PT1797893E - Anticorpos contra conjugados de fosforilcolina - Google Patents

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Description

ΕΡ 1 797 893/ΡΤ DESCRIÇÃO "Anticorpos contra conjugados de fosforilcolina"
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao campo do tratamento de aterosclerose e doenças cardiovasculares isquémicas.
DESCRIÇÃO DO ESTADO DA TÉCNICA A aterosclerose é uma doença crónica que provoca um espessamento da camada mais interna (a intima) de artérias de dimensão grande e média. Diminui o fluxo sanguíneo e pode provocar isquemia e destruição dos tecidos em órgãos fornecidos pelo vaso afectado. A aterosclerose é a principal causa de doença cardiovascular incluindo enfarte do miocárdio, icto e doença arterial periférica. É a principal causa de morte no mundo ocidental e prevê-se que se torne a principal causa de morte em todo o mundo em duas décadas. A doença é iniciada por acumulação de lipoproteínas, principalmente lipoproteína de baixa densidade (LDL), na matriz extracelular do vaso. Estas partículas de LDL agregam-se e sofrem modificação oxidativa. A LDL oxidada é pro-inflamatória, tóxica e causa lesões vasculares. A aterosclerose representa em muitos aspectos uma resposta a esta lesão incluindo inflamação e fibrose.
Em 1989 Palinski e colaboradores identificaram auto-anticorpos em circulação contra a LDL oxidada em seres humanos. Esta observação sugeriu que a aterosclerose pode ser uma doença auto-imune causada por reacções imunitárias contra lipoproteínas oxidadas. Nesta altura vários laboratórios começaram a investigar associações entre os títulos de anticorpos contra LDL oxidada e a doença cardiovascular. Contudo, o quadro que emergiu destes estudos estava longe de ser claro. Existiam anticorpos contra um grande número de diferentes epítopos na LDL oxidada, mas a estrutura destes epítopos era desconhecida. A expressão "anticorpos contra LDL 2 ΕΡ 1 797 893/ΡΤ oxidada" refere-se assim a uma mistura desconhecida de diferentes anticorpos e não a um anticorpo especifico.
Está bem estabelecido que existe uma inflamação decorrente nas lesões ateroscleróticas, caracterizada por activação de células imunocompetentes e produção de citoquinas inflamatórias. Provavelmente os factores de risco estabelecidos como a hipertensão, os lípidos sanguíneos, a diabetes e tabagismo promovem esta reacção inflamatória, mas os mecanismos através dos quais isto ocorre não estão bem caracterizados e existem diferentes possibilidades não mutuamente exclusivas. Foram propostos vários auto-antigénios diferentes que podiam eliciar esta imunorreactividade, incluindo lipoproteína de baixa densidade oxidada (oxLDL) e proteínas de choque térmico (HSP)2'3. Dados disponíveis sobre o papel das reacções imunitárias na aterosclerose indicam uma relação complexa. Um exemplo disto é a imunização em modelos animais para influenciar a aterogénese. Quando se utiliza HSP, a aterosclerose aumenta mas diminui quando a oxLDL é o ant igénio4,5. 0 papel do aOxLDL na doença humana parece ser complexo. Em seres humanos, foi anteriormente demonstrado que o aOxLDL é superior em controlos saudáveis relativamente a homens com hipertensão marginal, um exemplo de doença cardiovascular precoce6. Estudos recentes estão em linha com esta observação7,8. Adicionalmente, existe uma correlação inversa
S , S , O O entre os níveis plasmaticos de OxLDL e os títulos de aOxLDL . Isto pode sugerir que níveis elevados de aOxLDL desempenham um papel na regulação dos níveis plasmáticos de OxLDL, embora a regulação dos níveis plasmáticos de OxLDL seja também afectada por outros factores, talvez devido a uma resposta imunitária complexa envolvendo uma gama de anticorpos quando se utiliza OxLDL como antigénio. Por outro lado, vários autores relataram que os aOxLDL estão aumentados em doenças cardiovasculares (DCV) humanas, especialmente em estádios mais avançados2,3,9'10. Um exemplo é o lúpus eritematoso sistémico (LES) e a doença auto-imune associada a um risco muito elevado de DCV. Os pacientes de LES com um historial de DCV tinham níveis claramente aumentados de aOxLDL11. Estes resultados, em algum grau contraditórios, podem depender de diferentes métodos e estádios de oxidação da LDL, originando diferenças de 3
ΕΡ 1 797 893/PT antigenicidade. É igualmente provável que o estádio da doença e o perfil de factores de risco estejam relacionados com os níveis de anticorpo. Encontraram-se também níveis elevados de aOxLDL em pacientes com aterosclerose avançada e são preditivos de progressão de aterosclerose das carótidas28. A lipoproteína de baixa densidade oxidada (oxLDL) tem ela própria muitas propriedades pro-inflamatórias incluindo activação de células t12'13, monócitos/macróf agos e células endoteliais14-16. A oxLDL promove a inflamação também em células imunocompetentes de lesões ateroscleróticas17. Contudo, deverá notar-se que a oxLDL pode também melhorar reacções inflamatórias agudas e pelo contrário promover uma inflamação crónica de grau mais baixo como se pode observar na aterosclerose18. É interessante notar que muitos efeitos biológicos da oxLDL são causados por lípidos semelhantes ao factor activador de plaquetas (PAF) na oxLDL19 21. A fosforilcolina (PC) é um componente principal não apenas dos fosfolípidos inflamatórios como o factor activador de plaquetas - PAF (onde é essencial para a interacção com o receptor de PAF) e das oxLDL, como o é também como componente imunogénico de muitas bactérias incluindo S. Pneumoniae22. Adicionalmente, a PC é expressa por células apoptóticas2,23.
Em US5455032 utilizaram-se conjugados de fosfocolina em vacinas para induzir imunoprotecção contra infecções tais como Streptococcus pneumoniae. Num estudo recente de Binder et al. sobre a vacina de pneumococos em ratinhos, mostrou-se também que a vacinação diminuía a formação de lesões ateroscleróticas. Verificou-se que muitos auto-anticorpos contra oxLDL derivados de ratinhos ateroscleróticos partilham identidade estrutural com anticorpos que protegem contra patogénios infecciosos comuns, incluindo Streptococcus pneumoniae. 0 estudo, em ratinhos, não em seres humanos, não dá qualquer informação acerca da especificidade, ou de que anticorpos IgM anti-fosforilcolina sejam significativamente mais importantes do que os correspondentes anticorpos IgG como factor protector na aterosclerose. Adicionalmente, os conjugados de fosforilcolina não foram utilizados na vacina de pneumococos. 4 ΕΡ 1 797 893/ΡΤ
Noutro estudo mostrou-se25 que os níveis de anticorpos anti-fosforilcolina estão elevados em seres humanos com doenças periodontais. A conclusão é de que a fosforilcolina é um importante antigénio oral associado a organismos da flora periodontal e que o anticorpo anti-PC está elevado em consequência da doença periodontal. Não é dada nenhuma informação em relação aos anticorpos e a uma possível protecção contra, ou progressão de, aterosclerose.
Foram publicados alguns documentos (e.g. W02002080954, WO0168119 e W0941445432) relacionados com tratamento de imunização contra aterosclerose mas estes são baseados na utilização de fragmentos peptídicos da apolipoproteína B, anticorpos contra cadeias alfa/beta de um receptor de células T ou uma vacina à base de esterol. Foram também descritos métodos para detectar a placa aterosclerótica (W09908109 e W0013207033) utilizando anticorpos monoclonais contra epítopos específicos de oxidação na lipoproteína. Estes são diferentes do método proposto na presente invenção onde se utiliza um conjugado de fosforilcolina para detectar anticorpos, e.g. anticorpos IgM ou IgG, em amostras de indivíduos.
