JP2011051961A - 近赤外光発光化合物、その合成法及びその発光法 - Google Patents
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Abstract
【課題】
生体あるいは生体成分を含んだ検体からの光透過性に優れた近赤外光を強く発する新規近赤外化学発光化合物を提供し、さらにはその発光化合物を用いた発光方法を提供すること。
【解決手段】
イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類とインドシアニン類が共有結合した近赤外光を発する発光化合物を合成する。この化合物を発光試薬の成分として用いることによって上記課題を解決する。
【選択図】 図１
生体あるいは生体成分を含んだ検体からの光透過性に優れた近赤外光を強く発する新規近赤外化学発光化合物を提供し、さらにはその発光化合物を用いた発光方法を提供すること。
【解決手段】
イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類とインドシアニン類が共有結合した近赤外光を発する発光化合物を合成する。この化合物を発光試薬の成分として用いることによって上記課題を解決する。
【選択図】 図１
Description
本発明は、発光実験や発光分析検査・診断に有用な近赤外光を発する発光化合物とその合成法、ならびにその発光法に関する。さらに詳しくは、近赤外光を化学反応により発するインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物、その合成法、及びインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物の合成に必要な合成中間体、すなわちインドシアニン化合物のスクシンイミジル化合物、そのスクシンイミジル化合物の前駆体でありインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物の合成前駆体となるカルボン酸化合物及びそのカルボン酸化合物の合成前駆体となるクロロ化合物に関する。さらには、インドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物を含有する発光試薬及びその発光方法に関する。
これまでイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物は種々合成されており、それらは化学発光試薬として有用であることが知られている。これらのイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物の中でCLA、MCLA、FCLA、Red-CLA、Green Chemiluminescent CD、EMPEC等は、活性酸素種の化学発光分析試薬としても用いられ、市販されている。しかし、これらの化学発光試薬から誘導される発光は、水溶液中、CLA、MCLA及びEMPECは青色、FCLA及びGreen Chemiluminescent CDは緑色、Red-CLAは紅色の光であり、被検体中の夾雑物による消光や被検体からの光透過性が低いという欠点、発光波長が重なる欠点があった。
それに対し、生体内からの光透過性が上記波長領域の光に比べて優れている近赤外光については、近赤外領域の励起光の照射により近赤外蛍光を発する近赤外蛍光物質が、長年、生体蛍光分析に用いられている。しかし、励起光を必要とせず近赤外光を発する近赤外化学発光物質は２００７年までは見出されていなかった。そのような状況において、２００８年に、本発明者は近赤外化学発光を示すイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物を発明するに至った（特許文献１及び非特許文献１）。
Synthesisand characterization of near-infrared chemiluminescent probes, Teranishi, K.Proceedings of the 15th international symposium on bioluminescence and chemiluminescence,World Scienctific, 143-146 (2008).
しかしながら、上記近赤外化学発光を示すイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物には、発光強度が微弱であるという問題点があった。又、近赤外領域以外の発光が少なからずあり、検体からの光透過性の観点から近赤外領域以外の発光を低減することが望まれている。これらの課題を解決するため、本発明は、近赤外光の発光強度が従来の化合物よりも高い化学発光化合物、その合成法、その合成上必要な合成中間体、発光試薬、さらには発光法を提供する。
本発明は、
＜１＞次式で示されるインドシアニン類とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類が共有結合してなるインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物である。
（式中のＲは、アルキル基、アルコキシル基、アリール基であり、Ｍは、ＨあるいはＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａなどのアルカリ金属、アルカリ土類金属であり、ｍ、ｎ、pは、それぞれ１以上７以下の整数である。）
＜１＞次式で示されるインドシアニン類とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類が共有結合してなるインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物である。
＜２＞次に、次式で示されるスルホインドシアニン類とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類が共有結合してなるスルホインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物である。
（式中のＭは、ＨあるいはＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａなどのアルカリ金属、アルカリ土類金属である。）
＜３＞次に、次式で示されるスクシンイミジル化合物である。
（式中のＲは、アルキル基、アルコキシル基、アリール基であり、Ｍは、ＨあるいはＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａなどのアルカリ金属、アルカリ土類金属であり、ｍ、ｎ、pは、それぞれ１以上７以下の整数である。）
