイムノ−プレートはヌンク（Nunc）（デンマーク、ロスキレ）から購入し、ＰＣ−ＢＳＡ（ホスホリルコリン-ウシ血清アルブミン）はバイオサーチ・テクノロジーズ社（Biosearch Technologies, INC）（米国）から購入した。

ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ｒ鎖特異的）、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＭ（ｕ鎖特異的）、ＰＮＰＰ（アルカリホスファターゼ基質）はシグマ（Sigma）（米国、ミズーリ州、セントルイス）から入手した。カルジオリピン（ＣＬ）はＡＶＡＮＴＴ（米国）から購入し、β_２糖タンパク質（β_２ＧＰ１）はカルバイオケム（Calbiochem）（米国）から入手した。

総ＩｇＧおよびＩｇＭレベルは、先に記載されているような慣例の技術によって求めた^６。

ＣＲＰは、血清において、粒子増感された免疫比濁分析（ベイリング・ネフェロメーター・アナライザー（Behring Nephelometer Analyzer）、ＢＮ II（デイドベイリング社（Dade Behring GmBH）、ドイツ、マールブルク））を用いる高感度法によって分析し、アンティア（antir）分析評価変動＜４％であった。

ＰＣ、ｏｘＬＤＬおよびＭＤＡ−ＬＤＬに対する自己抗体の測定
ＰＣ−ＢＳＡに対するＩｇＧおよびｉｇＭ抗体を、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって調べた。１７人の抗リン脂質症候群の患者から得たプールした血清を、内部標準として用い、プレート毎に試験した。抗体結合のプラトーは１０μｇ／ｍｌという抗原濃度で到達した。したがって、Ｆ９６マイクロタイターポリソープ（polysorp）プレートを、ＰＢＳ中ＰＣ−ＢＳＡ（１０μｇ／ｍｌ）５０μｇウェルでコーティングした。コーティングしたプレートを４℃で一晩インキューベートした。ＰＢＳで５回洗浄した後、２％ＢＳＡ−ＰＢＳを用い、室温で２時間プレートをブロッキングし、上記のように洗浄した。血清サンプルは０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈（１：３０）し、５０μｌ／ウェルで加えた。

ＬＤＬは、記載されたように^６、健常なドナーの血漿から連続分離超遠心によって単離し、銅イオンの使用によって酸化させるか（ＯｘＬＤＬ）、ＭＤＡを用いて誘導体化した（ＭＤＡ−ＬＤＬ）。

ＯｘＬＤＬおよびＭＤＡ−ＬＤＬは、本質的には記載されたように^６ＥＬＩＳＡによって測定した。ＯｘＬＤＬまたはＭＤＡ−ＬＤＬはコーティングバッファー（炭酸−重炭酸バッファー５０ｍＭｐＨ９．７）で２μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌ／ウェルを用いてＥＬＩＳＡプレート（コスター（Costar）２５８１）をコーティングした。このプレートを４℃で一晩維持し、ＰＢＳで４回洗浄し、次いで、ＰＢＳ中２０％成体ウシ血清（２０％ＡＢＳ−ＰＢＳ）を用い、室温で２時間ブロッキングした。次いで、それらを、２０％ＡＢＳ−ＰＢＳで１：３０希釈した１００μｌの血清とともに４℃で一晩インキュベートした。

プレートを４℃で一晩インキュベートし、上記のように洗浄した。アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（サンプルバッファーで１：９０００希釈したもの）およびアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＭ（サンプルバッファーで１：７０００希釈したもの）を、１００μｌ／ウェルで加え、４℃で一晩インキュベートした。５回洗浄した後、アルカリホスファターゼ基質（ＰＮＰＰ）を１００μｌ／ウェルで加え、プレートを室温、暗所で６０分間インキュベートすることによって色を発現させた。プレートは、ＥＬＩＳＡマルチスキャンプラススペクトロフォトメーター（Multiskan Plus spectrophotometer）において４０５ｎｍで読み取った。すべてのサンプルを単一の分析評価したところ、変動係数は１０〜１５％より小さかった。