Verifica-se que a imunização activa com epítopos de OxLDL, tais como MDA-LDL, ou com um patogénio natural, S. pneumoniae, é ateroprotectora em modelos de aterosclerose no ratinho, mas respostas pró-aterogénicas através de respostas adoptivas de Thl são também eliciadas27. Os níveis de E06, um anticorpo que se liga a PC, são elevados mas não é dada nenhuma evidência do seu verdadeiro papel na imunidade ateroprotectora inata.
Mostrou-se que anticorpos criados contra haptenos de PC se ligam a diferentes antigénios de PC encontrados numa gama de diferentes contextos biológicos, tais como nas membranas de células apoptóticas, patogénios e/ou lesões ateroscleróticas29. Foram descritos métodos para a produção de anticorpos anti-PC mas não para utilização no tratamento de aterosclerose30,31. 5 ΕΡ 1 797 893/ΡΤ
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção refere-se à utilização de composições farmacêuticas compreendendo uma preparação de anticorpos, por exemplo um anticorpo monoclonal, com especificidade para um conjugado de fosforilcolina, e à utilização destas composições no tratamento ou prevenção da aterosclerose, por exemplo no tratamento, prevenção ou redução de progressão adicional da aterosclerose. Adicionalmente, a invenção refere-se também à utilização da referida preparação de anticorpos, por exemplo o anticorpo monoclonal, para produzir uma composição farmacêutica opcionalmente com um adjuvante.
Um primeiro aspecto da invenção proporciona a utilização de uma composição farmacêutica compreendendo uma preparação de anticorpos com especificidade para um conjugado de fosforilcolina, no fabrico de um medicamento para imunização e tratamento de seres humanos contra aterosclerose ou uma doença relacionada com aterosclerose. 0 medicamento destina-se a proporcionar imunização, possuindo propriedades imunogénicas ou terapêuticas contra a aterosclerose.
Numa concretização, a preparação de anticorpos pode ser um anticorpo monoclonal.
Conjugado de fosforilcolina significa uma porção de fosforilcolina ligada a um transportador, preferivelmente através de um espaçador. 0 elemento estrutural fosforilcolina pode compreender um derivado de fosforilcolina. Estão descritos exemplos de conjugados de fosforilcolina adequados em US 5455032, como notado acima. Por exemplo, em US 5455032 proporcionam-se conjugados de fosforilcolina em que a porção fosforilcolina está ligada através de uma cadeia alquilo linear e uma ligação peptídica a uma variedade de transportadores imunológicos. O conjugado de fosforilcolina pode por exemplo ser um conjugado de fosforilcolina com albumina sérica humana (HSA) ou com hemocianina de lapa Fissurella (KLH) ou um conjugado de fosforilcolina com albumina sérica bovina (BSA) (por exemplo como descrito nos Exemplos). O PC-BSA (Fosforilcolina-Albumina sérica bovina) pode ser adquirido a Biosearch Technologies, INC (Ca, EUA) . 6
ΕΡ 1 797 893/PT HSA-BSA pode ser conjugado através de um procedimento químico, por exemplo o procedimento seguinte: A O-(4-aminofenilfosforil)colina (I) pode ser preparada a partir de 0-(4-nitrofenilfosforil)colina (Sigma N 5879) com rendimento quantitativo por redução com hidrogénio gasoso a 1 atm com paládio a 10% sobre carvão activado como catalisador, de acordo com um procedimento descrito por Chesebro, B. em Biochemistry 11, (1972) 766 .
(I) pode ser acoplado a HSA por meio de EDC (l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida) em tampão MES, pH 4, essencialmente de acordo com um procedimento descrito por Padilla, N.D. et al. em J. Immun. Methods 2 93 (2004) 1-11. A HSA conjugada pode ser isolada por diálise contra solução salina tamponada a pH 7,4. 0 transportador pode ser, por exemplo, uma proteína, um lípido ou um polímero. O transportador pode ser contas de látex, por exemplo como descrito nos Exemplos. 0 medicamento pode ser destinado a administração por injecção.
Um segundo aspecto da invenção proporciona a utilização de uma preparação de anticorpos com especificidade para um conjugado de fosforilcolina, no fabrico de um medicamento para o tratamento profiláctico ou terapêutico de um ser humano que sofre de aterosclerose ou que enfrenta o risco de desenvolver doença cardiovascular isquémica. Numa concretização, a preparação de anticorpos é um anticorpo monoclonal.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Os exemplos divulgados adiante são proporcionados apenas para fins de ilustração da presente invenção. É descrito um exemplo de um método para determinar a presença ou ausência (ou nível) de anticorpos IgM contra fosforilcolina que estão relacionadas com um risco aumentado ou diminuído de desenvolvimento doenças cardiovasculares isquémicas. Podem também utilizar-se outros métodos conhecidos 7 ΕΡ 1 797 893/ΡΤ na especialidade. Podem ser utilizados métodos similares para determinar a presença ou ausência (ou nivel) de anticorpos IgG contra fosforilcolina. Métodos para determinar a presença ou ausência de anticorpos IgM contra fosforilcolina
Os anticorpos IgM contra PC-BSA foram determinados por um método de ensaio imunossorvente com enzimas ligadas.
Revestiu-se uma placa de microtítulo com PC-BSA (10yg/ml; por exemplo da Biosearch Technologies, INC (Ca, EUA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Após lavagens com PBS, bloquearam-se as placas com uma solução de BSA a 2%. Diluíram-se amostras de soro (1:30) em BSA-PBS a 0,2%. Incubaram-se as placas durante a noite a 40°C e lavaram-se. Adicionou-se IgM de cabra anti-humana conjugada com fosfatase alcalina (diluída de 1:7000 no tampão da amostra) a lOOul/poço e incubou-se a 40 °C durante a noite. Após lavagens, desenvolveu-se a cor por adição de um substrato da fosfatase alcalina e incubação das placas durante 60 min à temperatura ambiente no escuro. As absorvâncias foram lidas num espectrofotómetro a 405nm.
Foram testados diferentes transportadores e espaçadores para a fosforilcolina. Os transportadores exemplificados não estão limitados a estes. Podem também ser utilizados outros transportadores tais como outras proteínas, lípidos ou polímeros, tais como contas de látex que são conhecidos na especialidade. Estão discutidos transportadores em US 5455032, como notado acima.