＜４＞次に、次式で示されるスクシンイミジル化合物である。
（式中のＭは、ＨあるいはＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａなどのアルカリ金属、アルカリ土類金属である。）
＜５＞次に、次式で示されるカルボン酸化合物である。
（式中のＲは、アルキル基、アルコキシル基、アリール基であり、Ｍは、ＨあるいはＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａなどのアルカリ金属、アルカリ土類金属であり、ｍ、ｎ、pは、それぞれ１以上７以下の整数である。）
＜６＞次に、次式で示されるカルボン酸化合物である。
（式中のＭは、ＨあるいはＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａなどのアルカリ金属、アルカリ土類金属である。）
＜７＞次に、次式で示されるスルホインドシアニン化合物である。
（式中のＭは、ＨあるいはＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａなどのアルカリ金属、アルカリ土類金属である。）
＜８＞次に、本発明に係わるインドシアニン類とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類が共有結合してなる化合物の合成法は、化学式３（化３）又は化学式４（化４）で示されるスクシンイミジル化合物と次式で示されるイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物とを反応させることを特徴とする。
＜９＞次に、本発明に係わるインドシアニン類とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類が共有結合してなる化合物の合成法は、化学式５（化５）又は化学式６（化６）で示されるカルボン酸化合物と化学式８（化８）で示されるイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物とを脱水縮合反応させることを特徴とする。
＜１０＞次に、化学式５（化５）又は化学式６（化６）で示されるカルボン酸化合物をスクシンイミジル化し、化学式３（化３）又は化学式４（化４）で示されるスクシンイミジル化合物を合成することを特徴とする。
＜１１＞次に、前記インドシアニン類とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類が共有結合してなる化合物を含有することを特徴とする化学発光試薬である。
＜１２＞さらに、前記化学発光試薬を検体溶液と接触させ、発光強度を測定することを特徴とする発光分析方法である。
本発明の化学式１（化１）又は化学式２（化２）で示される近赤外光を発するインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物によれば、従来品よりも近赤外発光強度が高く、発光検出が向上する。又、化学式３（化３）又は化学式４（化４）で示されるスクシンイミジル化合物によれば、カルボニル基が活性化されており、本発明のインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物の合成に有用な前駆体となる。又、化学式５（化５）又は化学式６（化６）で示されるカルボン酸化合物によれば、本発明のインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物の合成に有用な前駆体となり、本発明のスクシンイミジル化合物の合成に有用な前駆体となる。又、本発明のインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物の合成法によれば、インドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物の有用な合成を提供することができる。
本発明のインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物を含有する発光試薬は、近赤外化学発光を提供することができる。又、本発明のインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物を含有する発光試薬を用いる発光法によれば、新規な近赤外化学発光を提供することができる。
＜１．近赤外光発光化合物＞
本発明の近赤外光を発する化学発光化合物は、インドシアニン類とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類が共有結合してなる化学式１（化１）で示されるインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物である。この時、化学式１（化１）中のｍは、８以上では水溶性が低下するため７以下が好ましく、３〜５が合成しやすい。ｎは、８以上では発光強度が低下するため７以下が好ましく、２〜４が合成しやすい。ｐは、発光検出器の特性に依存するものであり、７以下が好ましい。
本発明の近赤外光を発する化学発光化合物は、インドシアニン類とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類が共有結合してなる化学式１（化１）で示されるインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物である。この時、化学式１（化１）中のｍは、８以上では水溶性が低下するため７以下が好ましく、３〜５が合成しやすい。ｎは、８以上では発光強度が低下するため７以下が好ましく、２〜４が合成しやすい。ｐは、発光検出器の特性に依存するものであり、７以下が好ましい。
又、化学式１（化１）中のＲは、長鎖官能基では水溶性が低下する。水溶性と発光強度を確保するには、メチル、エチル、ブチル等のアルキル基、芳香族基、エーテル基等が好ましく、メチル基が最も合成効率が高い。
したがって、本発明におけるインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物としては、化学式２（化２）のものがより好ましく例示される。
＜２．近赤外光発光化合物の合成法＞
本発明におけるインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物は、以上の通りのものであり、その合成法は、化学式３（化３）又は化学式４（化４）と、化学式８（化８）で示されるイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物とを溶液中において反応させることにより成し遂げられる。