抗ホスホリルコリン−ＢＳＡ抗体の特異性
抗ホスホリルコリン−ＢＳＡの特異性を調べるために、プールした高力価血清を使用することによって吸収分析評価を実施した。ＰＣ−ＢＳＡとの最大結合の５０％を生じる希釈で、高力価血清を、種々の濃度のＰＣ−ＢＳＡとともにプレインキュベートした。ボルテックス処理した後、試験管を４０℃で一晩インキュベートし、１３０００ｒ．ｐ．ｍ．で３０分間（４０℃）遠心分離した。上清を、記載したようにＰＣ−ＢＳＡとの抗体結合について調べた。阻害のパーセンテージは以下のように算出した：

阻害パーセント＝（競合物のないＯＤ−競合物のあるＯＤ）×１００／競合物のないＯＤ

統計分析
抗ホスホリルコリンレベルを７５パーセンタイルと９０パーセンタイルで二分した。示したように、ロジスティック回帰分析およびオッズ比（ＯＲ）の算出および９５％信頼区間（ＣＩ）、またはスピアマン相関を用いる比較を用いて、ＩＭＴの増加（はいまたはいいえ）を評価することによって、抗ホスホリルコリン（またはその他の抗体）と４年間にわたるアテローム性動脈硬化症の進行の間の関連を調べた。年齢、喫煙習慣、血清コレステロール、血清トリグリセリドおよび抗高血圧治療の様式（ラシジピン、アテノロール）をはじめ、可能性ある交絡因子について調製を行った。両側ｐ値＜０．０５を有意と考えた。

結果
研究に登録した時点での被験体の基本特性は他で詳細に記載されており（ポックレー（Pockley）ら（２００３）ハイパーテンション（Hypertension）４２、２３５〜２３８頁）、表１に示す。

競合研究は、ＩｇＭおよびＩｇＧサブクラスのａＰＣは、ＰＣ−ＢＳＡとともにプレインキュベーションすることによって競合されたが、カルジオリピンは弱い競合能しか有しておらず、ホスファチジルセリンは競合能を有していなかったということを示す（図１ａ、１ｂ）。β２−糖タンパク質ＩはＰＣ−ＢＳＡとのＩｇＧ結合について、ある程度まで競合したが、ＩｇＭについてはそれほどではなかった（図１ａ、１ｂ）。ＰＣ−ＢＳＡは、調べた他の抗原とは競合して結合する低い能力しか有していなかった（データは示していない）。ＯｘＬＤＬおよびＭＤＡ−ＬＤＬはＰＣ−ＢＳＡとのＩｇＭａＰＣの結合に競合し得、また、ＩＧＧａＰＣの結合にも同程度までではないが競合し得た（図２ａ、２ｂ）。

追跡調査時のＩＭＴの増加は、登録の時点でＰＣ（７５または９０パーセンタイル）、ｏｘＬＤＬおよびＭＤＡ−ＬＤＬ（９０パーセンタイル）に対するＩｇＭの血清レベルが高い被験体ではあまり広まっていなかったが、ＣＲＰはＩＭＴ変化と関連がなかった（表２）。

ロジスティック回帰分析により、ＰＣ、ｏｘＬＤＬおよびＭＤＡ−ＬＤＬに対するＩｇＭ自己抗体とＩＭＴの変化の間の関係は、年齢、喫煙習慣、アテノロールまたはラシジピンでの治療および血中脂質とは無関係であったということが示された。ａＰＣＩｇＭはまた、７５パーセンタイルと９０パーセンタイルの双方でＩＭＴの変化と有意に関連していたが、ＩｇＭサブクラスのａＯｘＬＤＬおよびａＭＤＡ−ＬＤＬは、９０パーセンタイルでしか有意性を示さなかった（表３ａ〜ｄ）。ＩｇＭ自己抗体はＩｇＧ値とも無関係である（データは示していない）。さらに、全ＩｇＧおよびＩｇＭレベルはＩＭＴ測定値または変化と関連していなかった（データは示していない）。