Os anticorpos IgM ou IgG detectados por estes métodos podem também ligar-se à fosforilcolina (PC) presente em compostos contendo PC em que a PC está exposta, por exemplo na lisofosfatidilcolina (lysoPC; veja-se, por exemplo, Kim et al., J Exp Med. 2002 Sep 2; 196 (5) :655-65) . Assim, um método da invenção pode detectar anticorpos IgM ou IgG que se ligam a lisofosfatidilcolina. 8
ΕΡ 1 797 893/PT Síntese de um conjugado de fosforilcolina e preparação de uma composição farmacêutica
Suspenderam-se contas de látex (0,20 pm ou 0,81pm) em PBS e misturaram-se ao longo da noite com uma solução a 10 pg/ml de fosforilcolina-BSA. As contas foram então centrifugadas e lavadas várias vezes com tampão e bloqueadas com uma solução a lOpg/ml de BSA. Após outra lavagem repetida, ressuspenderam-se as contas numa concentração adequada num tampão adequado e armazenaram-se refrigeradas até à utilização. A fosforilcolina com um braço ligante pode também ser conjugada a KLH (hemocianina de lapa Fissurella) através de um grupo diazofenilo. Mais preferivelmente um derivado p-nitrofenil-6-(0-fosfocolina)hidroxi-hexanoato de PC pode ser sintetizado de acordo com Chesebro, B. e Metzger, H. (1972) Biochem. _1JL: 776 . O p-nitrofenil-6-(O-f osf ocolina) hidroxi-hexanoato foi dissolvido em acetonitrilo seco (100 mg/ml) imediatamente antes da sua adição à KLH. O derivado e a KLH foram misturados durante a noite a 4°C e depois foram dialisados para remover espaçador não ligado e p-nitrofenilato, que é o grupo rejeitado.
Uma solução para injecção do conjugado de fosforilcolina preparado, suspenso num tampão adequado, pode ser directamente utilizada para imunização.
Imunização com um conjugado de fosforilcolina
Determinou-se um titulo elevado de anticorpos IgM que reconhecem fosforilcolina no plasma de ratinhos BALB/c após imunização com 200 pg de [p-nitrofenil-6-(0-fosfocolina) hidroxi-hexanoato - KLH] i.p. utilizando o método de imunoensaio sugerido.
Anticorpos monoclonais contra um conjugado de fosforilcolina
Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos utilizando qualquer método padrão conhecido na especialidade. Veja-se por exemplo "Briles DE, Forman C, Hudak S, Claflin JL. Anti-phosphorylcholine antibodies of the T15 idiotype are optimally protective against Streptococcus pneumoniae. J Exp Med. 9 ΕΡ 1 797 893/ΡΤ 1982;156:1177-85" ou "Τ15 PC binding monoclonal antibodies retain specificity when they switch from IgM to IgG., Spira, Gad; Aguila, Hector L.; Scharff, Matthew D. Fac. Med., Techniton-Israel Inst. Technol., Haifa, Israel. Journal of Immunoloqy (1988), 140(8), 2675-80.
Outros anticorpos contra um conjugado de fosforilcolina podem ser preparados utilizando métodos bem conhecidos dos peritos na especialidade. Por exemplo, uma sub-fracção com actividade de aPC de uma preparação de imunoglobulina humana pode ser preparada, por exemplo como descrito acima, por exemplo por purificação de afinidade utilizando um conjugado de fosforilcolina. A preparação intravenosa de imunoglobulina (e.g. IGIV; Baxter e outros) é uma preparação altamente purificada de IgG comercialmente disponível e é utilizada no tratamento de pacientes que não têm, ou têm níveis muito baixos de produção de anticorpos. As preparações de imunoglobulina incluem as disponíveis dos seguintes fabricantes: Baxter (EUA) eg Gammagard®, Isiven (Antimo Naples, Itália), Omrix (Tel-Hashomer, Israel), Miles (Biological Products Division, West Heaven, CT), Sclavo (Lucca, Itália), Sandoz (Novartis, Basel, Suíça) eg Sandoglobulin®, Biotest Diagnostic Corporation (Deville, NJ) . Exemplos de preparações de imunoglobulina são Gammagard S/D®, Gammar IV®, Gammar-P IV®, Gammimune N®, Iveegam®, Panglobulin®, Polygam S/D®, Sandoglobulin®, Venoglobulin®. As preparações de imunoglobulina tipicamente contêm alguma IgM assim como IgG. Estão presentes quantidades traço de IgM na Gammagard®. A Pentaglobin (Biotest) é uma preparação de IgM enriquecida que tem sido utilizada para o tratamento de SARS. A sub-fracção com actividade de aPC pode compreender tanto IgG como IgM, ou pode ser seleccionada para compreender principalmente IgG (por exemplo partindo de uma preparação rica em IgG tal como Gammagard® e/ou seleccionando a IgG); ou principalmente IgM (por exemplo partindo de uma preparação rica em IgM tal como Pentaglobin e/ou seleccionando a IgM).
Uma preparação de anticorpos com especificidade para um conjugado de fosforilcolina liga-se a fosforilcolina não conjugada e pode também ligar-se a fosforilcolina (PC) presente em compostos contendo PC em que a PC está exposta, por exemplo em lisofosfatidilcolina (lysoPC; veja-se, por 10 ΕΡ 1 797 893/ΡΤ exemplo, Kim et al., J Exp Med. 2002 Sep 2_; 196 (5) : 655-65) .
Assim, uma preparação de anticorpos com especificidade para um conjugado de fosforilcolina pode também ligar-se a lisfosfatidilcolina. Níveis de imunogiobulina IqM em indivíduos ateroscleróticos
Os níveis de auto-anticorpo IgM contra fosforilcolina em indivíduos com hipertensão (pressão diastólica >95 mmHg) foram determinados na linha de base e após 4 anos num estudo de correlação de factores de risco para aterosclerose. Os resultados estão resumidos adiante.
Foram detectadas placas carótidas em 77 indivíduos (35%) no arrolamento, e em 84 indivíduos (38%) no seguimento de 4 anos. No total estiveram no estudo 218 indivíduos humanos. Os aumentos de espessura da íntima-média (IMT) no seguimento foram menos prevalecentes em indivíduos possuindo níveis séricos elevados de IgM contra PC (75° ou 90° percentil) no momento do arrolamento. Há uma diferença significativa entre os valores médios dos níveis de anticorpo IgM anti-fosforilcolina entre indivíduos com IMT aumentada e diminuída (638,8±219,6 vs. 734,8±266,9, p=0,004).
As relações entre auto-anticorpos IgM contra PC e alterações na IMT foram independentes da idade, dos hábitos tabagistas, do tratamento com atenolol ou lacidipina e dos lípidos no sangue. Os auto-anticorpos IgM foram também independentes dos valores de IgG.
Como aqui descrito, numa concretização não reivindicada, pode-se utilizar um conjugado de fosforilcolina para a preparação de uma composição farmacêutica destinada a utilização no tratamento ou prevenção de aterosclerose. O conjugado pode ser fosforilcolina ligada a uma proteína ou a um polímero. A composição farmacêutica é preferivelmente dada por injecção. O método de imunização activa proposto irá modular o título de auto-anticorpos que por sua vez irá ter um efeito positivo no desenvolvimento da aterosclerose. 11
ΕΡ 1 797 893/PT A presente invenção proporciona a utilização de uma preparação de anticorpos, por exemplo um monoclonal anticorpo, que reconhece um conjugado de fosforilcolina, para a preparação de uma composição farmacêutica destinada a utilização no tratamento ou prevenção de aterosclerose. 0 anticorpo monoclonal pode ser produzido utilizando métodos conhecidos na especialidade.
Um outro método não reivindicado aqui descrito é um método de diagnóstico da presença ou ausência de anticorpos, por exemplo anticorpos IgM ou IgG, contra fosforilcolina, um factor que está relacionado com um risco aumentado ou diminuído de desenvolvimento de doenças cardiovasculares isquémicas, utilizando um conjugado de fosforilcolina. Um método preferido é um imunoensaio. 0 método pode ser utilizado na avaliação do risco do paciente desenvolver, ou da progressão de, doença cardiovascular isquémica.