本発明におけるインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物は、以上の通りのものであり、その合成法は、化学式３（化３）又は化学式４（化４）と、化学式８（化８）で示されるイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物とを溶液中において反応させることにより成し遂げられる。
本発明におけるインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物の合成法は、化学式５（化５）又は化学式６（化６）と、化学式８（化８）で示されるイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物とを溶液中において脱水縮合反応させることによっても成し遂げられる。
前記の化学式３（化３）又は化学式４（化４）で示されるスクシンイミジル化合物の合成は、化学式５（化５）又は化学式６（化６）で示されるカルボン酸化合物をスクシンイミジル化することにより成し遂げられる。
なお、化学式（化３）又は化学式４（化４）で示されるスクシンイミジル化合物は、化学式１（化１）又は化学式２（化２）で示されるインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物の合成前駆体、化学式５（化５）又は化学式６（化６）で示されるカルボン酸化合物は、前記インドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物の合成前駆体又は前記スクシンイミジル化合物の前駆体、化学式７（化７）で示されるスルホインドシアニン化合物は、前記カルボン酸化合物の合成前駆体となる他、蛍光化合物そのものとして、又は蛍光ラベル化剤として利用可能である。
＜３．近赤外光発光化合物の合成法（合成経路の一例）＞
化学式２（化２）に示される化合物、スクシンイミジル化合物（化４）、カルボン酸化合物（化６）は、一例として次式に示した合成経路に従って合成することができる。
化学式２（化２）に示される化合物、スクシンイミジル化合物（化４）、カルボン酸化合物（化６）は、一例として次式に示した合成経路に従って合成することができる。
＜化学式９（化９）中の工程１＞
化学式９中の化学式１２で示される新規インドシアニン化合物は、例えば非特許文献２に記載の方法により合成する4-(2,3,3-trimethyl-5-sulfo-3H-indolium-1-yl)butane-1-sulfonate（化学式９中の化学式１０）と、特許文献２に記載の方法により合成する1-(2-carboxyethyl)-2,3,3-trimethyl-3H-indolium-5-sulfonate(化学式９中の化学式１１)と、2-[6-acethlphenylamino]1,3,5-hexatrienyl]-3,3-dimethyl-5-sulfo-1-(4-sulfobutyl)3-H-indoliumとをモル比１：１：１の混合比で、メタノール中、酢酸ナトリウム及びN-[(3-(アニリノメチレン)-2-クロロ-1-シクロヘキセン-１-イル)メチレン]アニリン塩酸を加え、室温から７０℃で１時間から３時間反応することにより得ることができる。
化学式９中の化学式１２で示される新規インドシアニン化合物は、例えば非特許文献２に記載の方法により合成する4-(2,3,3-trimethyl-5-sulfo-3H-indolium-1-yl)butane-1-sulfonate（化学式９中の化学式１０）と、特許文献２に記載の方法により合成する1-(2-carboxyethyl)-2,3,3-trimethyl-3H-indolium-5-sulfonate(化学式９中の化学式１１)と、2-[6-acethlphenylamino]1,3,5-hexatrienyl]-3,3-dimethyl-5-sulfo-1-(4-sulfobutyl)3-H-indoliumとをモル比１：１：１の混合比で、メタノール中、酢酸ナトリウム及びN-[(3-(アニリノメチレン)-2-クロロ-1-シクロヘキセン-１-イル)メチレン]アニリン塩酸を加え、室温から７０℃で１時間から３時間反応することにより得ることができる。
＜化学式９（化９）中の工程２＞
化学式６（化６）で示される新規インドシアニン化合物は、インドシアニン化合物（化１２）をメタノール中、ナトリウムメトキシドやカリウムメトキシドなどの金属アルコキシドを加え、室温から７０℃で１時間から５０時間反応することにより得ることができる。
化学式６（化６）で示される新規インドシアニン化合物は、インドシアニン化合物（化１２）をメタノール中、ナトリウムメトキシドやカリウムメトキシドなどの金属アルコキシドを加え、室温から７０℃で１時間から５０時間反応することにより得ることができる。
＜化学式９（化９）中の工程３＞
化学式４（化４）で示されるインドシアニン化合物は、インドシアニン化合物（化６）をピリジンとN,N-ジメチルホルムアミドとの混合液中で、室温から８０℃で３０分から２時間、N,N-ジスクシイミジルカーボネートと反応することにより得ることができる。
化学式４（化４）で示されるインドシアニン化合物は、インドシアニン化合物（化６）をピリジンとN,N-ジメチルホルムアミドとの混合液中で、室温から８０℃で３０分から２時間、N,N-ジスクシイミジルカーボネートと反応することにより得ることができる。
＜化学式９（化９）中の工程４＞
化学式２（化２）で示される発光化合物は、化学式６（化６）と化学式８（化８）とをピリジンと燐酸緩衝液の混合液中で、０℃から５０℃で３０分から２４時間、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドやWSCなどの脱水縮合剤を加えることにより得ることができる。
化学式２（化２）で示される発光化合物は、化学式６（化６）と化学式８（化８）とをピリジンと燐酸緩衝液の混合液中で、０℃から５０℃で３０分から２４時間、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドやWSCなどの脱水縮合剤を加えることにより得ることができる。
＜化学式９（化９）中の工程５＞
化学式２（化２）で示される発光化合物は、化学式４（化４）と化学式８（化８）とをピリジンと燐酸緩衝液の混合液中で、０℃から５０℃で３０分から２４時間、反応することによっても得ることができる。