ＩＭＴが増加した被験体ではＰＣに対するＩｇＧ自己抗体は傾向的に低かったが、この相違は統計的な有意性には達しなかった。（表２）。

男性と女性のａＰＣ、ａＭＤＡ−ＬＤＬおよびａＯｘＬＤＬのＩｇＭサブクラス間には著しい相違があり、男性においてよりも女性において有意に高かった（ｐ’ｓ＜０．０５）。対照的に、これらの自己抗体のＩｇＧレベルには男性と女性の間で相違はなかった。さらに、女性はベースラインおよび追跡調査時のプラークの発生が有意に低かった（ｐ＜０．０５）。

ａＰＣＩｇＭレベルはＩＭＴの増加と負に相関しており（Ｒｈｏ０．１８、ｐ＝０．００６）、対照的に２種の他の保護因子、ＨＤＬおよびＨＳＰ７０は、連続測定時のＩＭＴ変化と相関していなかった（データは示していない）。ａＰＣＩｇＭとは異なり、これらの測定ではａＯＸＬＤＬおよびａＭＤＡ−ＬＤＬはこれらの有意性に到達しなかった（データは示していない）。

ａＰＣＩｇＭレベルとａＯＣＬＤＬＩｇＭ（Ｒｈｏ０．７４、ｐ＜０．００１）およびａＭＤＡ−ＬＤＬＩｇＭ（ｒｈｏ０．５１、ｐ＜０．００１）との間には有意な関連があった。同様にａＰＣは、ＨＳＰ６０（Ｒｈｏ０．２８、ｐ＜０．００１）、ＨＳＰ７０（Ｒｈｏ０．３５、ｐ＜０．００１）と相関があり、これらは本発明者らがこのコホートにおけるヒトアテローム性動脈硬化症の新規保護因子として最近記載し（ポックレー（Pockley）ら（２００３）前掲）、またＨＤＬとも相関があった（Ｒｈｏ０．２３、ｐ＜０．０１）。ａＰＣＩｇＭ、ａＯｘＬＤＬＩｇＭまたはａＯｘＬＤＬ、ＭＤＡ−ＬＤＬおよびＬＤＬ、ＣＲＰまたはトリグリセリド間には関連はなかった（データは示していない）。

年齢、総コレステロール、トリグリセリド、喫煙および治療について制御しつつ、男性および女性について別個のロジスティック回帰分析を行った場合、ＩｇＭａＰＣはそれぞれ、女性においては９０パーセンタイルを調べた場合にのみ有意な保護作用を示し（ＥＸＰ（Ｂ）＝．１７、９５％ＣＩ＝０．０５〜．６８；ｐ＝０．０１）、男性では７５パーセンタイルを調べた場合にのみ有意な保護効果を示した（それぞれ、ＥＸＰ（Ｂ）＝．１８、９５％ＣＩ＝０．０４〜．７４；ｐ＝０．０１）。

ＭＤＡ−ＬＤＬおよびｏｘＬＤＬに対するＩｇＭは、女性の値のみが独立に統計的有意性に達したのでこの点において異なっている。したがって、年齢、総コレステロール、トリグリセリド、喫煙および治療について制御しつつ、男性および女性について別個のロジスティック回帰分析を行った場合に、ＭＤＡ−ＬＤＬに対するＩｇＭおよびｏｘＬＤＬに対するＩｇＭは女性では有意な保護作用を示したが（それぞれ、ＥＸＰ（Ｂ）＝１７、９５％ＣＩ＝．０５〜．６８、ｐ＝０．０１およびＥＸＰ（Ｂ）＝．１８、９５％ＣＩ＝．０４〜．７４、ｐ＝０．０１）、男性の間では作用は有意性に達せず（それぞれ、ＥＸＰ（Ｂ）＝．６０、９５％ＣＩ＝．１５〜２．２、ｐ＝０．４４およびＥＸＰ（Ｂ）＝．３９、９５％ＣＩ＝．１０〜１．５、ｐ＝０．１７）、このことはＯｘＬＤＬに対する、およびＭＤＡ−ＬＤＬに対する高いＩｇＭ力価は女性の間で特異的に保護的であり得るということを示す。