Figuras:
Figura la: Inibição da ligação de anticorpos (IgM) a placas de ELISA revestidas com PC-albumina por β2ΘΡΙ, PS e CL. Inibição por diferentes antigénios da ligação a placas revestidas com PC-albumina. Para investigar a especificidade de aPC, realizaram-se ensaios de competição como descrito na secção Experimental. Os resultados estão apresentados como média ± DP.
Figura lb: Inibição da ligação de anticorpos (IgG) a placas de ELISA revestidas com PC-albumina por P2GPI, PS e CL. Inibição por diferentes antigénios da ligação a placas revestidas com PC-albumina. Para investigar a especificidade de aPC, realizaram-se ensaios de competição como descrito na secção Experimental. Os resultados estão apresentados como média ± DP.
Figura 2a: Inibição da ligação de anticorpos (IgM) a placas de ELISA revestidas com PC-albumina por oxLDL e MDA-LDL. Inibição por diferentes antigénios da ligação a placas revestidas com PC-albumina. Para investigar a especificidade de aPC, realizaram-se ensaios de competição como descrito na secção Experimental. Os resultados estão apresentados como média ± DP. 12 ΕΡ 1 797 893/ΡΤ
Figura 2b: Inibição da ligação de anticorpos (IgG) a placas de ELISA revestidas com PC-albumina por oxLDL e MDA-LDL. Inibição por diferentes antigénios da ligação a placas revestidas com PC-albumina. Para investigar a especificidade de aPC, realizaram-se ensaios de competição como descrito na secção Experimental. Os resultados estão apresentados como média ±DP.
Figura 3: Efeito sobre a assimilação de oxLDL em macrófagos por aPC extraído de IGIV
Testámos dois grupos: macrófagos com oxLDL e macrófagos com oxLDL + pré-incubação com aPC extraído de IVIG. 34,58% 9,35% 43,93%
Grupo macrófago+ -oxLDL (total de 107 células) Coloração fraca 37/107 =
Coloração forte 10/107= coloração total positiva 47/107=
Grupo macrófago+Dil-oxLDL+ aPC- (156 células verificadas): Coloração fraca 37/156 = 23,72%
Coloração forte 2/156= 1,28% coloração total positiva 39/156= 25%. A Figura 3A mostra a coloraçao com oxLDL marcada com Dil. A Figura 3B mostra a coloração com oxLDL não marcada.
Figura 4: Efeito de pré-incubação de soro com título elevado de anticorpos antifosfolípido (aPL) com imunoglobulina humana reunida Gammagard® sobre a ligação de Anexina V a células endoteliais umbilicais humanas (HUVEC): análise de citometria de fluxo após 24 h de cultura. IVIG pré-incubada com soro a Intensidade mediana de fluorescência (IMF) da ligação de Anexina V 0 mg/ml 6 4 9 2,5 mg/ml 913 5 mg/ml 1269 10 mg/ml 1382 13 ΕΡ 1 797 893/ΡΤ
Figura 5: Efeito de células endoteliais aPC sobre a indução de ICAM em Adicionou-se 1 yg/ml de PAF a culturas de células endoteliais, com ou sem pré-incubação com aPC IgM. Testou-se a expressão de ICAM-1 por FACScan. A linha verde representa o efeito de PAF, enquanto a vermelha é PAF + aPC IgM e a preta é o controlo. Os resultados indicam claramente um desvio para a esquerda do histograma quando se adiciona aPC IgM.
SECÇÃO EXPERIMENTAL
Indivíduos
Obtiveram-se amostras de soro de 226 indivíduos com hipertensão estabelecida (pressão diastólica >95 mm Hg) antes da sua entrada na componente sueca do Estudo Europeu da
Lacidipina na Aterosclerose (ELSA, European Lacidipine Study on Atherosclerosis) 25,26 . Colheram-se amostras após um período de descanso de 4 semanas sem medicação para minimizar os efeitos do tratamento sobre os parâmetros medidos. Determinaram-se a pressão sanguínea, os níveis de colesterol e triglicéridos como escrito anteriormente25,26 . Cento e quinze dos indivíduos foram subsequentemente designados para tratamento com o β-bloqueador atenolol, e 111 dos indivíduos foram designados para tratamento com o antagonista do cálcio lacidipina. 0 estudo foi aprovado pelo Comité de Ética do Hospital Karolinska Hospital e foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsínquia. Todos os indivíduos deram o seu consentimento informado.
Ultra-sons da carótida
As determinações ultra-sónicas da carótida foram realizadas e analisadas como detalhado noutros documentos25'26. Um total de 218 pacientes tinha medições ultra-sónicas válidas na linha de base e no seguimento de 4 anos. Resumidamente, examinaram-se as artérias carótidas direita e esquerda com um explorador (scanner) Biosound 2000 ILA duplex utilizando um transdutor de arranjo anular de 8,0 MHz. A espessura íntima-média (I—M) foi determinada na parede mais afastada como a distância entre a linha da frente do eco de íntima-lúmen e a linha da frente do eco de média-adventícia. A medição 14
ΕΡ 1 797 893/PT resultante como um indicador sub-rogado para aterosclerose foi a alteração da média do máximo da espessura íntimal-Média (IMT) das quatro paredes mais afastadas nas carótidas comuns distais e bilateralmente nas bifurcações carótidas (CBMmax) no seguimento de 4 anos. Determinaram-se as associações entre os níveis de anticorpo contra PC no momento do arrolamento no estudo e um aumento ou uma diminuição na IMT no seguimento de 4 anos.
Reagentes
As imuno-placas de microtítulo Polysorp F96 foram adquiridas a Nunc (Roskilde Dinamarca), a PC-BSA (Fosforilcolina-Albumina sérica bovina) foi adquirida a Biosearch Technologies, INC (EUA). A albumina sérica bovina (BSA), a IgG de cabra anti-humana conjugada com Fosfatase alcalina (específica da cadeia r), a IgM de cabra anti-humana conjugada com Fosfatase alcalina (específica da cadeia u) , o PNPP (substrato de Fosfatase alcalina), foram obtidos de Sigma (St. Louis, MO, EUA) . A cardiolipina (CL) foi adquirida a AVANTT (EUA, a β2ρ1ίοορΓθ0βίη3 (β20Ρ1) foi obtida de Calbiochem (EUA).
Os níveis totais de IgG e IgM foram determinados por técnicas de rotina como anteriormente descrito6. A CRP (proteína c-reactiva) foi analisada no soro por métodos altamente sensíveis utilizando imunonefelometria melhorada por partículas (Behring Nephelometer Analyzer, BN II (Dade Behring GmBH, Marburg, Alemanha)) com uma variação inter-ensaios <4%.
Determinação de auto-anticorpos contra PC, oxLDL e MDA-LDL
Os anticorpos IgG e IgM contra PC-BSA foram determinados por ensaio imunossorvente com enzima ligada (ELISA). Utilizou-se soro reunido de 17 pacientes de síndrome de fosfolípidos como padrão interno e testou-se em cada uma das placas. 0 patamar de ligação do anticorpo foi atingido com a concentração de antigénio de 10yg/ml. A placa de microtítulo Polysorp F96 foi portanto revestida com PC-BSA (10pg/ml) a 15 ΕΡ 1 797 893/ΡΤ 50 yg/poço em PBS. As placas revestidas foram incubadas durante a noite a 4°C. Após cinco lavagens com PBS, bloquearam-se as placas com BSA-PBS a 2% durante 2h à temperatura ambiente e lavaram-se como descrito acima. Diluiram-se as amostras de soro (1:30) com BSA-PBS a 0,2% e adicionaram-se a 50yl/poço.