化学式２（化２）で示される発光化合物は、化学式４（化４）と化学式８（化８）とをピリジンと燐酸緩衝液の混合液中で、０℃から５０℃で３０分から２４時間、反応することによっても得ることができる。
＜４．近赤外光発光化合物を含有する発光試薬、発光方法＞
本発明の発光試薬は、化学式１（化１）又は化学式２（化２）で示されるインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物を含有する発光試薬である。
本発明の発光試薬は、化学式１（化１）又は化学式２（化２）で示されるインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物を含有する発光試薬である。
さらに、本発明の発光試薬は、以上の通りのインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物を含有するものであれば、その他の物質、例えば、溶剤、緩衝剤、安定剤、界面活性剤等を含有してもよい。
そして、本発明は、発光方法をも提供する。すなわち、本発明の発光方法では、前記の発光試薬を検体溶液に添加、混合するなどして接触させ、インドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物によって発せられる光の強度を測定する。
この時、添加する発光試薬の量等の分析条件は特に限定されない。具体的には、発光試薬の濃度は、発光系に影響を与えない程度であればよい。又、発光は、検体に影響を与えない温度範囲で行なえばよい。例えば、一般に生体を検体とし、水溶液中で分析を行なう場合には、約１０℃〜４０℃の温度範囲が好ましい。
さらに、本発明のインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物によって発せられる光の発光波長は、極大波長約８００ｎｍであるため生体成分による消光は少なく検体からの光透過性がよい。なお、検体により発光波長は多少変動する。
＜５．定義等＞
本発明において、「アルキル基」とは、置換基を有していてもよい炭素数１個〜２０個の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基をいい、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、イコサニルなどの直鎖の基、又は分岐状に結合した基をいう。
本発明において、「アルキル基」とは、置換基を有していてもよい炭素数１個〜２０個の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基をいい、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、イコサニルなどの直鎖の基、又は分岐状に結合した基をいう。
本発明において、「アルコキシル基」とは、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、メチキシエトキシ、メトキシプロポキシ、エトキシエトキシ、エトキシプロポキシ、メトキシエトキシエトキシ基などの炭素数１個〜２０個のアルコキシル基が直鎖上に又は分岐状に結合したものなどを挙げることができる。
本発明において、「アリール基」とは、フェニル、ナフチルなどの炭素数６〜２０個の芳香族炭化水素を挙げることができる。
以下に本発明の好適な一実施の形態を実施例によって具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は下記の実施形態によって限定されるものでなく、本発明の範囲で様々に改変して実施することができる。
＜実施例１：化学式１２（化１２）で示される化合物4-(2-((E)-2-((E)-3-((E)-2-(1-(2-carboxyethyl)-3,3-dimethyl-5-sulfoindolin-2-ylidene)ethylidene)-2-chlorocyclohex-1-enyl)vinyl)-3,3-dimethyl-5-sulfo-3H-indolium-1-yl)butane-1-sulfonateの合成（工程１）＞
化学式１０（化１０）で示される4-(2,3,3-trimethyl-5-sulfo-3H-indolium-1-yl)butane-1-sulfonate（１．０ｇ）、化学式１１（化１１）で示される1-(2-carboxyethyl)-2,3,3-trimethyl-3H-indolium-5-sulfonate （０．８２ｇ）、N-[(3-(アニリノメチレン)-2-クロロ-1-シクロヘキセン-1-イル)メチレン]アニリン塩酸（０．９６ｇ）、酢酸ナトリウム（０．８８ｇ）、メタノール（２４ｍＬ）の混合物を５０℃で１時間撹拌した。メタノールを減圧除去し、残渣に水（５０ｍＬ）及びクロロホルム（５０ｍＬ）を加え分配した。さらに水層をクロロホルム（５０ｍＬ×５回）で洗浄し、水層を減圧濃縮した。残渣を０．１％ＴＦＡ水溶液に溶解し、ＯＤＳカラムクロマトグラフィーに供し、水とアセトニトリルの混合液で溶出した。目的物の溶出液を減圧濃縮し、目的物０．６７ｇを青緑固体として得た。以下に目的物の機器分析データを示す。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 25 oC, TMS:0.0 ppm) 1.65 (6H, s),
1.67 (6H, s), 1.75 (2H, quin, J = 7.3 Hz), 1.83 (4H, m), 2.60 (2H, t, J
= 7.3 Hz), 2.70 (6H, m), 4.26 (2H, t, J = 7.3 Hz), 4.38 (2H, t, J
= 7.3 Hz), 6.34 (1H, d, J = 14 Hz), 6.45 (1H, d, J = 14 Hz), 7.30
(1H, d, J = 8.5 Hz), 7.47 (1H, d, J = 8.5 Hz), 7.62 (1H, d,d, J
= 1.2, 8.5 Hz), 7.67 (1H, d,d, J = 1.2, 8.5 Hz), 7.74 (1H, d, J =
1.2 Hz), 7.81 (1H, d, J = 1.2 Hz), 8.18 (1H, d, J = 14 Hz), 8.29
(1H, d, J = 14 Hz)
ESI-MS m/z calcd for C37H43N2O11S3Cl
822.17, found 823.23 [M+1]