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ＰＣの保護作用を示す研究
マルメ（Malmo）の観察研究（ザ・マルメ・ダイエット・アンド・キャンサー・スタディー（the Malmo Diet and Cancer Study））では、頸動脈の超音波測定による無症状アテローム性動脈硬化症の非侵襲評価を含む、大規模な心臓血管研究にコーホートからの３００００人の被験体のうち約６０００人が当てられた。さらに、さらなる心臓血管の危険因子をベースラインで測定した。これらの被験体を、心臓血管疾患の新規イベント（心筋梗塞、慢性冠動脈心疾患、アテローム血栓性卒中）の発生に関して１０年間追跡調査した。９５％信頼区間で（相対ハザードとして算出される）相対危険度を評価するために、低レベルの、ホスホリルコリンに対する抗体（ａＰＣ−ＩｇＭ）について、コーホート内症例対照解析（症例あたり３対照）を行った。全部で１４５ＣＶＤ症例（主に、心筋梗塞（ＭＩ）および虚血性卒中）があり、４００の年齢および性別がマッチした対照があった。ａＰＣのカットオフレベルは、ａＰＣレベルの１０パーセンタイルの３０７とした。１０パーセンタイルより低いａＰＣレベルにおいて２０ＣＶＤ症例（１４％）があり、３４（９％）の対照があり、これは１．９（９５％ＣＩ１．１〜４．３）という相対ハザードに相当していた。ａＰＣの１０パーセンタイルよりも低い男性ＣＶＤ症例の対応する数は、１６（１９％）であり、このレベルより低い２５（１１％）の対照患者があり、これは１．９（９５％ＣＩ１．１〜３．５）という相対ハザードに相当していた。女性の症例の数は、相対危険度に関して確固たる情報を得るには少なすぎた（表１および２参照）。結果から、健常な被験体における低いａＰＣレベルは心臓血管疾患の発生の予測となり、心臓血管疾患のマーカーとして作用し得るということが示唆される。

ａＰＣの作用
はじめに
本発明者らは、ＰＣ−ＢＳＡ、ＰＣ−ＫＬＨまたは肺炎球菌ワクチン（スタテンズ・セーラム社（Statens Serum Institute）、デンマーク）を予め吸着させたカラムを用いることによって、これらの化合物に対して反応性を有する抗体を抽出した。ａＰＣＩｇＧのレベルはこれらのうち少なくとも最初に２種では上がる。ＩＶＩＧから少量のＩｇＭも抽出し、次いで、前記の抗原を予め吸着させたカラムに流すこともできる。本発明者らは、この方法によってＩｇＧおよびＩｇＭサブクラスのポリクローナルヒトａＰＣを得ることができる。タンパク質測定値から、０．５ｍｇ／ｍｌというａＰＣＩｇＭレベルを抽出できたことが示唆される。本発明者らはこれらの抗体を用い、ｉｎｖｉｔｒｏモデルを用いて、その機能的特性を試験できる：
１．漸増濃度のａＰＣＩｇＭを、酸化したＬＤＬとともにプレインキュベーションすることによって、単球／マクロファージ細胞株、ＴＨＰ１における結合および取り込みを低減し得るか？共焦点顕微鏡および／またはＦＡＣＳを用いる試験系を使用できる。
２．漸増濃度のａＰＣＩｇＭを対照として正常なＩｇＭとともに、ＰＡＦ、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）とともにプレインキュベートすることによって、これらの脂質による内皮細胞での接着分子ＩＣＡＭの誘導を阻害できるか？また、その他のサイトカインは市販のキットを用いて試験できる（数種の異なるサイトカイン；バイオソース（BioSource））。試験にはＦＡＣＳｃａｎを使用できる。

細胞培養
２継代の低温保存したプールしたＨＵＶＥＣを、カスケード・バイオロジックス社（Cascade Biologics Inc.）（米国、オレゴン州、ポートランド）から購入した。培養物は、２％ウシ胎児血清およびサプリメントを含有する、ＥＧＭ（商標）フェノールレッド不含培地（クロネティックス（Clonetics）、米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）で維持した。この細胞を、加湿した５％ＣＯ^２条件下、７５ｃｍ^２のフラスコ（ＴＰＰ、ＡＧ、トラサディンゲン（trasadingen）、スイス）中、３７℃でインキュベートした。