Isolou-se a LDL do plasma de dadores saudáveis por ultracentrifugação preparativa sequencial e oxidou-se utilizando iões de cobre (OxLDL) ou derivatizou-se com MDA(MDA-LDL) como descrito6.
Determinaram-se a oxLDL e a MDA-LDL por ELISA essencialmente como descrito6. Diluiram-se a oxLDL ou a MDA-LDL para 2yg/ml em tampão de revestimento (tampão de carbonato-bicarbonato 50 mM, pH9,7), e utilizaram-se ΙΟΟμΙ/poço para revestir placas de ELISA (Costar 2581). Mantiveram-se as placas a 4°C durante a noite, lavaram-se 4 vezes com PBS, e depois bloquearam-se com soro de bovino adulto a 20% em PBS (ABS-PBS a 20%) durante 2 horas à temperatura ambiente. Depois incubaram-se com 100 μΐ de soro, diluiram-se de 1:30 em ABS-PBS a 20% a 4°C durante a noite.
Incubaram-se as placas durante a noite a 4°C e lavaram-se como descrito acima. Adicionaram-se IgG de cabra anti-humana conjugada com fosfatase alcalina (diluída de 1:9000 no tampão da amostra) e igM de cabra anti-humana conjugada com fosfatase alcalina (diluída de 1:7000 no tampão da amostra) a ΙΟΟμΙ/poço e incubaram-se a 4°C durante a noite. Após cinco lavagens, desenvolveu-se a cor por adição do substrato da fosfatase alcalina (PNPP) a ΙΟΟμΙ/poço e incubação das placas durante 60 min à temperatura ambiente no escuro. Leram-se as placas num espectrofotómetro de ELISA Multiskan Plus a 405nm. Todas as amostras foram medidas num único ensaio e o coeficiente de variação foi inferior a 10-15%.
Especificidade de anticorpos anti-fosforilcolina-BSA
Para investigar a especificidade de anti-fosforilcolina-BSA, realizaram-se ensaios de absorção utilizando os soros de título elevado reunidos. A uma diluição que origina 50% da ligação máxima a PC-BSA, pré-incubaram-se os soros de título 16 ΕΡ 1 797 893/ΡΤ elevado reunidos com diferentes concentrações de PC-BSA. Após agitação no vórtex, incubaram-se os tubos a 40°C durante a noite e centrifugaram-se a 13 000 r.p.m. durante 30 min (40°C). Testaram-se os sobrenadantes quanto à ligação do anticorpo a PC-BSA conforme descrito. A percentagem de inibição foi calculada como se segue:
Percentagem de inibição = (DO sem competidor - DO ccm competidor) x 100/DO sem competidor
Análise estatística
Os níveis anti-fosforilcolina foram dicotomizados no 75° e 90° percentil. Determinou-se a associação entre anti-fosforilcolina (ou outros anticorpos) e a progressão da aterosclerose ao longo de um período de 4 anos por estimativa dos aumentos da IMT (sim ou não) utilizando análise de regressão logística e o cálculo das razões de probabilidades (OR - odds ratio) e intervalos de confiança de 95% (IC), ou comparação utilizando a correlação de Spearman como indicado. Fizeram-se ajustes para possíveis perturbadores incluindo idade, hábitos tabagistas, colesterol sérico, triglicéridos séricos e modo de tratamento anti-hipertensor (lacidipina, atenolol) . Considerou-se um valor p bicaudado <0,05 como significativo.
Resultados
As características básicas dos indivíduos no momento do arrolamento no estudo foram detalhadas noutro local (Pockley et al. (2003) Hypertension 42, 235-238) e estão apresentadas na Tabela I.
Os estudos de competição revelam que o aPC da subclasse IgM e IgG sofreu competição por pré-incubação com PC-BSA, enquanto a cardiolipina teve fraca e a fosfatidilserina não teve, capacidade competitiva (Figura la, lb). A P2-glicoproteína I competiu em alguma extensão com a ligação de IgG a PC-BSA mas não tanto com a de IgM (Figura la, lb). 0 PC-BSA teve baixa capacidade para competir pela ligação aos outros antigénios testados (dados não mostrados). A oxLDL e a MDA-LDL conseguiram competir com a ligação de aPC IgM a PC-BSA, e também de aPC IgG, embora não na mesma extensão (Figura 2a,2b). 17 ΕΡ 1 797 893/ΡΤ
Aumentos de ΙΜΤ no seguimento foram menos prevalecentes em indivíduos possuindo elevados níveis séricos de IgM contra PC (75° ou 90° percentil), oxLDL e MDA-LDL (90° percentil) no momento do arrolamento, enquanto a CRP não estava associada com alterações de IMT (Tabela 2). A análise de regressão logística revelou que as relações entre auto-anticorpos IgM contra PC, oxLDL e MDA-LDL e as alterações de IMT eram independentes da idade, dos hábitos tabagistas, do tratamento com atenolol ou lacidipina e dos lípidos no sangue. Os aPC IgM estavam significativamente associados com alterações de IMT em ambos os percentis, 75° e 90°, enquanto aOxLDL e aMDA-LDL da subclasse IgM apenas apresentaram significância no 90° (Tabela 3a-d). Os auto-anticorpos IgM foram também independentes dos valores de IgG (dados não mostrados). Adicionalmente, os níveis totais de IgG e IgM não estavam associados com medições ou alterações de IMT (dados não mostrados).
Os auto-anticorpos IgG contra PC foram tendencialmente inferiores em indivíduos com aumentos de IMT mas esta diferença não atingiu significância estatística (Tabela 2).
Houve grandes diferenças entre os homens e as mulheres. O aPC, o aMDA-LDL e o aOxLDL da subclasse IgM, foram significativamente superiores nas mulheres relativamente aos homens (p<0,05). Em contraste, não houve diferenças entre os homens e as mulheres nos níveis de IgG destes auto-anticorpos. Em adição, as mulheres tinham uma ocorrência significativamente inferior de placa na linha de base e no seguimento (p<0,05).
Os níveis de aPC IgM estavam correlacionados negativamente com o aumento de IMT (Ró 0,18, p=0, 006) em contraste com dois outros factores de protecção, HDL e HSP70, que não estavam correlacionados com alterações de IMT como medições contínuas (dados não mostrados). Ao contrário do aPC IgM, o aOXLDL e o aMDA-LDL não atingiram significância nestas determinações (dados não mostrados). 18 ΕΡ 1 797 893/ΡΤ
Houve associações significativas entre os níveis de aPC IgM e de aOxLDL IgM (Ró 0,74, p<0,001) e de aMDA-LDL IgM (Ró 0,51, p<0,001). Do mesmo modo, o aPC estava correlacionado com HSP60 (Ró 0,28, p<0,001), HSP70 (Ró 0,35, p<0,001), gue descrevemos recentemente como um novo factor protector para aterosclerose humana neste coorte (Pockley et al. (2003) supra) e também com HDL (Ró 0,23, p<0,01) . Não houve associações entre aPC IgM, aOxLDL IgM ou aOxLDL, MDA-LDL e LDL, CRP ou triglicéridos (dados não mostrados) .
Quando se fizeram análises de regressão logística separadas para homens e mulheres, controlando a idade, o colesterol total, os triglicéridos, o tabagismo e o tratamento, o aPC IgM apresentou efeitos protectores significativos em mulheres apenas quando foi estudado o 90° percentil (EXP (B)=0,17, IC 95%=0,05-0,68; p=0,01 e nos homens apenas quando foi estudado o 75° percentil EXP (B)=0,18, IC 95%=0,04-0,74; p=0,01, respectivamente).