化学式１０（化１０）で示される4-(2,3,3-trimethyl-5-sulfo-3H-indolium-1-yl)butane-1-sulfonate（１．０ｇ）、化学式１１（化１１）で示される1-(2-carboxyethyl)-2,3,3-trimethyl-3H-indolium-5-sulfonate （０．８２ｇ）、N-[(3-(アニリノメチレン)-2-クロロ-1-シクロヘキセン-1-イル)メチレン]アニリン塩酸（０．９６ｇ）、酢酸ナトリウム（０．８８ｇ）、メタノール（２４ｍＬ）の混合物を５０℃で１時間撹拌した。メタノールを減圧除去し、残渣に水（５０ｍＬ）及びクロロホルム（５０ｍＬ）を加え分配した。さらに水層をクロロホルム（５０ｍＬ×５回）で洗浄し、水層を減圧濃縮した。残渣を０．１％ＴＦＡ水溶液に溶解し、ＯＤＳカラムクロマトグラフィーに供し、水とアセトニトリルの混合液で溶出した。目的物の溶出液を減圧濃縮し、目的物０．６７ｇを青緑固体として得た。以下に目的物の機器分析データを示す。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 25 oC, TMS:0.0 ppm) 1.65 (6H, s),
1.67 (6H, s), 1.75 (2H, quin, J = 7.3 Hz), 1.83 (4H, m), 2.60 (2H, t, J
= 7.3 Hz), 2.70 (6H, m), 4.26 (2H, t, J = 7.3 Hz), 4.38 (2H, t, J
= 7.3 Hz), 6.34 (1H, d, J = 14 Hz), 6.45 (1H, d, J = 14 Hz), 7.30
(1H, d, J = 8.5 Hz), 7.47 (1H, d, J = 8.5 Hz), 7.62 (1H, d,d, J
= 1.2, 8.5 Hz), 7.67 (1H, d,d, J = 1.2, 8.5 Hz), 7.74 (1H, d, J =
1.2 Hz), 7.81 (1H, d, J = 1.2 Hz), 8.18 (1H, d, J = 14 Hz), 8.29
(1H, d, J = 14 Hz)
ESI-MS m/z calcd for C37H43N2O11S3Cl
822.17, found 823.23 [M+1]
＜実施例２：化学式６（化６）で示される化合物4-(2-((E)-2-((E)-3-((E)-2-(1-(2-carboxyethyl)-3,3-dimethyl-5-sulfoindolin-2-ylidene)ethylidene)-2-methoxycyclohex-1-enyl)vinyl)-3,3-dimethyl-5-sulfo-3H-indolium-1-yl)butane-1-sulfonateの合成（工程２）＞
化学式１２（化１２）で示される化合物4-(2-((E)-2-((E)-3-((E)-2-(1-(2-carboxyethyl)-3,3-dimethyl-5-sulfoindolin-2-ylidene)ethylidene)-2-chlorocyclohex-1-enyl)vinyl)-3,3-dimethyl-5-sulfo-3H-indolium-1-yl)butane-1-sulfonate（０．２ｇ）、メタノール（１２ｍＬ）、カリウムブトキシド（０．５６ｇ）の混合物を５０℃で１２時間撹拌し、次に氷冷下において水（２０ｍＬ）、１Ｎ ＨＣｌ水溶液（５ｍＬ）を加え中和した。反応液を減圧濃縮し、残渣を０．１％ＴＦＡ水溶液に溶解し、ＯＤＳカラムクロマトグラフィーに供した。水とアセトニトリルの混合液で溶出し、溶出液を減圧濃縮し、目的物０．２０ｇを青緑色固体として得た。以下に目的物の機器分析データを示す。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 23 oC, TMS:0.0 ppm) 1.65 (6H, s),
1.67 (6H, s), 1.70-1.85 (6H, m), 2.55-2.65 (6H, m), 2.70 (2H, t, J = 7.3
Hz), 3.95 (3H, s), 4.21 (2H, br.), 4.35 (2H, br.), 6.20 (1H, d, J = 14.1
Hz), 6.28 (1H, d, J = 14.7 Hz), 7.27 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.42
(1H, d, J = 8.0 Hz), 7.62 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7. 65 (1H, d, J
= 8.0 Hz), 7.72 (1H, s), 7.79 (1H, s), 7.95 (1H, d, J = 14.1 Hz), 8.06
(1H, d, J = 14.7 Hz)
ESI-MS m/z calcd for C38H46N2O12S3
818.22, found 819.19 [M+1]
化学式１２（化１２）で示される化合物4-(2-((E)-2-((E)-3-((E)-2-(1-(2-carboxyethyl)-3,3-dimethyl-5-sulfoindolin-2-ylidene)ethylidene)-2-chlorocyclohex-1-enyl)vinyl)-3,3-dimethyl-5-sulfo-3H-indolium-1-yl)butane-1-sulfonate（０．２ｇ）、メタノール（１２ｍＬ）、カリウムブトキシド（０．５６ｇ）の混合物を５０℃で１２時間撹拌し、次に氷冷下において水（２０ｍＬ）、１Ｎ ＨＣｌ水溶液（５ｍＬ）を加え中和した。反応液を減圧濃縮し、残渣を０．１％ＴＦＡ水溶液に溶解し、ＯＤＳカラムクロマトグラフィーに供した。水とアセトニトリルの混合液で溶出し、溶出液を減圧濃縮し、目的物０．２０ｇを青緑色固体として得た。以下に目的物の機器分析データを示す。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 23 oC, TMS:0.0 ppm) 1.65 (6H, s),
1.67 (6H, s), 1.70-1.85 (6H, m), 2.55-2.65 (6H, m), 2.70 (2H, t, J = 7.3
Hz), 3.95 (3H, s), 4.21 (2H, br.), 4.35 (2H, br.), 6.20 (1H, d, J = 14.1
Hz), 6.28 (1H, d, J = 14.7 Hz), 7.27 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.42