すべての実験は３〜４継代で実施した。細胞を、フローサイトメトリー分析のために２×１０^４個細胞／ｍｌの密度で１２ウェルプレート（ヌンク社（NUNC Inc.）、米国、イリノイ州、ネーパービル）に播種した。１２〜２４時間付着させた後、細胞を処理の前に少なくとも１２時間ＳＦＭで静止状態にした。

単球細胞株ＴＨＰ−１はＡＴ＆Ｔ（米国）から入手した。細胞は１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩで維持した。

ａＰＣの調製
ＩｇＭまたはＩｇＧの総フラクションは、ハイトラップ（HiTrap）ＩｇＭまたはＩｇＧカラム（アマシャム・バイオサイエンセス（Amersham Biosciences））を用いて、５０ｍｇ／ｍｌの市販のプールされたヒト免疫グロブリン（ガンマーガード（Gammagard）（登録商標））から分離した。ホスホリルコリン（ＰＣ）に対する抗体は、ＩｇＭまたはＩｇＧフラクションを、キーホールリンペットタンパク質（ＫＬＨ）（１もしくは５ｍｇ／ｍｌ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（１ｍｇ／ｍｌ）のいずれかと結合しているＰＣとカップリングしているＮＨＳ−セファロースカラムに装填した後、続いてＢＳＡのみのカラムにより溶出した。ＰＣ−ＢＳＡ（ホスホリルコリン−ウシ血清アルブミン）およびＰＣ−ＫＬＨは、バイオサーチ・テクノロジーズ社（Biosearch Technologies, INC）（米国、カリフォルニア州）から購入した。溶出フラクションは、ＰＤ−１０カラムでバッファー交換し、ミリポアセントリコン（Millipore Centricone）（登録商標）装置で濃縮した。手順は、製造業者によって与えられた説明書にしたがって実施した。調製したＩｇＭａＰＣの濃度は、通常、５０μｇ／ｍｌであり、ＩｇＧａＰＣの濃度は、通常３０μｇ／ｍｌであった。

ＴＨＰ−１由来マクロファージによる、ｏｘＬＤＬのスカベンジャー結合および取り込み
酸化されたＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）は、記載されたように、銅イオンとともにインキュベーションすることによって調製する。第１に、ｏｘＬＤＬをＤｉｌ（Ｄｉｌ−（１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルヨードカルボシアニンパーコレート；モレキュラー・プローブス社（Molecular Probes, Inc））で標識し、生理食塩水−ＥＤＴＡバッファーで１ｍｇ／ｍｌに希釈する。その後、１ｍｇのｏｘＬＤＬにつき２ｍｌのリポタンパク質欠乏血清を加え、次いで、濾過する（０．４５μｍ）。１ｍｇのｏｘＬＤＬにつき５０μｌのＤＭＳＯ中Ｄｉｌ（３ｍｇ／ｍｌ）を加え、混合物を１５時間、３７℃でインキュベートし、次いで、数回交換する生理食塩水−ＥＤＴＡに対して６時間透析する。この後、混合物を再度、０．４５μｍで濾過する。

蛍光／共焦点顕微鏡を用いてｏｘＬＤＬの取り込みを調べる。単球／マクロファージのモデルとしてＴＨＰ−１細胞を、スライドチャンバー上で一晩増殖させる（培地：ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／Ｇｌｕ／ＰＥＳＴ）。
ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地で３回洗浄する。
ｏｘＬＤＬ−ＤｉＯ５μｇ／ｍｌ（ＳＦＭ培地）とともに６時間インキュベートする。
細胞を０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳで５回、ＰＢＳで１回洗浄する。

マクロファージ核染色：細胞を１μｇ／ｍｌのビスベンジミドとともに１０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。

固定およびマウント：次いで、細胞をＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで３０分、ＰＢＳで３回、最後に1滴のマウントゲルで固定した。スライドはカバースリップで覆った。