As IgM para MDA-LDL e oxLDL foram diferentes a este respeito, pois apenas os valores para as mulheres atingiram independentemente significância estatística. Assim, quando se fizeram análises de regressão logística separadas para homens e mulheres, controlando a idade, o colesterol total, os triglicéridos, o tabagismo e o tratamento, tanto a IgM contra MDA-LDL como a IgM contra OxLDL apresentaram efeitos protectores significativos em mulheres (EXP (B)=0,17, IC 95% = 0,05-0,68, p=0,01 e EXP (B) =0,18, IC 95% = 0,04-0,74, p=0,01, respectivamente), enquanto entre os homens o efeito não atingiu significância (EXP (B)=60, IC 95% = 0,15-2,2, p=0,44, e EXP (B)=0,39, IC 95% = 0,10-1,5, p=0,17 respectivamente) , indicando que elevados títulos de IgM contra OxLDL e contra MDA-LDL podem ser especificamente protectores entre as mulheres. 19 ΕΡ 1 797 893/ΡΤ
Tabela 1. Características básicas do grupo de estudo no arrolamento. Os resultados estão apresentados como médias (DP) ou percentagem (%) e mg/dL para lípidos.
Total (N=2 2 6) Atenolol (N=l15) Lacidipina (N=l11) Idade (anos) 57,7 (7,8) 57,6(7,6) 57,7(7,9) Sexo (% masculino) 50 46 53 IMC 26,7 (3,7) 26,3(3,3) 27,1 (3,9) Colesterol total 232,4 (37, 8) 233,5(38,1) 231,4 (37, 4) HDL 55,6 (27,6) 56,5(25,8) 54,7(27,6) LDL 149, 4 (37, 8) 149,7(37,1) 149,2 (38,6) Triglicéridos 131,6(58,2) 128,6 (57, 0) 134,7(59,5)
Tabela 2. Previsão não ajustada de alterações na IMT com níveis de linha de base de auto-anticorpos IgG e IgM contra fosforilcolina (PC).
Variável Razão de probabilidades (IC 95%) P Inferior Superior 75° percentil aPC(IgG) 0,60 0,32 1,1 0, 10 aPC(IgM) 0,46 0,25 0, 85 0,01 aOxLDL (IgG) 1,2 0,64 2,3 0,57 aOxLDL (IgM) 0, 77 0, 41 1,4 0,40 aMDA-LDL (IgG) 0,80 0, 43 1,5 0,48 aMDA-LDL (IgM) 0,67 0,36 1,2 0,18 proteína C-reactiva 0, 80 0, 43 1,5 0,46 90° percentil aPC (IgG) 0,60 0,5 1,4 0,24 aPC (IgM) 0,36 0, 15 0,87 0,024 aOxLDL (IgG) 0,94 0,8 2,31 0,90 aOxLDL (IgM) 0,27 0, 11 0,69 0,006 aMDA-LDL (ICfG) 0,63 0,26 1,5 0,30 aMDA-LDL (IgM) 0,27 0, 11 0,69 0,006 proteína C-reactiva 0, 60 0,24 1,4 0,24 20 ΕΡ 1 797 893/ΡΤ
Tabela 3a: Previsão de alterações de IMT ao longo de um período de 4 anos utilizando o 75° percentil de auto-anticorpos aPC IgM na linha de base em indivíduos com hipertensão estabelecida.
Variável no modelo Coeficiente (B) razão de probabilidades estimada Exp(B) P IC 95% Inferior Superior Tabagismo -0,01 0, 99 0,95 0,66 1,5 Sexo -0,05 0, 95 0,87 0,54 1,4 Colesterol total 0, 003 1,0 0,45 0,99 1,0 Triglicéridos plasmáticos -0,001 0, 99 0,63 0,99 1,0 Idade (anos) 0,01 1,0 0,59 0,97 1,0 Tratamento (A/L) -0,23 0, 79 0,40 0,45 1,4 aPC IgM -i,o 37 0,0027 0,15 0,89
Tabela 3b: Previsão de alterações na IMT ao longo de um período de 4 anos utilizando o 90° percentil de auto-anticorpos aPC IgM em indivíduos com hipertensão estabelecida.
Variável no modelo Coeficiente (B) Razão de probabilidades estimada Exp(B) P IC 95% Inferior Superior Tabagismo -0, 02 0, 97 0,90 0,65 1,5 Sexo -0,005 1,0 0,98 0,56 1,8 Colesterol total 0,003 1,0 0,42 0, 99 1,0 Triglicéridos plasmáticos -0,001 0, 99 0,67 0,99 1,0 Idade (anos) 0,003 1,0 0,87 0,97 1,0 Tratamento (A/L) -0,22 0, 80 0,43 0, 46 1,4 aPC IgM -0, 77 0, 46 0, 017 0,24 0,87 21 ΕΡ 1 797 893/ΡΤ
Tabela 3c: Previsão de alterações de IMT ao longo de um período de 4 anos utilizando o 90° percentil com auto-anticorpos IgM contra OxLDL e outros factores de risco em indivíduos com hipertensão estabelecida
Variável no modelo Coeficiente (B) Razão de probabilidades estimada Exp(B) P IC 95% Inferior Superior Tabagismo \—1 O o 1 0, 99 0, 95 0,66 1,5 Sexo 0, 001 1,1 0, 98 0,56 1,8 Colesterol total 0, 001 1,0 0, 72 0,99 1,1 Triglicéridos plasmáticos 0, 001 1,0 0, 71 0,99 1,0 Idade (anos) 0,01 1,0 0,60 0,97 1,1 Tratamento (A/L) -0,28 0, 77 0,35 0,44 1,3 aOxLDL IgM -1,3 0,26 0, 008 0,11 0, 72
Tabela 3d: Previsão de alterações de IMT ao longo de um período de 4 anos utilizando o 90° percentil com auto-anticorpos IgM contra MDA-LDL e outros factores de risco em indivíduos com hipertensão estabelecida
Variável no modelo Coeficiente (B) Razão de probabilidades estimada Exp(B) P IC 95% Inferior Superior Tabagismo 1 O O 0, 93 0, 73 0,62 1,4 Sexo -0,001 0, 99 0,99 0,56 1, 7 Colesterol total 0.001 1,0 0, 78 0, 99 1,0 Triglicéridos plasmáticos -0,001 0, 99 0, 74 0,99 1,1 Idade (anos) 0,01 1,0 0,54 0,97 1,0 Tratamento (A/L) r- CN o 1 0, 76 0,34 0, 44 1,3 aMDA-LDL IgM -1,1 0,31 0,01 0,12 0, 79 22 ΕΡ 1 797 893/ΡΤ
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Estudo que mostra o efeito protector de aPC
Num estudo de observação de Malmõ (o Malmõ Diet and Câncer Study) , cerca de 6000 de 30 000 indivíduos da coorte foram recrutados para investigações cardiovasculares extensas, incluindo determinação não invasiva de aterosclerose subclínica através de medições ultra-sónicas das carótidas. Em adição, mediram-se factores de risco cardiovascular adicionais na linha de base. Estes indivíduos tinham sido seguidos durante mais de 10 anos em relação à ocorrência de novos eventos de doenças cardiovasculares (enfarte do miocárido, doença cardíaca coronária crónica, icto aterotrombótico). Para avaliar os riscos relativos (calculados como ameaças relativas) com intervalos de confiança de 95%, realizaram-se análises de controlo de casos enquadrados (nested-case- 26
ΕΡ 1 797 893/PT control) (3 controlos por caso) para baixos níveis de anticorpos contra fosforilcolina (aPC-IgM). Houve no total 145 casos de DCV (principalmente enfarte do miocárdio (EM) e icto isquémico) e 400 controlos de idade e sexo correspondentes. O nível do limite de exclusão para aPC foi de 307 para o décimo percentil dos níveis de aPC. Houve no total 20 casos de DCV com níveis de aPC inferiores ao décimo percentil (14%), e 34 controlos (9%), correspondendo a uma ameaça relativa de 1,9 (IC 95% 1,1-4,3) . O número correspondente de casos de DCV no sexo masculino abaixo do décimo percentil de aPC foi de 16 (19%), e 25 pacientes de controlo abaixo deste nível (11%), correspondendo a uma ameaça relativa de 1,9 (IC 95% 1,1-3,5). O número de casos no sexo feminino foi demasiado baixo para se retirar uma informação robusta sobre os riscos relativos (vejam-se as Tabelas 1 e 2). Os resultados sugerem que baixos níveis de aPC são preditivos de ocorrência de doença cardiovascular em indivíduos saudáveis, e podem actuar como marcadores para doenças cardiovasculares.