(1H, d, J = 8.0 Hz), 7.62 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7. 65 (1H, d, J
= 8.0 Hz), 7.72 (1H, s), 7.79 (1H, s), 7.95 (1H, d, J = 14.1 Hz), 8.06
(1H, d, J = 14.7 Hz)
ESI-MS m/z calcd for C38H46N2O12S3
818.22, found 819.19 [M+1]
＜実施例３：化学式４（化４）で示される化合物4-(2-((E)-2-((E)-3-((E)-2-(1-(3-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yloxy)-3-oxopropyl)-3,3-dimethyl-5-sulfoindolin-2-ylidene)ethylidene)-2-methoxycyclohex-1-enyl)vinyl)-3,3-dimethyl-5-sulfo-3H-indolium-1-yl)butane-1-sulfonateの合成（工程３）＞
化学式６（化６）で示される化合物4-(2-((E)-2-((E)-3-((E)-2-(1-(2-carboxyethyl)-3,3-dimethyl-5-sulfoindolin-2-ylidene)ethylidene)-2-methoxycyclohex-1-enyl)vinyl)-3,3-dimethyl-5-sulfo-3H-indolium-1-yl)butane-1-sulfonate（０．１５ｇ）、N,N-ジスクシイミジルカーボネート（０．７ｇ）、ピリジン（３ｍＬ）、N,N-ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）の混合物を、５０℃で４０分間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣を塩化メチレンとメタノールの混合液に溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。塩化メチレンとメタノールの混合液で溶出し、目的物を含む溶出液を減圧濃縮し、目的物０．１４３ｇを青色固体として得た。以下に目的物の機器分析データを示す。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 23 oC, TMS:0.0 ppm) 1.63 (6H, s),
1.66 (6H, s), 1.70-1.85 (6H, m), 2.55 (2H, t, J = 7.3 Hz), 2.60 (4H,
Br.), 2.78 (4H, s), 3.25 (2H, t, J = 7.3 Hz), 3.94 (3H, s), 4.23 (2H,
br.), 4.43 (2H, br.), 6.08 (1H, d, J = 13.3 Hz), 6.35 (1H, d, J =
14.6 Hz), 7.23 (1H, d, J = 8.5 Hz), 7.45 (1H, d, J = 8.5 Hz),
7.56 (1H, d, d, J = 1.2, 8.5 Hz), 7.66 (1H, d, J = 8.5 Hz), 7.67
(1H, s), 7.80 (1H, s), 7.88 (1H, d, J = 13.3 Hz), 8.10 (1H, d, J
= 14.6 Hz)
ESI-MS m/z calcd for C42H49N3O14S3
915.24, found 916.11 [M+1]
化学式６（化６）で示される化合物4-(2-((E)-2-((E)-3-((E)-2-(1-(2-carboxyethyl)-3,3-dimethyl-5-sulfoindolin-2-ylidene)ethylidene)-2-methoxycyclohex-1-enyl)vinyl)-3,3-dimethyl-5-sulfo-3H-indolium-1-yl)butane-1-sulfonate（０．１５ｇ）、N,N-ジスクシイミジルカーボネート（０．７ｇ）、ピリジン（３ｍＬ）、N,N-ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）の混合物を、５０℃で４０分間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣を塩化メチレンとメタノールの混合液に溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。塩化メチレンとメタノールの混合液で溶出し、目的物を含む溶出液を減圧濃縮し、目的物０．１４３ｇを青色固体として得た。以下に目的物の機器分析データを示す。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 23 oC, TMS:0.0 ppm) 1.63 (6H, s),
1.66 (6H, s), 1.70-1.85 (6H, m), 2.55 (2H, t, J = 7.3 Hz), 2.60 (4H,
Br.), 2.78 (4H, s), 3.25 (2H, t, J = 7.3 Hz), 3.94 (3H, s), 4.23 (2H,
br.), 4.43 (2H, br.), 6.08 (1H, d, J = 13.3 Hz), 6.35 (1H, d, J =
14.6 Hz), 7.23 (1H, d, J = 8.5 Hz), 7.45 (1H, d, J = 8.5 Hz),
7.56 (1H, d, d, J = 1.2, 8.5 Hz), 7.66 (1H, d, J = 8.5 Hz), 7.67
(1H, s), 7.80 (1H, s), 7.88 (1H, d, J = 13.3 Hz), 8.10 (1H, d, J
= 14.6 Hz)
ESI-MS m/z calcd for C42H49N3O14S3
915.24, found 916.11 [M+1]
＜実施例４：化学式２（化２）で示される化合物4-(2-((E)-2-((E)-2-methoxy-3-((E)-2-(1-(3-(2-(3-(6-(4-methoxyphenyl)-3-oxo-3,7-dihydroimidazo[1,2-a]pyrazin-2-yl)propanamido)ethylamino)-3-oxopropyl)-3,3-dimethyl-5-sulfoindolin-2-ylidene)ethylidene)cyclohex-1-enyl)vinyl)-3,3-dimethyl-5-sulfo-3H-indolium-1-yl)butane-1-sulfonateの合成（工程４）＞