内皮細胞とのアネキシンＶ結合
アネキシンＶ結合を阻害する高い能力を有する、ヘパリン保存した血漿を、ＳＦＭ中１０％という濃度でＨＵＶＥＣ単層に加えた。２４時間後、細胞を細胞解離溶液（Cell Dissociation Solution）（ＣＤＳ；シグマ−アルドリッチ（Sigma- Aldrich）、米国、ミズーリ州、セントルイス）で回収し、上清を用い、はがれた浮遊細胞の選択的減少をなくすよう注意深くプールし、１２００ｒｐｍで７分の遠心分離を続けた。１００μｌのアネキシンＶ結合バッファー（モレキュラー・プローブス社（Molecular Probes Inc）、米国、オレゴン州、ユージーン）に再懸濁した後、サンプルを２μｌの５ｍｇ／ｍｌアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（モレキュラー・プローブス（Molecular Probes））で染色し、氷上で１５分間インキュベートした。獲得の直前に、１ｍｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ；生体染色色素；Ｒ＆Ｄシステムス・ヨーロッパ社（R&DSystems Europe Ltd）、英国、アビンドン）を加えた。分析は上記の通り実施した。

統計分析
統計はスタットビュー（Stat View）ソフトウェア、ＳＡＳインスティチュートＡＢ（SAS
Institute AB）、スウェーデン、エーテボリを用いてコンピュータで計算した。非対称の連続型変数を対数的に変形した。連続型変数についてＡＮＯＶＡおよびカテゴリ変数についてカイ二乗を用いて研究群を比較した。フィッシャーのＰＬＳＤを、ポストホックテストとして用いた。相関係数は単純回帰または正規分布変数についてではないスピアマンの順位相関を用いて算出した。有意レベルはｐ＜０．０５で設定した。

結果
内皮細胞とのアネキシンＶ結合の測定
アネキシンＶ染色のＨＵＶＥＣ陽性の頻度を、二変数ドットプロットでのアネキシンＶ^＋／ＰＩ⁻細胞のパーセンテージとしてか、ヒストグラムに基づくアネキシンＶ^＋細胞のパーセンテージのいずれかとして求めた。結合を低下させると知られている血清の存在下でのＨＵＶＥＣとの、およびＩＶＩＧとプレインキュベートしたＨＵＶＥＣとのアネキシンＶ結合を調べた。ＩＶＩＧとのプレインキュベーションはアネキシンの結合を回復させることができ、このことはＩＶＩＧ中に存在する抗体が結合を中和できたということを示す（図４）。

ＥＣとのアネキシンＶ結合を有するＣＶＤの病歴のあるＳＬＥ患者では、ＡＰＣ−ＢＳＡおよびａＰＣ−ＫＨＬは双方とも有意に関連していた（それぞれ、ｒ＝０．４５；ｐ＝０．０２ならびにｒ＝０．４２およびｐ＝０．０３）。ａＰＣは上記のように測定した。

ＰＣによる、マクロファージにおけるｏｘＬＤＬ取り込み対する作用
指摘したようにＩＶＩＧから抽出した、ＩｇＭおよびＩｇＧサブクラスのａＰＣを必要性を示すｏｘＬＤＬとともにプレインキュベートした（図３）。本発明者らは総ＩｇＭをａＰＣＩｇＭおよびマクロファージ取り込みに対する効果の対照として用いた（マクロファージ＋Ｄｉｌ−ｏｘＬＤＬ＋ＩｇＭ）。陽性染色細胞の全パーセンテージは４６．６２％であり、これはＩｇＭ自体はａＰＣが有する阻害作用を有していないということを示す。ＩｇＭはシグマ（SIGMA）から購入し、精製ヒトＩｇＭは、通常のヒト血清を出発物質として用いて沈殿およびゲル濾過技術によって製造されている。免疫グロブリンは少なくとも９５％純粋であると測定されている。

内皮細胞におけるＩＣＡＭ誘導に対するａＰＣの作用
ＰＡＦを、必要性を示す濃度のＥＣとともにインキュベートした。図５に示されるように、この脂質はＩＣＡＭ発現の有意な増加を誘導できた。指摘したようにＩＶＩＧから抽出したＩｇＭサブクラスのａＰＣを、必要性を示されるようにこれらの脂質とともにプレインキュベートした（図５）。