Tabela 1. Estatística Descritiva para aPC (<10° percentil) SEXO Todos Masculino Feminino Caso Controlo Caso Controlo Caso Controlo Abaixo do 10° pct. Não n 68 206 57 160 125 366 o o 81 89 93 95 86 92 Sim N 16 25 4 9 20 34 O. "0 19 11 7 5 14 9 27
ΕΡ 1 797 893/PT
Tabela 2. Análise univariada da influência de aPC (<10° percentil) na DCV por regressão logística condicional para todos os pacientes, sexo masculino e feminino, respectivamente.
Variável valor P razão de ameaça Limites de Confiança de razão de ameaça de 95% Todos os pacientes aPC 0,0308 1,939 1,063 3,536 Masculino aPC 0,0262 2, 181 1,097 4,338 Feminino aPC 0,6556 1,331 0,379 4,676
Efeitos de aPC Introdução
Utilizando colunas que são pré-absorvidas com PC-BSA, PC-KLH ou vacina pneumocócica (Statens Serum Institute, Dinamarca), extraímos anticorpos com reactividade contra estes compostos. Os níveis de aPC IgG são aumentados em pelo menos as duas primeiras. Podem ser extraídas pequenas quantidades de IgM de IVIG que depois também correm através das colunas pré-absorvidas com os antigénios supramencionados. Através deste método podemos obter aPC policlonal humano da subclasse IgG e IgM. A medição da proteína indica que podem ser extraídos níveis de aPC IgM de 0,5 mg/ml. Utilizando estes anticorpos podemos testar as suas propriedades funcionais utilizando modelos in vitro: 1. Poderá a pré-incubação de concentrações crescentes de aPC IgM com LDL oxidada diminuir a ligação e a assimilação na linha celular de monócitos/macrófagos, THP1? Podem utilizar-se sistemas de teste com microscopia confocal e/ou FACS. 2. Poderá a pré-incubação de concentrações crescentes de aPC IgM com IgM normal como controlo, com PAF, lisofosfatidilcolina (LPC) inibir a indução de moléculas de adesão ICAM em células endoteliais por estes lípidos? Também outras citóquinas podem ser testadas utilizando um kit 28
ΕΡ 1 797 893/PT comercial (várias diferentes citoquinas; BioSource). Os testes podem utilizar FACScan.
Cultura celular
Adquiriram-se HUVEC reunidas criopreservadas de passagem 2 a Cascade Biologics, Inc. (Portland, OR, EUA). Mantiveram-se as culturas em meio isento de vermelho de fenol EGM™ (Clonetics, San Diego, CA, EUA) , contendo 2% de soro bovino fetal e suplementos. Incubaram-se as células em balões de 75 cm2 (TPP, AG, Trasadingen, Suíça) a 37°C sob condições de CO2 a 5% humidificado.
Todas as experiências foram na passagem 3 para 4. Semearam-se as células a uma densidade de 2xl04 células/ml em placas de 12 poços (NUNC, Inc, Naperville, IL, EUA) para análise de citometria de fluxo. Após deixar 12-24 horas para fixação, tornaram-se as células quiescentes em SFM durante pelo menos 12 h antes do tratamento. A linha de células monocíticas THP-1 era de AT&T (EUA). Mantiveram-se as células em RPMI com 10% de FCS.
Preparação de aPC
Separou-se a fracção total de IgM ou IgG da imunoglobulina humana reunida comercialmente disponível (Gammagard®) a 50mg/ml utilizando colunas HiTrap de IgM ou IgG (Amersham Biosciences). Os anticorpos contra fosforilcolina (PC) foram eluídos após a carga da fracção de IgM ou IgG em colunas de NHS-Sepharose acopladas a PC conjugada com proteína de lapa Fissurella (KLH) (1 ou 5 mg/ml) ou com albumina sérica bovina (BSA) (1 mg/ml), seguida de uma coluna de apenas BSA. A PC-BSA (Fosforilcolina-Albumina sérica bovina) e a PC-KLH foram adquiridas a Biosearch Technologies, INC (Ca, EUA) . Trocou-se o tampão às fracções eluídas em colunas PD-10 e concentrou-se com dispositivos Millipore Centricone®. Os procedimentos foram realizados de acordo com as instruções dadas pelos fabricantes. A concentração de aPC IgM preparada era tipicamente 50 yg/ml, e a concentração de aPC IgG era tipicamente de 30pg/ml. 29
ΕΡ 1 797 893/PT
Ligação de sequestrante e assimilação de oxLDL por macrófagos derivados de THP-1
Prepara-se LDL oxidada (oxLDL) como descrito por incubação com iões de cobre. Primeiro, marca-se a oxLDL com Dil (Dil - perclorato de (1,1'-dioctadecil-3,3,3' , 3'-tetrametilindocarbocianina; Molecular Probes, Inc)) e dilui-se em tampão de Solução salina-EDTA para lmg/ml. Depois disso, adicionam-se 2ml de soro deficiente em lipoproteína para lmg de oxLDL e depois filtra-se (0,45um). Adicionam-se 50ul de Dil (3mg/ml) em DMSO para lmg de oxLDL e incuba-se a mistura 15h, a 37°C, e depois dialisa-se contra várias trocas de solução salina-EDTA durante 6h. depois disto a mistura é novamente filtrada por 0,45um. A assimilação da oxLDL é estudada com microscopia de fluorescência/confocal. As células THP-1 como modelos para monócitos/macrófagos são crescidas durante a noite em câmara de lâminas, (meio: DMEM/FBS a 10%/Glu/PEST)
Lava-se 3X com meio DMEM sem FBS
Incuba-se com oxLDL-DiO a 5ug/ml (meio SFM) 6h.
Lava-se as células com BSA-PBS a 0,2% 5X, PBS IX
Coloração de núcleos de macrófagos: as células foram incubadas com bisbenzimida a lug/ml 10' e lavam-se com PBS 3X.
Fixação e montagem: as células foram então fixadas com paraformaldeido a 4% em PBS durante 30', PBS 3X, finalmente, após 1 gota de gel de montagem. As lâminas foram cobertas com lamelas.