化学式４（化４）で示される4-(2-((E)-2-((E)-3-((E)-2-(1-(3-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yloxy)-3-oxopropyl)-3,3-dimethyl-5-sulfoindolin-2-ylidene)ethylidene)-2-methoxycyclohex-1-enyl)vinyl)-3,3-dimethyl-5-sulfo-3H-indolium-1-yl)butane-1-sulfonate（０．０５ｇ）と化学式８（化８）で示されるN-(2-aminoethyl)-3-(6-(4-methoxyphenyl)-3-oxo-3,7-dihydroimidazo[1,2-a]pyrazin-2-yl)propanamide（０．００８７ｇ）をピリジン（０．６ｍＬ）及び０．１Ｍ燐酸緩衝液(ｐＨ７．４、０．２５ｍＬ）の混合液中、水素置換し室温で４時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣を０．１％ＴＦＡ水溶液で溶解し、本溶液をＯＤＳカラムクロマトグラフィーに供した。水とアセトニトリルの混合液で溶出し、目的物の溶出液を減圧濃縮し、目的物０．００９ｇを黄緑色固体として得た。以下に目的物の機器分析データを示す。
1H NMR (500 MHz, D2O, 22 oC, Aceton:2.07 ppm) 1.21
(6H, s), 1.38 (6H, s), 1.52 (2H, br.), 1.62 (2H, br.), 2.37 (2H, t, J =
7.3 Hz), 2.45 (2H, br.), 2.72 (4H, m), 3.00 (4H, m), 3.42 (3H, s), 3.46 (3H,
s), 3.62 (2H, br.), 4.00 (2H, br.), 5.25 (1H, br.), 5.55 (1H, br.), 6.48 (2H,
d, J = 7.9 Hz), 6.78 (1H, br.), 6.93 (1H, br.), 7.10 (2H, d, J =
7.9 Hz), 7.35 (1H, s), 7.40 (1H, d, J = 7.4 Hz), 7.48 (1H, br.), 7.55
(3H, m), 7.63 (1H, s), 7.83 (1H, s)
ESI-MS m/z calcd for C56H65N7O14S3
1155.38, found 1156.33 [M+1]
化学式４（化４）で示される4-(2-((E)-2-((E)-3-((E)-2-(1-(3-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yloxy)-3-oxopropyl)-3,3-dimethyl-5-sulfoindolin-2-ylidene)ethylidene)-2-methoxycyclohex-1-enyl)vinyl)-3,3-dimethyl-5-sulfo-3H-indolium-1-yl)butane-1-sulfonate（０．０５ｇ）と化学式８（化８）で示されるN-(2-aminoethyl)-3-(6-(4-methoxyphenyl)-3-oxo-3,7-dihydroimidazo[1,2-a]pyrazin-2-yl)propanamide（０．００８７ｇ）をピリジン（０．６ｍＬ）及び０．１Ｍ燐酸緩衝液(ｐＨ７．４、０．２５ｍＬ）の混合液中、水素置換し室温で４時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣を０．１％ＴＦＡ水溶液で溶解し、本溶液をＯＤＳカラムクロマトグラフィーに供した。水とアセトニトリルの混合液で溶出し、目的物の溶出液を減圧濃縮し、目的物０．００９ｇを黄緑色固体として得た。以下に目的物の機器分析データを示す。
1H NMR (500 MHz, D2O, 22 oC, Aceton:2.07 ppm) 1.21
(6H, s), 1.38 (6H, s), 1.52 (2H, br.), 1.62 (2H, br.), 2.37 (2H, t, J =
7.3 Hz), 2.45 (2H, br.), 2.72 (4H, m), 3.00 (4H, m), 3.42 (3H, s), 3.46 (3H,
s), 3.62 (2H, br.), 4.00 (2H, br.), 5.25 (1H, br.), 5.55 (1H, br.), 6.48 (2H,
d, J = 7.9 Hz), 6.78 (1H, br.), 6.93 (1H, br.), 7.10 (2H, d, J =
7.9 Hz), 7.35 (1H, s), 7.40 (1H, d, J = 7.4 Hz), 7.48 (1H, br.), 7.55
(3H, m), 7.63 (1H, s), 7.83 (1H, s)
ESI-MS m/z calcd for C56H65N7O14S3
1155.38, found 1156.33 [M+1]
＜実施例５：化学式２（化２）で示される化合物4-(2-((E)-2-((E)-2-methoxy-3-((E)-2-(1-(3-(2-(3-(6-(4-methoxyphenyl)-3-oxo-3,7-dihydroimidazo[1,2-a]pyrazin-2-yl)propanamido)ethylamino)-3-oxopropyl)-3,3-dimethyl-5-sulfoindolin-2-ylidene)ethylidene)cyclohex-1-enyl)vinyl)-3,3-dimethyl-5-sulfo-3H-indolium-1-yl)butane-1-sulfonateの合成（工程５）＞
化学式６（化６）で示される化合物4-(2-((E)-2-((E)-3-((E)-2-(1-(2-carboxyethyl)-3,3-dimethyl-5-sulfoindolin-2-ylidene)ethylidene)-2-methoxycyclohex-1-enyl)vinyl)-3,3-dimethyl-5-sulfo-3H-indolium-1-yl)butane-1-sulfonate（０．０３ｇ）、化学式８（化８）で示されるN-(2-aminoethyl)-3-(6-(4-methoxyphenyl)-3-oxo-3,7-dihydroimidazo[1,2-a]pyrazin-2-yl)propanamide（０．０１７ｇ）、ＷＳＣ ＨＣｌ（０．２２ｇ）、ピリジン（０．６ｍＬ）及び０．１Ｍ燐酸緩衝液(ｐＨ７．４、０．０５ｍＬ）の混合物を、水素置換し室温で２時間攪拌した。反応液にアセトンを加え、生成した固体と上澄み液とを分離した後、固体を０．１％ＴＦＡ水溶液で溶解し、本溶液をＯＤＳカラムクロマトグラフィーに供した。水とアセトニトリルの混合液で溶出し、目的物の溶出液を減圧濃縮し、目的物０．００７ｇを黄緑色固体として得た。