先に記載したような（高血圧症の２２６個体の）ＥＬＳＡ研究におけるａＰＣとその他の危険マーカー間の相関
表４に示されるように、ａＰＣＩｇＭは２つのその他の保護因子、ＨＳＰ７０およびＨＤＬと関連していた。また、ＴＮＦ、つまり、炎症のマーカーでありアテローム生成性サイトカインとも、弱くはあるが有意な関連があった。

ＴＮＦは重要な炎症性サイトカインであり、ＴＮＦレベルはａＰＣｉｇＭレベルと負に関連していた。この関連は弱いが有意である。

ＨＳＰ７０は、本発明者等によって最近記載された新規保護因子である。明確な正の関連がある。また、ＨＳＰ６０は、弱い保護因子であるが、これも関連している。

ＨＤＬはよく知られている「良性」コレステロールであり、抗炎症特性を有する。ＨＤＬは、ａＰＣＩｇＭと有意に関連している。

Claims

心臓血管疾患を発症または進行するヒト患者の危険性を評価するための方法であって、ここで該方法は、
（ａ）患者から採取された生体外サンプルにおいて、ホスホリルコリン複合体と反応性の、患者の抗体のレベルを評価する工程、および
（ｂ）患者から採取された生体外サンプルにおいてのホスホリルコリン複合体と反応性の抗体の評価されたレベルに基づいて、心臓血管疾患を発症または進行する患者の危険性を決定する工程、を含み、
ここで患者から採取された生体外サンプルにおいての前記ホスホリルコリン複合体と反応性の抗体のレベルは、健常なヒト患者において心臓血管疾患を発症または進行する危険性とは逆相関するものである、ことを特徴とする心臓血管疾患を発症または進行するヒト患者の危険性を評価するための方法。
心血管疾患を発症または進行するヒト患者の危険性を評価するための方法におけるホスホリルコリン複合体の使用であって、ここで前記方法は、
（ａ）患者から採取された生体外サンプルにおいて、ホスホリルコリン複合体と反応性の、患者の抗体のレベルを評価する工程、および
（ｂ）ホスホリルコリン複合体と反応性の抗体の評価されたレベルに基づいて、心臓血管疾患を発症または進行する患者の危険性を決定する工程、を含み、
ここで患者から採取された生体外サンプルにおいての前記ホスホリルコリン複合体と反応性の抗体のレベルは、健常なヒト患者において心臓血管疾患を発症または進行する危険性とは逆相関するものである、ことを特徴とする心血管疾患を発症または進行するヒト患者の危険性を評価するための方法におけるホスホリルコリン複合体の使用。
心臓血管疾患が、虚血性心臓血管疾患である、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の使用。
心臓血管疾患が、アテローム性動脈硬化症である、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の使用。
ホスホリルコリン複合体と反応性の、患者のＩｇＭ抗体のレベルが評価される、請求項１または請求項３または請求項４に記載の方法、または請求項２乃至請求項４のいずれか１つに記載の使用。
ホスホリルコリン複合体と反応性の、患者のＩｇＧ抗体のレベルが評価される、請求項１または請求項３または請求項４に記載の方法、または請求項２乃至請求項４のいずれか１つに記載の使用。
ホスホリルコリンがスペーサーを介して担体に結合されている、請求項１または請求項３乃至請求項６のいずれか１つに記載の方法、または請求項２乃至請求項６のいずれか１つに記載の使用。
ホスホリルコリン複合体が、選択的にスペーサーを介して、タンパク質担体に結合されているホスホリルコリンを含む、請求項１または請求項３乃至請求項７のいずれか１つに記載の方法、または請求項２乃至請求項７のいずれか１つに記載の使用。
タンパク質がＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）またはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である、請求項８に記載の方法または使用。
評価が免疫評価である、請求項１または請求項３乃至請求項９のいずれか１つに記載の方法、または請求項２乃至請求項９のいずれか１つに記載の使用。