Ligação de anexina V a células endoteliais
Plasma conservado em heparina com elevada capacidade para inibir a ligação de anexina V foi adicionado a HUVEC em monocamada na concentração de 10% em SFM. Após 24 h colheram-se as células com Solução de Dissociação Celular (CDS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e reuniram-se cuidadosamente com sobrenadantes, para excluir a perda selectiva de células destacadas flutuantes, seguindo-se centrifugação a 1200 rpm durante 7 min. Após ressuspensão em 30 ΕΡ 1 797 893/ΡΤ ΙΟΟμΙ de tampão de ligação de anexina V (Molecular Probes Inc., Eugene, OR, EUA) as amostras foram coradas com 2μ1 de anexina V-FITC a 5 mg/ml (Molecular Probes) e incubadas durante 15 min. em gelo. Pouco antes da aquisição adicionou-se 1 mg/ml de iodeto de propidio (PI; um corante vital; R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, RU) . A análise foi realizada como descrito acima.
Análise Estatística
As estatísticas foram calculadas em computador utilizando o software Stat View; SAS Institute AB, Gõteborg, Suécia. As variáveis contínuas desviadas foram transformadas logaritmicamente. Grupos de estudo foram comparados utilizando ANOVA para variáveis contínuas e Qui quadrado para variáveis em classes. Utilizou-se PLSD de Fischer como teste post hoc. Os coeficientes de correlação foram calculados utilizando regressão simples ou, para variáveis sem distribuição normal, a correlação ordinal de Spearman. O nível de significância foi estabelecido em p<0,05.
Resultados
Medições de ligação de anexina V a células endoteliais A frequência de HUVEC positivas na coloração com anexina V foi determinada quer como percentagem de células anexina V+/PI“ num gráfico de pontos bivariado quer como percentagem de células anexina V+ baseada num histograma. Determinou-se a ligação de anexina V a HUVEC na presença de soro que se sabe diminuir a ligação e pré-incubada com IVIG. A pré-incubação com IVIG conseguiu restabelecer a ligação de anexina, indicando que os anticorpos presentes em IVIG podiam neutralizar a ligação (Fig.4). 0 aPC-BSA e o aPC-KHL estavam ambos associados significativamente, em pacientes de SLE com um historial de DCV, com ligação de anexina V a CE (r=0,45 ; p=0,02 e r=0,42 e p=0,03 respectivamente). Os aPC foram determinados como descrito acima. 31 ΕΡ 1 797 893/ΡΤ
Efeito sobre a assimilação de oxLDL em macrófagos por aPC
0 aPC da subclasse IgM e IgG, extraídos de IVIG como indicado foram pré-incubados com oxLDL indicada (fig. 3). Utilizámos IgM total como controlo para aPC IgM (macrófago+Dil-oxLDL+IgM) e efeito sobre a assimilação de macrófagos. A percentagem total de células com coloração positiva é de 46,62%, indicando que a IgM per se não tem os efeitos inibidores que tem o aPC. A IgM foi adquirida a SIGMA, e a IgM humana purificada é produzida por técnicas de precipitação e filtração em gel utilizando soro humano normal como material de partida. A imunoglobulina é determinada como sendo pelo menos 95% pura.
Efeito de aPC sobre a indução de ICAM em células endoteliais
Incubou-se PAF com CE nas concentrações indicadas. Como demonstrado na Fig. 5, este lípido conseguiu induzir um aumento significativo na expressão de ICAM. Os aPC da subclasse IgM, extraídos de IVIG como indicado foram pré-incubados com estes lípidos como indicado (Fig. 5).
Correlações entre aPC e outros marcadores de risco num estudo ELISA (226 indivíduos com hipertensão como descrito previamente. 0 aPC IgM estava associado com dois outros factores de protecção, HSP 70 e HDL, como indicado na Tabela 4. Houve também uma associação fraca, se bem que significativa, com TNF, um marcador de inflamação e uma citoquina pró-aterogénica. O TNF é uma importante citoquina pró-inflamatória e os níveis de TNF estão negativamente associados com os níveis de aPC IgM. A associação é fraca, mas significativa. O HSP 70 é um novo factor de protecção recentemente descrito por nós e por outros. Há uma associação claramente positiva. Também o HSP60, que é um factor de protecção mais fraco, está associado. 32
ΕΡ 1 797 893/PT Ο HDL é o bem conhecido colesterol "bom", com propriedades anti-inflamatórias. Está significativamente associado com aPC IgM. ANTPCIGG ANTPCIGM Coeficiente de Correlação Ró de Spearman de ANTPCIGG 1,000 0,245 Sig. (bicaudado) r 0,000 N 22D 220 Coeficiente de Correlação de ANTPCIGM 0,245 1,000 Sig. (bicaudado) 0,000 r N 220 220 Coeficiente de Correlação de HDL 0,008 0,233 Sig. (bicaudado) 0,906 0,001 N 206 206 Coeficiente de Correlação de TNFA -0,012 -0,136 Sig. (bicaudado) 0,863 0,044 N 220 220 Coeficiente de Correlação de HSP60 0,138 0,279 Sig.(bicaudado) 0,047 0, 000 N 209 209 Coeficiente de correlação de HSP70 0, 157 0,356 Sig. (bicaudado) 0, 022 0, 000 N 213 213 ** A correlação é significativa ao nível 0,01 (bicaudado) * A correlação é significativa ao nível 0,05 (bicaudado). •
Lisboa, 2010-07-07

Claims (10)

  1. ΕΡ 1 797 893/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma composição farmacêutica compreendendo uma preparação de anticorpos, com especificidade para um conjugado de fosforilcolina, no fabrico de um medicamento para imunização e tratamento de seres humanos contra a aterosclerose ou uma doença relacionada com aterosclerose.
  2. 2. Preparação de anticorpos com especificidade para um conjugado de fosforilcolina para utilização na imunização e tratamento de seres humanos contra aterosclerose ou uma doença relacionada com aterosclerose.
  3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou preparação de anticorpos de acordo com a reivindicação 2 em que a preparação de anticorpos é um anticorpo monoclonal.
  4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 3 ou preparação de anticorpos de acordo com a reivindicação 2 ou 3 em que o medicamento se destina a administração por injecção.
  5. 5. Utilização ou preparação de anticorpos de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes em que a fosforilcolina está ligada a um transportador através de um espaçador.
  6. 6. Utilização ou preparação de anticorpos de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o conjugado de fosforilcolina compreende fosforilcolina ligada a uma proteína transportadora, opcionalmente através de um espaçador.
  7. 7. Utilização ou preparação de anticorpos de acordo com a reivindicação 6, em que a proteína é KLH (hemocianina de lapa Fissurella) ou albumina sérica humana (HSA).
  8. 8. Utilização de uma preparação de anticorpos, com especificidade para um conjugado de fosforilcolina no fabrico de um medicamento para o tratamento profiláctico ou terapêutico de um ser humano que sofre de aterosclerose ou que ΕΡ 1 797 893/ΡΤ 2/2 enfrenta ο risco de desenvolvimento de doença cardiovascular isquémica.
  9. 9. Preparação de anticorpos com especificidade para um conjugado de fosforilcolina para utilização no tratamento profiláctico ou terapêutico de um ser humano que sofre de aterosclerose ou que enfrenta o risco de desenvolvimento de doença cardiovascular isquémica.
  10. 10. Utilização de acordo com a reivindicação 8 ou preparação de anticorpos de acordo com a reivindicação 9 em que a preparação de anticorpos é um anticorpo monoclonal. Lisboa, 2010-07-07
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