化学式６（化６）で示される化合物4-(2-((E)-2-((E)-3-((E)-2-(1-(2-carboxyethyl)-3,3-dimethyl-5-sulfoindolin-2-ylidene)ethylidene)-2-methoxycyclohex-1-enyl)vinyl)-3,3-dimethyl-5-sulfo-3H-indolium-1-yl)butane-1-sulfonate（０．０３ｇ）、化学式８（化８）で示されるN-(2-aminoethyl)-3-(6-(4-methoxyphenyl)-3-oxo-3,7-dihydroimidazo[1,2-a]pyrazin-2-yl)propanamide（０．０１７ｇ）、ＷＳＣ ＨＣｌ（０．２２ｇ）、ピリジン（０．６ｍＬ）及び０．１Ｍ燐酸緩衝液(ｐＨ７．４、０．０５ｍＬ）の混合物を、水素置換し室温で２時間攪拌した。反応液にアセトンを加え、生成した固体と上澄み液とを分離した後、固体を０．１％ＴＦＡ水溶液で溶解し、本溶液をＯＤＳカラムクロマトグラフィーに供した。水とアセトニトリルの混合液で溶出し、目的物の溶出液を減圧濃縮し、目的物０．００７ｇを黄緑色固体として得た。
＜実施例６：発光スペクトル及び発光強度の測定＞
ＫＣｌ（０．２Ｍ）、ＥＤＴＡ（０．１ｍＭ）、3-モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（２０ｍＭ）を含む緩衝水溶液（ｐＨ７．２、０．１ｍＬ）に２５℃で、ヒポキサンチン水溶液（０．３ｍＭ、０．１ｍＬ）、インドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物（前記式（化１０））の水溶液（０．１ｍＭ、２５μＬ）及びキサンチンオキシダーゼ水溶液（０．１８ｕｎｉｔ／２０μＬ）を加え、ルミフルスペクトロキャプチャー（アトー社製）を用いて発光スペクトルを測定した。図１に発光スペクトルを示す。先行技術文献に記載の化合物（化１３）の発光スペクトルでは、極大発光波長は約７９０ｎｍであるのに対し、化学式２（化２）に示した化合物の極大発光波長は約８０３ｎｍであった。それぞれの極大発光波長における発光強度の比較では、化学式２（化２）に示した化合物は約３倍の発光強度を示した。近赤外領域以外の発光は、先行技術文献に記載の化合物（化１３）に比べ化学式２（化２）に示した化合物の方が低かった。
ＫＣｌ（０．２Ｍ）、ＥＤＴＡ（０．１ｍＭ）、3-モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（２０ｍＭ）を含む緩衝水溶液（ｐＨ７．２、０．１ｍＬ）に２５℃で、ヒポキサンチン水溶液（０．３ｍＭ、０．１ｍＬ）、インドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物（前記式（化１０））の水溶液（０．１ｍＭ、２５μＬ）及びキサンチンオキシダーゼ水溶液（０．１８ｕｎｉｔ／２０μＬ）を加え、ルミフルスペクトロキャプチャー（アトー社製）を用いて発光スペクトルを測定した。図１に発光スペクトルを示す。先行技術文献に記載の化合物（化１３）の発光スペクトルでは、極大発光波長は約７９０ｎｍであるのに対し、化学式２（化２）に示した化合物の極大発光波長は約８０３ｎｍであった。それぞれの極大発光波長における発光強度の比較では、化学式２（化２）に示した化合物は約３倍の発光強度を示した。近赤外領域以外の発光は、先行技術文献に記載の化合物（化１３）に比べ化学式２（化２）に示した化合物の方が低かった。
Claims (12)
- 次式で示されるインドシアニン類とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類が共有結合してなるインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物。
- 次式で示されるスルホインドシアニン類とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類が共有結合してなるスルホインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物。
- 次式で示されるスクシンイミジル化合物。
- 次式で示されるスクシンイミジル化合物。
- 次式で示されるカルボン酸化合物。
- 次式で示されるカルボン酸化合物。
- 次式で示されるスルホインドシアニン化合物。
- 請求項３又は請求項４に記載のスクシンイミジル化合物と次式で示されるイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物との縮合反応により、請求項１に記載のインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物又は請求項２に記載のスルホインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物を合成する方法。
- 請求項５又は請求項６に記載のカルボン酸化合物と請求項８に記載のイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物との脱水縮合反応により、請求項１に記載のインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物又は請求項２に記載のスルホインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物を合成する方法。
- 請求項５又は請求項６に記載のカルボン酸化合物のスクシンイミジル化反応により、請求項３又は請求項４に記載のスクシンイミジル化合物を合成する方法。
- 請求項１に記載のインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物又は請求項２に記載のスルホインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物を含有することを特徴とする発光試薬。
- 請求項１１に記載の発光試薬を検体溶液と接触させ、発光強度を測定することを特徴とする分析方法。
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